CN111812251A - 一种测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物(十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵和双十二烷基二甲基氯化铵)的方法，包括以下步骤：将植物地上部样品进行冷冻干燥、研磨，加入回收率指示物氘代十四烷基二甲基苄基氯化铵和提取剂，超声提取后得提取液；提取液经中性氧化铝固相萃取柱进行净化；净化后的提取液加入内标物四丁基硝酸铵，得提取净化液；采用液相色谱‑串联质谱联用进行检测，与平行操作的三种季铵盐化合物标准品进行比较，以保留时间和优化的特征离子进行定性，以信噪比较高，峰形好、干扰小的离子为定量离子，使用内标法定量。本发明所述方法适用于测定植物地上部复杂基质中三种典型季铵盐化合物含量，结果准确且回收率高。

Description

一种测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法。

背景技术

季铵盐化合物(Quaternary ammonium compounds，QACs)是近十几年来备受国内外学者和公众关注的一类新兴环境污染物。季铵盐化合物是由铵根的氢原子被烷烃或芳烃基团取代而生成，通式为(R₄N⁺)X^-，其中R为烷烃或芳烃基团，X^-为卤素离子。常见的QACs按R基团的结构和性质可分为烷基三甲基铵盐(Alkyltrimethylammonium compounds，ATMACs)、二烷基二甲基铵盐(Dialkyldimethlammonium compounds，DADMACs)、苄基烷基二甲基铵盐(Benzylalkyldimethylammonium compounds，BACs)等。研究表明，QACs在较低浓度下即可对微生物、原生动物等产生毒害作用。另外，QACs会导致环境中耐药菌的增加，加剧病菌耐药性的问题，对生态环境、人体健康产生严重威胁。

据调查，我国一些大城市的污泥中QACs的浓度范围在几个mg kg^-1至上百mg kg^-1之间，如广州的污泥中QACs浓度达167mg kg^-1(干重)。含有QACs的污泥农用或污水灌溉会导致QACs大量进入土壤介质，造成土壤-植物系统污染。目前，有关QACs的研究主要集中在河流环境中它们的污染特征和环境行为，植物中的QACs相关研究相对较少。开发多种QACs同时测定的分析方法并以此对植物中的QACs进行检测，对于全面认识QACs在土壤-植物系统中的迁移、富集行为具有重要意义。

目前关于植物中QACs的测定方法主要针对单一结构类型的QACs，，对于同时适用于三种结构类型的QACs检测方法还未见报道。部分针对ATMACs和DADMACs的方法使用气相色谱-质谱联用作为定量分析仪器，但该类型仪器在分析过程中可能会导致BACs热分解，无法做到精确定量。此外，提取植物地上部样品过程中使用极性有机溶剂会导致色素杂质的大量溶出，对后期在仪器上定量分析存在干扰。因此，有必要建立一种适用于植物地上部基质并能同时测定三种结构类型QACs的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，包括以下步骤：

(1)将植物地上部样品进行冷冻干燥、研磨，加入回收率指示物和提取剂，超声提取后得提取液；

(2)提取液经固相萃取柱进行净化，加入内标物，得提取净化液；

(3)将提取净化液采用液相色谱-串联质谱联用进行检测；

所述典型季铵盐化合物为十二烷基三甲基氯化铵(Dodecyltrimethylammoniumchloride，DTAC，CAS号：112-00-5)、十二烷基二甲基苄基氯化铵(Dodecyldimethylbenzylammonium chloride，DBAC，CAS号：139-07-1)和双十二烷基二甲基氯化铵(Didodecyldimethylammonium chloride，DDAC，CAS号：3401-74-9)。

优选地，步骤(1)中，所述提取剂为含盐酸的甲醇溶液，所述回收率指示物为氘代十四烷基二甲基苄基氯化铵(Tetradecyldimethylbenzylammonium-d7chloride，TBAC-d7，CAS号：1219178-72-9)。

