CN113466368B - 一种枸杞品种耐盐性的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种枸杞品种耐盐性的评价方法，涉及枸杞逆境适应性评价领域。该方法包括：将待评价的枸杞品种的幼苗分别扦插在不加NaCl的培养基和添加NaCl的培养基中进行培养，作为对照组和实验组；分别取对照组和实验组培养后幼苗的叶片，检测叶片中脂质分子的含量，得出实验组相对于对照组含量发生显著变化的脂质分子的种类；根据含量发生显著变化的脂质分子的种类数目和/或其含量变化大小来评价枸杞品种的耐盐性，其中，含量发生显著变化的脂质分子的种类数目越少，含量变化越小，则枸杞品种的耐盐性越高。基于脂质分子的含量分析可以精准地反映不同枸杞品种之间的耐盐性高低，对于枸杞的抗逆育种工作具有重要的指导意义。

Description

一种枸杞品种耐盐性的评价方法
技术领域
本发明涉及枸杞逆境适应性评价领域，具体涉及一种枸杞品种耐盐性的评价方法。
背景技术
枸杞，多年生落叶灌木，属于药食同源物种，分布于中国宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏等地区。枸杞的果实和叶片均含有丰富的营养成分和功效物质，是一味常用的中药材，同时也是非常重要的保健功能食品。近年来关于枸杞的育种、种植以及功效成分的研究等得到了广泛的关注。
盐碱土是指在自然因素和人为因素作用下，集聚大量可溶性盐的土壤。目前，土壤盐碱化是制约农业生产和经济发展的关键因素。枸杞属植物具有较强的耐盐碱和耐旱性，适宜在盐碱、干旱和沙荒地种植。枸杞作为中国西北地区植被恢复、荒漠化防治、盐碱地利用的先驱树种之一，改善其在盐碱地等极端环境下的生长状态，培育和筛选高耐盐性枸杞品种，具有重要的现实意义。
土壤中可溶性盐分过多对植物的不利影响称为盐害，而植物对盐害的耐受能力称为耐盐性。目前，现有技术中通常采用的是观察不同盐胁迫条件下幼苗生长发育状态以及利用种子萌发率来评价不同枸杞品种的耐盐性。以上方法虽然可以直观地展现出不同品种枸杞耐盐性的差异，但是对于枸杞耐盐性的评价比较粗略，缺乏精准的分析。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中评价枸杞品种耐盐性的方法比较粗略、缺乏精准分析的缺陷，从而提供一种新的枸杞品种耐盐性的评价方法。
本发明提供一种枸杞品种耐盐性的评价方法，包括：
将待评价的枸杞品种的幼苗分别扦插在不加NaCl的培养基和添加NaCl的培养基中进行培养，作为对照组和实验组；
分别取对照组和实验组培养后幼苗的叶片，检测叶片中脂质分子的含量，得出实验组相对于对照组含量发生显著变化的脂质分子的种类；
根据含量发生显著变化的脂质分子的种类数目和/或其含量变化大小来评价枸杞品种的耐盐性，其中，含量发生显著变化的脂质分子的种类数目越少，含量变化越小，则枸杞品种的耐盐性越高。
进一步的，在所述添加NaCl的培养基中，NaCl的浓度为100～200mmol/L，优选为150mmol/L。
进一步的，所述培养基为MS培养基。
进一步的，所述待评价的枸杞品种的幼苗，其获取方法包括：
剪取枸杞树新发的嫩枝，消毒处理后扦插在培养基上，于温室培养生长3～4周，优选为3周，再次剪取嫩枝进行无菌扩繁，剪取长度、茎粗一致的嫩枝幼苗用作所述待评价的枸杞品种的幼苗。
进一步的，所述培养是在温室中培养，光周期为10h光照和14h黑暗，温度25℃，湿度50～70％，培养21天。
进一步的，通过t检验得出实验组相对于对照组含量发生显著变化的脂质分子的种类。
进一步的，检测叶片中的脂质分子含量的方法包括预处理和仪器检测，其中，所述预处理包括：
(1)取叶片研磨后的粉末加入预热好的异丙醇，加热，加入全脂内标物、三氯甲烷和超纯水，涡旋，离心，取上清液1；
(2)向步骤(1)取上清液1后余下的液体中加入含BHT的三氯甲烷和甲醇的混合液，涡旋，离心，取上清液2；
(3)合并上清液1和上清液2并向其中加入KCl，涡旋，离心，取下清液，氮吹干，用异丙醇复溶，过滤，得到待测液，
