CN104839030A - 一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法。本发明所述方法，以橡胶树古铜期芽条的茎段或叶柄为外植体，消毒后将外植体切段分别接种于对照培养基和添加有待检测化学试剂的筛选培养基，24-28℃暗条件下培养60-100d，然后统计对照培养基和筛选培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率，以筛选培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率显著高于对照培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率为判断标准，筛选出可以作为橡胶树增产刺激剂的待检测化学试剂。与现有方法相比，本发明方法重复性好、时间短，不易受环境影响，能大大提高橡胶树增产刺激剂的筛选效率，可用于橡胶树增产刺激剂的规模化筛选。

Description

一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法。

背景技术

橡胶树(Hevea brasiliensis Muell-Arg)属大戟科橡胶属，是重要的热带经济作物。橡胶树树皮被定期开割，胶乳(细胞质)从割断处排出，经加工成为天然橡胶。目前橡胶树所产的天然橡胶占全世界天然橡胶总产量的99％以上，与石油、煤炭、铁矿石并列为四大工业原料，是重要的战略物资。

应用化学药剂调控技术促进橡胶树的产胶和排胶技术，是提高橡胶树生产力重要技术，也是橡胶生产和理论研究的重要内容。传统的橡胶树增产刺激剂筛选方法是将药剂涂抹于成龄树皮，再对胶树进行割胶测产，以确定该药剂的增产效果。橡胶树属高大乔木，每亩种植约30株，其经济寿命长达40年。该方法存在如下显著缺点：①占地面积大，试验成本高。在验证化学药剂对橡胶树的增产效果试验时，需要大面积的成龄树林段，需耗费大量人力物力，导致试验成本过高。②一些药剂可能对胶树有伤害作用，会导致胶树损失经济价值；③环境因素难控制。试验在大田中进行，易受到季节、气候、植株间差异等环境因素的影响，往往造成试验重复性不好。④试验周期长。橡胶树从种植至能够开割，至少需7年时间。这些缺点限制了橡胶树化学药剂规模化筛选。迄今为止仅对茉莉酸、乙烯利等少数几种化学试剂进行了割胶增产效果试验，而对于大量其它化学药剂的增产效果由于试验条件所限尚未能得到验证，制约了橡胶树增产刺激剂筛选的效率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法，使得所述方法能够缩短筛选时间、简化筛选条件，并使得筛选结果重复性好。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法，包括：

以橡胶树古铜期芽条的茎段或叶柄为外植体，消毒后将外植体切段分别接种于对照培养基和添加有待检测化学试剂的筛选培养基，24-28℃暗条件下培养60-100d，然后统计对照培养基和筛选培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率，以筛选培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率显著高于对照培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率为判断标准，筛选出可以作为橡胶树增产刺激剂的待检测化学试剂；

其中，所述对照培养基为MS培养基附加2,4-D、6-BA、NAA、蔗糖、植物凝胶，pH值为5.8-6.2；所述筛选培养基为对照培养基附加待检测化学试剂。

本发明针对现有橡胶增产刺激剂筛选方法存在耗时长、成本高、重复性差等缺陷，通过细胞工程技术，以特定的培养基进行定向乳管细胞的诱导培养，然后加入待检测的化学试剂来影响这种诱导培养效果，以其分化频率作为判断标准来快速筛选橡胶增产刺激剂。

作为优选，所述对照培养基中2,4-D、6-BA、NAA、蔗糖、植物凝胶浓度为：2,4-D 1-5mg/L，6-BA 0.5-2mg/L，NAA 0.5-4mg/L，蔗糖30-50g/L，植物凝胶2.2-2.5g/L。在本发明的一些实施方式中，所述2,4-D的浓度可以为1mg/L、2mg/L、3mg/L或5mg/L；所述6-BA的浓度可以为0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L或2mg/L；所述NAA的浓度可以为0.5mg/L、1mg/L、3mg/L或4mg/L；所述蔗糖的浓度可以为30g/L、40g/L或50g/L；所述植物凝胶的浓度可以为2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L或2.5g/L。

作为优选，所述筛选培养基中待测化学试剂的浓度为0.5-20mg/L，更优选为0.5-2mg/L。

作为优选，所述统计乳管细胞分化频率通过石蜡制片镜检统计。

进一步优选，所述石蜡制片具体步骤为：

愈伤组织固定于FAA溶液，酒精系列脱水，溴-碘染色液染色，石蜡包埋制片。

更优选地，所述石蜡制片具体步骤为：

愈伤组织固定于FAA溶液，室温下固定48-72h，然后依次于50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精中脱水1h，60℃条件下溴-碘染色液染色36-42h，染色后愈伤组织用石蜡包埋，切片机切成8-12um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

