CN113514575B - 一种鉴定检测锰诱导的甘蔗分泌物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定检测锰诱导的甘蔗分泌物的方法：(1)甘蔗幼苗培养及解锰毒根分泌物的诱导；(2)根分泌物的收集；(3)根分泌物的浓缩；(4)分泌物的分离、鉴定；(5)液质联用定性鉴定结果的确认；(6)根分泌物浓度和分泌量的定量测定。本发明方法能够快速分离并高灵敏、高重现、高准确地鉴定甘蔗根系分泌物，鉴定锰毒胁迫诱导分泌物为3‑吡啶甲酰胺，检测精准度达1.0μg/L以上；本发明还能快速鉴定根系分泌物对于锰毒害的解毒功能。

Description

一种鉴定检测锰诱导的甘蔗分泌物的方法
技术领域
本发明涉及一种收集检测和鉴定甘蔗根系分泌物的方法，特别涉及一种检测鉴定解锰毒的甘蔗根系分泌物的方法。
背景技术
过多的锰离子是酸性土壤中限制作物生长和产量提高的重要因素，近年来，我国南方地区种植的甘蔗出现大面积的锰毒问题，甘蔗的生长严重受阻、产量和品质大幅度降低，严重威胁着我国的食糖安全。筛选、种植现有的耐锰作物品种，或者培育耐锰的作物新品种，是解决酸性土壤中甘蔗锰毒问题的最经济、有效的途径。作物对土壤中过多的锰毒害的抗性有明显的基因型差异，挖掘锰毒抗性作物的解锰毒新物质，对于土壤中锰的解毒及耐锰作物新品种的培育均有重要意义。另一方面，锰毒抗性的基因型可能通过根系分泌物解除锰对植物的毒害。这些分泌物无论在作物锰毒调控、生长介质中的解锰毒上，还是其作为抗性标志物而在耐锰作物的筛选及耐锰新品种培育上均有应用前景。
有关根系分泌物收集，主要采用培养液培养植物后直接收集培养液或氯化钙等简单溶液的方法来进行，培养液中的根系分泌物通过离子交换、层析等方法进行富集。这些分泌物的收集和富集方法仅适用于某些特定类别的根系分泌物，如离子交换方法适用于于有机酸等离子型分泌物的富集，C18吸附法只适合于极性差异的有机物组分的收集和富集。这些方法收集和富集到的根系分泌物由于含盐量过高也不适用于采用质谱、液质、气质等方法进行分泌物中有机组分物质的定性鉴定。对于根系分泌物鉴定和定量测定常常采用液相色谱、气相色谱或分光光度等方法。然而，色谱法和分光光度对构成复杂的分泌物中未知物质判断的依据在于色谱分离后的保留时间或对某些特定波长的光的吸收特性，鉴定的未知有机物常常是一类在色谱柱上保留特性相近或吸光性质相同的物质，难以对分泌物中未知物进行准确鉴定并因此影响定性分析的结果的可靠性。对于根系分泌物解毒功能鉴定和应用潜力评价，通常也采用培养试验或田间试验等的方法分析分泌物对植物产量等的影响进行。这些方法，操作麻烦、耗时长达数周至数月，而田间试验方法常需要使用大量的根系分泌物，且受多种自然环境因素的干扰则使得田间试验的结果需要在不同的区域、不同季节、不同年份的自然条件下进行大量重复试验验证。
发明内容
本发明针对上述技术问题，发明一种收集检测鉴定解锰毒的甘蔗根系分泌物的方法，旨在得到一种能够有效鉴定出解锰毒的甘蔗根分泌物，并且对该分泌物浓度和分泌量进行高精度的测定。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种鉴定检测锰诱导的甘蔗分泌物的方法，包含以下操作步骤：
(1)甘蔗幼苗培养及解锰毒根分泌物的诱导：采用“水培甘蔗幼苗培养装置”(ZL201821550320.1)准备甘蔗种茎并在种茎上萌发的幼苗的根长达5-10mm后将幼苗移栽并培养在1/5强度的Hogland培养液中8-20d，然后，将幼苗继续培养在含0.1-0.2mM MnCl2(Mn2+)的Hogland培养液中，培养1～3d；