优选的，在步骤(1)中，以每20mg叶片粉末的重量计，加入异丙醇3mL，全脂内标物100μL，三氯甲烷1.5mL，超纯水0.6mL；异丙醇的预热温度为75℃，加热时间为15min；全脂内标物的浓度为10μg/mL；涡旋时间为1h；
在步骤(2)中，混合液中三氯甲烷和甲醇的体积比为2：1，BHT的浓度为0.01％；重复提取3次，以每20mg叶片粉末的重量计，每次加入混合液的体积为4mL；涡旋时间为30min；
在步骤(3)中，KCl的浓度为1mol/L，以每20mg叶片粉末的重量计，加入KCl的体积为1mL；复溶加入的异丙醇的体积为1mL；用孔径0.22μm的有机滤膜进行过滤。
进一步的，所述仪器检测采用超高效液相色谱-串联质谱联用方法，其中，
色谱系统：shimadzu UPLC LC-30A；色谱柱：Phenomenex Kinete C18 column，100×2.1mm，2.6μm；进样量：1μL；流速：0.4mL/min；柱温：60℃；样品室温度：4℃；流动相A相：体积比为1：1：1的水、甲醇和乙腈的混合液，含5mmol/L醋酸铵；流动相B相：体积比为5：1的异丙醇和乙腈的混合液，含5mmol/L醋酸铵；梯度洗脱条件：0min→0.5min，A相：B相＝80:20，V/V；0.5min→1.5min，A相：B相＝60:40；1.5min→3.0min，A相：B相＝40:60；3.0min→13.0min，A相：B相＝80:20；13.0min→17.0min，A相：B相＝80:20；
质谱系统：AB Sciex TripleTOF 6600；ESI离子源：正模式；质谱采集的质量范围为m/z 100-1200；质谱条件：帘气：35.000psi；离子源气体1：50.000；离子源气体2：50.00；离子喷雾电压：5500.00V；离子源温度：600℃。
进一步的，所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，还包括：
分别取对照组和实验组培养后幼苗的叶片，检测叶片中脱落酸和/或茉莉酸的含量；
根据实验组相对于对照组叶片中脱落酸和/或茉莉酸含量变化的显著性来评价枸杞品种的耐盐性，其中，脱落酸和/或茉莉酸的含量变化显著性越高，则枸杞品种的耐盐性越高。
进一步的，检测叶片中脱落酸或茉莉酸的含量的方法包括：
(1)取叶片加液氮研磨成均匀的粉末；
(2)向步骤(1)得到的粉末中加入内标物，并加入提取试剂进行提取，得提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液浓缩、复溶、过滤，得到待测液；
(4)将步骤(3)得到的待测液使用超高效液相色谱-二级质谱联用法进行检测，通过内标法测定脱落酸或茉莉酸的含量，
优选的，在步骤(2)中，向步骤(1)得到的粉末中加入内标物，并加入所述提取试剂萃取、离心去除杂质，取上清液，即为所述提取液；检测脱落酸和茉莉酸时使用的提取试剂均为体积比为15:4:1的甲醇、水和甲酸的混合液；更优选的，以每100mg叶片粉末的重量计，加入脱落酸和/或茉莉酸的内标物的体积均为100μL，加入提取试剂的体积为1mL；
优选的，在步骤(3)中，将所述提取液离心，去上清，保留沉淀物，随后用质量分数80％的甲醇水溶液溶解所述沉淀物，待完全溶解后，过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，过滤所得溶液即为所述待测液；
优选的，在步骤(4)中，色谱系统：Shim-pack UFLC SHIMADAZU CBM30A；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18，1.8μm，2.1mm×100mm；流动相：水相为超纯水，含0.05％甲酸；有机相为乙腈，含0.05％甲酸；梯度洗脱条件：0min，超纯水：乙腈＝95:5，V/V；0min→1.0min，超纯水：乙腈＝95:5；1.0min→8.0min，超纯水：乙腈＝5:95；8.0min→9.0min，超纯水：乙腈＝5:95；9.0min→9.1min，超纯水：乙腈＝95:5；9.1min→12.0min，超纯水：乙腈＝95:5；流速0.35mL/min；柱温40℃；进样量2μL；
