CN110669120A - 基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法 - Google Patents

基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，通过采用多溶剂复配的醇溶蛋白提取液提升单粒谷子种籽中醇溶蛋白的溶解度和提取效率；通过提高胶浓度到15％以上实现对谷子醇溶蛋白的充分拦截，通过提高硫酸亚铁和双氧水用量以提高氧化还原反应的速度和力度以增加凝胶强度并减少胶在起板的过程中的损伤率，使得醇溶蛋白带谱足量清晰显现；最后读取带谱完成谷子杂交种纯度的鉴定。

Description

基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定 方法
技术领域
本发明涉及生物分子检测和鉴定技术领域，具体涉及一种单粒谷子种子醇溶蛋白的提取、检测方法及其应用。
背景技术
近年谷子杂种优势利用研究也取得了较大成绩，如张家口农科院选育的“张杂谷5号”于2007年创造了小面积亩产810.6公斤的我国春谷高产记录，唐山师范学院选育的“5695”创造了小面积实打亩产765.5公斤的夏谷高产记录。但是，由于谷子杂交种是两系杂交种，亦即只有母本-不育系和父本-恢复系，没有保持系，母本不育系并非100％不育，而是具有5％左右的自交结实特性，且可以稳定遗传，其不育性的保持就是通过其自身5％左右的自交结实特性进行的。然而，谷子杂交种亲本的这些特性造成其种子中总是混有一定的不育系，且由于授粉和收获等原因，还会混有一定的恢复系，乃至其他材料。鉴于此，为保证杂交种的增产效果，在谷子杂交种试验、示范、推广过程中，首先要考虑如何去除杂交种中混杂的不育系、恢复系等杂株，因此，必须先鉴定杂交种的纯度，确定谷子杂交种适宜的播种量，而这也是品种管理的重要依据和管理环节。如何鉴定谷子杂交种的纯度，确定适宜的播种量，成为制约谷子杂交种推广以及品种管理方面的一大技术难题。
20世纪90年代以前，谷子杂交种鉴定主要通过父母本苗色的差别，选用苗色深的材料做父本，以苗色较浅的不育系为母本，依据深颜色对浅颜色为显性的遗传规律，杂交种与父本颜色相同，通过拔除杂交种中混杂的颜色较浅的母本，去除杂株，也通过调查其中颜色较浅的不育株的比例确定杂交种的纯度，这一方法虽然能去除杂交种中的部分杂株，但限制颜色较深的不育系的应用，且费工费时，不能去除杂交种中混杂的恢复系和其它材料，鉴定的纯度也不准确。
20世纪90年代以后，随着抗除草剂材料的引进、创制成功，通过培育抗除草剂的恢复系，而不育系不抗除草剂，利用抗除草剂性状为显性遗传的特性，通过苗期喷施除草剂杀除其中假杂种，来鉴定杂交种的纯度、去除假杂种，这一方法，使各种苗色的不育系均能获得应用，但仍不能鉴定出杂交种混杂的恢复系或其它抗除草剂材料，仍不能彻底去除杂交种中的假杂种，也不能准确的鉴定杂交种的纯度。因此，创造一种能够准确鉴定杂交种纯度的方法成为对谷子杂交种进行品种管理、保证其增产效果的当务之急。
利用分子标记构建作物品种的指纹图谱，是目前常用的杂交种乃至品种常用的鉴定方法，但是这种方法需要使用较多的典型引物，且要求引物多态性较好，否则，构建的品种指纹图谱不够准确，也难以准确的鉴定杂交种的纯度，同时该方法还需要经过育苗、DNA提取、电泳、读带等过程，操作复杂，鉴定时间长，不适合大批量的进行杂交种纯度鉴定。
醇溶蛋白是禾本科作物种子中的一种主要的贮藏蛋白，是种子萌发时C和N的主要来源[1,2]。其电泳带谱完全受基因型控制，不受环境条件影响，且遗传变异丰富,在品种间存在着稳定的多态性，可作为品种的“指纹”[3]。同时，其多态性检测不需要育苗、DNA提取、聚合酶链式反应等环节，操作简单，已在小麦、水稻等作物品种鉴定、纯度分析、种质资源的鉴定评价、物种遗传多样性研究等方面广泛应用[4]；国际种子检验协会已把小麦醇溶蛋白带谱鉴定作为标准方法用于小麦种子的纯度鉴定[5]，因此，醇溶蛋白在品种的真假和纯度鉴定中的作用越来越受到科研人员的重视。
