JPH06189764A - スイカf1品種の識別に用いる合成オリゴヌクレオチド - Google Patents
スイカf1品種の識別に用いる合成オリゴヌクレオチドInfo
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- JPH06189764A JPH06189764A JP4288119A JP28811992A JPH06189764A JP H06189764 A JPH06189764 A JP H06189764A JP 4288119 A JP4288119 A JP 4288119A JP 28811992 A JP28811992 A JP 28811992A JP H06189764 A JPH06189764 A JP H06189764A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記の配列を有する合成オリゴヌクレオチ
ド、 5’−ACCACCTGGCTC−3’ スイカより抽出したDNAを鋳型とし、上記の合成オリ
ゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によりD
NAの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動分析す
ることを特徴とするスイカ品種の識別方法並びに該反応
により得た増幅産物を電気泳動分析し、F1種子と種子
親(母本)の自殖種子を識別することによりスイカF1
種子の純度を判定する方法。 【効果】 本発明によれば、スイカF1品種の識別に用
いる合成オリゴヌクレオチドが提供され、これを用いる
ことによりスイカ品種の識別とF1種子の純度検定を高
精度,高効率で実施することができる。本発明の実施例
に用いた親系統、都系×富研系の組合わせは、わが国の
スイカF1品種の作出に用いられる一般的な組合わせで
あり、F1品種‘富士光’種子生産以外にもHc×HdのF
1種子生産等他の多くの組合わせにおいてもこのプライ
マーによるスイカ品種の識別とF1種子の純度検定が可
能である。
ド、 5’−ACCACCTGGCTC−3’ スイカより抽出したDNAを鋳型とし、上記の合成オリ
ゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によりD
NAの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動分析す
ることを特徴とするスイカ品種の識別方法並びに該反応
により得た増幅産物を電気泳動分析し、F1種子と種子
親(母本)の自殖種子を識別することによりスイカF1
種子の純度を判定する方法。 【効果】 本発明によれば、スイカF1品種の識別に用
いる合成オリゴヌクレオチドが提供され、これを用いる
ことによりスイカ品種の識別とF1種子の純度検定を高
精度,高効率で実施することができる。本発明の実施例
に用いた親系統、都系×富研系の組合わせは、わが国の
スイカF1品種の作出に用いられる一般的な組合わせで
あり、F1品種‘富士光’種子生産以外にもHc×HdのF
1種子生産等他の多くの組合わせにおいてもこのプライ
マーによるスイカ品種の識別とF1種子の純度検定が可
能である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、スイカF1品種の識別
に用いる合成オリゴヌクレオチドに関し、詳しくは特定
の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを提供すると共
に、該合成オリゴヌクレオチドを用いてDNA分析によ
りスイカ品種を識別する方法並びにスイカ品種を識別し
てスイカF1種子の純度を判定する方法に関する。
に用いる合成オリゴヌクレオチドに関し、詳しくは特定
の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを提供すると共
に、該合成オリゴヌクレオチドを用いてDNA分析によ
りスイカ品種を識別する方法並びにスイカ品種を識別し
てスイカF1種子の純度を判定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術、発明が解決しようとする課題】野菜種子
生産においては、その殆どがF1種子であるので、種子
親(母本)と特定な他の花粉親(父本)との交配を行う
必要がある。しかし、多くの場合、種子親の自殖が可能
であるため、F1種子の中に母本の自殖種子が混入する
危険がある。また、この混入率は、交配ミスの程度,気
象条件,栽培条件などにより変化する。
生産においては、その殆どがF1種子であるので、種子
親(母本)と特定な他の花粉親(父本)との交配を行う
