KR100652501B1

KR100652501B1 - 금싸라기 계통 참외의 에프1 종자 순도검정방법

Info

Publication number: KR100652501B1
Application number: KR1020050050672A
Authority: KR
Inventors: 이승인; 권용삼; 송인호
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2004-10-27
Filing date: 2005-06-14
Publication date: 2006-12-01
Also published as: KR20060046434A

Abstract

본 발명은 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 일대잡종(F1) 종자의 게놈(genome) DNA를 금싸라기 계통 참외의 특이 DNA 마커로부터 설계된 프라이머와 PCR(polymerase chain reaction) 반응에 의하여 증폭시킨 후, 이를 겔(gel)에서 전기영동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 금싸라기 계통 참외의 일대잡종(F₁)종자 순도검정에 적용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 국내 거의 모든 금싸라기 계통 참외품종에 대하여 포장에서 재배시험으로 수행하던 종자순도검정을 실내검정으로 전환할 수 있으며, 검정에 대한 신뢰도 향상은 물론 검정 소요기간을 수개월에서 수일내로 단축함으로써 관련 종자산업 분야 전체에서 포장ㆍ관리인력 절감, 유통 대기시간 단축 등에 따른 생산비 원가절감 효과가 있다.

종자의 순도검정, SSR(simple sequence repeats), 유전자 마커(DNA maker), PCR(polymerase chain reaction) 반응, 금싸라기 참외

Description

금싸라기 계통 참외의 에프1 종자 순도검정방법{A HYBRID PURITY CHECKING METHOD FOR F1 SEEDS OF GEUMSSARAKI TYPE'S ORIENTAL MELON}

도 1은 국내 유통중인 금싸라기 계통 참외의 주요 품종의 양친과 F1 종자에 대한 순도검정용 DNA 마커의 적용성 검정결과이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 금싸라기 계통 참외의 F1 종자순도검정을 위한 폴리아크릴아마이드 겔 시스템에서의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 금싸라기 계통 참외의 F1 종자순도검정을 위한 아가로스 겔 시스템에서의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 금싸라기 계통 참외의 F1 종자순도검정을 위하여 종자에서 직접 DNA를 채취하여 아가로스 겔 시스템에서의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내 거의 모든 금싸라기 계통 참외품종에 대하여 포장에서 재배시험으로 수행하던 종자순도검정을 실내검정으로 전환할 수 있으며, 검정에 대한 신뢰도 향상은 물론 검정 소요기간을 수개월에서 수일내로 단축함으로써 우리나라 종자산업 분야 전체에서 포장ㆍ관리인력 절감, 유통 대기시간 단축 등에 따른 생산비 원가절감의 효과를 얻을 수 있는 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법에 관한 것이다.

참외는 멜론과 함께 박과류 (Cucurbitaceae) 1년생 채소작물로서 식물분류학상으로는 동일하게 Cucumis melo L. (2n=24)에 속하며, 동서양을 막론하고 소비가 많은 중요한 과채류 작물중 하나이다. 참외 (oriental melon 혹은 sweet melon)는 삼국시대부터 재배되었으며 우리나라에서 특산품종화 되었다. 우리나라 참외의 품종개발 역사는 재래종 참외 재배단계에서 '금싸라기은천'이라는 교배종 참외가 나오기까지로 정리할 수 있으며, 그 과정이 대부분 최근 50 여년 사이에 이루어졌다.

금싸라기은천 참외는 이전 품종들과 달리 단성화로 생리적 특성이 전환된 것이 가장 큰 특징이며, 당도가 높고 육질의 기호도와 저장성을 높여 전반적인 품질의 향상을 가져와 소비량 감소로 급격히 줄어들던 재배면적을 확대시키면서 참외가 우리나라 대표적인 과채류의 하나로 자리 잡게 되는 계기가 되었다. 금싸라기은천 품종이 소비자에게 심어준 강한 인상은 참외에 대한 상품적, 작물학적 가치 기준의 고정화로 이어져서 필연적으로 품종의 단순화를 촉발하였고, 이후 개발된 유사 품종들을'금싸라기'계통이라 통칭하게 되었다. 현재 우리나라 시장에서는 여러 종자회사에서 개발된'금싸라기'계통 품종들이 유통의 절대 다수를 차지하고 있는 실정이다. 현재 참외는 재배면적과 생산액 기준으로도 국내 10대 채소작물의 하나로 꼽힌다.