关于玉米、高粱、小麦、大麦、水稻的醇溶蛋白提取方法已有一些报道[6,7,8,9,10,11,12]，与上述作物相比，谷子的醇溶蛋白分子量小、粒小，千粒重2.5g左右，仅为小麦、高粱、水稻的1/10-1/20左右，比玉米更小，提取难度更大，上述作物醇溶蛋白提取方法很难直接用于谷子醇溶蛋白的提取，更不能用于谷子单粒醇溶蛋白的提取，因此，欲开展利用谷子醇溶蛋白鉴定杂交种纯度的技术体系，必须先开展单粒法谷子醇溶蛋白提取技术研究，首先要根据谷子醇溶蛋白的特点，探明适宜谷子醇溶蛋白提取的试剂及建立适宜谷子醇溶蛋白的提取体系、反应条件。而谷子醇溶蛋白的突出特点是分子量小、且仍存在较大差别，在14kDa--66kDa之间，要建立适宜谷子的醇溶蛋白多态性检测技术，第一要能够将单粒谷子的醇溶蛋白尽量多的提取出来，这首先要选择能够很好的溶解含有分子量不一的醇溶蛋白谷子粉末的有机溶剂，并筛选、增加能凝聚蛋白的试剂，创造适宜它们发生反应的环境条件，彻底提取谷子籽粒中的醇溶蛋白；第二要提高胶浓度，以便尽量多将低分子量的谷子醇溶蛋白拦截下，并通过调整催化剂，提高胶的硬度和质量，使谷子醇溶蛋白条带尽量多的显现出来。
部分谷子科研人员通过研究，曾得出盐溶蛋白可用作品种鉴定[13]，但进一步研究表明，盐溶蛋白等非醇溶蛋白大多为参与免疫反应的非储存蛋白，多态性较差，不适宜品种纯度鉴定[14]，研究人员在此基础上，开始尝试利用小麦醇溶蛋白A-PAGE方法鉴定谷子醇溶蛋白的多态性[5,14,15,16]，但是由于谷子籽粒小，需要10粒以上的种子才能提取到谷子醇溶蛋白[14]，而品种纯度鉴定必须以每一粒种子为依据，因此，这种方法也不能用于谷子杂交种的纯度鉴定；科研人员又开始尝试利用SDS-PAGE方法鉴定谷子醇溶蛋白的多态性[17]，但是，由于SDS-PAGE存在电泳时间长的缺点，且在异丙醇浓度提高到50％的情况下，需要20粒以上提取的谷子醇溶蛋白才能提取出谷子醇溶蛋白，检测多态性，不能满足谷子杂交种纯度鉴定的需要。到目前为止，谷子醇溶蛋白多态性无法应用于遗传多样性鉴定和品种纯度鉴定。因此，急需建立有效、快速、实用的单粒谷子醇溶蛋白检测技术，以实现对谷子杂交种纯度的鉴定。上文所述相关参考文献包括：
[1]Cagampang G B,Cruz L J,Espiritu S G,et al.Studies on theextractionand composition of rice protein[J].Cereal Chem,1966,43:145-155.
[2]Muntz K.Deposition of storage proteins[J].Plant Mol Biol,1998,38:77-99.
[3]赵伟，邵景侠，张改生.麦醇溶蛋白电泳技术在杂交小麦种子纯度鉴定中的应用[J].麦类作物学报，2007，27(2):223-225.
[4]王伟，印丽萍，刘许佳，陈沁.种子醇溶蛋白提取及检测条件探索[J].西北植物学报,2007,27(1):21-27
[5]杨延兵，管延安，秦岭，等.谷子籽粒醇溶蛋白提取条件及A-PAGE方法研究[J].种子，2010，29(1):8-10.
[6]EVANS C D,MANLEY R H Solvents for zein,primary solvents[J]Industrial and Engineering Chemistry,1941,33:1 415-1 417.
[7]张春庆，金锡奎，郑成超.NAU-PAGE技术与玉米种子纯度测定，中国农业科学，1995,28(6)：20-24.
[8]TAYLOR J R N,SCHUSSLER L,VAN DER WALT W H Fractionation ofproteins from low-tannin sorghum grain[J]J Agric Food Chem,1984,32:149-154
[9]颜启传，黄亚军，徐媛.试用ISTA推荐的种子醇溶蛋白电泳方法鉴定大麦和小麦品种[J].作物学报，1992(1):61-68
[10]郎明林，卢少源，赵家发，张荣芝，杨学举.适合我国小麦醇溶蛋白“指纹图谱”绘制的改良APAGE分子标记技术，河北农业大学学报，1998,21(4),1-5.
[11]陆作媚，王华，沈又佳.杂交稻胚乳贮藏蛋白多态性及其应用研究，南京农业大学学报，2001，24(2):6-11.
[12]，刘强，水稻杂交种子纯度检测技术研究，山东农业大学，硕士论文，泰安.
[13]张华文,杨延兵,秦岭,管延安,段乃彬,倪大鹏,于东安.谷子盐溶蛋白A-PAGE电泳方法的探索,山东农业科学，2007(5):34-37.
[14]杨延兵张华文秦岭王海莲管延安段乃彬张晗.利用A-PAGE研究谷子籽粒蛋白质多态性,作物学报，2009,35(7):1374-1378.
[15]杨天育，沈裕琥，黄相国，等.用A－PAGE鉴定谷子遗传多样性[J].作物学报，2005，31(1):131－133.