必要がある。しかし、多くの場合、種子親の自殖が可能
であるため、F1種子の中に母本の自殖種子が混入する
危険がある。また、この混入率は、交配ミスの程度,気
象条件,栽培条件などにより変化する。
【0003】混入した自殖種子に由来する植物は、F1
種子由来のものと性質が異なるので、種子の品質を低下
させる要因となる。そこで、スイカ品種の識別とF1種
子の純度検定が必要となる。従来は、生産された種子
を圃場あるいは苗床に播種し、発芽した植物の形態的特
徴から母本の自殖種子とF1種子とを見分け、純度を検
定する方法(形態的検定)あるいは種子または幼植物
を適当な緩衝液で磨砕し、電気泳動にかけ、特定の酵素
の活性染色を行い、アイソザイムの違いから種子の識別
を行う方法(酵素的検定)が実施されている。
種子由来のものと性質が異なるので、種子の品質を低下
させる要因となる。そこで、スイカ品種の識別とF1種
子の純度検定が必要となる。従来は、生産された種子
を圃場あるいは苗床に播種し、発芽した植物の形態的特
徴から母本の自殖種子とF1種子とを見分け、純度を検
定する方法(形態的検定)あるいは種子または幼植物
を適当な緩衝液で磨砕し、電気泳動にかけ、特定の酵素
の活性染色を行い、アイソザイムの違いから種子の識別
を行う方法(酵素的検定)が実施されている。
【0004】しかし、前者の方法は、圃場を必要とする
上に、植物の生育に比較的長時間を要し、かつ形態的に
似通った親同士の交配の場合は、F1種子と母本との差
異が僅かであるため、判定ができなかったり、判定を誤
る場合がある。また、後者の方法は、分析できる酵素に
は実際上限度があるため、アイソザイムが同じ親同士の
組合わせの場合には利用できない。このように、従来法
では品種の識別やF1種子の純度検定は必ずしも満足し
得る水準で行われているとは言えなかった。
上に、植物の生育に比較的長時間を要し、かつ形態的に
似通った親同士の交配の場合は、F1種子と母本との差
異が僅かであるため、判定ができなかったり、判定を誤
る場合がある。また、後者の方法は、分析できる酵素に
は実際上限度があるため、アイソザイムが同じ親同士の
組合わせの場合には利用できない。このように、従来法
では品種の識別やF1種子の純度検定は必ずしも満足し
得る水準で行われているとは言えなかった。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、スイカ
品種の識別とF1種子の純度検定を高精度,高効率で実
施できる方法を提供することである。本発明者は、任意
な配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR,Polymerase chain reaction)によ
り、植物体DNAを分析する手法でスイカF1種子と種
子親との識別に成功した。この方法は、種子の親子関係
の識別だけでなく、品種の識別にも利用でき、かかる知
見に基づいて本発明を完成したのである。
品種の識別とF1種子の純度検定を高精度,高効率で実
施できる方法を提供することである。本発明者は、任意
な配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR,Polymerase chain reaction)によ
り、植物体DNAを分析する手法でスイカF1種子と種
子親との識別に成功した。この方法は、種子の親子関係
の識別だけでなく、品種の識別にも利用でき、かかる知
見に基づいて本発明を完成したのである。
【0006】すなわち本発明は、下記の配列を有する合
成オリゴヌクレオチドを提供すると共に、 5’−ACCACCTGGCTC−3’ スイカより抽出したDNAを鋳型とし、上記合成オリゴ
ヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によりDN
Aの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動分析する
ことを特徴とするスイカ品種の識別方法と該反応により
得た増幅産物を電気泳動分析し、F1種子と種子親(母
本)の自殖種子を識別することによりスイカF1種子の
純度を判定する方法を提供するものである。
成オリゴヌクレオチドを提供すると共に、 5’−ACCACCTGGCTC−3’ スイカより抽出したDNAを鋳型とし、上記合成オリゴ
ヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によりDN
Aの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動分析する
ことを特徴とするスイカ品種の識別方法と該反応により
得た増幅産物を電気泳動分析し、F1種子と種子親(母