(2)根分泌物的收集：经步骤(1)培养的后所得幼苗根系依次浸入0.5mM CaCl2溶液、去离子水、灭菌水中各1min后，将幼苗根系浸没至灭菌水中2～4h(t)；
(3)根分泌物的浓缩：将步骤(2)中50～400mL(V0)浸泡了幼苗根系的灭菌水放入1000mL浓缩瓶中，所述灭菌水中含有根系分泌物，浓缩瓶中的溶液在旋转蒸发仪上减压浓缩至近干后将浓缩液转移至50mL浓缩瓶中，残留在1000mL浓缩瓶的浓缩液以5mL甲醇溶液洗涤并重复洗涤3次，每次洗涤液均与上述50mL浓缩瓶中的溶液合并，50mL浓缩瓶中的溶液再次减压浓缩至干后，加入1.00mL甲醇-水溶液洗脱浓缩瓶中的分泌物，得复溶液；
(4)分泌物的分离、鉴定：将步骤(3)中所得复溶液用0.22μm有机滤膜过滤，滤液采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(UPLC-QQQ-MS/MS)进行分离鉴定；色谱分离条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，B为甲醇溶液；流速为0.3mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL；梯度洗脱程序：0～1min 1％的甲醇；1～7min 1％～100％的甲醇；7～9min 100％的甲醇；9.1～12min1％的甲醇；质谱条件：电喷雾离子源，扫描方式：正离子多重反应监测(MRM)模式；雾化气：氮气；碰撞气：氮气；毛细管电压：4200V；锥孔电压：45V；挡板电压：700V；离子源温度：105℃；脱溶剂气体温度：480℃；锥孔气体流量：72L/h；脱溶剂气体流速：540L/h；反吹气流速：120L/h；碰撞气流速：42mL/h；在正离子模式下进行全扫描获得母离子峰后，在碰撞能量分别为28、32eV，锥孔电压为45V下采集母离子的二级定性离子信号，质谱检测器上如检测到母离子(m/z为123.01)、子离子(m/z为52.80、79.89)信号，初步鉴定复溶液中的有机物质有3-吡啶甲酰胺；
(5)液质联用定性鉴定结果的确认：将步骤(4)中初步定性鉴定出的有机物质3-吡啶甲酰胺标准物，按照步骤(4)的分离条件进行分离，采集二次质谱信息并与甲醇溶解液质谱信息对比；如标准物与复溶液中均有相同母离子和子离子信号峰，即可确认复溶液也即根分泌物溶液中的有机物有3-吡啶甲酰胺；按步骤(1)培养甘蔗幼苗于含0(对照)或0.1-0.2mM Mn2+培养液中后，按步骤(1)-(4)收集、分离分泌物组分，采集3-吡啶甲酰胺的定量离子(m/z 79.8、53.8)信号，如Mn2+培养液中培养的根分泌物图谱中3-吡啶甲酰胺信号强于对照的信息，即可确认3-吡啶甲酰胺是锰胁迫诱导的根分泌物；
(6)根分泌物浓度和分泌量的定量测定：将步骤(3)中所得含根分泌物的复溶液和3-吡啶甲酰胺标准物溶液(浓度0-200ng/mL)，按照步骤(4)的分离条件进行分离并采集定量离子质谱信号；以3-吡啶甲酰胺浓度为横坐标(x)，以质谱信号强度为纵坐标(y)在Excel中绘制散点图，添加y随x变化而变化的趋势线、显示相关曲线y＝a+bx；将复溶液样品的质谱信息强度(yi)代入上述相关曲线，计算相应的xi值；根据xi(μg/mL)和步骤(3)中灭菌水体积(V0)、根重(W，g)等信息，计算3-吡啶甲酰胺分泌物的浓度(C＝xi÷V0)(μg/mL)、分泌量(E＝C×V0÷W)(mg/kg)、分泌速率(S＝E/t)。