优选地，所述含盐酸的甲醇溶液中，盐酸的体积浓度为0.1％。

优选地，步骤(2)中，所述净化包括以下步骤：

(a)对中性氧化铝固相萃取柱采用乙酸乙酯进行活化；

(b)加入步骤(1)所得提取液，用乙酸乙酯淋洗；

(c)用甲醇洗脱，收集洗脱液；

(d)将洗脱液旋蒸浓缩至近干，用60％甲醇水溶液(v/v)复溶，加入内标物，即得所述提取净化液。

优选地，所述淋洗剂为异丁醇和正己烷的混合溶液或乙酸乙酯；采用上述两种淋洗剂处理后可以显著减少最终提取净化液中色素的含量，减少色素等杂质对仪器检测的干扰，提高定量检测的准确性，QACs回收率均达到国际准则(DG345SANCO/12459/2011)的要求。更优选地，所述淋洗剂为乙酸乙酯。

优选地，所述异丁醇和正己烷的混合溶液中，所述异丁醇和正己烷的体积比为1:1。

优选地，所述中性氧化铝固相萃取柱规格为CNWBOND Alumina-N SPE萃取柱(20g，60mL)。

优选地，所述内标物为四丁基硝酸铵(Tetra-n-butylammonium nitrate，TBAN，CAS号：1941-27-1)。

优选地，步骤(3)中，液相色谱条件为：C18色谱柱，色谱柱的尺寸为1.9μm×2.1mm×100mm；柱温为40℃，流动相A相为0.1％的甲酸水溶液，流动相B相为甲醇。

优选地，步骤(3)中，所述流动相的洗脱程序为：B相开始时为60％，3min时升至100％并保持4min，8min时降回至60％并保持3min；流速为300μL min^-1。

优选地，质谱的条件为：ESI扫描模式为正离子模式，喷雾电压为+3000V，源加热温度为350℃，离子传输管温度为300℃，鞘气45arb，辅气8arb；定量扫描模式：SRM模式，碰撞气氩气为1.5mTorr。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法。本发明所述方法针对植物地上部复杂基质样品，可以同时测定三种结构类型(ATMACs、DADMACs和BACs)的QACs含量，回收率高；对于植物地上部样品在提取过程带来的严重色素溶出问题，本发明通过使用合适的淋洗剂作为净化过程中的淋洗溶剂，可以显著减少最终提取净化液中色素的含量，减少色素等杂质对仪器检测的干扰，提高定量检测的准确性。

附图说明

图1为三种处理方法处理下加标样品颜色对比；(a)不淋洗；(b)使用乙酸乙酯淋洗；(c)使用异丁醇/正己烷混合溶液(1:1，v/v)淋洗；

图2为三种QACs在(a)空白溶剂(60％甲醇水溶液)和(b)植物地上部基质中的色谱图，其中QACs的加标浓度均为10μg L^-1。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法的一种实施例，本实施例所述方法包括以下步骤：

(1)样品预处理过程：将植物样品冷冻干燥、研磨至粉末；

(2)样品提取过程：准确称取0.1g植物地上部样品于50mL特氟龙离心管中，加入10μL回收率指示物TBAC-d7(浓度为1.0μg mL^-1)和15mL提取液(含0.1％盐酸的甲醇提取液(v/v))，振摇数下，超声提取20分钟后，离心(13000rpm，20min)，重复三次，合并上清液于100mL鸡心瓶中，旋蒸浓缩至小于1mL，得提取液；

(3)净化过程：将植物地上部样品的提取液过CNWBOND Alumina-N SPE萃取柱(20g，60mL)。先加入20mL乙酸乙酯活化萃取柱，再加入地上部样品提取液，用30mL乙酸乙酯淋洗，再用40mL甲醇洗脱；洗脱液旋蒸浓缩至近干，复溶于60％甲醇水溶液(v/v)，加入20μL内标TBAN(浓度为0.1μg mL^-1)，最终定容至10mL；混匀后过0.22μm尼龙滤膜，得提取净化液，放置-20℃冰箱中待测；

(4)采用液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS，Thermo TSQ Quantum Ultra)进行检测，以内标法进行定量分析。柱型号为Thermo公司的Hypersil GOLD C18柱(1.9μm×2.1mm×100mm)。柱温40℃，流动相A相为0.1％甲酸水，流动相B相为甲醇。流动相梯度如表1所示。