本)の自殖種子を識別することによりスイカF1種子の
純度を判定する方法を提供するものである。
【0007】任意な配列を持つ合成オリゴヌクレオチド
を用いたPCRにより得られるDNAの多型は、RAP
D(Random amplified polymorphic DNA) とも言われ、
使用する合成オリゴヌクレオチドの種類を変えることに
より、容易に数多くの多型を得ることができる。この手
法に必要な工程は、抽出されたDNAを鋳型としたPC
RによるDNAの増幅と増幅されたDNAの電気泳動お
よび泳動像の撮影だけの簡単なものである。そのため、
これまでに種々の生物の遺伝解析や品種・個体の識別に
用いられてきた。本発明は、この手法をスイカ品種の識
別とF1種子の純度検定に初めて応用したものである。
を用いたPCRにより得られるDNAの多型は、RAP
D(Random amplified polymorphic DNA) とも言われ、
使用する合成オリゴヌクレオチドの種類を変えることに
より、容易に数多くの多型を得ることができる。この手
法に必要な工程は、抽出されたDNAを鋳型としたPC
RによるDNAの増幅と増幅されたDNAの電気泳動お
よび泳動像の撮影だけの簡単なものである。そのため、
これまでに種々の生物の遺伝解析や品種・個体の識別に
用いられてきた。本発明は、この手法をスイカ品種の識
別とF1種子の純度検定に初めて応用したものである。
【0008】本発明の合成オリゴヌクレオチドは、乱数
表により任意に配列を求め、市販のDNA/RNA合成
機を使用して合成することができる。また、市販のオリ
ゴヌクレオチドを利用することもできる。スイカ品種の
識別とF1種子の純度検定を行うため、スイカ組織から
全DNAを常法、例えばセチルトリメチルアンモニウム
ブロミド(CTAB)法〔クローニングとシーケンス、
p252,1989年、農村文化社〕に従って抽出し、
DNA標品とする。なお、DNAの抽出はスイカ組織を
緩衝液と共に磨砕したのち固−液分離して得た上清にイ
ソプロパノール等の溶媒を加えて回収する簡便法(K.Ed
wards ら、Nucleic Acids Research,vol.19,p.1349) で
行うこともできる。
表により任意に配列を求め、市販のDNA/RNA合成
機を使用して合成することができる。また、市販のオリ
ゴヌクレオチドを利用することもできる。スイカ品種の
識別とF1種子の純度検定を行うため、スイカ組織から
全DNAを常法、例えばセチルトリメチルアンモニウム
ブロミド(CTAB)法〔クローニングとシーケンス、
p252,1989年、農村文化社〕に従って抽出し、
DNA標品とする。なお、DNAの抽出はスイカ組織を
緩衝液と共に磨砕したのち固−液分離して得た上清にイ
ソプロパノール等の溶媒を加えて回収する簡便法(K.Ed
wards ら、Nucleic Acids Research,vol.19,p.1349) で
行うこともできる。
【0009】次に、上記のようにして抽出したDNAを
鋳型とし、前記合成オリゴヌクレオチドを用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応によりDNAの増幅を行う。すなわち、
0.5mlプラスチック試験管に鋳型DNA,耐熱性DN
Aポリメラーゼ,デオキシヌクレオチドモノマー4種,
合成プライマーRA12−12,10倍濃縮反応液およ
び蒸留水を混合し、その上を鉱物油で覆い、PCR機
(例えばASTEC社製、プログラムテンプコントロー
ル等)にかける。反応は、通常高温処理の後、熱変性,
アニーリング,伸長反応を繰り返して行う。例えば94
℃で30秒の前処理後、熱変性94℃,25秒、アニー
リング40℃,2分、伸長反応72℃,3分、45サイ
クルで行う。
鋳型とし、前記合成オリゴヌクレオチドを用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応によりDNAの増幅を行う。すなわち、
0.5mlプラスチック試験管に鋳型DNA,耐熱性DN
Aポリメラーゼ,デオキシヌクレオチドモノマー4種,
合成プライマーRA12−12,10倍濃縮反応液およ
び蒸留水を混合し、その上を鉱物油で覆い、PCR機
(例えばASTEC社製、プログラムテンプコントロー
ル等)にかける。反応は、通常高温処理の後、熱変性,
アニーリング,伸長反応を繰り返して行う。例えば94
℃で30秒の前処理後、熱変性94℃,25秒、アニー
リング40℃,2分、伸長反応72℃,3分、45サイ
クルで行う。
【0010】しかる後、得られた増幅産物を電気泳動分
析する。ここで、電気泳動分析は常法によればよく、例
えば1.5%アガロースを含むトリス−ほう酸−EDTA