[16]Yang T-Y,Huang X-G,He J-H,ShenY-H,Wu G-Z.Advance in diversity ofgeneticresource of foxtail millet.Acta Agric Boreali-Occident Sin,2003,12(1):43-47.
[17]杨延兵，秦岭，管延安，等.不同生态区谷子籽粒醇溶蛋白多态性分析[J].中国粮油学报，2013，28(4):22－26.
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，通过采用多溶剂复配的醇溶蛋白提取液提升单粒谷子种籽中醇溶蛋白的溶解度和提取效率；通过提高胶浓度到15％以上实现对谷子醇溶蛋白的充分拦截，通过提高硫酸亚铁和双氧水用量以提高氧化还原反应的速度和力度以增加凝胶强度并减少胶在起板的过程中的损伤率，使得醇溶蛋白带谱足量清晰显现；最后读取带谱完成谷子杂交种纯度的鉴定。
作为本发明的一种优选技术方案，该方法包括如下步骤：
A、单粒醇溶蛋白的提取：通过采用多溶剂复配的醇溶蛋白提取液，提高单粒谷子种籽中醇溶蛋白的溶解度和提取效率，使提取的醇溶蛋白浓度达到能够进行谷子杂交种纯度鉴定要求；并通过醇溶蛋白的提取过程中，提取温度的控制，避免提取液中醇类物质造成的胶孔弯曲、条带不整齐和难以观察的问题；所述多溶剂复配的醇溶蛋白提取液具有如下组份：NN-二甲基甲酰胺10体积份，蔗糖20重量份，异丙醇50体积份，去离子水补充提取液到100体积份；
B、醇溶蛋白的多态性检测：将胶浓度提高到15％以上实现对谷子醇溶蛋白的充分拦截，同时提高硫酸亚铁和双氧水用量，以提高氧化还原反应的速度和力度，增加凝胶强度并减少胶在起板的过程中的损伤率，使得醇溶蛋白带谱尽量清晰显现，充分反映待测醇溶蛋白的多态性；其中，凝胶配方比例及加入顺序为：①尿素6g；②40％Acr：Bis＝29:137.5ml；③凝胶buffer 63ml，加入后、用玻璃板缓慢混匀；④FeSO4工作液100μl，混匀；⑤抗坏血酸VC 0.15g，混匀；
C、带谱的读取及杂交种纯度的鉴定：通过同时检测杂交种及其母本-不育系、父本-恢复系的醇溶蛋白多态性，依据带型的比对结果，统计杂交种的纯度。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，在醇溶蛋白的提取过程中控制提取温度为60-70℃，并进行涡旋震荡处理；向醇溶蛋白提取液中加入loading buffer，以提高多醇溶蛋白的提取数量及蛋白的多态性，以满足谷子杂交种纯度鉴定要求；所述loadingbuffer的组分为：丙三醇80ml，甲基绿0.02g，去离子水20ml；在醇溶蛋白提取液离心之后进行降温处理，通过低温促进醇溶蛋白析出与结合，得到的带谱清晰的醇溶蛋白；
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A包含如下实施步骤：
A-1.样品的准备：将目的种子制备成粉末状，将粉末放置于2.0ml离心管中；
A-2.提取液的配制：醇溶蛋白提取液包含如下组分：NN-二甲基甲酰胺10ml，蔗糖20g，异丙醇50ml，去离子水将溶液补至100ml；
A-3.醇溶蛋白的提取：
A-3-1将A-1制备的每个样品中，加入A-2制备的蛋白提取液即谷子醇溶蛋白提取液)50μl，盖好盖子，涡旋震荡混匀，放入65℃烘箱过夜；
A-3-2取出A-3-1制备的装有蛋白提取液和样品混合液的离心管，放入离心机，严格配平，12000rpm，离心10min；
A-3-3.取新的1.5ml离心管，并在离心管中加入15μl A-PAGE loading buffer。
A-3-4.分别用移液枪取A-3-2中制得的上清液30ul加入A-3-3制得的装有loadingbuffer离心管中，依次编号，确保顺序编号一致；离心1min，涡旋震荡混匀，然后用瞬时离心机调平后离心1min；
A-3-5上步所得放入冰箱4℃过夜，通过低温促进醇溶蛋白析出与loading更好结合，即为提取到的醇溶蛋白。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，凝胶的配方及加入顺序为：100ml，2板胶配方：①尿素6g；②40％Acr：Bis＝29:137.5ml；③凝胶buffer62.5ml，加入后、用玻璃板缓慢混匀；④FeSO4工作液100μl，混匀；⑤抗坏血酸VC 0.15g，混匀。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，凝胶buffer的配方及加入顺序为：1L凝胶buffer配方：①冰醋酸20ml；②Gly甘氨酸1g；③H2O定容至1L。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B包含如下实施步骤：