현재 유통 중인 참외는 거의 모두 양친의 교배를 통하여 생산된 일대잡종품종들이다. 일대잡종품종에서는 생산된 종자에 대하여 순도검정을 실시하게 되는데, 이는 의도하는 양친간 교배의 성립여부, 즉 이형성(heterozygosity)을 검정하고 그 정도를 순도(%)로서 표시하는 품질관리 행위를 말한다. 이와 관련하여 순도가 떨어지는 원인으로는 수정 시 타화분의 오염과 모본의 자식, 다른 종자의 단순 혼입 등이 있을 수 있다. 이 중에서 모본의 자식 개체 발생의 경우가 빈도가 가장 높은 것으로 알려져 있다. 따라서 모든 종자회사는 F₁ 종자의 순도검정을 위한 자체 검정 시스템으로서 그 과정과 인력, 시설을 기본적으로 유지하고 있다. 이는 해당 교배종 품종의 기본 유전적 특성을 유지시키는 품질관리 차원으로서 뿐만 아니라, 고품질 농산물의 재배 생산을 위하여 필수적인 고순도 종자를 확보하기 위한 기술적 수단이며, 종자의 품질 저하에서 초래되는 재배농민의 소득저하와 민원발생 요인을 원천적으로 방지하는 효과 등 매우 중요한 의미를 갖는 과정이다.

더구나 최근 해외 위탁채종이 대부분인 상황에서 종자회사로서는 생산된 종자의 품질관리를 항상 염려하는 바, F₁ 종자의 순도검정은 그 일환으로써 중요성이 강조된다. 이에 따라 잡종강세를 이용하는 교잡육종이 일반화된 채소작물에서 적절한 순도검정 수단의 확보는 종자산업계 입장에서 매우 요청되는 사항이다. 우리나라 종자산업 법에서는 채소작물의 경우 종자관리요강 4장(종자의 보증) 12조(포장검사 등의 검사기준)에 의거 포장검사 시 품종순도 98% 이상의 최저한도를 요구하고 있다.

초기에 모든 일대잡종(F₁) 품종의 종자의 순도검정은 종자관리요강에 규정되어 있듯 기본적으로 재배시험을 이용한 포장검정으로 이루어 졌다. 이는 시간과 소요 시설ㆍ경비 등 측면에서 매우 비효율적인 방법으로, 이후 작물의 생화학 혹은 유전적 특성을 이용하는 실험실적 방법으로 전환되었다. 이와 관련하여 지금까지 알려진 종자순도검정 방법으로는, 동위효소(isozyme)나 종실 저장단백질 등 단백질 성분에 대한 starch 겔 전기영동법, polyacrylamide 겔 전기영동법(PAGE), 그리고 IEF(isoelectric focussing) 법 등이 알려져 있다. 십자화과를 포함한 많은 채소작물에서는 일찍이 순도검정을 목적으로 한 동위효소에 대한 연구가 많이 이루어져 이를 마커로 활용한 PAGE 기법이 용이하게 사용되어 지고 있다.

그러나 참외ㆍ멜론 및 수박을 포함한 박과류의 일부 작물에서는 일반적으로 양친간 유전적 유사도가 높아 다형성을 보이는 동위효소를 확보할 수 없기 때문에 이를 종자 순도검정에 이용하고 있지 못하다. 따라서 참외의 경우 국내 모든 종자회사에서는 과거 관행적 방법에서 벗어나지 못하고 여전히 포장검정을 수행하고 있는 실정이다. 실제 생산된 F₁ 종자를 재파종하여 재배시험을 통한 포장검정을 실시할 경우에는 일반적으로 과실 특성 등을 확인하기 까지 최소 2개월 이상의 시간이 소용되는 실정이며, 채종농가 별로 100∼200 립 정도의 시료 종자를 대상으로 실시하고 있는 실정에 비추어, 이럴 경우 소요시설과 관리인력 및 시간비용은 상당한 원가부담으로 작용하고 있다.

따라서 산업현장에서는 이에 대한 대안으로 RAPD(randomly amplyfied polymorphic DNAs), ISSR(inter-simple sequence repeats) 등 비특이 DNA 마커를 품종별로 개발하여 이용하고자 시도하고 있다. 그러나 이 또한 품종별로 별도의 마커를 개발하는데 따른 시간, 경비 등 투자요소의 비효율성과 비특이 DNA 마커 사용시 예상되는 결과의 신뢰성 및 재현성 부족 등의 이유로 포장검정에 비하여 상대적 효용성을 확보하기가 어려워 실용화 단계에 이르지 못하고 있는 실정이며, 국내 여건상 종자회사 및 다른 연구집단 차원에서 이 분야에 대한 본격적인 연구와 투자를 진행하고 있지는 못하다.

