CN115326686B - 一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法 - Google Patents

一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，包括如下步骤：(1)分别采集内参对照样品叶片和待测枸骨样品叶片，细胞核染色后进行流式细胞检测，获得内参对照样品荧光强度和待测枸骨样品荧光强度；(2)按照如下公式计算待测枸骨基因组大小：待测枸骨样品基因组大小＝内参基因组大小×待测枸骨样品荧光强度/内参对照样品荧光强度；(3)对比枸骨雌雄植株基因组大小，实现性别鉴定。通过本发明方法可实现枸骨早期性别鉴定，对加快枸骨育种进程和实现分子育种具有重要意义。

Description

一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法。
背景技术
枸骨(Ilex cornuta)为冬青科冬青属常绿灌木或小乔木，叶形奇特，四季常青，果实秋冬红色；其枝叶能够治疗肺结核潮热以及咳血症状，果实常用于治疗白带过多以及慢性腹泻，根部具有滋补强壮、活络、清风热、祛风湿之功效；并且枸骨的嫩叶经水泡后晒干即为苦丁茶，有治疗头痛的功效。此外，枸骨是一种重要的园艺植物，在世界范围内均有着极高的知名度，选育出很多园艺品种及杂交种，特点各异。
同大多数雌雄异株的多年生植物一样，童期时枸骨雌雄植株营养器官表型无差异，只有等到开花结果，通过生殖器官鉴别枸骨性别；而枸骨童期长(杂交实生苗童期长达10年左右)，因此，无法对枸骨植株性别进行早期鉴定，给杂交育种或实生选育等工作带来困难，增加育种成本和工作量。
近年来，植物早期性别鉴定在细胞、生化和分子等不同水平上都有了一定的发展，其中DNA分子标记技术在鉴定植物性别领域的应用，大大提高了鉴定结果的准确性和可靠性，但由于这些标记具有种的特异性，需要极大量的引物或引物对来筛选与性别相关的标记，因此费时又费力并且效率低下，并且对实验室和操作人员的要求较高，鉴定成本过高，不适合大规模推广应用。此外，由于冬青属植物染色体小且数量多、制片困难等原因，因而利用细胞学进行遗传性别的鉴定较为困难。因此，亟需探索其他有效的信息来实现雌雄异株植物枸骨苗期性别鉴定。
发明内容
本发明公开了一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，可有效实现枸骨早期性别鉴定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，包括如下步骤：
(1)分别采集内参对照样品叶片和待测枸骨样品叶片，细胞核染色后进行流式细胞检测，获得内参对照样品荧光强度和待测枸骨样品荧光强度；
(2)按照如下公式计算待测枸骨基因组大小：
待测枸骨样品基因组大小＝内参基因组大小×待测枸骨样品荧光强度/内参对照样品荧光强度；
(3)对比枸骨雌雄植株基因组大小，实现性别鉴定。
雌雄株之间的差异通过基因表达必然在基因组方面有所体现，植物基因组大小是否可用于雌雄异株植物枸骨性别的鉴定尚未报道。为了从基因组方面区分鉴定枸骨雌雄株性别，本发明通过流式细胞技术对枸骨雌雄株之间基因组大小进行比较，研究结果表明枸骨雌雄株基因组大小间存在显著差异，雌株基因组大小远远低于雄株。因此，基因组大小可作为一种有效的枸骨雌雄株的性别鉴定的标记。
本发明方法简单，可准确、快速地实现大批量枸骨样品的性别鉴定，解决了枸骨缺乏有效的早期性别鉴定方法的问题。通过对枸骨不同性别植株的鉴定，特别是苗期雌雄鉴定，有效缩短育种周期，降低育种成本和工作量，对加快枸骨育种进程和实现分子育种具有重要意义。
优选地，内参对照样品选取水稻‘日本晴’，基因组大小为389Mbp。
优选地，采集的叶片为刚萌发的嫩叶。
优选地，步骤(1)具体如下：
1)取样：采集叶片，洗涤干燥后切除叶脉，剩余叶片组织切成块；
2)解离：使用解离液对切成块的叶片组织进行解离处理，获得提取混合液；
3)过滤：提取混合液过滤，滤液置于冰上孵育；
4)离心：滤液孵育后离心；
5)染色：离心后弃上清，加入染液进行染色；
6)上机检测：用流式细胞仪进行检测，分别得内参对照样品的荧光强度峰值及待测枸骨样品的荧光强度峰值。