质谱系统：Applied Biosystems 6500Quadrupole Trap；质谱条件：电喷雾离子源温度：500℃；质谱电压：4500V；帘气：35psi；碰撞诱导电离参数：medium。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的枸杞品种耐盐性的评价方法，分别对枸杞幼苗作盐胁迫处理(添加NaCl)和不作盐胁迫处理(不加NaCl)，取幼苗的叶片进行脂质分子检测和分析，利用盐胁迫处理组相对于不作盐胁迫处理组含量发生显著变化的脂质分子的种类数目和/或含量变化作为耐盐性的评价指标。基于盐胁迫处理和不作盐胁迫处理时脂质分子的含量分析可以精准地反映不同枸杞品种之间的耐盐性高低，对于枸杞的抗逆育种工作具有重要的指导意义，在促进中国西北地区植被恢复、荒漠化防治、盐碱地利用的进程中具有广阔的应用前景。
2.本发明提供的枸杞品种耐盐性的评价方法，还进一步包括利用脱落酸和/或茉莉酸来评价枸杞品种耐盐性的步骤，通过利用盐胁迫处理组相对于不作盐胁迫处理组叶片中脱落酸和/或茉莉酸含量变化的显著性作为耐盐性的评价指标，可以辅助分析不同枸杞品种之间的耐盐性高低，有利于为枸杞的抗逆育种工作提供更进一步的指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中实验组和对照组的脂质分子种类数目对比图；
图2是本发明实施例1中实验组和对照组不同脂质亚类下的脂质分子种类数目对比图；
图3是本发明实施例1中实验组1和对照组1不同脂质分子的含量变化图；
图4是本发明实施例1中实验组2和对照组2不同脂质分子的含量变化图；
图5是本发明实施例2中实验组和对照组的ABA含量对比图；
图6是本发明实施例2中实验组和对照组的JA含量对比图；
图7是本发明实施例2中实验组和对照组的SA含量对比图；
图8是本发明实施例3中不同盐胁迫条件下幼苗生长发育状态对比图；
图9是本发明实施例4中实验组和对照组萌发率随时间的变化趋势图；
图10是本发明实施例4中培养第24天实验组与对照组的萌发率比例统计图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中所用的MS培养基，购买于日水生物有限公司，配方如下：大量元素4.23g/L，微量元素85.29mg/L，维生素103.1mg/L。
实施例中所用的脱落酸内标物：[2H6]-脱落酸；茉莉酸内标物：[2H5]-茉莉酸；水杨酸内标物：[2H4]-水杨酸；购买来源均为上海甄准生物科技有限公司。
实施例中所用的全脂内标物为13种重氢脂质内标的混合物，每种浓度为100μg/mL，购买于Avanti公司，产品编号为330731-1EA。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用原料或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品，包括但不限于本申请实施例中采用的原料或仪器。
实施例1
利用脂质分析来评价中国枸杞(Lycium Chinese)和黑果枸杞(LyciumRuthenicum)的耐盐性，方法如下：
(1)分别剪取中国枸杞树和黑果枸杞树的新发嫩枝(春天从枸杞树上剪取新发的嫩枝，即为没有木质化的枝条)，剪取嫩枝的长度约8厘米。在超净工作台中利用升汞(0.01％氯化汞)对剪取的嫩枝进行消毒处理，灭菌水清洗并晾干后，扦插在MS培养基上，于温室(光周期为10h光照和14h黑暗，温度25℃，湿度50％)培养生长3周，再次剪取长度约5厘米的嫩枝在超净台中进行无菌扩繁，然后剪取长度约5厘米、茎粗一致的嫩枝幼苗，用于后续操作。
(2)将步骤(1)获得的中国枸杞的幼苗分别扦插在不加NaCl的MS培养基和添加NaCl的MS培养基(NaCl的浓度为150mmol/L)中，并于温室(光周期为10h光照和14h黑暗，温度25℃，湿度50％)培养21天，作为对照组1(LC-mock)和实验组1(LC-NaCl)；