따라서 간편하면서도 실용적인 참외의 F1 종자 순도검정을 위한 시스템의 개발이 필요한 실정이다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 금싸라기 계통 참외의 회사별 또는 품종별 개별성의 한계를 극복하며 품종 전반에 대하여 F₁순도검정을 포장검정에서 실내검정으로 전환시킬 수 있는 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 순도검정의 결과에 대한 신뢰도 향상은 물론 소요기간 면에서도 대폭 단축함으로써 관리인력 절감, 시간 단축, 비용 절감, 유통 대기기간의 단축, 원가절감 등의 효과를 얻을 수 있는 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 종자산업분야에 생명공학기술을 참외의 종자사업에 접목하여 실용화함으로써 우리나라 생명공학기술의 진보와 참외 육종분야에서의 독보적 위치 를 확보하도록 하여 종자산업에 있어 품종육성 효율을 높이는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법에 있어서, 일대잡종(F1) 종자의 게놈(genome) DNA를 염기서열목록 제1로 표시되는 DNA 마커로부터 설계된 프라이머와 PCR(polymerase chain reaction) 반응에 의하여 증폭시킨 후, 이를 겔(gel)에서 전기영동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법을 제공한다.

본 발명자들은 금싸라기 계통 참외의 일대잡종(F1) 품종들에서 공우성 대립유전자에 대한 heterozygous한 패턴을 보이는 DNA 마커를 개발하고 이 마커로부터 설계된 프라이머를 금싸라기 계통 참외의 F₁종자 순도검정에 사용할 수 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 구현한 기술적 개념을 설명하면 다음과 같다. 일대잡종(F₁) 품종을 이용하는 채소작물의 품종집단에서 이에 속하는 개별 품종들의 품종간 유전적 최소거리가 짧을 경우 SSR과 같은 공우성(codominant) DNA 마커에 대하여 다음과 같은 형식의 특이마커가 존재할 수 있다. 즉, 이 특이마커가 개별 일대잡종(F₁)품종들에서는 모두 동일한 형식으로 공우성 대립유전자(codominant allele)의 heterozygous(이중 밴드) 패턴을 나타내며, 동시에 각 품종 공히 유전형질이 고정된 모ㆍ부본 양친에서는 이들 대립유전자가 각각 homozygous 패턴(단일 밴드)으로 나타날 경우를 상정하면, 이 마커는 양친간 수정 혹은 그에 따른 유전물질의 교환을 확인할 수 있는 수단으로서 활용이 가능함을 알 수 있다. 그러나 비특이 마커인 경우에는, 품종별로 단순 불규칙 다형성을 나타내거나 혹은 마커에 의하여 나타난 양친의 대립유전자(의 크기)가 동일하여 다형성이 없을 경우는 이들 교배 후대인 F₁품종에서도 homozygous 패턴을 보일 것이므로 양친간 유전물질의 교환을 확인할 수 없을 것이다.

이와 같이 F₁개체의 heterozygosity를 검정함으로써 양친간 유전물질의 교환 여부를 확인할 수 있는 원리를 해당 작물의 F₁종자 개체들의 순도검정(hybrid purity check)에 적용할 경우, 부본 꽃가루의 수정 여부를 이로부터 유래된 대립유전자가 모본에서 수확된 F₁ 종자 개체들에서 존재하는지 여부를 검정하여 확인할 수 있다. 예를 들면, 정상적으로 수정된 F₁종자에서는 heterozygous 형식의 대립유전자가 관찰되는 경우에, 만약 모본과 같은 형식의 대립유전자가 homozygous 패턴으로 나오는 종자가 관찰된다면, 이것은 부본의 꽃가루가 수정되지 않은 모본의 자식개체인 경우이다. 또한 원래 부본에서 확인된 것과 다른 (크기의) 대립유전자가 F₁ 개체에서 확인되면 다른 부본의 꽃가루가 수정된 경우이거나, 교배조합이 다른 이품종(異品種)의 기계적 혼입인 경우이다.(꽃가루가 수정되지 않는 종자는 퇴화하여 발생하지 않는다.) 특히 이 경우에 특정 특이마커가 존재하여 품종간 최소거리가 짧은 전체 품종집단의 F₁품종들에서 이와 같이 heterozygosity를 노출시킬 수 있다 면, 이 마커는 순도검정 목적으로 단일 마커로서 해당 품종집단에 범용으로 적용할 수 있는 특성을 갖게 될 것이다.

본 발명에서는 위와 같은 개념적 전제 하에, 우리나라 재래종 참외인'깐치'에서 금싸라기 계통 참외의 거의 전 품종(F₁)에 대하여 일정하게 heterozygous 패턴의 대립유전자(allelic band)를 보여주는 특이 DNA 마커를 개발하였다(염기서열목록 제 1로 표시되는 DNA 클론). 또한 상기 마커에 의하여 금싸라기 참외의 확인 가능한 양친과 그 F₁품종에서 대립유전자의 homozygous와 heterozygous 패턴 관계를 관찰함으로써 양친 식물체의 수정에 따른 유전물질의 교환여부를 확인할 수 있다. 또한 상기 마커를 금싸라기 계통 참외 품종의 종자 순도검정에 적용할 경우 단일 마커 시스템으로 거의 전 금싸라기 품종에 범용으로 적용 가능하다.

