CN107228787B - 一种土壤dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土壤DNA提取方法，采用SDS‑溶菌酶法裂解土壤样本，得到裂解液；将所得的裂解液与5×SDS Loading Buffera按比例混匀后加入所得的蛋白胶梳孔内，按常规方法进行电泳，待电泳结束后，轻轻地将蛋白胶梳取出进行染色处理，当银白色的目的条带出现时，将目的条带切下，放入盛有2mLPBS的透析袋内，放入盛有适量的1×Tris‑Gly电泳缓冲液的水平电泳槽内，并将水平电泳槽置于冰上进行电泳；将所得的透析袋置于盛有灭菌的PBS的小烧杯内，4℃透析过夜，次日，收集透析袋内的上清液，即得土壤DNA提取液。本发明操作步骤简单，在操作中损失的DNA比较少，得到的DNA量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及土壤DNA提取领域，具体涉及一种土壤DNA提取方法。
背景技术
目前用于土壤总DNA提取方法主要有三种，直接法、间接法和试剂盒法。直接法是直接从土壤中裂解细胞，但目前的传统方法操作步骤太多，所以导致DNA产量低，且最后得到的DNA量不稳定。间接法是先分离细胞再裂解，但许多微生物与土壤颗粒紧密结合，细胞不易分离，导致最终的DNA产量低，且耗时较长。试剂盒法具有简单、快速的优点，但价格昂贵，对大批量样品提取不经济，而且有时候DNA提取不出来。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种土壤DNA提取方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种土壤DNA提取方法，包括如下步骤：
S1、采用SDS-溶菌酶法裂解土壤样本，得到裂解液；
S2、量取双蒸水2.45mL，30％的丙烯酰胺3.0mL，1.5mmol/L的Tris-HCl 1.9mL，10％的十二烷基硫酸钠75.0μL，10％的APS 75.0μL，TEMED 3.0μL，充分混合，搅拌均匀后立即加入玻璃制胶平板中，再加入蒸馏水，在分离胶液面上覆盖一层厚1.0cm的水层，室温静置30-40min，直至分离胶聚合；
S3、量取双蒸水2.1mL，30％的丙烯酰胺0.5mL，1.0mmol/L的Tris-HCl 0.38mL，10％的SDS 30.0μL，10％的APS 30.0μL，TEMED3.0μL，充分混合后，得5％的浓缩胶；
S4、倒掉步骤S2所得的制胶平板上面的水层，用蒸馏水洗涤，滤纸吸干分离胶顶端的水后，保持液面和玻璃板上沿齐平，加入所得的浓缩胶后立即在玻璃板之间插入间距为0.75mm的梳子，室温静置20-30min，待浓缩胶完全聚合后，轻轻拔出梳子，得蛋白胶梳；
S5、将所得的裂解液与5×SDS Loading Buffera按体积比4∶1混匀后加入步骤S4所得的蛋白胶梳孔内，按常规方法进行电泳，待电泳结束后，轻轻地将蛋白胶梳取出，放入洁净的培养皿内，加入适量的0.1mol/L的KCl染色10-20min，当银白色的目的条带出现时，用干净的刀片将目的条带切下，放入盛有2mLPBS的透析袋内，放入盛有适量的1×Tris-Gly电泳缓冲液的水平电泳槽内，并将水平电泳槽置于冰上，将电压调至180V，电泳40-50min，待目的胶带由淡蓝色变为透明时，电泳结束；
S6、将步骤S5所得的透析袋置于盛有灭菌的PBS的小烧杯内，4℃透析过夜，次日，收集透析袋内的上清液，即得土壤DNA提取液。
其中，所述步骤S5中上样时从蛋白胶梳的中间开始加。
其中，所述步骤S1具体包括如下步骤：用DNA提取缓冲液重悬土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混匀后37℃反应20min；加入SDS，65℃水浴30min，25℃下10000×g离心10min，得到的上清液即为裂解液。
其中，所述DNA提取缓冲液的pH为8.0，由水和溶质组成；溶质及其在所述DNA提取缓冲液中的浓度如下：100mM Tris-HCl，100mM EDTA·2Na，100mM磷酸钠，1.5M NaCl。
本发明具有以下有益效果：
以粘性土壤、亚粘土、亚沙土为材料，采取SDS和溶菌酶结合的方法裂解细胞释放DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶纯化。该方法操作步骤简单，在操作中损失的DNA比较少，得到的DNA量稳定。并且在提取过程中不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体伤害。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种土壤DNA提取方法，包括如下步骤：
S1、采用SDS-溶菌酶法裂解土壤样本，得到裂解液；具体包括如下步骤：用DNA提取缓冲液重悬土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混匀后37℃反应20min；加入SDS，65℃水浴30min，25℃下10000×g离心10min，得到的上清液即为裂解液；所述DNA提取缓冲液的pH为8.0，由水和溶质组成；溶质及其在所述DNA提取缓冲液中的浓度如下：100mM Tris-HCl，100mMEDTA·2Na，100mM磷酸钠，1.5M NaCl；
