CN108802242B - 一种同时测定水环境中6种手性农药对映体残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境保护技术领域，涉及测定水中农药残留的检测方法，具体涉及一种同时测定水环境中6种常见手性农药的对映体残留量的方法。本发明采用固相萃取结合分散液液微萃取作为水环境样品的前处理技术，采用Chiralcel OD‑RH手性柱对6种农药同时进行手性拆分，并利用液相色谱串联质谱作为检测器。克服了现有方法有机试剂消耗大、干扰多以及检测限高等问题，能够快速检测水环境中己唑醇、水胺硫磷、敌草胺、甲霜灵、氟环唑和腈菌唑6种手性农药的对映体含量，测定结果灵敏，准确，干扰少。

Description

一种同时测定水环境中6种手性农药对映体残留量的方法

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及测定水中农药残留的检测方法，具体涉及一种同时测定水环境中6种常见手性农药的对映体残留量的方法。

背景技术

化学农药在提高作物产量的同时，也造成了土壤和水体等环境污染，这已是国际环境科学界关注的焦点之一。在我国，有超过60％的农药是手性化合物，研究表明，手性农药的生物活性往往只存在于一个对映体或者几个对映体，而目前大多数手性农药仍以外消旋体的形式在销售和使用，这不仅会降低药效，增加农药使用量，而且可能污染环境，产生许多毒副作用，甚至会增加对非靶标生物的毒性，危害生态环境。

手性农药进入环境以后，被环境中的生物摄取吸收，其对映异构体在体内的代谢、转化等生命活动过程往往存在较大差异。而且越来越多的研究表明，手性农药在环境中的潜在毒性(致癌、致畸、致突变等)以及干扰内分泌活性等也表现出对映体选择性。例如，研究发现，芳氧苯氧丙酸类除草剂(禾草灵等)的除草活性主要来自于R型对映体；三唑类杀菌剂戊唑醇，其R构型的活性比S构型高100多倍；三唑醇的四个对映异构体中，SR-三唑醇的杀菌活性最高；实验结果表明，三唑类农药的对映异构体对大鼠的肝脏毒性不同；有机磷类农药马拉硫磷，研究发现其在体内的代谢具有明显的对映体选择性，R型对映体活性高于S型对映体。因此，在对映体水平上研究手性农药的环境行为和生态效应，可以对农药的生态风险性做出更准确地评价，而建立可靠的分离分析方法成为研究手性农药环境行为的基础和关键。目前，对手性农药进行手性拆分仍是农药研究的重点与难点。

通常，实际样品经过前处理之后可以直接进行测定分析，但是对于复杂环境中多组分痕量或超痕量存在的残留药物，单一的前处理方法往往不能满足仪器的检测要求。因此，考虑样品前处理联用技术。固相萃取结合分散液液微萃取(SPE-DLLME)具有回收率高、富集倍数高、灵敏度高等优点。本发明首次将该前处理技术与手性固定相色谱串联质谱相结合，用于环境水体中多种手性农药对映体含量的同时测定。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种同时测定水环境(河水和污水处理厂进出水)中6种手性农药对映体的方法。本发明采用固相萃取结合分散液液微萃取作为水环境样品的前处理技术，采用Chiralcel OD-RH手性柱对6种农药同时进行手性拆分，并利用液相色谱串联质谱作为检测器。克服了现有方法有机试剂消耗大、干扰多以及检测限高等问题，能够快速检测水环境中己唑醇、水胺硫磷、敌草胺、甲霜灵、氟环唑和腈菌唑6种手性农药的对映体含量，测定结果灵敏，准确，干扰少。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种同时测定水环境中6种手性农药对映体残留量的方法，其具体步骤如下：

固相萃取结合分散液液微萃取分离富集条件的优化

选择环境中常用的手性农药(己唑醇、水胺硫磷、敌草胺、甲霜灵、氟环唑和腈菌唑)，采用单因素试验，对影响SPE-DLLME萃取效果的诸多因素，如固相萃取小柱的种类、洗脱剂种类及体积、萃取剂和分散剂种类以及萃取剂和分散剂体积等参数进行了优化，选择最优的条件，得到在最优条件下对农药的最大萃取率。