緩衝液ゲル中で50Vの電圧をかけ電気泳動し、分離し
たDNAバンドパターンを分析する。それぞれの増幅産
物は、いくつかのバンドからなるが、850bpのバン
ドについてのみ個体間で差異が見られる。すなわち、花
粉親およびF1のDNAを鋳型として用いた場合には、
850bpのバンドが増幅され、種子親のDNAを鋳型
とした場合には、このバンドが現れない。このバンドの
増幅は極めて安定しており、花粉親およびF1の全ての
個体に見られ、種子親には全く見られない。したがっ
て、F1種子の検定には、検定しようとする種子を発芽
させてDNAを抽出し、これを鋳型として上記のポリメ
ラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物中の850bpのバン
ドの有無を調べ、これが存在するものを真のF1種子、
存在しないものを種子親の自殖種子、すなわち不純物
(夾雑種子)とみなし、F1種子の純度を算出すればよ
い。
析する。ここで、電気泳動分析は常法によればよく、例
えば1.5%アガロースを含むトリス−ほう酸−EDTA
緩衝液ゲル中で50Vの電圧をかけ電気泳動し、分離し
たDNAバンドパターンを分析する。それぞれの増幅産
物は、いくつかのバンドからなるが、850bpのバン
ドについてのみ個体間で差異が見られる。すなわち、花
粉親およびF1のDNAを鋳型として用いた場合には、
850bpのバンドが増幅され、種子親のDNAを鋳型
とした場合には、このバンドが現れない。このバンドの
増幅は極めて安定しており、花粉親およびF1の全ての
個体に見られ、種子親には全く見られない。したがっ
て、F1種子の検定には、検定しようとする種子を発芽
させてDNAを抽出し、これを鋳型として上記のポリメ
ラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物中の850bpのバン
ドの有無を調べ、これが存在するものを真のF1種子、
存在しないものを種子親の自殖種子、すなわち不純物
(夾雑種子)とみなし、F1種子の純度を算出すればよ
い。
【0011】
【実施例】以下において、本発明を実施例により詳しく
説明する。 実施例1 (1)DNAの抽出 都系×大和系の固定系統の種子親Ha, 富研系に属する花
粉親HbおよびそのF1〔富士光、(株)萩原農場〕(Ha
×Hb)の播種後4日目の根部から、全DNAを前述のC
TAB法により抽出した。すなわち、スイカの組織0.2
〜1.0gを同量の緩衝液(2%セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド,20mMトリス−塩酸緩衝液,pH8.
0,20mM EDTA,1.4M NaCl)と共に磨
砕し、55℃に10分間保温したのち、室温に冷却し
た。その後、等容のクロロホルムを加えて混和し、遠心
して2層に分離した。上層を分取し、1/10容の10
%セチルトリメチルアンモニウムブロミド,0.7M N
aClを加え、さらにクロロホルムを加えて同様にして
上層を得た。この上層に等容の1%セチルトリメチルア
ンモニウムブロミド,50mM NaClを加え、核酸
の沈殿を得た。この沈殿を100mMトリス−塩酸緩衝
液,1M NaClに溶かし、2.5容のエタノールを加
えて再び沈殿させた。この沈殿を70%エタノールで洗
浄後、乾燥させ、蒸留水に溶かしてDNA標品とした。
説明する。 実施例1 (1)DNAの抽出 都系×大和系の固定系統の種子親Ha, 富研系に属する花
粉親HbおよびそのF1〔富士光、(株)萩原農場〕(Ha
×Hb)の播種後4日目の根部から、全DNAを前述のC
TAB法により抽出した。すなわち、スイカの組織0.2
〜1.0gを同量の緩衝液(2%セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド,20mMトリス−塩酸緩衝液,pH8.
0,20mM EDTA,1.4M NaCl)と共に磨
砕し、55℃に10分間保温したのち、室温に冷却し
た。その後、等容のクロロホルムを加えて混和し、遠心
して2層に分離した。上層を分取し、1/10容の10
%セチルトリメチルアンモニウムブロミド,0.7M N
aClを加え、さらにクロロホルムを加えて同様にして
上層を得た。この上層に等容の1%セチルトリメチルア
ンモニウムブロミド,50mM NaClを加え、核酸
の沈殿を得た。この沈殿を100mMトリス−塩酸緩衝
液,1M NaClに溶かし、2.5容のエタノールを加
えて再び沈殿させた。この沈殿を70%エタノールで洗
浄後、乾燥させ、蒸留水に溶かしてDNA標品とした。
【0012】一方、比較のために、簡便法によりDNA
を抽出した。すなわち、スイカの組織30mgを100
μlの緩衝液(200mMトリス−塩酸緩衝液,pH7.