将步骤(1)获得的黑果枸杞的幼苗分别扦插在不加NaCl的MS培养基和添加NaCl的MS培养基(NaCl的浓度为150mmol/L)中，并于温室(光周期为10h光照和14h黑暗，温度25℃，湿度50％)培养21天，作为对照组2(LR-mock)和实验组2(LR-NaCl)；
分别将上述组别幼苗上的叶片从叶柄处剪下，并将叶片迅速冷冻于液氮中，随即保存在-80℃冰箱中，备用。
检测叶片中脂质分子的含量：取预先冻存在-80℃冰箱中的叶片加液氮研磨成均匀的粉末；称取20mg粉末，加入3mL预热至75℃的异丙醇，加热15min，加入100μL浓度为10μg/mL的全脂内标物、1.5mL三氯甲烷和0.6mL超纯水，涡旋1h，离心，取上清液1；取上清液1后余下的液体再加入4mL体积比为2：1的三氯甲烷和甲醇的混合液(含0.01％BHT)，涡旋30min，离心，取上清液2，重复三次；合并上清液1和上清液2，得到提取液；向提取液中加入1mL浓度为1mol/L的KCl，涡旋1h，离心，取下清液，氮吹干，用1mL异丙醇复溶，用0.22μm有机滤膜过滤，得到待测液。
(4)仪器检测：采用超高效液相色谱-质谱联用方法，其中，
色谱系统：shimadzu UPLC LC-30A；色谱柱：Phenomenex Kinete C18 column(100×2.1mm，2.6μm)；进样量：1μL；流速：0.4mL/min；柱温：60℃；样品室温度：4℃；流动相A相：体积比为1：1：1的水、甲醇和乙腈的混合液，含5mmol/L醋酸铵；流动相B相：体积比为5：1的异丙醇和乙腈的混合液，含5mmol/L醋酸铵；梯度洗脱条件：0min→0.5min，A相：B相＝80:20，V/V；0.5min→1.5min，A相：B相＝60:40；1.5min→3.0min，A相：B相＝40:60；3.0min→13.0min，A相：B相＝80:20；13.0min→17.0min，A相：B相＝80:20；
质谱系统：AB Sciex TripleTOF 6600；ESI离子源：正模式；质谱采集的质量范围为m/z 100-1200；质谱条件：帘气(Curtain Gas)：35.000psi；离子源气体1(Ion SourceGas1)：50.000；离子源气体2(Ion Source Gas2)：50.00；离子喷雾电压(IonSprayVoltage)：5500.00V；离子源温度(Temperature)：600℃。
(5)数据统计分析：使用软件sigmaplot进行数据统计分析，通过t检验(t-test)进行各组间脂质分子含量差异的显著性分析(*：p<0.05，差异性显著；**：p<0.01，差异性极显著)。
(6)结果分析：
①如图1所示，图中统计分析了盐胁迫对中国枸杞和黑果枸杞叶片中脂质分子种类数目的影响。通过对照组1和实验组1之间的对比(LC-mock_vs_LC-NaCl)可以看出，盐胁迫诱导中国枸杞叶片中36种脂质分子含量发生显著变化，其中约33种脂质分子的含量显著增多，3种脂质分子的含量显著减少。通过对照组2和实验组2之间的对比(LR-mock_vs_LR-NaCl)可以看出，盐胁迫在黑果枸杞叶片中只引起3种脂质分子的含量发生显著变化，且均为上调表达。同时，通过对照组1和对照组2之间的对比(LC-mock_vs_LR-mock)以及实验组1和实验组2之间的对比(LC-NaCl_vs_LR-NaCl)可以看出，无论在正常生长条件还是高盐胁迫条件下，与中国枸杞相比较，黑果枸杞叶片中含量发生显著变化的脂质分子大部分表现为上调表达。通过含量发生显著变化的脂质分子的种类数目来评价枸杞品种的耐盐性，需要调动抵御胁迫的脂质分子种类数目越少，耐盐性越强。由此得出黑果枸杞的耐盐性高于中国枸杞。
