CN116656865B - 一种快速鉴定绶草的检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物物种鉴定技术领域，涉及一种快速鉴定绶草的检测方法、试剂盒及其应用，检测引物由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成，以绶草的基因组DNA为模板，使用所述引物进行PCR扩增，以限制性内切酶SacI酶切扩增产物，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，为455bp和178bp的两条条带，从而根据电泳条带数目和大小快速鉴定绶草。本发明方法特异性强，鉴定结果直观，实现了快速准确检测鉴定绶草。
Description
技术领域
本发明属于植物物种鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定绶草的检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
绶草（Spiranthes sinensis）为兰科（Orchidaceae）绶草属多年生宿根草本植物，全草均可入药，药用价值较高。由于栖息地受破坏及自身繁殖生物学等因素影响，导致绶草野生资源逐渐枯竭。在加大濒危物种保护的同时，采用组织培养等开展人工繁育栽培，为绶草的研究应用以及自然资源保护提供技术保障。随着绶草药用功效的开发利用，容易出现品种混淆、掺伪现象等。
目前，国内外对植物物种资源的检测鉴定主要通过形态学特征进行观察分析，仅仅依靠形态学鉴定往往很难做出准确的鉴定，特别是在植物发育不完全或只有部分植株材料的时候。尤其经过加工处理后绶草的原有性状特征均已消失，将无法通过性状鉴定的方法进行有效鉴定。兰科植物种类繁多，地理分布较近的种类分子水平差异较小，设计出具有特异性的检测鉴定方法，是本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴定绶草的检测方法、试剂盒及其应用，该检测方法解决了绶草近似种基因序列差异较小，绶草特异片段定位困难，容易出现假阳性扩增的技术难题，从而快速准确地检测鉴定绶草。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种用于绶草鉴定的PCR引物，包括：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其序列为：
上游引物SEQ ID NO.1序列为：5'-TTGGATGACCCTTGATAACCC-3'；
下游引物SEQ ID NO.2序列为：5'-GATGTGCCACCTACAACGAAT-3'。
本发明还提供一种快速鉴定绶草的检测方法，包括：以样品DNA为模板，利用上述的引物进行PCR扩增，以限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带数目和大小鉴定绶草。
具体的，所述引物包含上游引物SEQ ID NO.1与下游引物SEQ ID NO.2，其序列为：
上游引物SEQ ID NO.1序列为：5'-TTGGATGACCCTTGATAACCC-3'；
下游引物SEQ ID NO.2序列为：5'-GATGTGCCACCTACAACGAAT-3'。
具体的，所述PCR反应体系为25μL，包括10×PCR 缓冲液（含Mg2+）12.5μL、dNTP 混合物（2.5 mmol/L）2μL、TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.4μL、上游引物SEQ ID NO.1（10μmol/L）1μL、下游引物SEQ ID NO.2（10μmol/L）1μL、DNA模板1μL、ddH2O 7.1μL。
其PCR反应条件：94°C预变性5min；94°C变性30s、55°C退火45s、72°C延伸1min，循环30次；72 °C延伸10min。
具体的，所述的限制性内切酶为SacI。
本发明提供的一种快速鉴定绶草的检测方法，提取待检植物样品DNA，利用特异性引物和限制性内切酶检测鉴定绶草。本发明根据电泳条带数目和大小快速鉴定绶草，使用特异性引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2进行PCR扩增，绶草扩增出一条大小为633bp的条带，其它近似种均无扩增产物。同时由于绶草的PCR产物中具有SacI酶切位点，将其酶切电泳后出现两条条带，大小分别为455bp和178bp。
本发明还提供了一种快速鉴定绶草的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：上游引物SEQ ID NO.1，下游引物SEQ ID NO.2。
具体的，所述上游引物SEQ ID NO.1序列为：5'-TTGGATGACCCTTGATAACCC-3'；
下游引物SEQ ID NO.2序列为：5'-GATGTGCCACCTACAACGAAT-3'；
具体的，所述的限制性内切酶为SacI。
本发明提供的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果或者优点：
（1）通过测定兰科植物的核糖体基因序列，序列比对分析绶草及其近似种的差异位点，根据绶草核糖体基因序列的特异靶标序列设计特异性引物和限制性内切酶，解决了绶草近似种基因序列差异较小，绶草特异片段定位困难的技术难题，可以有效地区分绶草及其近似种。
