KR101014238B1

KR101014238B1 - 수박 ｆ1 종자 순도 검정 방법

Info

Publication number: KR101014238B1
Application number: KR1020080036873A
Authority: KR
Inventors: 권용삼; 이승인; 김희열
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2008-04-21
Publication date: 2011-02-17
Also published as: KR20090111223A

Abstract

본 발명은 수박 F1 종자의 순도를 분자생물학적 기법에 의해 검정하는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 방법은 수박 F1 품종의 양친에 대해 다형성을 나타내는 프라이머 세트를 선별하고, 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 수박 F1으로부터 분리된 게놈 DNA를 증폭시키고 검출함으로써, 순도를 검정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존의 형태적 검정에 의한 양친의 교배 여부 판단 방법보다 분석시간, 제반 관리 비용 등을 절감시키는 효과가 있다.

수박, 순도검정, 키트

Description

수박 Ｆ1 종자 순도 검정 방법{A seed purity checking method for F1 hybrid of Citrullus lanatus}

본 연구는 농림수산식품부 농림기술관리센터의 농림기술개발연구과제의 일환으로 수행되었음[105085-03-1-CG000, 수박, 멜론의 품종 지문화 연구 및 순도검정 마커 개발].

본 발명은 수박 F1 종자 순도 검정 방법 및 수박 F1 종자 순도 검정용 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 수박 F1 품종의 양친에 대해 다형성을 나타내는 프라이머 세트를 선별하고, 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 수박 F1으로부터 분리된 게놈 DNA를 증폭시키고 검출함으로써, 수박 F1 종자의 순도를 검정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충용액(buffer)을 함유하는 수박 F1 종자 순도 검정용 키트에 관한 것이다.

박과 식물(Cucurbitaceae) 중 수박속(Citrullus) 식물은 남아프리카가 원산인 Citrullus lanatus, 북아프리카와 중동 원산인 Citrullus colocynthis, 서남 아프리카 원산인 Citrullus ecirrhosus와 Citrullus naudinianus, 인도 원산인 Citrullus fistulosus 5 종으로 분류되며, Citrullus lanatus는 var . lanatus와 var. lanatus 2종의 변종군으로 나누어진다. 우리가 식용으로 먹는 수박은 Citrullus lanatus var . lanatus에 포함되는 것으로 알려져 있다. 또한, 수박은 과형에 따라 타원형계와 원형계, 생장형에 따라 왜성형과 포복형으로 구분하고 있다.

한편, 우리나라에서 수박의 재배 면적은 2006년 기준 20,553 ha(노지:3718 ha, 시설:16,835 ha)이며, 생산량은 778,374 톤이 된다. 또한, 2007년 기준 수박의 수입 생산 판매 신고된 건수는 471품종, 품종보호출원 건수는 63품종, 등록설정된 품종은 28 품종일 정도로 종자 시장에서 차지하는 비중이 매우 큰 작물이다.

현재 종자회사에서 판매되고 있는 수박은 모두 양친을 고정시키고 이를 교배하여 양성된 일대 잡종(F1) 품종이 대부분이다. 이렇게 F1 품종을 재배하는 이유는 생산력의 증대가 확실하고 균일한 생산물을 얻을 수 있는 장점이 있기 때문이다. 그러나, 양친 교배시 타 화분의 오염, 모본(♀)만의 수정, 또는 다른 종자의 단순 혼입 등으로 인하여 순도가 떨어질 수 있다. 특히, 우리나라에서 재배되는 수박 품종들은 유전적 거리가 매우 좁기 때문에 이러한 순도와 관련하여 농가와 종자 회사간에 분쟁이 발생하기도 한다. 이에 F1 품종에서 생산된 종자에 대하여 순도검정을 실시하게 되고, 모든 종자회사는 F1 종자의 순도검정을 위한 자체 검정 시스템으로서 그 과정과 인력 및 시설을 기본적으로 유지하고 있다.

종자의 순도검정은 형태적 검정, 화학적 검정 및 전기영동에 의한 단백질 검정 방법을 주로 이용하고 있다. 그러나, 수박과 같이 양친 간에 유전적 유사도가 높거나 게놈의 크기가 큰 작물의 경우에는 이용하기가 거의 불가능하였다.