②脂质分子包含脂肪酸(FA)、溶血磷脂酸(LPA)、磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、甘油二酯(DG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)、单半乳糖甘油二酯(MGDG)、硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)、甘油三酯(TG)等多个亚类。如图2所示，图中统计分析了盐胁迫对中国枸杞以及黑果枸杞叶片中不同亚类下脂质分子种类数目的影响。由图中结果可见，盐胁迫诱导中国枸杞叶片中甘油三酯(TG)亚类下分子种类数目变化最多，甘油二酯(DG)亚类下的分子种类数目变化次之，其他亚类的脂质中只有少数种类含量发生变化；而在黑果枸杞中，盐胁迫只诱导两种磷脂酰乙醇胺(PE)分子和一种双半乳糖甘油二酯(DGDG)分子的含量发生显著变化。由此同样可以得出黑果枸杞的耐盐性高于中国枸杞。
③如图3所示(图中，FA：脂肪酸；LPA：溶血磷脂酸；LPC：溶血磷脂酰胆碱；LPE：溶血磷脂酰乙醇胺；PA：磷脂酸；PC：磷脂酰胆碱；PE：磷脂酰乙醇胺；PG：磷脂酰甘油；PI：磷脂酰肌醇；PMeOH：磷脂酰甲醇；PS：磷脂酰丝氨酸；DG：甘油二酯；DGDG：双半乳糖甘油二酯；MGDG：单半乳糖甘油二酯；SQDG：硫代异鼠李糖甘油二酯；TG：甘油三酯)，图中统计分析了盐胁迫对中国枸杞叶片中脂质分子含量的影响。通过对照组1和实验组1之间的对比(LC-mock_vs_LC-NaCl)可以看出，盐胁迫诱导中国枸杞叶片中36种脂质分子含量发生显著变化，其中22种甘油三酯(TG)上调表达，有7种脂质分子的含量变化达到2倍以上，其中的1种脂肪酸(FA)含量上调幅度最大，达3倍以上。只有三种甘油二酯(DG)的含量为下调表达，且下调幅度只有1倍左右。如图4所示，图中统计分析了盐胁迫对黑果枸杞叶片中脂质分子含量的影响。通过对照组2和实验组2之间的对比(LR-mock_vs_LR-NaCl)可以看出，盐胁迫仅诱导黑果枸杞叶片中3种脂质分子含量发生显著变化，且均为上调表达，包括2种磷脂酰乙醇胺(PE)和1种双半乳糖甘油二酯(DGDG)，三种脂质分子的上调幅度均较低，仅1.0～1.4倍。由此可见，黑果枸杞叶片中含量发生显著变化的脂质分子，其含量变化倍数低于中国枸杞，因此，由含量变化分析得出，黑果枸杞的耐盐性高于中国枸杞。
实施例2
利用激素分析来评价中国枸杞(Lycium Chinese)和黑果枸杞(LyciumRuthenicum)的耐盐性，方法如下：
(1)取实施例1中预先冻存在-80℃冰箱中的叶片，提取叶片中脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)：
取叶片加液氮研磨成均匀的粉末；
称取100mg粉末加入脱落酸、茉莉酸和水杨酸的内标物各100μL，并加入提取试剂(体积比为15:4:1的甲醇、水和甲酸的混合液)1mL萃取、离心去除杂质，取上清液，即得提取液；
将得到的提取液离心，去上清，保留沉淀物，随后用质量分数80％的甲醇水溶液溶解沉淀物，待完全溶解后，过0.22μm聚四氟乙烯(PTFE)滤膜，将过滤所得溶液(待测液)置于进样瓶中，用于下一步仪器分析。
(2)仪器检测：将步骤(1)得到的待测液使用超高液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)进行检测，通过内标法测定脱落酸、茉莉酸和水杨酸的含量：
色谱系统：Shim-pack UFLC SHIMADAZU CBM30A；色谱柱：Waters ACQUITY UPLCHSS T3 C18(1.8μm，2.1mm×100mm)；流动相：水相为超纯水，含0.05％甲酸；有机相为乙腈，含0.05％甲酸；梯度洗脱条件：0min，超纯水：乙腈＝95:5，V/V；0min→1.0min，超纯水：乙腈＝95:5，V/V；1.0min→8.0min，超纯水：乙腈＝5:95，V/V；8.0min→9.0min，超纯水：乙腈＝5:95，V/V；9.0min→9.1min，超纯水：乙腈＝95:5，V/V；9.1min→12.0min，超纯水：乙腈＝95:5，V/V；流速0.35mL/min；柱温40℃；进样量2μL；