B-1将电泳用的耳板和大板仔细清洗干净，在半干时检查玻璃板上是否有小胶粒，如果有继续清洗；
B-2步骤B-1胶板清洗干净后，配制凝胶，配置前将烧杯、量筒洗刷干净，并配制好FeSO4工作液：FeSO4 0.04g+1ml ddH2O；
B-3首先检查B-1清洗的玻璃板是否干净，然后将玻璃板耳板与大阪拼合，耳板朝外，安装到做胶架上，并用长尾夹固定到做胶架上，双面安装好后，放到封底架上，封底；
B-4检查梳子是否干净，确保梳齿上无胶粒，并用毛巾擦干，确保无杂物；
B-5配制H2O2工作液：将30％的H2O2储存液剧烈晃动混匀，吸取出200微升加入三角瓶中，并加入2ml ddH2O，混匀；
B-6将步骤B-2中配置好的凝胶用玻璃棒再次搅动、混匀，检查药品是否充分溶解，混匀后分装到2个干净的100ml的烧杯中，记为烧杯A和烧杯B；
B-7用移液枪上下吸吹混匀B-5配制的H2O2工作液，然后吸出150μl H2O2工作液，加入到步骤B-6准备的烧杯A中，轻轻晃动混匀，迅速倒入步骤B-3安装好的玻璃板中，倒满后插入步骤B-4中准备好的梳子；
B-8上下吸吹混匀B-5配制的H2O2工作液，然后吸出150μl H2O2工作液，加入到B-6清洗的烧杯B中，轻轻晃动混匀，迅速倒入步骤B-3的玻璃板中，倒满后插入步骤B-4中准备好的梳子；
B-9配制1X电极buffer：用量筒取50ml 20x A-PAGE电极buffer，加入量杯中，并在量杯中加入950ml ddH2O，置于磁力搅拌器上混匀；1L 20X电极buffer配方及加入顺序为：①冰醋酸80ml；②Gly(甘氨酸)8g；③H2O定容至1L；
B-10步骤B-7、B-8的胶体凝固后，拔下梳子，打开封底架，拆下长尾夹，耳板朝内，将玻璃板安装到电泳仪上，四个角的螺丝均匀上紧，然后将安装好的电泳仪放置到电泳槽内；
B-11关掉步骤B-9的磁力搅拌器，并将该步骤配制的1X电极buffer倒入步骤B-10准备的电泳仪上的槽中，检查是否漏液，确保不漏液后，再在下槽中加入步骤B-9制备的1X电极buffer，确保介于最低和最高线之间；
B-12将步骤B-11电泳仪与冷凝管连接，打开长尾夹，开启冷凝系统，在确保电泳仪为“run”的状态下，设定温度24℃；
B-13检查步骤B-12各种设定准确无误后，从左到右依次上样10μl，加样后，接上电极；
B-14步骤B-13完成电泳后，关掉电泳仪电源，关掉冷凝系统，用长尾夹夹住冷凝管，关闭冷凝系统进出水，然后卸下冷凝管；导出上槽中的电泳液，放置于垃圾桶中，然后用长尾夹关闭上槽导液管，缓慢松开固定螺丝，卸下玻璃板；
B-15小心剥离步骤B-14的耳板，将带胶大板，放入白瓷盘中，记好顺序，倒入考马斯亮蓝染液，染色；1L考马斯亮蓝R-250染色液配方：考马斯亮蓝R-250染色液1g g；异丙醇250ml；冰醋酸100ml；去离子水650ml；
B-16步骤B-15染色结束后，将胶板放置的新的盒子中，记录顺序，小心加入清水，10-30min后换水，随时观察，及时拍照；
作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，通过与喷施除草剂的测定结果的对比，进行该方法的可靠性验证。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤C包括如下实施步骤：选取杂交种种子，以其父母本为对照，通过提取醇溶蛋白、并进行电泳，检测杂交种及其父母本的醇溶蛋白带谱；分别读取杂交种及其父、母本的多态性检测结果，并将杂交种的带型与父、母本的带型进行比对分析；依据杂交种带型与父母本带型的比对结果，统计该杂交种的纯度。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
发明人研究探明了适宜谷子醇溶蛋白提取的试剂及建立适宜谷子醇溶蛋白的提取体系和反应条件，建立了有效、快速、实用的单粒谷子醇溶蛋白提取技术。本发明根据谷子籽粒小、谷子醇溶蛋白分子量低、且差别较大的特点，通过改变有机溶剂，在醇溶蛋白提取buffer中，增加对醇溶蛋白溶解度更高的有机溶剂DMF，用含有DMF和异丙醇两种有机溶剂、对醇溶蛋白溶解性好的“谷子醇溶蛋白提取buffer”替代“异丙醇”，解决异丙醇不能完全溶解将谷子籽粒中的醇溶蛋白的难题，和醇类物质吸收胶面中的水分造成胶孔弯曲，条带不整齐、难以观察的难题；采用涡旋震荡的方式，增加提取buffer与谷子籽粒粉末的接触面积，解决摇床不能晃动液面，提取液与谷子粉末接触不充分的难题；并通过提高温度，提高醇溶蛋白在提取液中的溶解度，促进醇溶蛋白提取，提高所提蛋白的浓度。