本发明还提供了一种同时对手性农药进行对映体拆分的方法，农药的对映体分离度在1.5以上，满足定量检测要求。

具体技术方案如下：

(1)水样的预处理

收集水样并过滤；

(2)固相萃取(SPE)富集浓缩过程

固相萃取小柱依次用甲醇和等体积的纯水活化，将预步骤(1)中处理过的水样加入所述活化后的固相萃取柱中，富集，纯水淋洗后用甲醇洗脱，洗脱液经氮气缓慢吹干，得残渣备用；

(3)分散液液微萃取(DLLME)净化过程

将步骤(2)中得到的残渣用纯水溶解，再迅速加入二氯甲烷和乙腈的混合溶液，超声，离心，将上层水相移去，下层有机相用氮气缓慢吹干，得残渣备用；

(4)手性液相色谱-质谱联用测定水环境中6种手性农药对映体含量

手性液相色谱对6种农药同时进行对映体拆分

将步骤(3)得到的残渣用100-200μL乙腈溶解，得供试品，进行色谱分析，色谱条件如下：色谱柱：Chiralcel OD-RH手性柱；流动相：A：乙腈，B：0.1％甲酸-水；等度洗脱：A与B的比例为2:3-3:7；流速：0.5-0.6mL/min；柱温：30-35℃；进样量：10-20μL；

质谱检测

质谱检测条件如下：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；检测方式：正离子模式；离子源温度：150℃；雾化气和干燥气：氮气；毛细管电压：3.0kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；扫描方式：多反应离子检测(MRM)。

步骤(1)中，水样用0.45μm尼龙膜过滤；

步骤(2)中，固相萃取小柱为C18柱，取水样200-500mL，活化固相萃取小柱的甲醇和纯水的用量为小柱体积的1-2倍，洗脱用甲醇的用量为小柱体积的1-2倍；

步骤(3)中，二氯甲烷的用量为500-700μL，乙腈的用量为二氯甲烷体积的1-1.5倍；超声时间：1-3min；离心转速：3000-6000rpm；离心时间：5-10min。

具体地，本发明可以采用如下方法制备：

(1)水样的预处理

收集水样，并用0.45μm尼龙膜过滤。

(2)固相萃取(SPE)富集浓缩过程

C18小柱使用之前依次用小柱体积1-2倍的甲醇和等体积纯水淋洗活化。取步骤(1)中过滤后的水样200-500mL,以10-15mL/min的流速加入萃取柱后，先用5-10mL纯水淋洗萃取柱，再将小柱置于真空状态下干燥5-10min，最后用小柱体积的1-2倍的甲醇洗脱待测物至具塞玻璃离心管中，洗脱液在30-35℃下，用氮气吹干，得残渣。

(3)分散液液微萃取(DLLME)净化过程

用5-10mL纯水溶解上述所得残渣，快速注入500-700μL二氯甲烷与二氯甲烷体积的1-1.5倍的乙腈，超声1-3min，形成混浊液，然后3000-6000rpm下离心5-10min，去除上层水，下层有机相在30-35℃用氮气吹干，得残渣备用。

(4)手性液相色谱-质谱联用测定水环境中6种手性农药对映体含量

(4.1)手性液相色谱对6种农药同时进行对映体拆分

将步骤(3)得到的残渣用100-200μL的乙腈溶解，得供试品，进行色谱分析，色谱条件如下：色谱柱：Chiralcel OD-RH手性柱；流动相：A：乙腈，B：0.1％甲酸-水；等度洗脱：A与B的比例为2:3-3:7；流速：0.5-0.6mL/min；柱温：30-35℃；进样量：10-20μL；

(4.2)质谱检测

质谱检测条件如下：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；检测方式：正离子模式；离子源温度：150℃；雾化气和干燥气：氮气；毛细管电压：3.0kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；扫描方式：多反应离子检测(MRM)。

(5)6种手性农药对映体含量测定结果的计算

本方法将固相萃取和分散液液微萃取联用，即SPE-DLLME，具有富集倍数高、操作简单、检出限低、重现性好等优点，适用于环境水体中痕量污染物的提取和富集，将其与手性固定相色谱串联质谱相结合，可用于环境中多种手性农药对映体含量的同时测定，为环境中手性农药的分析检测提供新思路。