따라서, 현재 수박 F1 종자 순도검정에서는 양친 교배 후 F1의 형태적 관찰에 의한 포장검정을 수행하고 있는 실정이다. 실제 생산된 F1을 파종하여 재배시험을 통한 포장검정을 실시하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 재배면적과 인력이 많이 소요될 뿐만 아니라, 수박을 수확하여 양친과의 형태적 특성을 비교하기까지는 상당한 시간이 걸리기 때문에 실효성이 떨어지는 문제점이 있다. 또한, 양친과 F1의 형태적 검정에 의한 순도검정은 검정자의 주관적인 판단에 의하기 때문에 순도검정의 정확성이 떨어져 신뢰도를 줄 수 없다는 문제점이 있다.

최근에는, 이러한 형태적 검정의 관행에서 벗어나 분자생물학적 기술에 따라 수박 F1 종자의 순도검정을 실시하고 있다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)에는 RAPD(random amplified polymorphic DANs), AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA), SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성을 검출할 수 있지만 밴드의 재현성이 떨어지고 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatelite) 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체 분석이 용이하고 재현성이 높다는 장점이 있어, 품종식별, 유전자 지도 작성 또는 유전자원의 특성 평가 등에 널리 활용되고 있다.

수박의 경우에는 지금까지 개발된 초위성체 마커가 88개에 불과할 정도로 개발 초기 단계라고 할 수 있다. 이에 본 발명자는 수박 양친에 대해 다형성을 나타 내는 프라이머 세트를 선별하고, 이를 프라이머로 사용하여 수박 F1 게놈 DNA를 증폭시킨 후, 생성된 증폭 산물을 검출에 의해 확인함으로써, 수박 F1 종자의 순도를 손쉽게 검정할 수 있음을 밝혀, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 국내에서 유통되고 있는 수박 대표 품종의 양친에 대해 다형성을 보이는 프라이머 세트를 선별하고, 이를 수박 F1 종자 순도검정에 활용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 순도검정의 정확도를 높일 수 있고, 포장검정에 소요되는 인력, 비용 및 유통대기기간 등과 같은 원가 절감 효과를 얻을 수 있는 수박 F1 종자 순도검정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 수박 종자 생산에 분자생물학적 기술을 접목하여 실용화함으로써 농업인에 대해 신뢰도 높은 종자의 보급을 통한 소득 향상뿐만 아니라 품종 육종에 이용함으로써 품종 육성 효율을 높이고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 기술한 목적을 달성할 수 있는 수박 F1 종자 순도 검정용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내에서 유통되고 있는 수박 대표 품종의 양친에 대해 다형성을 보이는 프라이머 세트(서열번호 1 내지 22)를 사용하는 수박 일대 잡종(F1) 종자 순도검정 방법 및 수박 F1 종자 순도 검정용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명의 수박 F1 종자 순도검정 방법을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 수박 F1 종자 순도검정 방법은 수박 일대 잡종(F1)으로부터 유래된 F1 핵산 시료를 주형으로 하고 프라이머 세트(서열번호 1 내지 22)를 프라이머로 이용하여 상기 F1 핵산 시료를 증폭하고, 증폭된 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 수박 F1 종자 순도검정 방법에서 F1 종자의 핵산 시료는 게놈 DNA이다. 게놈 DNA는 직접 수박 종자로부터 DNA를 채취하는 방법 또는 식물로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는 수박 F1 종자를 파종하고 출아한 후 어린 식물체의 잎과 줄기로부터 DNA를 채취하는 것이 좋다. 순도검정 방법의 정확성을 높이기 위해서는 채취된 DNA를 증폭시킨 후 아가로즈 겔에 전기영동하여 DNA 증폭 여부를 확인한 다음 폴리아크릴아마이드 겔에서 검정하는 것이 더 바람직하다.