S2、量取双蒸水2.45mL，30％的丙烯酰胺3.0mL，1.5mmol/L的Tris-HCl 1.9mL，10％的十二烷基硫酸钠75.0μL，10％的APS 75.0μL，TEMED 3.0μL，充分混合，搅拌均匀后立即加入玻璃制胶平板中，再加入蒸馏水，在分离胶液面上覆盖一层厚1.0cm的水层，室温静置30-40min，直至分离胶聚合；
S3、量取双蒸水2.1mL，30％的丙烯酰胺0.5mL，1.0mmol/L的Tris-HCl 0.38mL，10％的SDS 30.0μL，10％的APS 30.0μL，TEMED3.0μL，充分混合后，得5％的浓缩胶；
S4、倒掉步骤S2所得的制胶平板上面的水层，用蒸馏水洗涤，滤纸吸干分离胶顶端的水后，保持液面和玻璃板上沿齐平，加入所得的浓缩胶后立即在玻璃板之间插入间距为0.75mm的梳子，室温静置20-30min，待浓缩胶完全聚合后，轻轻拔出梳子，得蛋白胶梳；
S5、将所得的裂解液与5×SDS Loading Buffera按体积比4∶1混匀后加入步骤S4所得的蛋白胶梳孔内，上样时从蛋白胶梳的中间开始加，按常规方法进行电泳，待电泳结束后，轻轻地将蛋白胶梳取出，放入洁净的培养皿内，加入适量的0.1mol/L的KCl染色10-20min，当银白色的目的条带出现时，用干净的刀片将目的条带切下，放入盛有2mLPBS的透析袋内，放入盛有适量的1×Tris-Gly电泳缓冲液的水平电泳槽内，并将水平电泳槽置于冰上，将电压调至180V，电泳40-50min，待目的胶带由淡蓝色变为透明时，电泳结束；
S6、将步骤S5所得的透析袋置于盛有灭菌的PBS的小烧杯内，4℃透析过夜，次日，收集透析袋内的上清液，即得土壤DNA提取液。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种土壤DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用SDS-溶菌酶法裂解土壤样本，得到裂解液；具体包括如下步骤：用DNA提取缓冲液重悬土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混匀后37℃反应20min；加入SDS，65℃水浴30min，25℃下10000×g离心10min，得到的上清液即为裂解液；所述DNA提取缓冲液的pH为8.0，由水和溶质组成；溶质及其在所述DNA提取缓冲液中的浓度如下：100mM Tris-HCl，100mM EDTA·2Na，100mM磷酸钠，1.5M NaCl；
S2、量取双蒸水2.45mL，30％的丙烯酰胺3.0mL，1.5mmol/L的Tris-HCl 1.9mL，10％的十二烷基硫酸钠75.0μL，10％的APS 75.0μL，TEMED 3.0μL，充分混合，搅拌均匀后立即加入玻璃制胶平板中，再加入蒸馏水，在分离胶液面上覆盖一层厚1.0cm的水层，室温静置30-40min，直至分离胶聚合；
S3、量取双蒸水2.1mL，30％的丙烯酰胺0.5mL，1.0mmol/L的Tris-HCl 0.38mL，10％的SDS 30.0μL，10％的APS 30.0μL，TEMED3.0μL，充分混合后，得5％的浓缩胶；
S4、倒掉步骤S2所得的制胶平板上面的水层，用蒸馏水洗涤，滤纸吸干分离胶顶端的水后，保持液面和玻璃板上沿齐平，加入所得的浓缩胶后立即在玻璃板之间插入间距为0.75mm的梳子，室温静置20-30min，待浓缩胶完全聚合后，轻轻拔出梳子，得蛋白胶梳；
S5、将所得的裂解液与5×SDS Loading Buffera按体积比4∶1混匀后加入步骤S4所得的蛋白胶梳孔内，按常规方法进行电泳，待电泳结束后，轻轻地将蛋白胶梳取出，放入洁净的培养皿内，加入适量的0.1mol/L的KCl染色10-20min，当银白色的目的条带出现时，用干净的刀片将目的条带切下，放入盛有2mLPBS的透析袋内，放入盛有适量的1×Tris-Gly电泳缓冲液的水平电泳槽内，并将水平电泳槽置于冰上，将电压调至180V，电泳40-50min，待目的胶带由淡蓝色变为透明时，电泳结束；
S6、将步骤S5所得的透析袋置于盛有灭菌的PBS的小烧杯内，4℃透析过夜，次日，收集透析袋内的上清液，即得土壤DNA提取液。
2.根据权利要求1所述的一种土壤DNA提取方法，其特征在于，所述步骤S5中上样时从蛋白胶梳的中间开始加。
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| 一种土壤微生物总DNA的高效提取方法;黄婷婷等;《土壤》;20041231;全文 * |
| 一种适宜于文库构建的土壤微生物总DNA 提取方法;高岳;《安徽农业科技》;20141231;全文 * |
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