表1 LC-MS/MS洗脱梯度

质谱参数如下：ESI扫描模式为正离子模式，喷雾电压(Spray voltage)为+3000V，源加热温度(Source heater temperature)为350℃，离子传输管温度(Capillarytemperature)为300℃，鞘气(Sheath gas flow rate，N₂)45arb，辅气(Aux gas flowrate，N₂)8arb。定量扫描模式：选择反应监测模式(SRM)，碰撞气(Ar)为1.5mTorr，碰撞能量参数如表2所示。数据通过Thermo Xcalibur软件处理。

表2 QACs的测定质谱参数

*为定量离子。

实施例2

植物地上部样品净化过程的优化

为减少植物地上部在提取过程中溶出的色素对后续检测的干扰，以小麦地上部作为供试植物地上部的代表，通过进行不同浓度的QACs加标回收实验，考察不同淋洗方法对减少色素的优劣。本方法比较了三种处理方法，分别是不淋洗、使用乙酸乙酯淋洗和使用异丁醇/正己烷混合溶液(1:1，v/v)淋洗。具体步骤如下：

(1)选择不受污染的小麦地上部样品(即植物地上部的空白基质样品)，经冷冻干燥后研磨备用；

(2)按照实施例1步骤(2)进行前处理，获得植物地上部的空白基质提取液，之后以该基质提取液稀释QACs标准储备液(10μg mL^-1)，配制三种QACs的加标样品(10μg L^-1)，旋蒸浓缩至小于1mL，得浓缩后加标样品；

(3)步骤(2)所得三种浓缩后加标样品分别采用(a)不淋洗处理；(b)淋洗剂为乙酸乙酯；(c)淋洗剂为异丁醇/正己烷混合溶液(1:1，v/v)进行净化处理，处理方法具体为：用20mL淋洗剂活化CNWBOND Alumina-N SPE萃取柱(20g，60mL)，加入浓缩后加标样品，用30mL淋洗剂淋洗，再用40mL甲醇洗脱(不淋洗处理的(a)组则直接用40mL甲醇洗脱)；洗脱液旋蒸浓缩至近干，复溶于60％甲醇水溶液(v/v)，加入20μL内标TBAN(浓度为0.1μg mL^-1)，最终定容至10mL；混匀后过0.22μm尼龙滤膜，得提取净化液，放置-20℃冰箱中待测；

(4)同实施例1的步骤(4)。

结果见图1，图1原图为彩色图片，从图1可知，不淋洗的样品颜色极深且浑浊，无法上机测试。与不淋洗的样品相比，使用乙酸乙酯淋洗和使用异丁醇/正己烷混合溶液(1:1，v/v)淋洗的样品颜色显著变浅，表明色素等杂质含量明显下降。使用乙酸乙酯淋洗的处理下，三种QACs的回收率分别为89％(DTAC)、85％(DBAC)和72％(DDAC)。使用异丁醇/正己烷混合溶液(1:1，v/v)淋洗的处理下，三种QACs的回收率分别为82％(DTAC)、88％(DBAC)和90％(DDAC)。两种淋洗方法处理的三种QACs回收率均达到国际准则(DG345SANCO/12459/2011)的要求(回收率在70～120％)。因为异丁醇的沸点(107℃)高于乙酸乙酯(77℃)，过萃取柱后不利于旋转蒸发浓缩，因此本发明方法更优选为使用乙酸乙酯作为净化过程中的淋洗剂。

实施例3

本发明方法的适用性验证

以小麦地上部作为供试植物地上部的代表，通过进行不同浓度的QACs加标回收实验考察本方法的适用性。具体步骤如下：

(1)用60％甲醇水溶液稀释QACs标准储备液(μg mL^-1)，配制三种QACs的样品(0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10μg L^-1)，按照实施例1步骤(4)用LC-MS/MS测定，以内标法进行定量分析，并通过线性回归计算三种QACs的标线。三种QACs的仪器检出限(Instrumentdetection limits，IDLs)以低浓度样品的QACs的3倍信噪比计算，而方法检出限(Methoddetection limits，MDLs)则是以连续6次进样低浓度样品后，以样品相对偏差的5倍来计算。