为了进一步进行谷子醇蛋白的多态性检测，本发明在获取醇溶蛋白后，通过加适宜剂量的loading buffer，解决了样品易漂移的难题；通过提高胶浓度到15％，以最大限度的拦截低分子量的谷子醇溶蛋白，解决胶浓度低的情况下，只能拦截部分谷子醇溶蛋白分子，拦截不充分的难题；通过提高硫酸亚铁和双氧水用量，提高氧化还原反应的速度和力度，增加凝胶强度，减少胶在起板子的过程中的损伤率，解决凝胶易破坏的难题。以保证醇溶蛋白带谱尽量多而清晰的显现出来，充分反映供试材料的醇溶蛋白多态性。
参见下文的实施例，申请人项目组已利用本发明的方法成功的检测到单粒谷子中丰富的醇溶蛋白、及其多态性，并以此为依据，准确的鉴定出了谷子杂交种的纯度，为谷子杂交种纯度检测、品种管理及示范推广等相关研究奠定了基础。
附图说明
图1是实施例3中谷子杂交种及其父、母本多态性检测结果。图中，*所在孔道为真实杂交种；1、2、3、4、为真实杂交种鉴定指示条带、5号孔道为恢复系/父本混杂代表带谱、6号孔道为不育系/母本混杂代表带谱。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
实施例1、材料和设备
本发明所用试剂如无特别说明均购自Coolaber公司，离心机为Eppenddorf5424R离心机；如无特殊说明，离心均在4℃下进行，电泳仪为君意JY600E，电泳槽为君意JY-SCZ8，低温冷凝槽为DC-0506。
本发明所用凝胶、溶液及缓冲液的配方如下表所示：
1.谷子醇溶蛋白提取buffer配方
Figure BDA0002253843410000101
2.A-PAGE loading buffer配方
Figure BDA0002253843410000111
3.1L凝胶buffer配方
Figure BDA0002253843410000112
4.凝胶配方(100ml，2板胶，如果配制1板，药品减半即可)
Figure BDA0002253843410000113
5.1L 20X电极buffer(电极缓冲液)配方
Figure BDA0002253843410000114
6.考马斯亮蓝R-250染色液配方
实施例2、谷子单粒醇溶蛋白的提取
在本实施例中进行单粒谷子种子醇溶蛋白的提取，根据谷子籽粒小、醇溶蛋白含分子量低的特点，在通过实验探明NN-二甲基甲酰胺(DMF)适宜溶解分子量较高的醇溶蛋白、异丙醇适宜溶解分子量较低的醇溶蛋白特点的前提下，通过改变有机溶剂，在继续借鉴前人以“异丙醇”为有机溶剂的为基础上，再加入对醇溶蛋白溶解性好的“有机溶剂-DMF”，解决用“异丙醇”为有机溶剂时，醇溶蛋白溶解度偏低、提取效率不高，且醇类物质由于具有极性、易吸收胶面中的水分造成胶孔弯曲，条带不整齐、难以观察的难题；采用涡旋震荡的方式，增加提取buffer与谷子的接触面积，解决由于提取剂用量少造成的摇床不能晃动液面，提取液与谷子粉末接触不充分的难题，并通过提高温度，提高醇溶蛋白与提取液的反应速度与溶解度，促进醇溶蛋白提取，提高提取效率；同时根据谷子醇溶蛋白分子量小的特点，在获取醇溶蛋白后，通过加适宜剂量的loading buffer，保证样品不浪费、全部加入点样孔，解决不加loading buffer情况下，样品易漂移的难题。具体操作步骤包括：
(1)样品的准备：选取120粒饱满的谷子杂交种“56229”种子及其母本-56A、父本-HK229饱满种子各8粒，每粒种子分别装入1个内壁光滑的小纸袋中，做好标记；然后，用锤子将种子砸成粉末状，将粉末放置于2.0ml离心管中。
(2)配制醇溶蛋白提取液(见表1)。
1.谷子醇溶蛋白提取buffer配方
Figure BDA0002253843410000121
(3)向每个装有谷子粉末样品的离心管中，加入蛋白提取液50μl，盖好盖子，涡旋震荡混匀，放入65℃烘箱过夜。
(4)取出步骤(3)中的离心管，放入离心机，严格配平，12000rpm，离心10min。
(5)取新的1.5ml离心管，并在离心管中加入15μl A-PAGE loading buffer(见表2)。
2.A-PAGE loading buffer配方
Figure BDA0002253843410000131
(6)分别用移液枪取步骤(4)制得的上清液30ul加入步骤(5)制得的装有loadingbuffer离心管中，依次编号，确保顺序编号一致；离心1min，涡旋震荡混匀，然后用瞬时离心机(调平)离心1min，放入冰箱过夜(低温促进醇溶蛋白析出与loading更好结合，使得带谱更清晰)。即为提取到的醇溶蛋白。