如上所述方法可用于选育在锰毒胁迫下分泌3-吡啶甲酰胺的抗锰毒品种。
如上所述3-吡啶甲酰胺在解锰毒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明方法能够快速分离并高灵敏、高重现、高准确地鉴定甘蔗根系分泌物，鉴定锰毒胁迫诱导分泌物为3-吡啶甲酰胺，检测分泌物中的3-吡啶甲酰胺的精准度达1.0ng/mL以上；本发明还能快速鉴定根系分泌物对于锰毒害的解毒功能。
附图说明
图1是各组分二级质谱图；其中，分泌物为甘蔗根分泌物的二级质谱图，(a)为3-吡啶甲酰胺二级质谱图，(b)为结构类似物烟酸的二级质谱图。
图2是锰和对照处理的根分泌物的质谱图。
图3是3-吡啶甲酰胺浓度(x)与质谱响应信号(y)的相关曲线，其中(a)图中3-吡啶甲酰胺的浓度范围为0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0mg/L；(b)图3-吡啶甲酰胺的浓度为0、25、50、75、125、150、200mg/L。
图4是3-吡啶甲酰胺对锰引起的甘蔗根生长及根尖对伊文思蓝吸附量、活性氧和丙二醛积累量的影响；其中(a)为根相对生长率，(b)为根吸附的伊文思蓝对620nm光的吸收值，(c)活性氧积累量，(d)丙二醛积累量。
图5是3-吡啶甲酰胺(a)和烟酸(b)标准溶液二级定性定量质谱图。
图6是3-吡啶甲酰胺(保留时间1.84min)和烟酸(保留时间2.52min)质谱分离的总离子流图。
图7是不同甘蔗品种在锰毒胁迫条件下根分泌3-吡啶甲酰胺及叶片锰积累量的差异。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
实施例1
一种鉴定检测锰诱导的甘蔗分泌物的方法，具体操作步骤如下：
(1)甘蔗幼苗培养及解锰毒根分泌物的诱导：采用“水培甘蔗幼苗培养装置”(ZL201821550320.1)准备甘蔗种茎并在种茎上萌发的幼苗的根长至长5mm后将幼苗培养在1/5强度Hogland培养液中15d后，移植至含0.1mM MnCl2的Hogland培养液中，培养1d；
(2)根分泌物的收集：经步骤(1)培养后所得幼苗根系依次浸入0.5mM CaCl2溶液、去离子水、灭菌水中各1min后，将幼苗根系浸没至灭菌水中4h(t)；
(3)根分泌物的浓缩：将步骤(2)中200mL(V0)浸泡了幼苗根系的灭菌水放入1000mL浓缩瓶中，所述灭菌水中含有根系分泌物，浓缩瓶中的溶液在旋转蒸发仪上减压浓缩至近干后将浓缩液转移至50mL浓缩瓶中，残留在1000mL浓缩瓶的浓缩液以5mL甲醇溶液洗涤并重复洗涤3次，每次洗涤液均与上述50mL浓缩瓶中的溶液合并，50mL浓缩瓶中的溶液再次减压浓缩至干后，加入1.00mL50％甲醇-水溶液洗脱浓缩瓶中的分泌物，得复溶液；
(4)分泌物的分离、鉴定：将步骤(3)中所得复溶液用0.22μm有机滤膜过滤，滤液采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(UPLC-QQQ-MS/MS)进行分离鉴定；色谱分离条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，B为甲醇溶液；流速为0.3mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL；梯度洗脱程序：0～1min 