본 발명은 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법에 있어서, 염기서열목록 제1로 표시되는 DNA 마커로부터 설계된 프라이머를 일대잡종(F1) 종자의 게놈(genome) DNA와 PCR(polymerase chain reaction) 반응에 의하여 증폭시킨 후, 이를 겔(gel)에서 전기영동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 DNA 마커는 서열 중간에 [CT]의 서열 단위가 14회 반복(simple sequence repeats)되는 micro-satellite 클론임을 알 수 있다. SSR 마커는 단위 서열의 반복 횟수의 차이에 의하여 품종간 다형성이 나타나므로, 이 부분을 중심으로 양단에서 임의의 위치로부터도 genomic DNA PCR을 위한 프라이머를 제작할 수 있다.

바람직하게는 상기 프라이머는 하기 표 1에 기재된 염기서열목록 제2 내지 제9로 표시되는 프라이머로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 프라이머인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 상기 프라이머는 2와 3, 4와 5, 6과 7, 및 8과 9의 4가지 쌍(pair)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 프라이머인 것이 좋으며, 가장 바람직하게는 염기서열목록 2와 3을 사용하는 것이 좋다.

[표 1]

염기서열목록 No	프라이머 명	크기(bp)	증폭산물의 크기(bp)	서 열
2	CMGG 70F	23	257	TTC ATG CAC CCT TCA TTC TCG AC
3	CMGG 70R	25	257	CGC TGA CTA GGA TGT TTA GCT ACA A
4	CMGG 68F	21	203	TCT TTG GAG GCC GGT CAT ATC
5	CMGG 68R	25	203	ATT AGC GAA AAC AAA AGG AAG TAG C
6	CMGG 48F	22	222	TCT TTG GAG GCC GGT CAT ATC G
7	CMGG 48R	24	222	ATG GAA ATA TCC CCC TCA AAT TAG
8	CMGG 18F	23	192	CGC CAT CGA TCT CCT CCG TCT TC
9	CMGG 18R	25	192	AAA TAT CCC CCT CAA ATT AGC GAA A

또한 본 발명의 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법에서 F1 종자의 genomic DNA 채취는 직접 참외 종자로부터 DNA를 채취하거나 통상적인 채소의 DNA 채취방법이 사용될 수 있음은 물론이며, 바람직하게는 F1 종자의 파종을 한 다음 출아 후 5일 정도된 유식물체의 DNA를 채취하는 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 채취된 DNA를 증폭시킨 후 아라로즈 겔에 걸어서 균일성을 검증한 것을 사용하는 것이 좋다.

또한 본 발명의 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법에서 전기영동시 사용하는 상기 겔은 통상적으로 전기영동에서 사용할 수 있는 겔들이 사용할 수 있는 겔들이 사용됨은 물론이며, 대표적인 예로 폴리아크릴아마이드 겔을 들 수 있 다. 특히 상기 제2 또는 제3 으로 표시되는 프라이머의 경우에는 아가로즈 겔을 사용할 수 있다. 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동을 할 경우에는 손쉽게 분석을 할 수 있어 폴이아크릴아마이드 겔 분석시 필요한 특별한 분석도구 및 시설, 기술 등이 필요하지 않으며, 분석 소요시간을 획기적으로 줄일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 발명의 금싸라기 계통 참외의 특이 마커는 다음과 같은 방법으로 개발되었다.

a) 5'- anchored PCR 방법을 이용한 SSR - enriched library 제작 및 클론의 분리

재래 고정종'깐치'참외에서 분리한 genomic DNA를 재료로 degenerate primer PCT4, KKVRVRV(CT)₆를 이용하여 5'- anchored PCR을 실시하였다. 반응액 조성은 깐치의 genomic DNA (30 ng), primer PCT4 (50 uM), 2 ㎕의 dNTPs (2.5 mM), Taq DNA polymerase(1 U)에 PCR 완충액과 멸균수를 첨가하여 25 ㎕로 맞추어 수행하였다. PCR 증폭은 90 ℃ (3분), 5 cycle의 93 ℃/59 ℃/72 ℃ (각 30초), 35cycle의 93 ℃/57 ℃/72 ℃ (각 30초), 1 cycle의 72 ℃ (2분)으로 진행하였다. 상기 산물은 아가로스 겔에서 반응을 확인하고 크기별로 정제하여 pGEM-T Easy cloning vector (Promega)에 삽입하였다. 이를 E.coli에 형질전환시켜 SSR - enriched library를 만들었다. 각 클론을 배양하고 플라스미드(plasmid) DNA를 분리ㆍ절단하여 삽입단편을 확인 후 염기서열을 결정하였다. 이 자료를 근거로 프라이머에 포함된 반복염기서열(SSR)과 PCR 반응의 특이성을 확인할 수 있었다. 이로부터 SSR의 반복단위 수가 8개 이상으로 품종간 다형성 형성율이 높을 것으로 예상되는 클론만을 선정하여 해당 SSR 부위를 중심으로 결정된 염기서열 쪽 한편 프라이머를 특이화하였다. 추후 chromosome working 방법의 적용을 위하여 한편에서 두개의 특이 프라이머(CMGG 70R, CMGG 68R)를 확보하였다.