质谱系统：Applied Biosystems 6500Quadrupole Trap；质谱条件：电喷雾离子源温度：500℃；质谱电压：4500V；帘气：35psi；碰撞诱导电离参数：medium。
最后用Analyst1.6.1进行质谱数据的处理分析，进而获得激素的定性定量分析数据。
(3)数据统计分析：使用软件sigmaplot进行数据统计分析，通过t检验(t-test)进行各组间激素含量差异的显著性分析(*：p<0.05，差异性显著；**：p<0.01，差异性极显著)。
(4)结果分析：
如图5所示，对中国枸杞(LC)来说，实验组(150mM NaCl)相对于对照组(mock)叶片中脱落酸(ABA)含量增加，并且图中可以看出盐胁迫诱导中国枸杞叶片中脱落酸含量增多，但是没有达到显著差异；对黑果枸杞(LR)来说，实验组(150mM NaCl)相对于对照组(mock)叶片中脱落酸(ABA)含量同样增加，并且图中可以看出盐胁迫诱导黑果枸杞叶片中脱落酸含量极显著地增多(p<0.01)。综上，黑果枸杞相对于中国枸杞叶片中脱落酸含量变化显著性更高，因此黑果枸杞品种的耐盐性高于中国枸杞。这与实施例1的评价结果相同。
如图6所示，对中国枸杞(LC)来说，实验组(150mM NaCl)相对于对照组(mock)叶片中茉莉酸(JA)含量降低，并且图中可以看出盐胁迫诱导中国枸杞叶片中茉莉酸含量显著降低(p<0.05)；对黑果枸杞(LR)来说，实验组(150mM NaCl)相对于对照组(mock)叶片中茉莉酸(JA)含量降低，并且图中可以看出盐胁迫诱导中国枸杞叶片中茉莉酸含量极显著地降低(p<0.01)。综上，黑果枸杞相对于中国枸杞叶片中茉莉酸含量变化显著性更高，因此黑果枸杞品种的耐盐性高于中国枸杞。这与实施例1的评价结果也相同。
如图7所示，对中国枸杞(LC)来说，实验组(150mM NaCl)相对于对照组(mock)叶片中水杨酸(SA)含量增加，并且图中可以看出盐胁迫诱导中国枸杞叶片中水杨酸含量增加，但是没有达到显著差异；对黑果枸杞(LR)来说，实验组(150mM NaCl)相对于对照组(mock)叶片中水杨酸(SA)含量降低，并且图中可以看出盐胁迫诱导中国枸杞叶片中水杨酸含量降低，同样没有达到显著差异。因此不选择水杨酸作为评价枸杞品种耐盐性的指标。
实施例3
通过观察不同盐胁迫条件下幼苗生长发育状态来评价中国枸杞(LyciumChinese)和黑果枸杞(Lycium Ruthenicum)的耐盐性，从而验证实施例1和实施例2方法的可靠性，具体方法如下：
取实施例1步骤(1)无菌扩繁后剪取的嫩枝幼苗，将中国枸杞幼苗和黑果枸杞幼苗分别扦插在含有不同浓度NaCl(0mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L)的MS培养基中，于温室(光周期为10h光照和14h黑暗，温度25℃，湿度50％)培养21天后，将枸杞幼苗连根一起轻轻从MS培养基中分离取出，洗干净枸杞幼苗根部粘连的培养基，用吸水纸吸干水分，随后对枸杞幼苗拍照，观察。
如图8所示，150mmol/L浓度NaCl胁迫已经开始抑制枸杞幼苗的生长发育，但不会对枸杞幼苗引起致死的效果，随着NaCl浓度的升高，对枸杞幼苗带来的胁迫伤害愈加严重，并且由图也可以看出，相同盐胁迫条件下对中国枸杞比黑果枸杞的伤害更严重，所以得出黑果枸杞的耐盐性高于中国枸杞，这与实施例1和实施例2的评价结果相同。因此，本发明提供的评价方法可靠，能够用来评价不通枸杞品种的耐盐性。
实施例4
通过计算盐胁迫条件下种子萌发率来评价中国枸杞(Lycium Chinese)和黑果枸杞(Lycium Ruthenicum)的耐盐性，从而验证实施例1和实施例2方法的可靠性，具体方法如下：