1％的甲醇；1～7min 1％～100％的甲醇；7～9min 100％的甲醇；9.1～12min1％的甲醇；质谱条件：电喷雾离子源，扫描方式：正离子多重反应监测(MRM)模式；雾化气：氮气；碰撞气：氮气；毛细管电压：4200V；锥孔电压：45V；挡板电压：700V；离子源温度：105℃；脱溶剂气体温度：480℃；锥孔气体流量：72L/h；脱溶剂气体流速：540L/h；反吹气流速：120L/h；碰撞气流速：42mL/h；以表1条件在正离子模式下进行全扫描获得母离子峰后，采集母离子的二级定性离子信号。质谱检测器上如检测到母离子(m/z为123.01)、子离子(m/z为52.80、79.89)信号，初步鉴定复溶液中的有机物质有3-吡啶甲酰胺；
表1.3-吡啶甲酰胺的质谱条件
Figure BDA0003032914530000061
(5)液质联用定性鉴定结果的确认：将步骤(4)中初步定性鉴定出的有机物质3-吡啶甲酰胺标准物，按照步骤(4)的分离条件进行分离，采集二次质谱信息并与甲醇溶解液质谱信息对比，如标准物与复溶液中均有相同母离子和子离子信号峰，即可确认复溶液也即根分泌物溶液中的有机物有3-吡啶甲酰胺；按步骤(1)培养甘蔗幼苗于含0(对照)或0.1-0.2mM Mn2+培养液中后，按步骤(1)-(4)收集、分离分泌物组分，采集3-吡啶甲酰胺的定量离子(m/z 79.8、53.8)信号，如Mn2+培养液中培养的根分泌物图谱中3-吡啶甲酰胺信号强于对照的信息，即可确认3-吡啶甲酰胺是锰胁迫诱导的根分泌物；
(6)根分泌物浓度和分泌量的定量测定：将步骤(3)中所得含根分泌物的复溶液和3-吡啶甲酰胺标准物溶液(浓度0-200ng/mL)，按照步骤(4)的分离条件进行分离并采集定量离子质谱信号；以3-吡啶甲酰胺浓度为横坐标(x)，以质谱信号强度为纵坐标(y)在Excel中绘制散点图，添加y随x变化而变化的趋势线、显示相关曲线y＝a+bx；将复溶液样品的质谱信息强度(yi)代入上述相关曲线，计算相应的xi值；根据xi(μg/mL)和步骤(3)中灭菌水体积(V0)、根重(W，g)等信息，计算3-吡啶甲酰胺分泌物的浓度(C＝xi÷V0)(μg/mL)、分泌量(E＝C×V0÷W)(mg/kg)、分泌速率(S＝E/t)。
实施例2
一种鉴定检测锰诱导的甘蔗分泌物的方法，具体操作步骤如下：
(1)甘蔗幼苗培养及解锰毒根分泌物的诱导：采用“水培甘蔗幼苗培养装置”(ZL201821550320.1)准备甘蔗种茎并并在种茎上萌发的幼苗的根长至长10mm后将幼苗培养在1/5强度的Hogland培养液中18d后，移植至含0.2mM MnCl2的Hogland培养液中，培养2d；
(2)根分泌物的收集：经步骤(1)培养后所得幼苗根系依次浸入0.5mM CaCl2溶液、去离子水、灭菌水中各1min后，将幼苗根系浸没至灭菌水中3h(t)；
(3)根分泌物的浓缩：将步骤(2)中浸泡了幼苗根系的灭菌水100mL(V0)放入1000mL浓缩瓶中，所述灭菌水中含有根系分泌物，浓缩瓶中的溶液在旋转蒸发仪上减压浓缩至近干后将浓缩液转移至50mL浓缩瓶中。残留在1000mL浓缩瓶的浓缩液以5mL甲醇溶液洗涤并重复洗涤3次，每次洗涤液均与上述50mL浓缩瓶中的溶液合并，50mL浓缩瓶中的溶液再次减压浓缩至干后，加入1.00mL50％甲醇-水溶液洗脱浓缩瓶中的分泌物，得复溶液；