附图说明

图1为6种手性农药标准品混合溶液的液相色谱串联质谱图；

图2为固相萃取小柱种类对6种农药回收率的影响；

图3为流速对6种农药回收率的影响；

图4为洗脱剂种类对6种农药回收率的影响；

图5为洗脱剂体积对6种农药回收率的影响；

图6为萃取剂种类对6种农药回收率的影响；

图7为萃取剂体积对6种农药回收率的影响；

图8为分散剂种类对6种农药回收率的影响；

图9为分散剂体积对6种农药回收率的影响。

具体实施方式

本发明采用固相萃取结合分散液液微萃取作为水环境样品的前处理技术，并开发了对6种手性农药同时进行对映体拆分的液相色谱串联质谱法。最后，开发的方法应用于水环境(河水和污水处理厂进出水)中6种农药对映体的检测。

本发明的具体实施方法如下：

(1)水样预处理

分别收集河水和污水处理厂进出水，并用0.45μm尼龙膜过滤。

(2)固相萃取-分散液液微萃取(SPE-DLLME)富集浓缩过程

C18小柱使用之前依次用小柱体积1-2倍的甲醇和等体积纯水淋洗活化。取步骤(1)中过滤后的水样200-500mL,以10-15mL/min的流速加入萃取柱后，先用5-10mL纯水淋洗萃取柱，再将小柱置于真空状态下干燥5-10min，最后用小柱体积的1-2倍的甲醇洗脱待测物至具塞玻璃离心管中，洗脱液在30-35℃下，用氮气吹干，得残渣。用5-10mL纯水溶解上述所得残渣，快速注入500-700μL二氯甲烷与二氯甲烷体积的1-1.5倍的乙腈，超声1-3min，形成混浊液，然后3000-6000rpm下离心5-8min，去除上层水，下层有机相在30-35℃用氮气吹干，得残渣备用。

(3)利用Waters Acquity^TM超高液相色谱和Xevo^TM Triple Quadrupole MS/MS质谱系统测定水环境中6种手性农药的对映体含量

色谱柱：Chiralcel OD-RH(150mm×4.6mm，5μm，日本大赛璐公司)

流动相：A：乙腈，B：0.1％甲酸-水

等度洗脱：A：B＝2：3

进样量：10-20μL

柱温：30-35℃

流速：0.5-0.6mL/min

离子源：电喷雾电离源(ESI源)

检测方式：正离子模式

离子源温度：150℃

雾化气和干燥气：氮气

毛细管电压：3.0kV

脱溶剂气温度：500℃

脱溶剂气流量：1000L/hr

扫描方式：多反映离子监测(MRM)

6种目标分析物用于定量分析的质谱参数见表1。

表1 6种农药的质谱条件

(4)方法学验证

基质效应的计算

采集各水样，按上述步骤(2)富集浓缩，按上述步骤(3)测样，得到相应结果A，B为一定浓度标准溶液测定所得相应结果，C为萃取前向实际样品中加入一定浓度标准溶液后经过步骤(2)富集浓缩后测定所得相应结果，D为实际样品经过步骤(2)富集浓缩之后，向得到的残渣中加入一定浓度标准溶液后测定所得相应结果。则基质效应(ME)，提取回收率(RE)和总流程效率(PE)分别由下式计算：

富集因子(CF)由下式计算：CF＝PE×1000

结果见表2。结果表明，SPE-DLLME方法可以有效的减少基质对测定结果的影响。另外，6种农药的富集倍数较高，显著提高方法的灵敏度。

表2各待测物在水样中的基质效应、总过程效率及富集倍数

注：E1：第一个出峰的对映体；E2：第二个出峰的对映体

标准曲线与线性范围

取200-500mL水样，按照步骤(2)处理，所得残渣用100-200μL含6种农药的混合对照品溶液复溶，制备系列基质匹配标准溶液。以样品峰面积对相应的系列标准溶液中各目标物的质量浓度作图。