5,250mM NaCl,25mM EDTAおよび
0.5%SDSを含む)と共に磨砕し、遠心の後、上清に
等容のイソプロパノールを加え、核酸を回収した。
を抽出した。すなわち、スイカの組織30mgを100
μlの緩衝液(200mMトリス−塩酸緩衝液,pH7.
5,250mM NaCl,25mM EDTAおよび
0.5%SDSを含む)と共に磨砕し、遠心の後、上清に
等容のイソプロパノールを加え、核酸を回収した。
【0013】(2)オリゴヌクレオチドプライマーの合
成 DNA/RNA合成機(ABI社製、392型)に4種
の保護モノマー(和光純薬製)およびその他必要な合成
用試薬を取付け、プライマーサイクル(0.2μモル規
模)を用いてCPGカラム(ABI社製)上でオリゴヌ
クレオチドを自動合成した。合成後、自動切り出しを行
い、バイアル管にアンモニア水溶液として回収した。
成 DNA/RNA合成機(ABI社製、392型)に4種
の保護モノマー(和光純薬製)およびその他必要な合成
用試薬を取付け、プライマーサイクル(0.2μモル規
模)を用いてCPGカラム(ABI社製)上でオリゴヌ
クレオチドを自動合成した。合成後、自動切り出しを行
い、バイアル管にアンモニア水溶液として回収した。
【0014】合成したオリゴヌクレオチドは減圧下でア
ンモニアを除いた後、蒸留水に溶かし、n−ブタノール
で洗浄したのち、エタノールを加えて沈殿させ、再び水
に溶かしてから分光光度計で紫外吸収を測定し、DNA
量を算出した後、プライマーとして用いた。
ンモニアを除いた後、蒸留水に溶かし、n−ブタノール
で洗浄したのち、エタノールを加えて沈殿させ、再び水
に溶かしてから分光光度計で紫外吸収を測定し、DNA
量を算出した後、プライマーとして用いた。
【0015】CTAB法あるいは簡便法で抽出したDN
A5〜10ngを鋳型とし、200μM dNTPs,0.2μM
オリゴヌクレオチドプライマー(1種類)に0.5ユニッ
トのTth DNA ポリメラーゼ(東洋紡製)を加え、25μ
lの反応液とした。ポリメラーゼ連鎖反応は、94℃,
30秒の前処理後、熱変性94℃,25秒、アニーリン
グ40℃,2分、伸長反応72℃,3分、45サイクル
の条件でプログラムテンプコントロール(ASTEC社
製、PC−700)を用いて行った。
A5〜10ngを鋳型とし、200μM dNTPs,0.2μM
オリゴヌクレオチドプライマー(1種類)に0.5ユニッ
トのTth DNA ポリメラーゼ(東洋紡製)を加え、25μ
lの反応液とした。ポリメラーゼ連鎖反応は、94℃,
30秒の前処理後、熱変性94℃,25秒、アニーリン
グ40℃,2分、伸長反応72℃,3分、45サイクル
の条件でプログラムテンプコントロール(ASTEC社
製、PC−700)を用いて行った。
【0016】(3)アガロースゲル電気泳動 アガロースゲル電気泳動は、電気泳動装置(コスモバイ
オ社製、ミューピド)を用いて行った。ゲルトレーに泳
動ゲル(トリス−ほう酸−EDTA緩衝液、TBE),
1.5%アガロースおよび1μg/mlエチジウムブロミ
ドを含む)を作成し、ポリメラーゼ連鎖反応にて増幅し
たDNA標品を添加したのち、50Vで泳動した。な
お、DNA分子量マーカーとしてλファージDNAをEc
oRI とHindIII で消化したものを同時に泳動した。
オ社製、ミューピド)を用いて行った。ゲルトレーに泳
動ゲル(トリス−ほう酸−EDTA緩衝液、TBE),
1.5%アガロースおよび1μg/mlエチジウムブロミ
ドを含む)を作成し、ポリメラーゼ連鎖反応にて増幅し
たDNA標品を添加したのち、50Vで泳動した。な
お、DNA分子量マーカーとしてλファージDNAをEc
oRI とHindIII で消化したものを同時に泳動した。
【0017】親系統HaとHbを識別するために、市販のプ
ライマーおよび合成プライマーの合計57種類(8mer
〜26mer)について検索を行った。その結果、9種類の
プライマーを用いて増幅した産物の電気泳動パターンで
HaとHbを識別できることが判明した。この中で花粉親Hb
に特異的で、しかも明瞭なバンド認められたのは、下記
の配列を有する合成プライマーRA12−12による増
幅産物であった。 5’−ACCACCTGGCTC−3’ すなわち、花粉親HbおよびF1(Ha×Hb)の増幅産物に