作为优选，所述橡胶树品种为热研7-33-97或RRIM600。

以现有的橡胶增产刺激剂茉莉酸、乙烯利和非橡胶增产刺激剂赤霉素为检测对象，按照本发明的方法进行检测，结果显示，添加有茉莉酸、乙烯利的筛选培养基的愈伤组织，其乳管细胞分化频率显著高于对照培养基，而添加有赤霉素的筛选培养基的愈伤组织其乳管细胞分化频率与对照培养基无显著差异，且筛选结果的重复性较好。上述结果表明，本发明方法具有较高的重复性、准确性。

利用本发明方法筛选橡胶树增产刺激剂具有明显优势：1、愈伤组织的生长条件是可控的，其培养温度、光照强度、温度、营养成分等在室内条件下得到控制，因此不受环境因素的影响，筛选试验重复性好。2、筛选试验在室内进行，操作方便，不需占用大面积田间材料，试验成本低，节省大量人力物力。3、愈伤组织一般生长周期为2-3个月，在该周期内检测所筛选的化学药剂对愈伤组织中乳管细胞分化的影响，从而快速知道该药剂的刺激效果，大大缩短试验周期。与现有方法相比，本发明能大大提高橡胶树增产刺激剂的筛选效率，可用于橡胶树增产刺激剂的规模化筛选。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

依照本发明的发明内容，本发明所述对照培养基和筛选培养基可以选择如下：

(1)对照培养基

MS培养基+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶2.2g/L，pH＝5.8；

MS培养基+2,4-D 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5g/L，pH＝6.0；

MS培养基+2,4-D 5mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 3mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.3g/L，pH＝6.2；

MS培养基+2,4-D 3mg/L+6-BA 1.5mg/L+NAA 4mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.4g/L，pH＝6.1；

(2)筛选培养基

(1)中任意一项对照培养基+0.5-20mg/L待测化学试剂；

(1)中任意一项对照培养基+0.5-2mg/L待测化学试剂；

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法进行详细说明。

实施例1：本发明所述筛选橡胶树增产刺激剂的方法

对照培养基：MS培养基+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶2.2g/L，pH＝5.8；

筛选培养基：对照培养基+0.5mg/L茉莉酸；

橡胶树外植体：橡胶树品种热研7-33-97(从中国热带农业科学院橡胶种质圃购得)古铜期芽条的茎段；

采集橡胶树品种热研7-33-97古铜期芽条的茎段，70％酒精消毒60秒，0.15％升汞消毒13分钟，无菌滤低吸干，切成长1cm小段。分别接种于对照培养基(以下简称对照组)和筛选培养基(以下简称处理组)，24℃暗培养70d。

在对照组和处理组中分别随机选取10块愈伤组织，室温下于FAA中固定48h，将固定好的愈伤块依次于50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精中脱水1h，60℃条件下溴-碘染色液(100mL醋酸中含0.4g固体溴和4.5g碘)中染色36h，石蜡包埋愈伤块，切片机切成8um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

光学显微镜下统计处理组与对照组愈伤组织中乳管细胞分化频率，采用SAS统计软件进行方差分析。愈伤组织中乳管细胞分化频率(％)＝愈伤组织中乳管细胞数量/愈伤组织中总细胞数量×100。由表1结果可知，处理组中乳管细胞分化频率极显著高于对照组。这些结果表明茉莉酸能促进乳管细胞分化，可作为橡胶树增产刺激剂。

表1

实施例2：本发明所述筛选橡胶树增产刺激剂的方法

对照培养基：MS培养基+2,4-D 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5g/L，pH＝6.0；

筛选培养基：对照培养基+2mg/L茉莉酸；

橡胶树外植体：橡胶树品种热研7-33-97(从中国热带农业科学院橡胶种质圃购得)古铜期芽条的叶柄；

采集橡胶树品种热研7-33-97古铜期芽条的茎段，70％酒精消毒40秒，0.15％升汞消毒10分钟，无菌滤低吸干，切成长1.5cm小段。分别接种于对照培养基(以下简称对照组)和筛选培养基(以下简称处理组)，26℃暗培养80d。