(4)分泌物的分离、鉴定：将步骤(3)中所得复溶液用0.22μm有机滤膜过滤，滤液采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(UPLC-QQQ-MS/MS)进行分离鉴定；色谱分离条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，B为甲醇溶液；流速为0.3mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL；梯度洗脱程序：0～1min 1％的甲醇；1～7min 1％～100％的甲醇；7～9min 100％的甲醇；9.1～12min1％的甲醇；质谱条件：电喷雾离子源，扫描方式：正离子多重反应监测(MRM)模式；雾化气：氮气；碰撞气：氮气；毛细管电压：4200V；锥孔电压：45V；挡板电压：700V；离子源温度：105℃；脱溶剂气体温度：480℃；锥孔气体流量：72L/h；脱溶剂气体流速：540L/h；反吹气流速：120L/h；碰撞气流速：42mL/h；以表1条件在正离子模式下进行全扫描获得母离子峰后，采集母离子的二级定性离子信号。质谱检测器上如检测到母离子(m/z为123.01)、子离子(m/z为52.80、79.89)信号，初步鉴定复溶液中的有机物质有3-吡啶甲酰胺；
表1.3-吡啶甲酰胺的质谱条件
Figure BDA0003032914530000071
(5)液质联用定性鉴定结果的确认：将步骤(4)中初步定性鉴定出的有机物质3-吡啶甲酰胺标准物，按照步骤(4)的分离条件进行分离，采集二次质谱信息并与甲醇溶解液质谱信息对比，如标准物与复溶液中均有相同母离子和子离子信号峰，即可确认复溶液也即根分泌物溶液中的有机物有3-吡啶甲酰胺；按步骤(1)培养甘蔗幼苗于含0(对照)或0.1-0.2mM Mn2+培养液中后，按步骤(1)-(4)收集、分离分泌物组分，采集3-吡啶甲酰胺的定量离子(m/z 79.8、53.8)信号，如Mn2+培养液中培养的根分泌物图谱中3-吡啶甲酰胺信号强于对照的信息，即可确认3-吡啶甲酰胺是锰胁迫诱导的根分泌物；
(6)根分泌物浓度和分泌量的定量测定：将步骤(3)中所得含根分泌物的复溶液和3-吡啶甲酰胺标准物溶液(浓度0-200ng/mL)，按照步骤(4)的分离条件进行分离并采集定量离子质谱信号；以3-吡啶甲酰胺浓度为横坐标(x)，以质谱信号强度为纵坐标(y)在Excel中绘制散点图，添加y随x变化而变化的趋势线、显示相关曲线y＝a+bx；将复溶液样品的质谱信息强度(yi)代入上述相关曲线，计算相应的xi值；根据xi(μg/mL)和步骤(3)中灭菌水体积(V0)、根重(W，g)等信息，计算3-吡啶甲酰胺分泌物的浓度(C＝xi÷V0)(μg/mL)、分泌量(E＝C×V0÷W)(mg/kg)、分泌速率(S＝E/t)。
实施例3
采用本发明的方法可以收集并准确鉴定到甘蔗根系分泌的3-吡啶甲酰胺：
1、3-吡啶甲酰胺的定性鉴定
采用上述实施例1方法(即在含0.1mM MnCl21/5强度的Hogland培养液中培养甘蔗幼苗后，收集根系分泌物并浓缩100倍后在液质联用仪上进行未知分泌物的鉴定)，结果表明，0.1mM MnCl2溶液处理的甘蔗根系分泌物的二级质谱图中出现质m/z为123的母离子的子离子(m/z 52.8/79.8的子离子(图1a)，并与3-吡啶甲酰胺标准物的图谱一致。并且，3-吡啶甲酰胺与其结构类似物烟酸(图1b)(母离子m/z124)的子离子的m/z(77.8、79.8)不同。可见，采用本发明技术可以分离、鉴定甘蔗根系分泌物中的3-吡啶甲酰胺。