は850bp付近にバンドが見られたが、種子親Haのそ
れには見られなかった。
ライマーおよび合成プライマーの合計57種類(8mer
〜26mer)について検索を行った。その結果、9種類の
プライマーを用いて増幅した産物の電気泳動パターンで
HaとHbを識別できることが判明した。この中で花粉親Hb
に特異的で、しかも明瞭なバンド認められたのは、下記
の配列を有する合成プライマーRA12−12による増
幅産物であった。 5’−ACCACCTGGCTC−3’ すなわち、花粉親HbおよびF1(Ha×Hb)の増幅産物に
は850bp付近にバンドが見られたが、種子親Haのそ
れには見られなかった。
【0018】このことは、花粉親HbのDNAには合成プ
ライマーRA12−12のプライマー結合部位が+鎖の
ある部位とその上流850bpの−鎖の部位に存在した
ため、その間のDNAがポリメラーゼ連鎖反応にて増幅
され、一方この一組の結合部位が種子親HaのDNAには
存在しなかったため、850bpのバンドは増幅されな
かったものと考えられる。また、花粉親Hbにおけるこの
一組の増幅可能部位は遺伝により、F1に受け継がれた
ため、F1のDNAを鋳型とした場合も、850bpの
バンドが増幅されたものと考えられる。
ライマーRA12−12のプライマー結合部位が+鎖の
ある部位とその上流850bpの−鎖の部位に存在した
ため、その間のDNAがポリメラーゼ連鎖反応にて増幅
され、一方この一組の結合部位が種子親HaのDNAには
存在しなかったため、850bpのバンドは増幅されな
かったものと考えられる。また、花粉親Hbにおけるこの
一組の増幅可能部位は遺伝により、F1に受け継がれた
ため、F1のDNAを鋳型とした場合も、850bpの
バンドが増幅されたものと考えられる。
【0019】種子親Ha,花粉親HbおよびF1(Ha×Hb)
それぞれ5個体ずつから別々に抽出したDNAを鋳型と
して同様にポリメラーゼ連鎖反応にかけた場合、850
bpのバンドは種子親では全ての個体で見られず、花粉
親およびF1の全ての個体で観察された。この増幅可能
部位の存在は、花粉親およびF1の全ての個体で認めら
れ、一方全ての種子親の個体に存在しないと推定された
(図1参照)。なお、この種子親は10代以上自殖を繰
り返しているため、ほぼ純系であり、種子親の自殖個体
も全て増幅可能部位を有していないことが明白である。
それぞれ5個体ずつから別々に抽出したDNAを鋳型と
して同様にポリメラーゼ連鎖反応にかけた場合、850
bpのバンドは種子親では全ての個体で見られず、花粉
親およびF1の全ての個体で観察された。この増幅可能
部位の存在は、花粉親およびF1の全ての個体で認めら
れ、一方全ての種子親の個体に存在しないと推定された
(図1参照)。なお、この種子親は10代以上自殖を繰
り返しているため、ほぼ純系であり、種子親の自殖個体
も全て増幅可能部位を有していないことが明白である。
【0020】F1種子の生産の場合、種子親は稔性があ
るため、交配作業のミスから種子親の自殖種子がF1種
子に混入する可能性があり、F1種子の純度を低下させ
る主要な原因となる。この自殖種子の混入率は、種子を
発芽させ、DNAを抽出し、上記の手法により合成プラ
イマーRA12−12を用いたポリメラーゼ連鎖反応を
行い、850bpのバンドの有無から自殖種子の混入率
を算出し、F1種子の純度を判定することができる。
るため、交配作業のミスから種子親の自殖種子がF1種
子に混入する可能性があり、F1種子の純度を低下させ
る主要な原因となる。この自殖種子の混入率は、種子を
発芽させ、DNAを抽出し、上記の手法により合成プラ
イマーRA12−12を用いたポリメラーゼ連鎖反応を
行い、850bpのバンドの有無から自殖種子の混入率
を算出し、F1種子の純度を判定することができる。
【0021】図2は、F1種子と種子親自殖種子を実際
に混合し、発芽させた後、DNAを抽出し、前記の合成
プライマーRA12−12を用いたポリメラーゼ連鎖反
応による検定結果を示す。電気泳動パターンから検定し
た14個体中、4個体に850bpのバンドが認められ
ず、これらは種子親自殖種子であると判定することがで
きた。
に混合し、発芽させた後、DNAを抽出し、前記の合成
プライマーRA12−12を用いたポリメラーゼ連鎖反