b) Chromosome working 방법을 이용한 클론의 분리

SSR을 포함하는 전체 클론을 확보하여 중심서열(core motif)을 정확히 동정하고 다른 한쪽 프라이머를 특이화 하기 위해 Genome Walker^TM Kit (BD Bioscience)를 이용한 PCR-based cromosome working을 실시하였다. 먼저 깐치 genomic DNA 25 ㎕ (0.1 ㎍/㎕)를 4가지 제한효소 DraⅠ, EcoRⅤ, PvuⅡ, StuⅠ각 8 ㎕ (10 U/㎕)를 사용하여 100 ㎕ 반응액에서 절단하고 페놀(phenol)을 처리하여 정제한 후 최종 TE buffer 20 ㎕에 녹였다. 다시 각 제한효소 처리액에 Genome Walker Adaptor를 연결(ligation)하여 최종적으로 4가지 제한효소로 절단된 깐치 genomic DNA의 Genome Walker library를 완성하였다. 먼저 각 DNA library 1 ㎕을 주형으로 CMGG 70R과 Adaptor primer 1 (AP1)을 이용하여 1차 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 two-step 방식으로 94 ℃ 25초, 72 ℃ 1분에서 7 cycle 반응 후, 94 ℃ 25 초, 67 ℃ 1 분에서 30 cycle, 이후 67 ℃, 7 분으로 수행하였다. 다시, 1차 PCR 반응산물 희석액(50배), 1㎕에 대하여 CMGG 68R과 AP2를 사용하여 2차 PCR 반응을 실시하였다(동일 PCR 조건). 반응의 결과는 아가로스 겔에서 확인하였다. 각 제한효소에 해당하는 DNA library별로 PCR 산물이 뚜렷한 반응액을 선정하여 low melting gel과 gel elution kit를 이용하여 PCR 반응산물을 정제하였다. 이를 pGEM-T Easy cloning vector (Promega)에 삽입하고, E.coli에 형질변환시킨 후, 배양된 각 클론에서 플라스미드(plasmid) DNA를 분리, 절단하여 삽입단편을 확인하고 염기서열을 결정하였다.

c) 금싸라기 계통 특이 SSR마커 클론의 선발 및 순도검정 프라이머 제작

5'- anchored PCR 클론과 chromosome walking 클론에서 얻어진 염기서열 결과를 비교분석하여 contig를 제작하고 반복서열을 포함하는 전체 SSR 클론을 완성할 수 있었다(염기서열목록 1). 이를 바탕으로 각 SSR 클론의 염기서열을 재분석하여 기존에 제작된 GSPs 반대쪽에서 상대되는 프라이머(CMGG 70F)를 제작하고 최종적으로 해당 SSR 마커에 대한 양쪽 특이 프라이머를 완성하였다. 품종별 다형성 검정 PCR 반응은 CMGG 70F, CMGG 68R 혹은 CMGG 70R을 이용하여 실시하였다. 품종별 다형성 검정 결과, 염기서열목록 제1로 표시되는 DNA 마커는 1381 bp이며, 금싸라기 계통 참외에 특이적인 heterozygous 형식의 대립유전자를 나타내는 마커인 것으로 밝혀졌다.

상기 DNA 클론의 염기서열을 바탕으로 금싸라기 계통 참외 종자순도검정을 위하여 기존의 특이 프라이머 CMGG 70F와 CMGG 68R을 포함한 가능한 프라이머 조합 의 예로서 증폭산물의 크기별로 Oligo Ver.6(Molecular Biology Insigfts) Primer Analysis Software를 이용하여 상기 1에 기재된 프라이머들을 제작하였다.

[실시예 2]

상기 실시예 1에서 제작된 프라이머들 중 CMGG 70F, R을 이용하여 국내에 유통중인 참외의 품종별 적용성 여부를 다음과 같이 검정하였다.

시료종자는 하기 표 2에 기재된 종자를 페트리디쉬에서 3∼5일 정도 발아시켜 유식물체를 확보하고 개체별로 따로 DNA를 분리하였다. 준비된 genomic DNA와 제작된 CMGG 70F, R을 재료로 PCR을 실시하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다. genomic DNA 50 ng, 양단의 프라이머 각 10 pM, 2 ㎕ dNTPs(각 2.5 mM), Taq polymerase 1U에 PCR 버퍼와 증류수를 첨가 25㎕ 반응액에서 94 ℃ 2분 처리/ 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초를 1회로 35회 증폭반응/ 72℃ 2분 처리하였다. 반응이 끝난 산물은 일반 아가로스 겔에서 반응여부와 농도를 확인한 후, 겔 전기영동을 수행하였다. 겔 분석은 요소가 포함된 6 % denaturing acrylamide gel(35x45 ㎝)에서 실시하였다. 0.5x TBE 완충용액을 사용하여 60 W에서 약 150분 전기영동 한 후, Silver sequence^TM staining reagents (Promega)를 이용하여 염색하였다. 이때 양친이 있는 일대잡종품종인 경우 비교를 위하여 양친과 나란히 전기영동을 실시하였으며, 그 결과는 표2 및 도 1에 나타내었다.