본 발명 순도검정 방법에서 프라이머로 사용된 프라이머 세트는 수박 양친으로부터 유래된 핵산에 대해 다형성을 나타낸다. 보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 수박 5개의 품종인 금천, 스피드, 스타꿀, 꿀보단 및 꼬마 품종의 부본(♂)과 모본(♀)에 대해 다형성을 나타내었다(도 1 참조). 이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트는 공우성(co-dominant) 마커 즉, 수박 양친에 대해 특이적이므로 수박 F1 개체에서 나타나는 두 개의 대립 유전자가 수박 양친으로부터 유래되었는지 여부를 명확히 판별할 수 있게 한다.

최근에 박과 작물인 멜론과 수박에서 여러 연구자에 의해 초위성체 마커 개 발에 대한 많은 연구가 진행되어 오고 있다. Danin-Poleg 등은 멜론과 오이에서 유래된 초위성체 마커 34개를 개발하였고(Danin-Poleg Y, Reis N, Tzuri G, Katzir N. 2001 Theor Appl Genet 102, 61-72), Chiba 등은 멜론 유래 초위성체 마커 31개를 개발하여 박과 작물에 상호 이용이 가능함을 구명하였다(Chiba N, Suwabe K, Nunome T, Hirai M, 2003 Breeding Science 53, 21-27). 최근에 Ritschel 등은 멜론 유래 SSR 마커를 144개 개발하여 이를 유전자원 특성 평가에 이용한 바 있으며(Ritschel PS, de Lima Lins TC, Tristan RL, Buso GSC, Buso JA, Ferreira ME. 2004 BMC Plant Biology 4, 1471-2229), Gonzalo 등도 멜론 유래 57개의 SSR 마커를 개발하여 유전자 지도 작성에 활용하였다(Gonzalo MJ, Oliver M, Garcia-Mas J, Monfort A, Dolcet-Sanjuan R, Katzir N, Monforte AJ. 2005 Theor Appl Genet 110:802-811). 그리고 수박 초위성체 마커는 미국에서 Jarret 등이 7개의 마커를 개발한 이후(Jarret RL, Merrick LC, Holms T, Evans J, Aradhya MK. 1997 Genome 40:433-441), 스페인에서 19개의 초위성체 마커가 개발됨을 보고하였고(Guerra-Sanz JM. 2002 Molecular Ecology Notes 2: 223-225), 최근에는 미국의 Joobeur 등이 38개의 마커를 개발하여 유전자원의 특성평가에 활용한 보고가 있다(Joobeur T, Gusmini G, Zhang X, Levi A, Xu Y, Wehner TC, Oliver M, Dean R. 2006 Theor Appl Genet 112:1553-1562). 그러나 수박 F1 종자의 순도 검정에 DNA 마커의 이용을 제시한 연구 결과는 아직까지 없는 실정이다. 따라서 멜론과 수박에서 유래된 프라이머들 중에서 대립 유전자의 밴드 패턴이 깨끗하면서 수박 F1 양친에 다형성을 나타내었던 것을 이용하였다.

바람직하게는, 본 발명의 프라이머 세트는 하기 표 1에 기재된 염기서열(서열번호 1 내지 22)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함한다. 더욱 바람직하게는 상기 프라이머 세트는 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14, 서열번호 15와 16, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 및 서열번호 21과 22의 세트로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