实施例3、醇溶蛋白多态性检测
本实施例在获取醇溶蛋白后，根据谷子醇溶蛋白分子量小的特点，通过提高胶浓度，将胶浓度提高到15％，以最大限度的拦截各种分子量的谷子醇溶蛋白；通过提升硫酸亚铁和双氧水两种催化剂，提高氧化还原反应的速度和力度，使胶的硬度上升，减少胶在起板子的过程中的损伤率。以保证醇溶蛋白带谱尽量多而清晰的显现出来，充分反映供试材料的醇溶蛋白多态性。具体操作步骤包括：
(1)将电泳用的耳板和大板仔细清洗干净。
(2)配制凝胶(表3、表4)，配置前将烧杯、量筒洗刷干净，并配制好FeSO4工作液(FeSO4 0.04g+1ml ddH2O)。
3.1L凝胶buffer配方
Figure BDA0002253843410000132
Figure BDA0002253843410000141
4.凝胶配方(100ml，2板胶，如果配制1板，药品减半即可)
(3)首先检查步骤(1)清洗的玻璃板是否干净，然后将玻璃板耳板与大阪拼合，耳板朝外，安装到做胶架上，并用长尾夹固定到做胶架上，双面安装好后，放到封底架上，封底。
(4)检查梳子是否干净，确保梳齿上无胶粒，并用毛巾擦干，确保无杂物。
(5)配制H2O2工作液：将30％的H2O2储存液剧烈晃动混匀，吸取出200μl加入三角瓶中，并加入2ml ddH2O，混匀
(6)将步骤(2)中配置好的凝胶用玻璃棒再次搅动、混匀，检查药品是否充分溶解，混匀后分装到2个干净的100ml的烧杯中，记为烧杯A和烧杯B。
(7)用移液枪上下吸吹混匀步骤(5)配制的H2O2工作液，然后吸出150μl H2O2工作液，加入到步骤烧杯A中，轻轻晃动混匀，迅速倒入安装好的玻璃板中，倒满后插入梳子。
(8)上下吸吹混匀步骤(5)配制的H2O2工作液，然后吸出150μl H2O2工作液，加入到烧杯B中，轻轻晃动混匀，迅速倒入安装好的玻璃板中，倒满后插入梳子。
(9)配制1X电极buffer(表5)：用量筒取50ml 20x A-PAGE电极buffer，加入量杯中，并在量杯中加入950ml ddH2O，置于磁力搅拌器上混匀。
5.1L 20X电极buffer(电极缓冲液)配方
(10)步骤(7)、(8)的胶体凝固后，拔下梳子，打开封底架，拆下长尾夹，耳板朝内，将玻璃板安装到电泳仪上，四个角的螺丝均匀上紧，然后将安装好的电泳仪放置到电泳槽内。
(11)关掉步骤(9)的磁力搅拌器，并将该步骤配制的1X电极buffer倒入步骤(10)准备的电泳仪上的槽中，检查是否漏液，确保不漏液后，再在下槽中加入步骤(9)制备的1X电极buffer，确保介于最低和最高线之间。
(12)将电泳仪与冷凝管连接，打开长尾夹，开启冷凝系统，在确保电泳仪为“run”的状态下，设定温度24℃。
(13)检查步骤(12)各种设定准确无误后，从左到右依次上样10μl，各板的顺序均为15个杂交种、2个母本、2个父本、15个杂交种，加样后，接上电极。在500v电压下，电泳1h30min。
(14)完成电泳后，关掉电泳仪电源，关掉冷凝系统，用长尾夹夹住冷凝管，关闭冷凝系统进出水，然后卸下冷凝管。导出上槽中的电泳液，放置于垃圾桶中，然后用长尾夹关闭上槽导液管，缓慢松开固定螺丝，卸下玻璃板。
(15)小心剥离步骤B-14的耳板，将带胶大板，放入白瓷盘中，记好顺序，倒入考马斯亮蓝染液(表6)，染色。
6.考马斯亮蓝R-250染色液配方
Figure BDA0002253843410000152
(16)步骤(15)染色结束后，将胶板放置的新的盒子中，记录顺序，小心加入清水，10-30min后换水，随时观察，及时拍照(见附图1)。
实施例4、谷子杂交种56229的纯度统计与检测
本实施例进行带谱的读取及杂交种纯度鉴定；通过同时检测杂交种及其母本-不育系、父本-恢复系的醇溶蛋白多态性，依据带型的比对结果，统计杂交种的纯度，并与喷施除草剂的测定结果进行对比，验证高方法的可靠性。操作步骤包括：
(1)分别读取步骤杂交种及其父、母本的多态性检测结果，并将杂交种的带型与父、母本的带型进行比对分析。
(2)依据(1)中杂交种带型与父母本带型的比对结果，统计该杂交种的纯度，结果表明：118孔可读条带中，28条孔道为真杂交种(图中*标识)，该杂交种纯度为23.73％；3条为父本条带，87条为母本条带，杂交种中混杂母本比例为73.73％、父本混杂比例为2.54％。