结果见表3。由表可知，己唑醇、氟环唑、腈菌唑和甲霜灵对映体在1.00～250ng/mL范围内，水胺硫磷和敌草胺对映体在2.00～250ng/mL范围内，均呈现良好的线性关系。

表3 6种目标分析物的线性范围、相关系数、方法检测限和方法定量限

注：E1：第一个出峰的对映体；E2：第二个出峰的对映体

检测限和定量限

仪器检测限(IDL)和仪器定量限(IQL)：依次稀释对照品溶液，分别以信噪比3:1和10:1时对应的化合物的浓度作为检测限和定量限。

方法检测限(MDL)和方法定量限(MQL)：根据下列公式计算6种手性农药对映体在三种不同水环境基质中的MDL和MQL。

MDL和MQL的计算值见表3，结果显示，河水和污水处理厂进出水中各目标物的MDL和MQL分别为0.11～0.48ng/L和0.46～1.49ng/L，方法灵敏度可以满足环境水样中实际测定的需要。

加标回收率与日内、日间精密度

以河水为例，按上述步骤(1)收集处理河水水样，往该水样中加入一定浓度的各待测物，按上述步骤(2)富集浓缩后，按上述步骤(3)测样，得到相应结果A；采集水样按上述步骤(2)富集浓缩后，按上述步骤(3)测样，得到相应结果B；将一定浓度含各待测物的混标溶液按上述步骤(3)测样，得到相应结果C，则回收率(RE，％)的计算公式为：

其结果见表4，所得6种手性农药对映异构体的准确度范围在86.5％～102.4％之间，日内、日间精密度的相对标准偏差(RSD)值分别低于9.8％和7.9％，能够满足环境水样中手性农药对映体定量分析的要求。

表4河水中各待测物的加标回收率及日内、日间精密度

注：E1：第一个出峰的对映体；E2：第二个出峰的对映体

6种手性农药对映体含量的测定

按上述步骤(1)收集处理各水样，按上述步骤(2)富集浓缩后，按上述步骤(3)测样，得到响应结果，带入各自标准曲线中计算，结果见表5。

表5水样中各待测物的测定结果(ng/L)

注：“-”代表未检测到

实验结果表明：所建方法成功应用于不同水环境中6种手性农药对映体的测定。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种同时测定水环境中6种手性农药对映体残留量的方法，其特征在于，

(1)水样预处理

分别收集河水和污水处理厂进出水，并用0.45μm尼龙膜过滤；

(2)固相萃取-分散液液微萃取富集浓缩过程

C18小柱使用之前依次用小柱体积1-2倍的甲醇和等体积纯水淋洗活化，取步骤(1)中过滤后的水样200-500mL,以10-15mL/min的流速加入萃取柱后，先用5-10mL纯水淋洗萃取柱，再将小柱置于真空状态下干燥5-10min，最后用小柱体积的1-2倍的甲醇洗脱待测物至具塞玻璃离心管中，洗脱液在30-35℃下，用氮气吹干，得残渣；用5-10mL纯水溶解上述所得残渣，快速注入500-700μL二氯甲烷与二氯甲烷体积的1-1.5倍的乙腈，超声1-3min，形成混浊液，然后3000-6000rpm下离心5-8min，去除上层水，下层有机相在30-35℃用氮气吹干，得残渣备用；

(3)利用Waters Acquity^TM超高液相色谱和Xevo^TMTriple Quadrupole MS/MS质谱系统测定水环境中6种手性农药的对映体含量

色谱柱：Chiralcel OD-RH，50mm×4.6mm，5μm，日本大赛璐公司；

流动相：A：乙腈，B：0.1％甲酸-水

等度洗脱：A：B＝2：3

进样量：10-20μL

柱温：30-35℃

流速：0.5-0.6mL/min

离子源：电喷雾电离源(ESI源)

检测方式：正离子模式

离子源温度：150℃

雾化气和干燥气：氮气

毛细管电压：3.0kV

脱溶剂气温度：500℃

脱溶剂气流量：1000L/hr

扫描方式：多反映离子监测(MRM)

6种目标分析物用于定量分析的质谱参数如下：

2.权利要求1所述的方法在检测手性农药对映体残留量中的应用。

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