<표 1> 본 발명 프라이머 세트의 염기서열

서열번호	프라이머 이름	증폭산물의 크기(bp)	염기서열(5'→3')
1	CMBR139	232	정방향:5‘-AAA CGC ATC TTT CCA GTT AGG A- 3’
2			역방향:5‘-TCC AAA CCC ATC TCC ATT TC-3’
3	C.I.1-20	190	정방향:5‘-CGC GCG TGA GGA CCC TAT A-3’
4			역방향:5‘-AGC AAT TGA TTG AGG CGG TTC T-3’
5	TJ10	120	정방향:5‘-ACG AGG AAA ACG CAA AAT CA-3’
6			역방향:5‘-TGA ACG TGG ACG ACA TTT TT-3’
7	MCPI-3	218	정방향:5‘-GCA TAA ACC ACC TGT GAG TGG-3’
8			역방향:5‘-ATG GCT TTG CGT TTC ATT TC-3’
9	MCPI-7	249	정방향:5‘-GGT TAT GGC CAT CTC TCT GC-3’
10			역방향:5‘-GAG AGT GGG CGT AAG GTG AG-3’
11	MCPI-13	211	정방향:5‘-TTC CTG TTT CAT GAT TCT CCA C-3’
12			역방향:5‘-TCA GAA TGG AGC CAT TAA CTT G-3’
13	MCPI-14	240	정방향:5‘-TCA AAT CCA ACC AAA TAT TGC-3’
14			역방향:5‘-GAG AAG GAA ACA TCA CCA ACG-3’
15	MCPI-28	285	정방향:5‘-AAT GTT AAG CAG TAA GCA CAT GG-3’
16			역방향:5‘-ACA CCG GAG AAG GTG AAT TG-3’
17	MCPI-30	266	정방향:5‘-GCT TTG AAG TTT GTT TAA TTT TAG TCC-3’
18			역방향:5‘-CGC CTC ACG CTC TCT CTA AC-3’
19	MCPI-31	252	정방향:5‘-TAA CCG TCA CCA ACC CAT TC-3’
20			역방향:5‘-TCC AAA ATT GGT CGG ATT TG-3’
21	MCPI-32	264	정방향:5‘-AAG GCT GCA GAG ACC ATG AC-3’
22			역방향:5‘-AAT GAT GAA GAA CGG GCA AG-3’

본 발명에서 핵산 시료의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있 다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR 반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 수박 F1에서 추출된 게놈 DNA, 본 발명의 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액(buffer) 및 물(증류수를 포함)을 함유한다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유한다.

본 발명에서 상기 증폭된 핵산의 검출은 전기영동, 전기적 측정 및 광학적 측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의할 수 있다. 바람직하게는 증폭된 핵산을 전기영동에 의해 검출한다. 본 발명에서 전기영동시 사용하는 겔은 통상적으로 전기영동에서 사용할 수 있는 겔을 사용할 수 있고, 대표적인 예로 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔을 사용할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 전기영동 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 수박 F1 종자 순도검정 방법에서는, 수박 F1을 증폭시켰을 때 나타나는 밴드의 패턴을 분석함으로써, 순도 여부를 판단할 수 있다. 즉, 본 발명의 프라이머 세트는 수박 양친으로부터 유래된 대립 유전자의 초위성체(microsatelite)에 대해 다형성을 나타내었으므로, 각 품종 공히 유전형질이 고정된 부본과 모본 양친에서는 이들의 대립 유전자가 각각 단일(homozygous) 밴드 패턴으로 나타나게 된다. 수박 F1 종자의 핵산 시료를 증폭시켰을 때, 수박 양친에 서 나타났던 단일 밴드들이 heterogyzous한 상하 이중 밴드 형식으로 모두 나타나게 되면, 이 종자는 순도로 검정받게 된다. 다른 경우로서, 수박 F1 핵산을 증폭하였을 때 모본과 같은 형식의 대립 유전자만 단일 밴드 형식으로 나타난다면, 이 종자는 부본의 꽃가루가 수정되지 않은 모본만의 자식 개체라고 판단할 수 있게 된다. 또 다른 경우로서, 원래 부본에서 확인된 것과 다른 크기의 대립 유전자가 F1 개체에서 나타난다면, 이는 다른 부본의 꽃가루가 수정되거나, 교배 조합이 다른 이품종이 혼입된 것으로 검정할 수 있다. 따라서, 양친에 대한 검정과정 없이 F1 종자의 이형성(heterozygosity) 검정 결과만으로도 순도 여부를 판단할 수 있다.

본 발명은 순도검정 방법의 정확성을 높이기 위하여, 수박 F1의 양친(P)으로부터 유래된 P 핵산 시료를 주형으로 하고 프라이머 세트(서열번호 1 내지 22)를 프라이머로 이용하여 상기 P 핵산 시료를 증폭하고, 증폭된 P 핵산 시료를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 수박 F1 종자 순도검정 방법에서 F1의 양친(P)으로부터 유래된 P 핵산 시료는 게놈 DNA는 직접 수박 종자로부터 DNA를 채취하는 방법 또는 식물로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는 수박 F1 종자를 파종하고 출아한 후 어린 식물체의 잎과 줄기로부터 DNA를 채취하는 것이 좋다.