(2)选择不受污染的小麦地上部样品(即植物地上部的空白基质样品)，经冷冻干燥后研磨备用；

(3)取植物地上部的空白基质样品，分别按照实施例1步骤(1)～(3)进行前处理，获得植物地上部的空白基质提取净化液，之后以该基质提取净化液稀释QACs标准储备液(10μg mL^-1)，配制三种QACs的加标样品(10μg L^-1)，按照实施例1步骤(4)用LC-MS/MS测定，根据所得色谱图中三种目标QACs的分离度及其受基质杂质干扰的程度判断本发明方法的选择性。

(4)取植物的空白基质样品，分别加入QACs标准储备液(10μg mL^-1)，制得不同空白基质的加标样品(1、10μg L^-1)，按照实施例1步骤(1)～(3)进行前处理后，按照实施例1步骤(4)用LC-MS/MS测定，以内标法进行定量分析，回收率以加标样品测定浓度与其加标浓度的比值表示，精密度则以同一浓度加标样品测定浓度的相对标准偏差表示(设置5个平行样)。

结果见表3～4和图2。从表3可知，三种QACs在0.2～10μg L^-1范围内有较好的线性(R²>0.996)。三种QACs的IDLs分别为20ng L^-1(DTAC)、10ng L^-1(DBAC)和10ng L^-1干重(DDAC)。三种QACs在植物地上部基质样品中的MDLs分别为2.99ng g^-1干重(DTAC)、4.61ngg^-1干重(DBAC)和8.72ng g^-1干重(DDAC)。由此可见，本发明方法可测定植物地上部基质中达ng g^-1级别的QACs，具有较高的灵敏度。

表3三种QACs的线性范围及检出限

从图2可知，三种QACs在空白溶剂(60％甲醇水溶液)加标样品和不同基质溶液加标样品中均可通过保留时间和特征离子(m/z)有效分离，且在不同基质溶液样品中未检出对三种QACs具有干扰的色谱峰，由此可见，本发明方法具有较好的分离度和选择性。

从表4可知，三种QACs在不同基质中的加标(1、10μg L^-1)样品回收率范围在77.4％～94.1％之间，相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)范围在0.8％～14.5％之间，符合国际准则(DG345SANCO/12459/2011)的要求(回收率在70～120％，RSD≤20％)。由此可见，本发明方法具有较好的准确度和精密度。

表4三种QACs在不同基质中的加标样品回收率(n＝5，％)和相对标准偏差(RSD，％)

实施例4

实际污染植物地上部样品测定

通过人工配制的QACs污染土壤，并在温室内种植两种植物，分析本发明方法的效果。具体结果如下：

供试土壤为人工污染，具体分为：(1)T1：浓度为1mg kg^-1的DTAC污染土壤；(2)T10：浓度为10mg kg^-1的DTAC污染土壤；(3)B1：浓度为1mg kg^-1的DBAC污染土壤；(4)B10：浓度为10mg kg^-1的DBAC污染土壤；(5)D1：浓度为1mg kg^-1的DDAC污染土壤；(6)D10：浓度为10mgkg^-1的DDAC污染土壤。每个处理3个重复，每盆装土1.5kg。

本实验使用的南瓜品种为密本三号，种子购自广东省农业科学研究院；小麦品种为南农9918，种子购自南京农业大学。选取籽粒饱满的南瓜和小麦种子浸泡1-2h后，经5％NaClO溶液消毒处理。每盆20颗种子播种于装有供试土壤的塑料盆内。处理期间放置于温室中，条件为：光照16h，温度25℃，黑暗8h，温度20℃，湿度60％。4周后，采集两种作物地上部样品，用于测定三种QACs含量。

准确称取0.1g植物地上部样品于50mL特氟龙离心管中，加入10μL回收率指示物TBAC-d7(浓度为1.0μg mL^-1)和15mL提取液(含0.1％盐酸的甲醇提取液(v/v))，振摇数下，超声提取20分钟后，离心(13000rpm，20min)，重复三次，合并上清液于100mL鸡心瓶中，旋蒸浓缩至小于1mL，得提取液。