応による検定結果を示す。電気泳動パターンから検定し
た14個体中、4個体に850bpのバンドが認められ
ず、これらは種子親自殖種子であると判定することがで
きた。
【0022】一方、図3は、簡便法により抽出したDN
Aを用いて行った結果を示したものである。図から明ら
かなように、この場合もCTAB法で抽出したDNAを
用いて行った場合と同様に、850bpのバンドはF1
個体に見られ、種子親には見られなかった。
Aを用いて行った結果を示したものである。図から明ら
かなように、この場合もCTAB法で抽出したDNAを
用いて行った場合と同様に、850bpのバンドはF1
個体に見られ、種子親には見られなかった。
【0023】図4には、別の組合わせである種子親Hc×
花粉親HdのF1種子について、前記の合成プライマーR
A12−12を用いて行ったポリメラーゼ連鎖反応の結
果を示す。図から明らかなように、F1種子では850
bpのバンドが見られるのに対し、種子親では見られな
かった。
花粉親HdのF1種子について、前記の合成プライマーR
A12−12を用いて行ったポリメラーゼ連鎖反応の結
果を示す。図から明らかなように、F1種子では850
bpのバンドが見られるのに対し、種子親では見られな
かった。
【0024】
【発明の効果】本発明によれば、スイカF1品種の識別
に用いる合成オリゴヌクレオチドが提供され、これを用
いることによりスイカ品種の識別とF1種子の純度検定
を高精度,高効率で実施することができる。本発明の実
施例に用いた親系統、都系×富研系の組合わせは、わが
国のスイカF1品種の作出に用いられる一般的な組合わ
せであり、F1品種‘富士光’種子生産以外にもHc×Hd
のF1種子生産等他の多くの組合わせにおいてもこのプ
ライマーによるF1種子の純度検定が可能である。した
がって、この手法の開発により、スイカ品種の識別とF
1種子の純度検定を迅速、正確、かつ容易に行うことが
できる。
に用いる合成オリゴヌクレオチドが提供され、これを用
いることによりスイカ品種の識別とF1種子の純度検定
を高精度,高効率で実施することができる。本発明の実
施例に用いた親系統、都系×富研系の組合わせは、わが
国のスイカF1品種の作出に用いられる一般的な組合わ
せであり、F1品種‘富士光’種子生産以外にもHc×Hd
のF1種子生産等他の多くの組合わせにおいてもこのプ
ライマーによるF1種子の純度検定が可能である。した
がって、この手法の開発により、スイカ品種の識別とF
1種子の純度検定を迅速、正確、かつ容易に行うことが
できる。
【図1】 合成オリゴヌクレオチドプライマーRA12
−12を用いて得られたスイカ親系統Ha,Hb およびその
F1のDNAの多型を示す電気泳動写真。図中、1〜5
が種子親Ha,6〜10がF1(Ha×Hb) 、富士光,11
〜15が花粉親Hbを示す。矢印は識別に利用する850
bpのバンドである。
−12を用いて得られたスイカ親系統Ha,Hb およびその
F1のDNAの多型を示す電気泳動写真。図中、1〜5
が種子親Ha,6〜10がF1(Ha×Hb) 、富士光,11
〜15が花粉親Hbを示す。矢印は識別に利用する850
bpのバンドである。
【図2】 合成オリゴヌクレオチドプライマーRA12
−12を用いた種子の検定を示す電気泳動写真。矢印は
識別に利用する850bpのバンドである。なお、写真
中の両側は分子量マーカーである。
−12を用いた種子の検定を示す電気泳動写真。矢印は
識別に利用する850bpのバンドである。なお、写真
中の両側は分子量マーカーである。
【図3】 簡便法で抽出したDNAについて行った種子
の検定を示す電気泳動写真。左側5個体は種子親Ha,右
側5個体は花粉親Hbを示す。矢印は識別に利用する85
0bpのバンドである。なお、写真中の右端は分子量マ
ーカーである。
の検定を示す電気泳動写真。左側5個体は種子親Ha,右
側5個体は花粉親Hbを示す。矢印は識別に利用する85
0bpのバンドである。なお、写真中の右端は分子量マ
ーカーである。
【図4】 合成オリゴヌクレオチドプライマーRA12
−12を用いて得られたスイカ種子親HcおよびそのF1
(Hc×Hd) のDNAの多型を示す電気泳動写真。矢印は
識別に利用する850bpのバンドである。なお、写真
中の左端は分子量マーカーであり、続く7個体は種子親