将中国枸杞和黑果枸杞干燥的果实人工破碎，通过流动水从果肉中分离出种子，选择大小相同且饱满的种子用于后续实验。实验前将枸杞种子用0.1％次氯酸钠溶液表面灭菌10分钟，然后用无菌水冲洗5～6次，于超净工作台中吹干表面水分。将干燥的中国枸杞种子与黑果枸杞种子分别点种于不含NaCl的MS培养基和含150mmol/LNaCl的MS培养基上，于4℃冰箱层积处理3天，随后置于温室(光周期为10h光照和14h黑暗，温度25℃，湿度50％)培养。从点种第3天开始至点种第24天每天统计中国枸杞对照组(LC-mock)、中国枸杞实验组(LC-150mM NaCl)、黑果枸杞对照组(LR-mock)、黑果枸杞实验组(LR-150mM NaCl)的种子萌发率，并分别计算点种第24天中国枸杞和黑果枸杞的实验组/对照组的种子萌发率比例。使用软件sigmaplot进行数据统计分析，通过t检验(t-test)进行中国枸杞和黑果枸杞之间种子萌发率比例的显著性分析(*：p<0.05，差异性显著；**：p<0.01，差异性极显著)。
如图9和图10所示，盐胁迫不同程度的降低了中国枸杞与黑果枸杞种子的萌发率，并且对中国枸杞种子萌发率的抑制程度高于黑果枸杞。因此，黑果枸杞的耐盐性高于中国枸杞，这与实施例1和实施例2的评价结果相同。因此，更进一步证明了本发明提供的评价方法可靠，能够用来评价不通枸杞品种的耐盐性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，所述枸杞品种为中国枸杞和黑果枸杞，所述枸杞品种耐盐性的评价方法包括：
将待评价的枸杞品种的幼苗分别扦插在不加NaCl的培养基和添加NaCl的培养基中进行培养，作为对照组和实验组；
分别取对照组和实验组培养后幼苗的叶片，检测叶片中脂质分子的含量，得出实验组相对于对照组含量发生显著变化的脂质分子的种类；
根据含量发生显著变化的脂质分子的种类数目和/或其含量变化大小来评价枸杞品种的耐盐性，其中，含量发生显著变化的脂质分子的种类数目越少，含量变化越小，则枸杞品种的耐盐性越高，
检测叶片中的脂质分子含量的方法包括预处理和仪器检测，其中，所述预处理包括：
（1）取叶片研磨后的粉末加入预热好的异丙醇，加热，加入全脂内标物、三氯甲烷和超纯水，涡旋，离心，取上清液1；
（2）向步骤（1）取上清液1后余下的液体中加入含BHT的三氯甲烷和甲醇的混合液，涡旋，离心，取上清液2；
（3）合并上清液1和上清液2并向其中加入KCl，涡旋，离心，取下清液，氮吹干，用异丙醇复溶，过滤，得到待测液，
在步骤（1）中，以每20mg叶片粉末的重量计，加入异丙醇3mL，全脂内标物100μL，三氯甲烷1.5mL，超纯水0.6mL；异丙醇的预热温度为75℃，加热时间为15min；全脂内标物的浓度为10μg/mL；涡旋时间为1h；
在步骤（2）中，混合液中三氯甲烷和甲醇的体积比为2：1，BHT的浓度为0.01%；重复提取3次，以每20mg叶片粉末的重量计，每次加入混合液的体积为4mL；涡旋时间为30min；
在步骤（3）中，KCl的浓度为1mol/L，以每20mg叶片粉末的重量计，加入KCl的体积为1mL；复溶加入的异丙醇的体积为1mL；用孔径0.22μm的有机滤膜进行过滤，所述仪器检测采用超高效液相色谱-串联质谱联用方法，其中，
色谱系统：shimadzu UPLC LC-30A；色谱柱：Phenomenex Kinete C18 column，100×2.1mm，2.6μm；进样量：1μL；流速：0.4mL/min；柱温：60℃；样品室温度：4℃；流动相A相：体积比为1：1：1的水、甲醇和乙腈的混合液，含5mmol/L醋酸铵；流动相B相：体积比为5：1的异丙醇和乙腈的混合液，含5mmol/L醋酸铵；梯度洗脱条件：0min→0.5min，A相：B相=80:20，V/V；0.5min→1.5min，A相：B相=60:40；1.5min→3.0min，A相：B相=40:60；3.0min→13.0min，A相：B相=80:20；13.0min→17.0min，A相：B相=80:20；
质谱系统：AB Sciex TripleTOF 6600；ESI离子源：正模式；质谱采集的质量范围为m/z100-1200；质谱条件：帘气：35.000 psi；离子源气体1：50.000；离子源气体2：50.00；离子喷雾电压：5500.00V；离子源温度：600℃。