[표 2]

레인	품종번호	품종명	회사명	대립유전자 유전형	적용성	품종계통	비고
1	1	금싸라기(모)	세미니스코리아	Homo
2		(부)	"	Homo
3		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기
4	2	금싸라기2(모)	"	Homo
5		(부)	"	Homo
6		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기
7	3	슈퍼금싸라기(모)	"	Homo
8		(부)	"	Homo
9		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기
10	4	황금알(모)	"	Homo
11		(부)	"	Homo
12		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기
13	5	시교2(모)	"	Homo
14		(부)	"	Homo
15		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기	미발표품종
16	6	스타금지게(모)	동부한농	Homo
17		(부)	"	Homo
18		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기
19	7	슈퍼금동이(모)	"	Homo
20		(부)	"	Homo
21		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기
22	8	금동이(모)	"	Homo
23		(부)	"	Homo
24		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기
25	9	대황(모)	"	Homo
26		(부)	"	Homo
27		(F1)	"	Hetero	O	금싸라기
28	10	시교1(모)	세미니스코리아	Homo
29		(부)	"	Homo
30		(F1)	"	Homo	X	금싸라기	미발표품종

31	11	금관(모)	"	Homo
32		(부)	"	Homo
33		(F1)	"	Homo	X	금싸라기
34	12	통일황	농우바이오	Hetero	O	금싸라기
35	13	금황	"	Hetero	O	금싸라기
36	14	사계절꿀	"	Hetero	O	금싸라기
37	15	금노다지	"	Hetero	O	금싸라기
38	16	황진이	"	Hetero	O	금싸라기
39	17	007꿀	"	Hetero	O	금싸라기
40	18	금보라	세미니스코리아	Hetero	O	금싸라기
41	19	금괴	신젠타종묘	Hetero	O	금싸라기
42	20	금보따리	"	Hetero	O	금싸라기
43	21	금미	"	Hetero	O	금싸라기
44	22	다이아몬드	"	Hetero	O	금싸라기
45	23	고향	농우바이오	Hetero	O	금싸라기
46	24	슈퍼골드	세미니스코리아	Hetero	O	금싸라기
47	25	오복꿀	농우바이오	Hetero	O	금싸라기
48	26	돌풍꿀	"	Hetero	O	금싸라기
49	27	슈퍼성주꿀	동부한농	Hetero	O	금싸라기
50	28	성주꿀	"	Homo	X	금싸라기
51	29	금제	아시아종묘	Hetero	O	금싸라기
52	30	온마을	사카타종묘	Hetero	O	금싸라기
53	31	황금꿀	대농종묘	Hetero	O	금싸라기
54	32	신천지꿀	"	Hetero	O	금싸라기
55	33	황금맥	뉴서울종묘	Hetero	O	금싸라기
56	34	황금도끼	현대종묘	Hetero	O	금싸라기
57	35	순금덩어리	제일종묘농산	Hetero	O	금싸라기
58	36	슈퍼금덩어리	"	Hetero	O	금싸라기
59	37	슈퍼황금덩어리	"	Hetero	O	금싸라기
60	38	노랑꿀	신젠타종묘	Hetero	O	금싸라기
61	39	골든볼	"	Hetero	O	금싸라기
62	40	개구리	(재래종)	Homo	X	재래고정종	참고품종
63	41	깐치	(재래종)	Homo	X	재래고정종	참고품종
64	42	가야꿀	농우바이오	Homo	X	멜론형 참외 (F₁)	참고품종
65	43	참왕	원예연구소	Homo	X	멜론형 참외 (F₁)	참고품종
66	44	금항아리	원예연구소	Homo	X	멜론형 참외 (F₁)	참고품종

상기 표 3 및 도 1에 나타난 검정결과를 요약하면 다음과 같다.