(3)与此同时，另取300粒同一批次谷子杂交种-56229种子，分3次重复，每次重复100粒，播种于育苗盒，4-5叶期喷施拿扑净除草剂，喷药前前统计各重复的苗数，喷药后10天统计成活苗数，由于母本不抗拿扑净除草剂，而混杂的父本和杂交种都抗这种除草剂，因此，喷除草剂后，杀死的几乎全部是母本，据此统计母本杂株率，母本杂株率＝喷药后死苗数/喷药前总苗数，与醇溶多态性检测的母本杂株率进行对比，结果表明：喷施拿扑净除草剂后，56229平均存活率26.53％，亦即母本杂株率为73.47％；而醇溶蛋白检测结果，母本杂株率为73.73％。说明两种方法检测的母本杂株率基本相同，也证明醇溶蛋白的检测结果是可靠的。但是，对醇溶蛋白检测结果进一步分析发现：118株杂交种中，母本占73.73％，父本也占2.54％，真杂交种占23.73％，说明杂交种中还存在一定比例的父本杂株，这些杂株混杂到杂交种中，对于杂交种增产潜力的发挥还是有较大影响的，也说明，该方法对于进一步发挥杂交种的增产潜力具有显著意义的。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (9)

1.基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：通过采用多溶剂复配的醇溶蛋白提取液提升单粒谷子种籽中醇溶蛋白的溶解度和提取效率；通过提高胶浓度到15％以上实现对谷子醇溶蛋白的充分拦截；通过提高硫酸亚铁和双氧水用量提高氧化还原反应的速度和力度,以增加凝胶强度并减少胶在起板的过程中的损伤率，使得醇溶蛋白带谱足量清晰显现；最后读取带谱完成谷子杂交种纯度的鉴定。
2.根据权利要求1所述的基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、单粒醇溶蛋白的提取：通过采用多溶剂复配的醇溶蛋白提取液，使单粒谷子种籽当中醇溶蛋白的溶解度和提取效率达到谷子杂交种纯度鉴定要求，并通过醇溶蛋白的提取过程中，提取温度的控制,避免提取液中醇类物质造成的胶孔弯曲、条带不整齐和难以观察的问题；所述多溶剂复配的醇溶蛋白提取液具有如下组份：NN-二甲基甲酰胺10体积份，蔗糖20重量份，异丙醇50体积份，用去离子水补充到100体积份；
B、醇溶蛋白的多态性检测：将胶浓度提高到15％以上实现对谷子醇溶蛋白的充分拦截；同时提高硫酸亚铁和双氧水用量，以提高氧化还原反应的速度和力度，增加凝胶强度并减少胶在起板的过程中的损伤率，使得醇溶蛋白带谱足量清晰显现充分反映待测醇溶蛋白的多态性；其中，凝胶配方比例及加入顺序为：①尿素6g；②40％Acr：Bis＝29:1 37.5ml；③凝胶buffer 63ml，加入后、用玻璃板缓慢混匀；④FeSO4工作液100μl，混匀；⑤抗坏血酸VC0.15g，混匀；
C、带谱的读取及杂交种纯度的鉴定：通过同时检测杂交种及其母本-不育系、父本-恢复系的醇溶蛋白多态性，依据带型的比对结果，统计杂交种的纯度。
3.根据权利要求2所述的基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：步骤A中，在醇溶蛋白的提取过程中控制提取温度为65℃，并进行涡旋震荡处理；向醇溶蛋白提取液中加入loading buffer以提高多醇溶蛋白的提取数量及蛋白的多态性，以满足谷子杂交种纯度鉴定要求；所述loading buffer的组分为：丙三醇80ml，甲基绿0.02g，去离子水20ml；在醇溶蛋白提取液离心之后进行降温处理，通过低温促进醇溶蛋白析出与结合，得到的带谱清晰的醇溶蛋白。
4.根据权利要求3所述的基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：步骤A包含如下实施步骤：
A-1.样品的准备：将目的种子制备成粉末状，将粉末放置于2.0ml离心管中；
A-2.提取液的配制：醇溶蛋白提取液包含如下组分：NN-二甲基甲酰胺10ml，蔗糖20g，异丙醇50ml，去离子水将溶液补至100ml；
A-3.醇溶蛋白的提取：
A-3-1将A-1制备的每个样品中，加入A-2制备的蛋白提取液即谷子醇溶蛋白提取液)50μl，盖好盖子，涡旋震荡混匀，放入65℃烘箱过夜；
A-3-2取出A-3-1制备的装有蛋白提取液和样品混合液的离心管，放入离心机，严格配平，12000rpm，离心10min；
A-3-3.取新的1.5ml离心管，并在离心管中加入15μl A-PAGE loading buffer。
A-3-4.分别用移液枪取A-3-2中制得的上清液30ul加入A-3-3制得的装有loadingbuffer离心管中，依次编号，确保顺序编号一致；离心1min，涡旋震荡混匀，然后用瞬时离心机调平后离心1min；
A-3-5上步所得放入冰箱4℃过夜，通过低温促进醇溶蛋白析出与loading更好结合，即提取到醇溶蛋白。