在对照组和处理组中分别随机选取10块愈伤组织，室温下于FAA中固定72h，将固定好的愈伤块依次于50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精中脱水1h，60℃条件下溴-碘染色液(100mL醋酸中含0.4g固体溴和4.5g碘)中染色42h，石蜡包埋愈伤块，切片机切成12um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

光学显微镜下统计处理组与对照组愈伤组织中乳管细胞分化频率，采用SAS统计软件进行方差分析。愈伤组织中乳管细胞分化频率(％)＝愈伤组织中乳管细胞数量/愈伤组织中总细胞数量×100。由表2结果可知，处理组中乳管细胞分化频率极显著高于对照组。这些结果表明茉莉酸能促进乳管细胞分化，可作为橡胶树增产刺激剂。

表2

实施例3：本发明所述筛选橡胶树增产刺激剂的方法

对照培养基：MS培养基+2,4-D 5mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 3mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.3g/L，pH＝6.2；

筛选培养基：对照培养基+10mg/L乙烯利

橡胶树外植体：橡胶树品种RRIM600(从中国热带农业科学院橡胶种质圃购得)古铜期芽条的茎段；

采集橡胶树品种RRIM600古铜期芽条的茎段，70％酒精消毒30秒，0.15％升汞消毒15分钟，无菌滤低吸干，切成长2cm小段。分别接种于对照培养基(以下简称对照组)和筛选培养基(以下简称处理组)，28℃暗培养60d。

在对照组和处理组中分别随机选取10块愈伤组织，室温下于FAA中固定48h，将固定好的愈伤块依次于50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精中脱水1h，60℃条件下溴-碘染色液(100mL醋酸中含0.4g固体溴和4.5g碘)中染色40h，石蜡包埋愈伤块，切片机切成8um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

光学显微镜下统计处理组与对照组愈伤组织中乳管细胞分化频率，采用SAS统计软件进行方差分析。愈伤组织中乳管细胞分化频率(％)＝愈伤组织中乳管细胞数量/愈伤组织中总细胞数量×100。由表3结果可知，处理组中乳管细胞分化频率极显著高于对照组。这些结果表明乙烯利能促进乳管细胞分化，可作为橡胶树增产刺激剂。

表3

实施例4：本发明所述筛选橡胶树增产刺激剂的方法

对照培养基：MS培养基+2,4-D 3mg/L+6-BA 1.5mg/L+NAA 4mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.4g/L，pH＝6.1；

筛选培养基：对照培养基+20mg/L乙烯利；

橡胶树外植体：橡胶树品种RRIM600(从中国热带农业科学院橡胶种质圃购得)古铜期芽条的叶柄；

采集橡胶树品种RRIM600古铜期芽条的叶柄，70％酒精消毒50秒，0.15％升汞消毒8分钟，无菌滤低吸干，切成长1cm小段。分别接种于对照培养基(以下简称对照组)和筛选培养基(以下简称处理组)，25℃暗培养90d。

在对照组和处理组中分别随机选取10块愈伤组织，室温下于FAA中固定60h，将固定好的愈伤块依次于50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精中脱水1h，60℃条件下溴-碘染色液(100mL醋酸中含0.4g固体溴和4.5g碘)中染色38h，石蜡包埋愈伤块，切片机切成8um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

光学显微镜下统计处理组与对照组愈伤组织中乳管细胞分化频率，采用SAS统计软件进行方差分析。愈伤组织中乳管细胞分化频率(％)＝愈伤组织中乳管细胞数量/愈伤组织中总细胞数量×100。由表4结果可知，处理组中乳管细胞分化频率极显著高于对照组。这些结果表明乙烯利能促进乳管细胞分化，可作为橡胶树增产刺激剂。

表4

实施例5：本发明所述筛选橡胶树增产刺激剂的方法

对照培养基：MS培养基+2,4-D 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2.5g/L，pH＝6.0；

筛选培养基：对照培养基+2mg/L赤霉素(已知的非增产刺激剂)；

橡胶树外植体：橡胶树品种热研7-33-97(从中国热带农业科学院橡胶种质圃购得)古铜期芽条的叶柄；

采集橡胶树品种热研7-33-97古铜期芽条的茎段，70％酒精消毒40秒，0.15％升汞消毒10分钟，无菌滤低吸干，切成长1.5cm小段。分别接种于对照培养基(以下简称对照组)和筛选培养基(以下简称处理组)，26℃暗培养80d。