일대잡종(F₁)품종의 양친은 두 군데 종자회사(세미니스코리아, 동부한농화학)에서 11개 품종을 확보하였으며 그 중 9 품종(레인 1∼27)의 양친에서 각기 크기가 다른 대립유전자가 homozygous 형식으로 존재하고 있음을 확인하였다. 양친 의 유전적 특성을 반영한 F₁종자에서는 예외 없이 모두 heterozygous 밴드 패턴(상하 이중 밴드)을 보여 종자순도검정에 적용 가능한 것으로 밝혀졌다. 그러나 다른 두 품종에서는 양친 모두 동일한 대립유전자가 homozygous 형식으로 존재하여 이들의 일대잡종품종에서 순도검정에 필요한 이형성(heterozygosity)을 나타낼 수 없었다(레인 30 및 33). 이는 본 발명의 특이마커의 예외로 인정되며 따라서 종자순도검정 목적에 적용할 수 없는 품종으로 나타났다.

또한 양친 없이 F₁종자만 검정된 28개 품종(레인 34∼61)에 대하여도 heterozygous 밴드 패턴을 보인 27개 품종에 대하여는 순도검정이 적용 가능한 품종임을 알 수 있었다. 이는 앞으로 양친에 대한 검정과정 없이 F₁종자의 이형성(heterozygosity) 검정 결과만으로도 순도검정 적용성 여부를 판정할 수 있음을 나타낸다.

또한 참고품종으로 포함된 비금싸라기 계통 5 품종(레인 62∼66)에 대하여는 F₁품종임에도 불구하고 모두 homozygous 밴드 패턴을 보여 적용할 수 없음을 알 수 있다. 이는 본 발명에서 개발된 SSR 마커는 비금싸라기 계통 품종에는 적용되지 않는 금싸라기 계통 특이마커이며, 지금까지 분석된 전체 금싸라기 계통 참외 39품종 중 36품종에 범용(92.3 %)으로 적용 가능한 것으로 판정되었다. 또한 양친과 함께 검정된 품종번호 5번과 10번의'시교2'와 '시교1'은 모두 개발완료 단계의 미발표(미유통ㆍ미명명) 품종으로(2004년 9월 30일 현재), 이와 같이 차후 개발될 금싸라기 계통 품종에도 역시 본 발명에서 개발된 특이 마커를 적용할 경우 순도검정 이 가능함을 확인하였다.

[실시예 3]

양친의 교배과정을 통하여 생산된 '금싸라기은천' 품종 143개의 F₁식물체에 대한 실제 순도검정 실험을 하였다. 먼저 시료 종자를 발아시켜 유식물체에서 DNA를 분리하고, 상기 DNA와 본 발명에서 개발된 프라이머들 중 CMGG 70F, R을 적용하여 상기 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PCR을 실시하였다. PCR이 끝난 반응 산물은 상기 실시예 2와 같은 방법으로 요소가 포함된 6 % denaturing acrylamide gel에서 분석하였으며, 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2는 양친의 homozygous 패턴과 비교하여 분석된 전체 F₁식물체에서는 양친의 유전적 특성을 반영한 heterozygous 패턴을 보여주고 있다. 본 검정의 결과는 분석된 품종의 143개 F₁종자에 대하여 순도 100 %임을 나타낸다.

[실시예 4]

상기 실시예 3에서 분석한 동일 PCR 반응 산물의 일부에 대하여 약 5 ㎕를 Metaphor^®agarose gel(2.5 %)과 1xTBE 버퍼를 이용하여 일반적인 미니겔(폭 6 ㎝) 시스템에서 100 V 전압으로 약 60∼90분 동안 전기영동을 실시하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3은 양친의 homozygous 단일 밴드와 F₁식물체의 heterozygous 이중 밴드의 구별이 가능하여 본 발명의 순도검정이 아가로스 겔에서 간단하게 실시할 수 있음을 알 수 있다. Acrylamide 겔 분석은 겔 만들기에서 시 작하여 시료 준비 및 주입, 전기영동, 고정 및 은염색까지 통상 숙련된 실험자 1인이 1일 1회 1판(35 ㅧ 45 ㎝ 크기 겔판의 60∼70레인 기준)을 할 수 있다고 했을 때, 200립 종자의 겔 전기영동 분석에만 최소 3일 이상이 소요되며, 더욱이 이 경우 필요한 기술을 별도로 습득하거나 전담 연구원이 필요함을 알 수 있다. 그러나 이것을 아가로스 겔 시스템으로 전환했을 때는 실험자의 업무 소화능력이 아니라 가용 실험도구(예, 미니겔 전기영동 세트)의 숫자에 따라 겔 제조에서 밴드 확인까지 비숙련자라 할지라도 2∼3시간 이내에 분석을 완료할 수 있다. 따라서 acrylamide 겔에서 아가로스 겔로 분석도구를 전환할 수 있음은 실제 본 발명의 순도검정방법이 매우 실용적이며, 분석 단가 산정에도 큰 도움을 줄 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 5]