5.根据权利要求2所述的基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：步骤B中，凝胶的配方及加入顺序为：100ml，2板胶配方：①尿素6g；②40％Acr：Bis＝29:137.5ml；③凝胶buffer 62.5ml，加入后、用玻璃板缓慢混匀；④FeSO4工作液100μl，混匀；⑤抗坏血酸VC 0.15g，混匀。
6.根据权利要求2所述的基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：步骤B中，凝胶buffer的配方及加入顺序为：1L凝胶buffer配方：①冰醋酸20ml；②Gly甘氨酸1g；③H2O定容至1L。
7.根据权利要求2所述的基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：步骤B包含如下实施步骤：
B-1将电泳用的耳板和大板仔细清洗干净，在半干时检查玻璃板上是否有小胶粒，如果有继续清洗；
B-2步骤B-1胶板清洗干净后，配制凝胶，配置前将烧杯、量筒洗刷干净，并配制好FeSO4工作液：FeSO4 0.04g+1ml ddH2O；
B-3首先检查B-1清洗的玻璃板是否干净，然后将玻璃板耳板与大阪拼合，耳板朝外，安装到做胶架上，并用长尾夹固定到做胶架上，双面安装好后，放到封底架上，封底；
B-4检查梳子是否干净，确保梳齿上无胶粒，并用毛巾擦干，确保无杂物；
B-5配制H2O2工作液：将30％的H2O2储存液剧烈晃动混匀，吸取出200微升加入三角瓶中，并加入2ml ddH2O，混匀；
B-6将步骤B-2中配置好的凝胶用玻璃棒再次搅动、混匀，检查药品是否充分溶解，混匀后分装到2个干净的100ml的烧杯中，记为烧杯A和烧杯B；
B-7用移液枪上下吸吹混匀B-5配制的H2O2工作液，然后吸出150μl H2O2工作液，加入到步骤B-6准备的烧杯A中，轻轻晃动混匀，迅速倒入步骤B-3安装好的玻璃板中，倒满后插入步骤B-4中准备好的梳子；
B-8上下吸吹混匀B-5配制的H2O2工作液，然后吸出150μl H2O2工作液，加入到B-6清洗的烧杯B中，轻轻晃动混匀，迅速倒入步骤B-3的玻璃板中，倒满后插入步骤B-4中准备好的梳子；
B-9配制1X电极buffer：用量筒取50ml 20x A-PAGE电极buffer，加入量杯中，并在量杯中加入950ml ddH2O，置于磁力搅拌器上混匀；1L 20X电极buffer配方及加入顺序为：①冰醋酸80ml；②Gly(甘氨酸)8g；③H2O定容至1L；
B-10步骤B-7、B-8的胶体凝固后，拔下梳子，打开封底架，拆下长尾夹，耳板朝内，将玻璃板安装到电泳仪上，四个角的螺丝均匀上紧，然后将安装好的电泳仪放置到电泳槽内；
B-11关掉步骤B-9的磁力搅拌器，并将该步骤配制的1X电极buffer倒入步骤B-10准备的电泳仪上的槽中，检查是否漏液，确保不漏液后，再在下槽中加入步骤B-9制备的1X电极buffer，确保介于最低和最高线之间；
B-12将步骤B-11电泳仪与冷凝管连接，打开长尾夹，开启冷凝系统，在确保电泳仪为“run”的状态下，设定温度24℃；
B-13检查步骤B-12各种设定准确无误后，从左到右依次上样10μl，加样后，接上电极；
B-14步骤B-13完成电泳后，关掉电泳仪电源，关掉冷凝系统，用长尾夹夹住冷凝管，关闭冷凝系统进出水，然后卸下冷凝管；导出上槽中的电泳液，放置于垃圾桶中，然后用长尾夹关闭上槽导液管，缓慢松开固定螺丝，卸下玻璃板；
B-15小心剥离步骤B-14的耳板，将带胶大板，放入白瓷盘中，记好顺序，倒入考马斯亮蓝染液，染色；1L考马斯亮蓝R-250染色液配方：考马斯亮蓝R-250染色液1g g；异丙醇250ml；冰醋酸100ml；去离子水650ml；
B-16步骤B-15染色结束后，将胶板放置到新的盒子中，记录顺序，小心加入清水，10-30min后换水，随时观察，及时拍照。
8.根据权利要求2所述的基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：步骤C包括如下实施步骤：.选取杂交种种子，以其父母本为对照，通过提取醇溶蛋白、并进行电泳，检测杂交种及其父母本的醇溶蛋白带谱；分别读取杂交种及其父、母本的多态性检测结果，并将杂交种的带型与父、母本的带型进行比对分析；依据杂交种带型与父母本带型的比对结果，统计该杂交种的纯度。
9.根据权利要求2所述的基于单粒醇溶蛋白提取和检测技术的谷子杂交种纯度鉴定方法，其特征在于：步骤C中，通过与喷施除草剂的测定结果进行对比进行可靠性验证。
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