优选地，解离液选用WPB解离液，成分包括0.2mmol/LTris-HCl，4mmol/LMgCl2·6H2O，2mmol/L EDTA-Na2·2H2O，1％(V/V)Triton X-100，86mmol/LNaCl，10mmol/LNa2S2O5，pH＝7.5。
优选地，步骤2)中切成块的叶片组织取样量为50-60mg；
步骤3)中使用400目膜过滤，冰上孵育5-10min；
步骤4)中，4℃、800-1200r/min离心5-8min；
步骤5)中，4℃避光染色5-10min。
优选地，染液选用PI-RNase，成分包括50μg/mL PI，50μg/mL RNase。
优选地，流式细胞检测波长488nm，每次检测收集至少5000个颗粒，变异系数控制在5％以内。
优选地，步骤(3)中，若基因组大小为813-846Mbp，判定为雌株；若基因组大小为854-875Mbp，则判定为雄株。
上述方法可应用于枸骨育种。
综上所述，本发明提供了一种枸骨性别早期鉴定的方法，利用枸骨雌雄株间基因组大小差异进行性别鉴定，解决了枸骨早期没有稳定有效的性别鉴定方法的问题。另外，还具有以下优点：
1、与形态鉴定技术相比，由于本发明材料选取营养器官叶片(仅需50mg)，因此可在苗期实现枸骨植株性别鉴定，将枸骨性别鉴定时间大大提前，对加快枸骨育种进程和实现分子育种具有重要意义。
2、与分子标记鉴定技术相比，本发明基于流式细胞术检测基因组大小的试验流程样品处理简单，上机检测时间短(单个样品处理和检测时间仅需30min左右)，且大大降低了植物性别鉴定的技术难度，可简便、快速、大批量鉴定雌雄异株植物枸骨的性别。
3、通过对枸骨植株性别的鉴定，可以按需要繁育和种植枸骨不同性别的植株，有利于枸骨种植的经济效益。
附图说明
图1所示为内参对照样品与枸骨雌株样品经流式细胞仪检测获得的典型直方图；
横坐标为荧光强度的相对值，单位是道数；纵坐标为检测到的细胞数目；
P4代表水稻‘日本晴’的G0/G1期峰(左)、P5代表待测枸骨雌株样品的G0/G1期峰(右)。
图2所示为内参对照样品与枸骨雄株样本经流式细胞仪检测获得的典型直方图；
横坐标为荧光强度的相对值，单位是道数；纵坐标为检测到的细胞数目；
P4代表水稻‘日本晴’的G0/G1期峰(左)、P5代表待测枸骨雄株样品的G0/G1期峰(右)。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1.细胞核悬浮液制备
分别取20雌和20雄枸骨植株作为待测枸骨样品，同时选取水稻‘日本晴’作为内参对照样品。
采集刚萌发的新生嫩叶，依次用蒸馏水和去离子水洗涤，去除表面污垢，在滤纸上干燥。然后把叶脉切除，剩余叶片组织切成小块。
将塑料培养皿置于冰面上，在塑料培养皿中加入1mL预冷的WPB解离液(0.2mmol/LTris-HCl，4mmol/LMgCl2·6H2O，2mmol/L EDTA-Na2·2H2O，1％(V/V)Triton X-100，86mmol/L NaCl，10mmol/LNa2S2O5，pH＝7.5)；取切成块的待测枸骨样品叶片组织50mg和内参对照样品叶片组织50mg分别放入WPB解离液，使叶片组织完全浸没于解离液中，用锋利的刀片快速切碎，切碎后加入WPB解离液1mL，混合均匀，4℃静置3min，使叶片组织与解离液充分接触。
使用移液枪吸取解离后的提取混合液，用400目滤网过滤至1.5mL离心管中，冰上孵育5min后，4℃、800r/min离心5min。弃去上清，加入500μL配置好的PI-RNase染液[50μg/mL PI(propidium iodide)，50μg/mLRNase]，4℃避光染色10min。
2.流式细胞仪检测
采用BD Influx流式细胞仪对染色后的各样品细胞核悬浮液进行上机检测，通过488nm的激光激发，收集670/30通道的荧光，检测荧光强度。每次检测收集约10000个细胞，3次重复。测定所得的图像用流式细胞仪自带的软件(BD FACS sortware1.0.0.650软件)进行作图分析，部分直方图分别如图1(雌株的典型直方图)，图2(雄株的典型直方图)所示。所有样品的检测和数据收集过程中，变异系数(CV，％)均控制在5％以内，确保数据的可靠性。
3.基因组大小的获取