将植物地上部样品的提取液过CNWBOND Alumina-N SPE萃取柱(20g，60mL)。先加入20mL乙酸乙酯活化萃取柱，再加入地上部样品提取液，用30mL乙酸乙酯淋洗，再用40mL甲醇洗脱。洗脱液旋蒸浓缩至近干，复溶于60％甲醇水溶液(v/v)，加入20μL内标四丁基硝酸铵(浓度为0.1μg mL^-1)，最终定容至10mL。混匀后过0.22μm尼龙滤膜，，得提取净化液，以0.1％甲酸水、甲醇为流动相用LC-MS/MS进行测定，结果见表5。由表5可知，种植在QACs污染土壤上的南瓜和小麦均检出相应的QACs，其中南瓜茎部浓度为0.02～0.18μg g^-1干重，回收率指示物的回收率为83.13-89.03％；叶部浓度为0.02～0.16μg g^-1干重，回收率指示物的回收率为84.35-96.48％。小麦叶部浓度为0.03～0.12μg g^-1干重，回收率指示物的回收率为87.36-91.54％。在本实验中，植物地上部中均能检出三种不同结构的QACs，而且回收率高，证明本方法灵敏可靠。

表5植物中三种QACs的浓度(μg g^-1干重，表中数据为平均值±标准偏差，n＝3)

注：NA，未检测。因小麦茎叶不好分离，所以将小麦地上部样品作为一个整体进行检测，并将其结果以叶部浓度来表示。

综上所述，本发明提供了一种适用于植物地上部基质并能同时测定三种结构类型QACs(DTAC、DBAC、DDAC)的方法。本方法经超声提取后，过固相萃取柱净化，采用LC-MS/MS进行检测，内标法定量，具有高效、可靠、准确等优点，可为正确评价植物样品，尤其是地上部复杂基质样品中QACs的污染水平提供有效的检测分析方法。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将植物地上部样品进行冷冻干燥、研磨，加入回收率指示物和提取剂，超声提取后得提取液；

(2)提取液经中性氧化铝固相萃取柱进行净化，加入内标物，得提取净化液；

(3)将提取净化液采用液相色谱-串联质谱联用进行检测；

所述典型季铵盐化合物为十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵和双十二烷基二甲基氯化铵。

2.如权利要求1所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取剂为含盐酸的甲醇溶液；所述回收率指示物为氘代十四烷基二甲基苄基氯化铵。

3.如权利要求2所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，所述含盐酸的甲醇溶液中，盐酸的体积浓度为0.1％。

4.如权利要求1所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述净化包括以下步骤：

(a)对中性氧化铝固相萃取柱采用淋洗剂进行活化；

(b)加入步骤(1)所得提取液，用淋洗剂淋洗；

(c)用甲醇洗脱，收集洗脱液；

(d)将洗脱液旋蒸浓缩至近干，用60％甲醇水溶液(v/v)复溶，加入内标物，即得所述提取净化液。

5.如权利要求4所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，所述淋洗剂为异丁醇和正己烷的混合溶液或乙酸乙酯；优选地，所述淋洗剂为乙酸乙酯。

6.如权利要求4所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，所述异丁醇和正己烷的混合溶液中，所述异丁醇和正己烷的体积比为1:1。

7.如权利要求1所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，所述内标物为四丁基硝酸铵。

8.如权利要求1所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，液相色谱条件为：C18色谱柱，色谱柱的尺寸为1.9μm×2.1mm×100mm；柱温为40℃，流动相A相为0.1％的甲酸水溶液，流动相B相为甲醇。

9.如权利要求8所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，所述流动相的洗脱程序为：B相开始时为60％，3min时升至100％并保持4min，8min时降回至60％并保持3min；流速为300μL min^-1。

10.如权利要求1所述测定植物地上部中三种典型季铵盐化合物的方法，其特征在于，质谱的条件为：ESI扫描模式为正离子模式，喷雾电压为+3000V，源加热温度为350℃，离子传输管温度为300℃，鞘气45arb，辅气8arb；定量扫描模式：SRM模式，碰撞气氩气为1.5mTorr。

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