在对照组和处理组中分别随机选取10块愈伤组织，室温下于FAA中固定72h，将固定好的愈伤块依次于50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精中脱水1h，60℃条件下溴-碘染色液(100mL醋酸中含0.4g固体溴和4.5g碘)中染色42h，石蜡包埋愈伤块，切片机切成12um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

光学显微镜下统计处理组与对照组愈伤组织中乳管细胞分化频率，采用SAS统计软件进行方差分析。愈伤组织中乳管细胞分化频率(％)＝愈伤组织中乳管细胞数量/愈伤组织中总细胞数量×100。由表5结果可知，处理组中乳管细胞分化频率与对照组的相接近，无明显差异。这些结果表明赤霉素不能促进乳管细胞分化，不可作为橡胶树增产刺激剂。

表5

实施例6：不同对照培养基的对比试验

试验设计5种不同组分的对照培养基，分别为：1、MS+2,4-D 5mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.3g/L，pH＝6.2；2、MS+2,4-D 5mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.3g/L，pH＝6.2；3、MS+2,4-D 5mg/L+NAA 3mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.3g/L，pH＝6.2；4、MS+6-BA 2mg/L+NAA 3mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.3g/L，pH＝6.2；5、MS+2,4-D 5mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 3mg/L+蔗糖50g/L+植物凝胶2.3g/L，pH＝6.2。其中第5种组分为本发明的对照培养基。

橡胶树外植体：橡胶树品种RRIM600(从中国热带农业科学院橡胶种质圃购得)古铜期芽条的茎段；

采集橡胶树品种RRIM600古铜期芽条的茎段，70％酒精消毒30秒，0.15％升汞消毒15分钟，无菌滤低吸干，切成长2cm小段。分别接种于5种不同组分的对照培养基中，28℃暗培养60d。

在不同组分的对照培养基中分别随机选取10块愈伤组织，室温下于FAA中固定48h，将固定好的愈伤块依次于50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精中脱水1h，60℃条件下溴-碘染色液(100mL醋酸中含0.4g固体溴和4.5g碘)中染色40h，石蜡包埋愈伤块，切片机切成8um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

光学显微镜下统计不同组分的对照培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率，采用SAS统计软件进行方差分析。愈伤组织中乳管细胞分化频率(％)＝愈伤组织中乳管细胞数量/愈伤组织中总细胞数量×100。由表6结果可知，对照培养基中的组分对愈伤组织中乳管细胞分化起关键作用，只有本发明的对照培养基中愈伤组织才能分化出乳管细胞，而其它对照培养基中愈伤组织不能分化出乳管细胞。这些结果表明只有本发明的对照培养基才能用于筛选橡胶增产刺激剂。

表6不同对照培养基的组分对愈伤组织中乳管细胞分化的影响

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法，其特征在于，包括：

以橡胶树古铜期芽条的茎段或叶柄为外植体，消毒后将外植体切段分别接种于对照培养基和添加有待检测化学试剂的筛选培养基，24-28℃暗条件下培养60-100d，然后统计对照培养基和筛选培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率，以筛选培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率显著高于对照培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率为判断标准，筛选出可以作为橡胶树增产刺激剂的待检测化学试剂；

其中，所述对照培养基为MS培养基附加2,4-D、6-BA、NAA、蔗糖、植物凝胶，pH值为5.8-6.2；所述筛选培养基为对照培养基附加待检测化学试剂。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对照培养基中2,4-D、6-BA、NAA、蔗糖、植物凝胶浓度为：2,4-D 1-5mg/L，6-BA 0.5-2mg/L，NAA 0.5-4mg/L，蔗糖30-50g/L，植物凝胶2.2-2.5g/L。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述筛选培养基中待测化学试剂的浓度为0.5-20mg/L。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述筛选培养基中待测化学试剂的浓度为0.5-2mg/L。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述统计乳管细胞分化频率通过石蜡制片镜检统计。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述石蜡制片具体步骤为：

愈伤组织固定于FAA溶液，酒精系列脱水，溴-碘染色液染色，石蜡包埋制片。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述石蜡制片具体步骤为：

愈伤组织固定于FAA溶液，室温下固定48-72h，然后依次于50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％酒精中脱水1h，60℃条件下溴-碘染色液染色36-42h，染色后愈伤组织用石蜡包埋，切片机切成8-12um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述橡胶树品种为热研7-33-97或RRIM600。