Hcを、残りの7個体はF1 (Hc×Hd) を示す。
−12を用いて得られたスイカ種子親HcおよびそのF1
(Hc×Hd) のDNAの多型を示す電気泳動写真。矢印は
識別に利用する850bpのバンドである。なお、写真
中の左端は分子量マーカーであり、続く7個体は種子親
Hcを、残りの7個体はF1 (Hc×Hd) を示す。
Claims (3)
- 【請求項1】 下記の配列を有する合成オリゴヌクレオ
チド。 5’−ACCACCTGGCTC−3’ - 【請求項2】 スイカより抽出したDNAを鋳型とし、
請求項1記載の合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメ
ラーゼ連鎖反応によりDNAの増幅を行い、得られた増
幅産物を電気泳動分析することを特徴とするスイカ品種
の識別方法。 - 【請求項3】 請求項2記載の方法により得た増幅産物
を電気泳動分析し、F1種子と種子親(母本)の自殖種
子を識別することによりスイカF1種子の純度を判定す
る方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4288119A JPH0716421B2 (ja) | 1992-10-05 | 1992-10-05 | スイカf1品種の識別に用いる合成オリゴヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4288119A JPH0716421B2 (ja) | 1992-10-05 | 1992-10-05 | スイカf1品種の識別に用いる合成オリゴヌクレオチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06189764A true JPH06189764A (ja) | 1994-07-12 |
JPH0716421B2 JPH0716421B2 (ja) | 1995-03-01 |
Family
ID=17726059
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4288119A Expired - Lifetime JPH0716421B2 (ja) | 1992-10-05 | 1992-10-05 | スイカf1品種の識別に用いる合成オリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0716421B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101014238B1 (ko) * | 2008-04-21 | 2011-02-17 | 대한민국 | 수박 f1 종자 순도 검정 방법 |
CN103399076A (zh) * | 2013-07-30 | 2013-11-20 | 山东省农作物种质资源中心 | 一种玉米种子纯度鉴定方法 |
-
1992
- 1992-10-05 JP JP4288119A patent/JPH0716421B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PROC.NATL.ACAD.SCI.USA=1990 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101014238B1 (ko) * | 2008-04-21 | 2011-02-17 | 대한민국 | 수박 f1 종자 순도 검정 방법 |
CN103399076A (zh) * | 2013-07-30 | 2013-11-20 | 山东省农作物种质资源中心 | 一种玉米种子纯度鉴定方法 |
CN103399076B (zh) * | 2013-07-30 | 2015-01-07 | 山东省农作物种质资源中心 | 一种玉米种子纯度鉴定方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0716421B2 (ja) | 1995-03-01 |
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EXPY | Cancellation because of completion of term |