참외 씨앗으로부터 직접 DNA를 추출하여 검정에 사용함으로써 신속하게 순도검정을 수행할 수 있는 방법을 개발하였다. 순도검정에 사용하고자 하는 종자를 준비하여 표면을 깨끗이 하고, 코팅종자의 경우는 사전에 코팅 피막을 제거하였다. 준비된 종자를 1.5 ㎖ tube에 한 알씩 넣고, 종자 ㎎당 20 ㎕ (혹은 200 ㎕/립)의 0.5 N NaOH를 첨가하였다. 상온에서 40 분간 방치하되, 도중에 약 30초 간 2-3회 강하게 진탕시켰다. 진탕 후 25 ㎕ 추출액을 취하여 475 ㎕ 100 mM Tris-HCL (pH 8.0) 버퍼에 희석[희석배수 : 20배]하였다. 상기 희석액을 취하여 본 발명에서 개발된 프라이머들 중 CMGG 70F, R을 적용하여 상기 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PCR을 실시하였다. 상기 PCR 반응 산물의 일부에 대하여 약 5 ㎕를 Metaphor agarose gel(2.5 %)과 1xTBE 버퍼를 이용하여 일반적인 미니겔(폭 6 ㎝) 시스템에서 100 V 전압으로 약 60∼90분 동안 전기영동을 실시하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4는 양친의 homozygous 단일 밴드와 F₁식물체의 heterozygous 이중 밴드의 구별이 가능하여 본 발명의 순도검정이 아가로스 겔에서 간단하게 실시할 수 있음을 알 수 있다. 또한 본 실시예의 종자에서 직접 DNA를 채취하여 순도를 검정하는 방법은 총 기간이 2-3일 밖에 소요되지 않아 매우 효율적임을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따르면 재배시험을 통한 포장검정을 DNA 마커를 이용한 실내검정으로 대체함으로써 전체 검정 소요기간을 수개월(2∼3 개월)에서 수일(2∼3 일, 종자를 이용한 직접 검정법)로 단축함으로써 우리나라 종자산업 분야 전체에서 참외 F₁품종의 종자순도검정을 위한 포장ㆍ관리인력 절감, 유통 대기시간 단축 등에 따른 생산비 원가절감 효과가 있다.

또한 본 발명은 단일 SSR 마커 프라이머 조합 시스템을 이용하여 전체 금싸라기 계통 참외의 F₁ 종자 순도검정에 범용으로 적용할 수 있음으로써, 동일 목적을 위하여 품종별로 별도의 마커를 개발할 필요가 없으며, 더욱이 앞으로 개발될 금싸라기 계통 품종에도 계속 적용할 수 있는 가능성이 높다.

또한 본 발명에서 개발된 마커는 공우성(co-dominant) 마커 즉, 양친 특이적이어서 F₁개체에서 나타나는 두 대립유전자의 유래를 모ㆍ부본으로부터 명확히 정 의할 수 있으며, RAPD나 ISSR과 같은 비특이 우성(dominant) 마커의 사용시 우려되는 실험적 오류 가능성을 배제할 수 있어(결과의 신뢰도가 높음) 산업현장에서 실용적 적용이 당장 가능한 기술이다.

또한 우리나라 재래종 참외에서 국내 최초로 확보된 SSR 마커로부터 개발되어 유래 클론의 originality가 확보됨은 물론, 마커가 개발된 클론의 유래(작물)와 염기서열 등 마커의 기본 특성이 정의되어 있는 특이 마커를 동일 작물에 사용함으로써 결과의 신뢰성이 높다.

또한 일반적인 SSR 마커와 달리 아가로스 겔(agarose gel) 시스템에서 분석할 수 있어 acrylamide gel 분석 시 필요한 특별한 분석도구 및 시설, 기술 등이 필요치 않으며 분석 소요시간이 수일(숙련된 실험자 약 3 일)에서 수시간(비숙련자 1 일) 이내로 단축되어 일선 종자회사에서 손쉽게 이용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법에 있어서, 일대잡종(F1) 종자의 게놈(genome) DNA를 염기서열목록 제1로 표시되는 DNA 마커로부터 설계된 프라이머와 PCR(polymerase chain reaction) 반응에 의하여 증폭시킨 후, 이를 겔(gel)에서 전기영동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법.
제1항에 있어서,

상기 프라이머는 염기서열목록 제2 내지 제9로 표시되는 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머인 것을 특징으로 하는 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법.
제1항에 있어서,

상기 겔은 폴리아크릴아마이드 겔인 것을 특징으로 하는 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법.
제1항에 있어서,

상기 프라이머는 염기서열목록 제2 또는 제3으로 표시되는 프라이머인 것을 특징으로 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법.
제1항에 있어서,

상기 겔은 아가로즈 겔인 것을 특징으로 하는 금싸라기 계통 참외의 F1 종자 순도검정방법.
금싸라기 계통 참외의 일대잡종(F1) 품종들에서 공우성 대립유전자에 대한 heterozygous한 패턴을 보이는 염기서열목록 제1로 표시되는 염기서열을 갖는 마커.