采用本发明步骤(1-6)收集2μM(对照)、0.1mM(Mn)MnCl2溶液中培养1d后收集、分离甘蔗根分泌物，可在质谱检测器上检测到保留时间为1.77min的3-吡啶甲酰胺信号峰(图2)，且Mn溶液中甘蔗根根分泌物的质谱图上3-吡啶甲酰胺信号峰明显高于对照的信号，说明本发明可灵敏、准确低鉴定锰诱导甘蔗根分泌的3-吡啶甲酰胺。
2、3-吡啶甲酰胺的定量测定：
以3-吡啶甲酰胺标准品，配制0、2.5、5.0、10、20、50mg/L，或0、25、50、75、100、150、200mg/L的标准溶液，以本发明的液质联用分析条件，分别在液质联用仪上进样获取3-吡啶甲酰胺在质谱检测器上的响应信号，并以上述浓度的3-吡啶甲酰胺标准品的响应信号为纵坐标、以3-吡啶甲酰胺标准品浓度为横坐标绘制标准曲线(图3)，并在实施例2步骤(3)复溶液中添加10mg/L的3-吡啶甲酰胺后测定其回收率。
结果表明，以本发明的条件测定3-吡啶甲酰胺信号响应值与浓度(0-200mg/L)呈极显著的正相关，相关系数达1.00(图3)。加标回收率试验表明，在甘蔗根系分泌物待测溶液中添加10mg/L的3-吡啶甲酰胺后，3-吡啶甲酰胺的回收率高达95％，说明本发明的方法能有效分离并准确测定甘蔗根分泌物中的3-吡啶甲酰胺。
3、采用本发明实施例1操作方法，在含0、0.1、0.5、2.0、8.0mM MnCl2的培养液中培养甘蔗幼苗后，收集根系分泌物并浓缩100倍后在液质联用仪上进行3-吡啶甲酰胺分离和定量测定。结果表明，在0、0.1、0.5、2.0、8.0mM MnCl2处理后，根系分泌3-吡啶甲酰胺的速率分别为0.01、2.89、0.61、0.66、0.74mg/(kg.h)，对应根系分泌物收集液(步骤(2)中浸泡入根系的灭菌水)中3-吡啶甲酰胺浓度为3.09、7.70、3.67、1.25、0.95μg/L。可见，0.1mM是适宜的诱导根系分泌3-吡啶甲酰胺的锰处理浓度，且本发明的方法可收集检测到根系分泌、浓度低于1.0μg/L的3-吡啶甲酰胺，所发明的方法具有高灵敏度的特点。
4、采用本发明实施例2操作方法，在步骤(1)中含0.2mM MnCl2的培养液中培养甘蔗并隔天更换处理溶液。于处理后的第8天，分别(1)收集步骤1培养液，浓缩100倍、水溶、过滤后，采用高效液相色谱(C18柱，5μm，250mm×4.6mm)分离，7％甲醇-2％异丙醇-0.1％庚烷磺酸钠为流动相，紫外可见检测器检测，波长496nm；(2)采用(1)方法制备待测液，并采用本发明的实施例2步骤(4)方法在液质联用仪上分离、鉴定根系分泌物中的3-吡啶甲酰胺；(3)采用本发明的方法步骤(1)和步骤(3)，在锰处理后以无菌水收集分泌物后采用液相色谱分离、鉴定分泌物中的3-吡啶甲酰胺，分离条件同(1)；(4)采用本发明的方法步骤(1)和步骤(3)，在锰处理后以无菌水收集分泌物后采用液质联用技术鉴定分泌物中的3-吡啶甲酰胺，并定量测定其浓度、计算其分泌速率。
结果如表2所示，采用上述方法(1)、(3)未见保留时间为1.7min的3-吡啶甲酰胺吸收峰。采用方法(2)收集到的根系分泌物在液质联用仪上分离后，质谱离子源堵塞，无质谱信号。相反，采用本发明的方法实施例2，收集并分离根系分泌物中的3-吡啶甲酰胺，在质谱检测器上可见3-吡啶甲酰胺特征信号，分泌速率达4.39mg/(kg.h)。可见，采用本发明的方法收集和浓缩的甘蔗分泌物方法优于液相色谱法和方法(2)，所发明方法的准确度高。