수박 양친과 F1 개체로부터 유래된 핵산 시료를 각각 증폭한 후, 동시에 전기영동하였을 때, 수박 양친에서 나타나는 단일 밴드들이 F1 개체에서 상하 이중 밴드 형식으로 모두 나타나게 되면, 이 수박 F1은 수박 양친만이 교배된 순도로 검정받을 수 있다.

이하, 본 발명의 수박 F1 종자 순도 검정용 키트를 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충용액(buffer)을 함유하는 수박 F1 종자 순도 검정용 키트를 제공한다. PCR 완충용액에 포함되는 성분들은 상기에서 기술한 바와 같다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 순도검정 방법은 분자표지에 기초한 검정 방법이므로, 포장검정에서 소요되는 재배면적, 인력 및 시간의 손실을 막을 수 있어 경제적인 문제점을 해결할 수 있다.

또한, 본 발명의 순도검정 방법은 검정자의 주관적인 판단에서 벗어나 DNA의 전기영동에 의한 객관적인 검정 방법이므로, 양친 교배 여부를 정확하게 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 순도검정 방법에서 사용된 프라이머 세트는 수박 양친에 대해 양친 특이적으로 발현되는 공우성 마커이기 때문에, 양친의 순도 유지에 적극적으로 활용될 수 있을 뿐만 아니라 기존에 활용되던 RAPD나 ISSR(inter simple sequence repeat) 마커보다 재현성이 높아 산업현장에서 실용적으로 활용 가능한 기술이다.

또한, 본 발명의 순도검정 방법은 수박품종으로 인한 농가와 종자 회사간의 종자 분쟁을 해결하는데 적극적으로 이용될 수 있다.

이하, 본원 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본원 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예: 수박 F1 종자 순도검정

(1) 핵산 시료 분리

수박 공시 품종(표 2)으로부터 핵산 시료를 분리하였다. 구체적으로, 어린 잎을 2 ml 시험관에 텅스텐 구슬 3개와 세포 용해 버퍼(lysis buffer)를 넣고 볼텍싱(vortexing) 과정을 반복하면서 충분히 마쇄한 다음 Nucleospin Plant kit(Machery-Nagel Cat No. 740.270.540)을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 2% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 DNA 농도를 정량하였다. PCR 하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

<표 2> 수박 F1 순도검정에 이용된 품종명

연번	품종명	분석개체수	연번	품종명	분석개체수
1	금천(♀)	5	7	스타꿀(♂)	5
2	금천(♂)	5	8	꿀보단(♀)	5
3	스피드(♀)	5	9	꿀보단(♂)	5
4	스피드(♂)	5	10	꿀보단 F1	56
5	스피드 F1	56	11	꼬마(♀)	5
6	스타꿀(♀)	5	12	꼬마(♂)	5

(2) 프라이머 세트의 선별 및 제작

멜론에서 유래된 분자표지 200개(Danin-poleg et al ., 2001, Ritschel et al., 2004, Gonzalo et al ., 2005)와 수박에서 유래된 초위성 마커 88개(Jarret et al ., 1996, Guera-Sanz et al ., 2002, Joobeur et al ., 2006)를 대상으로 하여, 국내에서 통상적으로 재배되는 수박의 5개 품종인 금천, 스피드, 스타꿀, 꿀보단 및 꼬마의 5개 품종(농우 바이오에서 육성됨)의 부본과 모본 각각 5개 개체에 대해 다형성을 보이는지 여부를 판단하였다. 총 264개 마커 중 11개 마커가 상기 5개 품종에 대해 다형성을 나타내었다. 그 결과를 도 1에 나타내었으며, 상기 11개 마커의 염기서열을 상기 표 1에 나타내었다.