（2）本发明根据绶草核糖体基因序列的差异性，选取特异区域进行PCR扩增，进而利用限制性内切酶SacI对GAGCTC特异性识别酶切，通过琼脂糖凝胶电泳产生的条带数目和大小对绶草进行鉴定，鉴定准确性高，用于鉴定不同发育阶段的绶草。特别是在植物发育不完全或只有部分植株材料，以及经过加工处理的时候，也能做出准确的检测鉴定。
（3）本发明使用的PCR扩增和酶切技术均为传统分子生物学技术，通过巧妙利用基因序列差异，采用酶切鉴定，操作简便快捷，相比于基因测序方法更节省时间，可在一天时间内得到检测结果。可实现用一对引物和限制性内切酶在一个反应内对绶草进行快速、准确地鉴定溯源，且扩增效率高，解决了容易出现假阳性扩增的技术难题。
附图说明
图1为本发明中特异性引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SacI酶切位点在绶草核糖体基因序列上的位置示意图。
图2、图3为绶草PCR产物扩增以及酶切鉴定结果。其中，A为绶草Spiranthes sinensis、B为肥根兰Pelexia obliqua、C为线柱兰Zeuxine strateumatica、D为无叶兰Aphyllorchis montana、E为竹茎兰Tropidia nipponica、F为铠兰Corybas sinii、G为头蕊兰Cephalanthera longifolia、H为ddH2O。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案清楚、完整地进行描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例设计并合成了所述绶草的检测方法所用的特异性引物。
通过测定兰科植物的核糖体基因序列，以及GenBank DNA序列数据库进行比对分析，确定绶草及其近似种的差异位点。根据比对结果人工寻找绶草的特异性位点并在特异性位点上下游设计特异性引物。检查设计好的引物是否存在错配、二聚体和发夹结构，以及是否存在同源序列。随后在绶草的特异性引物范围内，人工寻找能与其他物种区分开的差异位点；并以此寻找特异酶切位点，酶切位点要满足特异性要求，并且其在目标序列中的位点要准确适宜，能将目标序列酶切成符合鉴定要求的条带大小，从而根据电泳条带数目和大小快速鉴定绶草。
经筛选比对后获得一组可用于鉴定绶草的特异性引物和限制性内切酶，其在绶草核糖体基因序列上的位置如图1所示，具体序列如下：
上游引物SEQ ID NO.1序列为：5'-TTGGATGACCCTTGATAACCC-3'；
下游引物SEQ ID NO.2序列为：5'-GATGTGCCACCTACAACGAAT-3'；
特异限制性内切酶为：SacI。
实施例2
本实施例建立了鉴定绶草的检测方法，其PCR反应体系为25μL，包括10×PCR 缓冲液（含Mg2+）12.5μL、dNTP 混合物（2.5 mmol/L）2μL、TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.4μL、上游引物SEQ ID NO.1（10μmol/L）1μL、下游引物SEQ ID NO.2（10μmol/L）1μL、DNA模板1μL、ddH2O7.1μL。
其PCR反应条件：94°C预变性5min；94°C变性30s、55°C退火45s、72°C延伸1min，循环30次；72 °C延伸10min。
本发明还提供了一种快速鉴定绶草的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：上游引物SEQ ID NO.1，下游引物SEQ ID NO.2。
采用实施例1获得的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2组合，进行PCR扩增，PCR产物扩增结果如图2所示，绶草扩增出一条大小为633bp的条带，其它近似种均无扩增产物。
以限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的酶切鉴定结果如图3所示，由于绶草的PCR产物中具有SacI酶切位点，将其酶切电泳后出现两条条带，大小分别为455bp和178bp，根据电泳条带数目和大小鉴定绶草。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (6)
1.一种用于绶草鉴定的PCR引物，其特征在于，包括：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；其序列为：
上游引物SEQ ID NO.1序列为：5'-TTGGATGACCCTTGATAACCC-3'；
下游引物SEQ ID NO.2序列为：5'-GATGTGCCACCTACAACGAAT-3'。
2.一种快速鉴定绶草的检测方法，其特征在于，包括：以样品DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，以限制性内切酶SacI对PCR扩增产物进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带数目和大小鉴定绶草。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，根据电泳条带数目和大小鉴定绶草，为根据455bp和178bp的两条特异性扩增条带判定阳性结果。
4.权利要求2-3任一项所述的检测方法在检测鉴定绶草中的应用。
5.一种快速鉴定绶草的检测试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的引物以及限制性内切酶，所述的限制性内切酶为SacI。
6.权利要求5所述的试剂盒在检测鉴定绶草中的应用。
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