表2.不同的收集和鉴定对甘蔗根系分泌物中的尼克酰胺测定结果比较
Figure BDA0003032914530000101
注：-/+表示无/有检测信号
5、采用本发明实施例1步骤(4)方法，分离3-吡啶甲酰胺和烟酸2种化合物的标准溶液，在正、负离子模式下进行全扫描；结果表明，在正离子模式下，2种化合物均获得分子离子峰，且离子化效率高；在确定3-吡啶甲酰胺母离子(m/z123)和烟酸母离子(m/z124)之后，进行二级质谱优化；结果表明(图5)，3-吡啶甲酰胺和烟酸的二级质谱不同，m/z为52.8的离子可作为3-吡啶甲酰胺的定性离子，采集m/z52.8、79.8离子对信号可准确鉴定样品中的3-吡啶甲酰胺。
6、采用本发明实施例1步骤(4)方法对3-吡啶甲酰胺色谱条件进行研究，首先比较C18柱、T3柱对3-吡啶甲酰胺及其结构类似物烟酸分离的影响，发现T3柱对各待测物响应稳定，色谱峰形好；然后，考察了甲醇-水溶液、甲醇-0.1％甲酸水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.1％甲酸水溶液流动相对3-吡啶甲酰胺和烟酸分离度的影响，结果显示选择T3柱为色谱柱甲醇-0.1％甲酸水溶液为流动相，目标化合物色谱峰形好，分离度好(图6)。
采用本发明的方法可以收集并快速鉴定到甘蔗根系分泌的3-吡啶甲酰胺具有解锰毒功能。
7、采用本发明方法步骤1准备并培养甘蔗幼苗并在含2(对照，正常锰水平)或200μM MnCl2(Mn)培养液中分别加入0、100μM 3-吡啶甲酰胺，5、21d后分别测定叶片的SPAD值和植株生物产量。
结果表明，虽然处理5d后观测不到200μM锰对植株生物产量和叶片叶绿素含量的显著影响，但延长处理时间至21d后植株的生物产量和叶绿素含量均显著减少(表3)，说明供试条件下甘蔗受到锰的毒害。在200μM锰溶液中添加3-吡啶甲酰胺5d后，植株的生物产量和叶片叶绿素含量与不加3-吡啶甲酰胺处理的相当。然而，处理21d后，添加3-吡啶甲酰胺处理的产量和叶绿素含量均高于无3-吡啶甲酰胺(200μM Mn)的处理。这些结果说明，3-吡啶甲酰胺是缓解甘蔗锰毒的解毒分泌物。
表3.3-吡啶甲酰胺对植株生长和叶片叶绿素含量的影响
Figure BDA0003032914530000111
8、采用本发明实施例1步骤(1)准备并方法培养甘蔗幼苗以2μMMnCl2(对照(CK)，正常锰水平)、100μM MnCl2(Mn)和100μM MnCl2和100μM吡啶甲酰胺(Mn+NIC，NIC是3-吡啶甲酰胺)的培养液处理甘蔗根，并在处理前和2d后分别测量根长，计算根的相对伸长率，处理2d后分别切取0-10.0mm根尖测定其对伊文思蓝吸附量及活性氧和丙二醛积累量(对照(CK)为正常锰水平的处理，Mn是锰毒胁迫的处理，Mn+NIC是在锰毒胁迫溶液中加入候选解毒物质NIC的处理)。
结果表明，Mn处理2d后甘蔗根长、伊文思蓝吸附量、活性氧及丙二醛积累量的均显著低于对照(CK)(图4)然而，在MnCl2溶液中加入100μM吡啶甲酰胺(Mn+NIC)2d后，甘蔗根长显著增加而伊文思蓝吸附量、活性氧及丙二醛积累量显著降低。这些结果进一步说明，3-吡啶甲酰胺可有效解除锰对甘蔗的毒害。这些结果还表明，根尖对伊文思蓝吸附能力及根尖活性氧、丙二醛积累量是锰毒害的敏感性指标，比植株生长、叶绿素等指标更敏感，采用本发明的方法可快速鉴定根分泌物对锰毒胁迫的解毒功能，可应用于甘蔗锰解毒功能物质及分泌解锰毒物质甘蔗品种的的快速鉴定。