도 1에서 살핀 바와 같이, 프라이머 세트 CMBR139는 스피드와 꿀보단 품종, 프라이머 세트 C.I.1-20은 금천, 스피드, 꼬마 품종, 프라이머 세트 TJ20은 금천, 스피드, 꿀보단 품종, 프라이머 세트 MCPI-03은 스피드, 꼬마 품종, 프라이머 세트 MCPI-07은 스타꿀, 꿀보단, 꼬마 품종, 프라이머 세트 MCPI-13은 스피드, 스타꿀, 꿀보단 품종, 프라이머 세트 MCPI-14는 금천, 꿀보단 품종, 프라이머 세트 MCPI-28은 금천, 스피드, 꿀보단 품종, 프라이머 세트 MCPI-30은 금천, 스피드 품종, 프라이머 세트 MCPI-31은 스피드, 꼬마 품종, 프라이머 세트 MCPI-32는 스피드, 스타꿀, 꿀보단, 꼬마 품종에서 다형성을 나타내어, 공시된 모든 품종의 순도 검정에 활용할 수 있는 것으로 판단하였다.

(3) PCR 및 순도검정

상기 준비된 게놈 DNA와 상기 제작된 프라이머 세트를 재료로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 상기 제작된 수박 게놈 DNA 20 ng, 0.1 μM의 상기 프라이머 세트, 2.0㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq polymerase 1U(Takara cAT. RR011A), 2.5 ㎕의 10 x PCR 버퍼(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl₂)에 증류수를 첨가하여 전체 부피를 20㎕로 조절하였다. PCR(Biometra, 독일) 증폭은 94℃에서 5분간 게놈 DNA를 충분히 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 50-58℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 과정으로 35회 반복 수행하였다. PCR 산물의 최종 신장을 위하여, 72℃에서 10분간 반응시켰으며, 어닐링의 온도는 각각의 프라이머 세트에 따라 50-58℃로 설정하여 수행하였다. PCR이 종료된 후, 2% 일반 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인하였고, 증폭된 시료들을 -20℃에서 보관하였다. 겔 분석은 PCR에 의해 증폭된 시료들을 요소가 포함된 6% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 1900 V로 2시간 정도 전기영동을 수행한 다음, Silver sequence ^TM staining reagents(Promega)를 이용하여 은 염색법으로 실시하였다.

이때 비교를 위하여 스피드와 꿀보단 두 품종의 양친과 동시에 전기영동을 실시하였으며, 그 결과를 도 2 내지 도 12에 나타내었다.

도 2 내지 도 12에서 살핀 바와 같이, 스피드와 꿀보단의 양친에서 각각 크기가 다른 대립 유전자들이 homozygous 형식으로 존재하고 있음을 확인하였다. 스피드와 꿀보단 수박 F1 종자에서는 양친에서 나타난 모든 대립 유전자들이 heterozygous 형식으로 존재하고 있음을 확인하였다. 따라서, 본 실시예에서 사용된 수박 F1 품종들은 모두 스피드 또는 꿀보단 품종의 순도임을 검정할 수 있었다. 도 3과 도 6의 초위성 마커는 양친에서 두 개의 대립 유전자가 검출되었는데 이는 초위성 마커의 특징의 하나인 여러 개의 대립 유전자가 출현됨을 확인할 수 있었으며, 자식성 작물인 벼에서도 특정 초위성 마커의 경우 자식성 개체에 대해 여러 개의 대립 유전자가 나타남을 권 등(Kwon, S.J. et al ., 2002, Korean J. Breed, 34 57-63)도 지적한 바 있다. 그러나 이들 마커에서도 양친간에 뚜렷한 다형성을 나타내며 F1에서 이형 접합성을 보여 수박 순도 검정에 큰 문제점이 없이 활용할 수 있음을 나타내고 있다.

도 1은 국내에서 유통중인 수박 5개 품종 금천, 스피드, 스타꿀, 꿀보단 및 꼬마의 부본(♂)과 모본(♀)에 대해 본 발명의 프라이머 세트가 다형성을 나타내었음을 검정한 결과이다.