2.根据权利要求1所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，在所述添加NaCl的培养基中，NaCl的浓度为100~200mmol/L。
3.根据权利要求2所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，在所述添加NaCl的培养基中，NaCl的浓度为150mmol/L。
4.根据权利要求1或2所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，所述培养基为MS培养基。
5.根据权利要求1或2所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，所述待评价的枸杞品种的幼苗，其获取方法包括：
剪取枸杞树新发的嫩枝，消毒处理后扦插在培养基上，于温室培养生长3~4周，再次剪取嫩枝进行无菌扩繁，剪取长度、茎粗一致的嫩枝幼苗用作所述待评价的枸杞品种的幼苗。
6.根据权利要求1或2所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，所述培养是在温室中培养，光周期为10h光照和14h黑暗，温度25℃，湿度50~70%，培养21天。
7.根据权利要求1或2所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，通过t检验得出实验组相对于对照组含量发生显著变化的脂质分子的种类。
8.根据权利要求1或2所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，还包括：
分别取对照组和实验组培养后幼苗的叶片，检测叶片中脱落酸和/或茉莉酸的含量；
根据实验组相对于对照组叶片中脱落酸和/或茉莉酸含量变化的显著性来评价枸杞品种的耐盐性，其中，脱落酸和/或茉莉酸的含量变化显著性越高，则枸杞品种的耐盐性越高。
9.根据权利要求8所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，检测叶片中脱落酸或茉莉酸的含量的方法包括：
（1）取叶片加液氮研磨成均匀的粉末；
（2）向步骤（1）得到的粉末中加入内标物，并加入提取试剂进行提取，得提取液；
（3）将步骤（2）得到的提取液浓缩、复溶、过滤，得到待测液；
（4）将步骤（3）得到的待测液使用超高效液相色谱-二级质谱联用法进行检测，通过内标法测定脱落酸或茉莉酸的含量。
10.根据权利要求9所述的枸杞品种耐盐性的评价方法，其特征在于，
在步骤（2）中，向步骤（1）得到的粉末中加入内标物，并加入所述提取试剂萃取、离心去除杂质，取上清液，即为所述提取液；检测脱落酸和茉莉酸时使用的提取试剂均为体积比为15:4:1的甲醇、水和甲酸的混合液；以每100mg叶片粉末的重量计，加入脱落酸和/或茉莉酸的内标物的体积均为100μL，加入提取试剂的体积为1mL；
在步骤（4）中，色谱系统：Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A；色谱柱：Waters ACQUITYUPLC HSS T3 C18，1.8μm，2.1mm×100mm；流动相：水相为超纯水，含0.05%甲酸；有机相为乙腈，含0.05%甲酸；梯度洗脱条件：0min，超纯水：乙腈=95:5，V/V；0min→1.0min，超纯水：乙腈=95:5；1.0min→8.0min，超纯水：乙腈=5:95；8.0min→9.0min，超纯水：乙腈=5:95；9.0min→9.1min，超纯水：乙腈=95:5；9.1min→12.0min，超纯水：乙腈=95:5；流速0.35mL/min；柱温40℃；进样量2μL；
质谱系统：Applied Biosystems 6500 Quadrupole Trap；质谱条件：电喷雾离子源温度：500℃；质谱电压：4500V；帘气：35 psi；碰撞诱导电离参数：medium。
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