9、采用本发明实施例1步骤(1)准备中蔗、F156、桂糖品种种茎并分别培养幼苗在100μM MnCl2的培养液中，2d后采用本发明实施例1步骤(2-4，6)方法收集、分析根分泌的3-吡啶甲酰胺，并将根系消解后采用原子吸收测定叶片中锰积累量。结果表明，锰毒胁迫下积累锰较少的中蔗及桂糖品种，3-吡啶甲酰胺分泌量较大(图7)。可见，本发明的方法可快速鉴定3-吡啶甲酰胺分泌量的品种并发现其与植株积累锰能力的关系。
本发明上述方法根分泌物解锰毒功能的鉴定：按照实施例1或实施例2步骤(4)和步骤(5)鉴定确认的在甘蔗分泌物含有且按照步骤(7)、(8)测定在Mn2+(0.1-0.5mM)处理的根系分泌物溶液中3-吡啶甲酰胺组分显著高于对照(0.5μM Mn2+)的分泌物3-吡啶甲酰胺组分组分，购置相关化学药品并配制成水溶液(0.1-0.5mM)加入到含锰(0.1-0.2mM Mn2+)培养液中，并以不加相关化学品的处理为对照；根据处理后甘蔗根长、根尖活性氧、丙二醛积累量及伊文思蓝吸附量、叶片叶绿素含量和植株生物产量的改善情况，判断上述分离、鉴定的根分泌是否有解锰毒功能。
如上所述方法可用于选育在锰毒胁迫下分泌具有解锰毒物质的抗锰毒的甘蔗种苗培育；如上所述方法鉴定的解锰毒物质也可作为解甘蔗锰毒肥料或植物生长调节剂应用于锰毒胁迫的甘蔗上。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (1)

1.一种鉴定检测锰诱导的甘蔗分泌物的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：
(1)甘蔗幼苗培养及解锰毒根分泌物的诱导：准备甘蔗种茎并在种茎上萌发的幼苗的根长达5-10mm后将幼苗移栽并培养在培养液中8-20d，然后，将幼苗继续培养在含0.1-0.2mM MnCl2的培养液中，培养1～3d；
(2)根分泌物的收集：经步骤(1)培养后的所得幼苗根系依次浸入CaCl2溶液、水、灭菌水中，然后将幼苗根系浸没至灭菌水中2～4h；
(3)根分泌物的浓缩：将步骤(2)中50～400mL浸泡了幼苗根系的灭菌水放入瓶中，瓶中的溶液减压浓缩至近干后将浓缩液转移至浓缩瓶中，残留浓缩液以甲醇溶液洗涤并重复洗涤，每次洗涤液均与上述浓缩瓶中的溶液合并，浓缩瓶中的溶液再次减压浓缩至干后，加入甲醇-水溶液洗脱浓缩瓶中的分泌物，得复溶液；
(4)分泌物的分离、鉴定：将步骤(3)中所得复溶液用0.22μm有机滤膜过滤，滤液分离鉴定；全扫描获得母离子峰后，采集母离子的二级定性离子信号，质谱检测器上如检测到母离子、子离子信号，初步鉴定复溶液中的有机物质有3-吡啶甲酰胺；所述母离子的m/z为123.01，所述子离子的m/z为52.80、79.89；
(5)液质联用定性鉴定结果的确认：将步骤(4)中初步定性鉴定出的有机物质3-吡啶甲酰胺标准物，按照步骤(4)的分离条件进行分离，采集二次质谱信息并与甲醇溶解液质谱信息对比，确认复溶液也即根分泌物溶液中的有机物有3-吡啶甲酰胺；
(6)根分泌物浓度和分泌量的定量测定：将步骤(3)中所得含根分泌物的复溶液和3-吡啶甲酰胺标准物溶液，按照步骤(4)的分离条件进行分离并采集定量离子质谱信号；以3-吡啶甲酰胺浓度为横坐标，以质谱信号强度为纵坐标绘制散点图，显示相关曲线y＝a+bx；计算3-吡啶甲酰胺分泌物的浓度。
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