도 2는 CMBR139 프라이머 세트에 의한 스피드와 꿀보단 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 C.I.1-20 프라이머 세트에 의한 스피드 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 TJ10 프라이머 세트에 의한 스피드와 꿀보단 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 MCPI-03 프라이머 세트에 의한 스피드 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 MCPI-07 프라이머 세트에 의한 꿀보단 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 MCPI-13 프라이머 세트에 의한 스피드와 꿀보단 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 MCPI-14 프라이머 세트에 의한 꿀보단 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 MCPI-28 프라이머 세트에 의한 스피드와 꿀보단 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 MCPI-30 프라이머 세트에 의한 스피드 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 MCPI-31 프라이머 세트에 의한 스피드 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 MCPI-32 프라이머 세트에 의한 스피드와 꿀보단 수박 F1 순도 검정을 폴리아크릴아미드 겔 시스템에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

<110> KOREA SEED and VARIETY SERVICE <120> A seed purity checking method for F1 hybrid of Citrullus lanatus <130> PN077840 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CMBR139 <400> 1 aaacgcatct ttccagttag ga 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CMBR139 <400> 2 tccaaaccca tctccatttc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for C.I.1-20 <400> 3 cgcgcgtgag gaccctata 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for C.I.1-20 <400> 4 agcaattgat tgaggcggtt ct 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TJ10 <400> 5 acgaggaaaa cgcaaaatca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TJ10 <400> 6 tgaacgtgga cgacattttt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCPI-3 <400> 7 gcataaacca cctgtgagtg g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCPI-3 <400> 8 atggctttgc gtttcatttc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCPI-7 <400> 9 ggttatggcc atctctctgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCPI-7 <400> 10 gagagtgggc gtaaggtgag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCPI-13 <400> 11 ttcctgtttc atgattctcc a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCPI-13 <400> 12 tcagaatgga gccattaact tg 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCPI-14 <400> 13 tcaaatccaa ccaaatattg c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCPI-14 <400> 14 gagaaggaaa catcaccaac g 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCPI-28 <400> 15 aatgttaagc agtaagcaca tgg 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCPI-28 <400> 16 acaccggaga aggtgaattg 20 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCPI-30 <400> 17 gctttgaagt ttgtttaatt ttagtcc 27 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCPI-30 <400> 18 cgcctcacgc tctctctaac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCPI-31 <400> 19 taaccgtcac caacccattc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCPI-31 <400> 20 tccaaaattg gtcggatttg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCPI-32 <400> 21 aaggctgcag agaccatgac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCPI-32 <400> 22 aatgatgaag aacgggcaag 20

Claims

삭제
수박 일대 잡종(F1)으로부터 유래된 F1 핵산 시료를 주형으로 하고,

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드의 CMBR139 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 스피드 또는 꿀보단 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드의 C.I.1-20 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 금천, 스피드 또는 꼬마 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드의 TJ10 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 금천, 스피드 또는 꿀보단 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드의 MCPI-3 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 꼬마 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드의 MCPI-7 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 스타꿀, 꿀보단 또는 꼬마 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드의 MCPI-13 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 스피드, 스타꿀 또는 꿀보단 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드의 MCPI-14 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 발현되는 금천 또는 꿀보단 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드의 MCPI-28 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 금천 또는 꿀보단 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드의 MCPI-30 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 금천 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ;

서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드의 MCPI-31 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 꼬마 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트 ; 및

서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드의 MCPI-32 프라이머 세트로 구성되며 양친에 대해 다형성을 나타내는 스타꿀, 꿀보단 또는 꼬마 수박품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머 세트를 이용하여 상기 F1 핵산 시료를 증폭하고, 증폭된 핵산을 검출하여 heterozygous 형식으로 존재하는지 확인하는 단계를 포함하는, 상기 프라이머 세트로 검정이 가능한 것으로 기재된 수박 품종의 일대 잡종 종자 순도검정 방법.
제2항에 있어서, 상기 핵산 시료가 잎, 종자 또는 줄기에서 유래된 핵산 게놈 DNA인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 수박 F1의 양친(P)으로부터 유래된 P 핵산 시료를 주형으로 하고 제2항에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 상기 P 핵산 시료를 증폭하고, 증폭된 P 핵산 시료를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
하나 이상의 제2항에 기재된 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충용액(buffer)을 함유하는, 상기 프라이머 세트로 순도 검정이 가능한 것으로 제2항에 기재된 수박 품종의 일대 잡종 종자 순도 검정용 키트.