以已知基因组大小的水稻‘日本晴’为内参对照，通过以下公式计算：
待测枸骨样品基因组大小(Mbp)＝内参对照样品基因组大小×待测枸骨样品的荧光强度/内参对照样品样品的荧光强度。
由流式细胞仪检测结果可知(图1-2)，峰值明显，两峰值有一定间距(待测枸骨样品与内参对照样品的荧光比值约为2倍)，说明水稻是适宜的内参植物，且该条件下可以良好的区分混合样品，可用流式细胞术所得数据进行基因组大小的分析。
经公式计算，结果见表1。结果发现20个枸骨雌株个体基因组大小一致，平均为829±10Mbp；20个枸骨雄株个体基因组大小一致，平均为866±6Mbp，且枸骨雌株基因组大小显著低于枸骨雄株基因组大小(P＜0.05)，相差4.5％。因此，通过基因组大小差异可实现枸骨性别的准确鉴定。
表1枸骨样品流式细胞仪测定结果
4.枸骨雌雄株鉴定
对于性别未知的枸骨采集幼嫩叶片，按照上述方法测定基因组大小。将测定的枸骨待测植株的基因组大小分别与枸骨雌株和雄株的标准基因组大小进行对比，若基因组大小为813-846Mbp，为雌株；若基因组大小为854-875Mbp，则判定该植株为雄株。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别采集内参对照样品叶片和待测枸骨样品叶片，细胞核染色后进行流式细胞检测，获得内参对照样品荧光强度和待测枸骨样品荧光强度；所述内参对照样品选取水稻‘日本晴’，基因组大小为389Mbp；
(2)按照如下公式计算待测枸骨基因组大小：
待测枸骨样品基因组大小＝内参基因组大小×待测枸骨样品荧光强度/内参对照样品荧光强度；
(3)对比枸骨雌雄植株基因组大小，实现性别鉴定，具体为：若基因组大小为813-846Mbp，判定为雌株；若基因组大小为854-875Mbp，则判定为雄株。
2.根据权利要求1所述一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，其特征在于，采集的叶片为刚萌发的嫩叶。
3.根据权利要求1所述一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，其特征在于，步骤(1)具体如下：
1)取样：采集叶片，洗涤干燥后切除叶脉，剩余叶片组织切成块；
2)解离：使用解离液对切成块的叶片组织进行解离处理，获得提取混合液；
3)过滤：提取混合液过滤，滤液置于冰上孵育；
4)离心：滤液孵育后离心；
5)染色：离心后弃上清，加入染液进行染色；
6)上机检测：用流式细胞仪进行检测，分别得内参对照样品的荧光强度峰值及待测枸骨样品的荧光强度峰值。
4.根据权利要求3所述一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，其特征在于，
解离液选用WPB解离液，成分包括0.2mmol/L Tris-HCl，4mmol/LMgCl2·6H2O，2mmol/LEDTA-Na2·2H2O，1％V/VTritonX-100，86mmol/LNaCl，10mmol/LNa2S2O5，pH＝7.5。
5.根据权利要求3所述一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，其特征在于，
步骤2)中切成块的叶片组织取样量为50-60mg；
步骤3)中使用400目膜过滤，冰上孵育5-10min；
步骤4)中，4℃、800-1200r/min离心5-8min；
步骤5)中，4℃避光染色5-10min。
6.根据权利要求3所述一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，其特征在于，染液选用PI-RNase，成分包括50μg/mLPI，50μg/mLRNase。
7.根据权利要求1所述一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法，其特征在于，流式细胞检测波长488nm，每次检测收集至少5000个颗粒，变异系数控制在5％以内。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在枸骨育种中的应用。
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