CN113375989A - 橡胶树乳管网络的分离方法和研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种橡胶树乳管网络的分离方法，包括以下步骤：将橡胶树树皮样品采用固定液进行固定，再将得到的橡胶树树皮样品采用酶解液进行酶解；所述酶解液中包括纤维素酶、果胶酶、离析酶、崩溃酶和甘露醇。本申请提供的橡胶树乳管网络的分离方法通过采用固定和酶解的方法，实现了橡胶树乳管网络的快速、完整分离，具有操作便捷、用时短、乳管解剖学方面信息齐全的优势。
Description
技术领域
本发明涉及农业组织解剖学技术领域，尤其涉及橡胶树乳管网络的分离方法和研究方法。
背景技术
橡胶树(Hevea brasiliensis Muell-Arg)属大戟科橡胶属，是多年生的异花授粉乔木，在热带地区广泛种植；其所产的天然橡胶与石油、煤炭、铁矿石并列为四大工业原料，是重要的战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位。橡胶树树皮乳管是橡胶生物合成和储存的唯一场所，是决定天然橡胶产量的最重要的结构成分。橡胶树含有初生和次生两种类型的乳管。初生乳管存在于橡胶树的根、花、果实、种子、叶片、幼茎中；次生乳管存在于成龄橡胶树的树干树皮中，是橡胶树产量的主要来源。
橡胶树的乳管是由无数个乳管细胞构成的贯通的网络结构。由于橡胶树次生乳管的重要性，很多科研人员聚焦于其解剖学研究。橡胶树树皮乳管细胞周边存在薄壁细胞、石细胞、单宁细胞等类型细胞。传统的研究橡胶树乳管解剖学方法是以整块树皮为研究对象，树皮块经固定后进行基于石蜡制片的溴-碘染色法来观察乳管分化情况，或者经超微制片后在电镜下观察乳管细胞内的细胞器变化情况。
以整块树皮为研究对象进行显微或超微结构研究存在以下的缺点：①切片中的乳管网络结构不全的缺点，导致所获得的乳管结构特征信息受限制，影响了橡胶树乳管解剖学研究进展；由于在制片中很难切到在同一平面的乳管网络，同时其他类型细胞的存在也会对乳管细胞造成一定的干扰，因此在制备好的树皮切片中只能观察到个别乳管细胞的形态特征，而不能观察到整个乳管网络的形态特征变化，导致切片所提供的乳管结构特征信息受限制；②乳管鉴定实验操作复杂、耗时；基于石蜡制片的溴-碘染色法是鉴定乳管的经典方法，也是研究乳管分化的最常用方法，但由于树皮乳管被其他类型细胞所包裹，溴和碘必须在醋酸作介质下在65℃高温条件下处理2～3d才能将树皮内部的乳管染上颜色，然后再经过石蜡包埋、切片、粘片、脱蜡、封片等一系列操作才能完成树皮样品的制备工作，实验操作复杂且耗时。
早期，赵修谦报道了一种橡胶树树皮乳管网络的分离方法，该方法是用将树皮放入10％的氢氧化钾溶液中煮软20min，再对乳管进行剥离(赵修谦。巴西橡胶制片法。植物学报，1980，22(1):101-102)。但上述方法中经强碱高温处理后的乳管其细胞壁会受到一定程度的损伤，同时乳管细胞内的细胞器会变形，所分离到的乳管不能用于超微结构研究。近期，公开号为CN106501035B的中国专利公开了一种快速显示橡胶树树皮乳管的组织化学方法，该方法操作虽然快捷，但其处理对象也是整个树皮块，观察到的是个别的乳管细胞，而不是整个乳管网络，乳管信息受限制。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种橡胶树乳管网络的分离方法，该方法可快速分离出橡胶树乳管网络的完整结构，以利于橡胶树乳管显微结构的研究。
有鉴于此，本申请提供了一种橡胶树乳管网络的分离方法，包括以下步骤：
将橡胶树树皮样品采用固定液进行固定，再将得到的橡胶树树皮样品采用酶解液进行酶解；
以100mL酶解液为基准，所述酶解液中包括2～3wt％的纤维素酶、2～3wt％的果胶酶、2～3wt％的离析酶、2～3wt％的崩溃酶、9～13wt％的甘露醇。
优选的，所述固定液为75％的乙醇或4％的戊二醛。
优选的，所述固定的过程具体为：
将橡胶树树皮样品置于固定液，在压力为350mm条件下真空抽气15～35min，再固定3～5h。
优选的，所述酶解前还包括：
将固定后的橡胶树树皮样品采用PBS缓冲液冲洗3～4次，每次10～15min。
优选的，所述酶解液中包括2wt％的纤维素酶、2w％的果胶酶、2wt％的离析酶、2wt％的崩溃酶、9wt％的甘露醇。
优选的，所述酶解液的pH为6.0～6.5。
优选的，所述酶解的温度为40～50℃，转速为60～70rmp，时间为12～24h。
本申请还提供了一种橡胶树乳管网络的研究方法，包括以下步骤：
将橡胶树树皮样品采用固定液进行固定，再将得到的橡胶树树皮样品采用酶解液进行酶解；
将酶解得到的橡胶树乳管网络进行显微研究或超微研究；
以100mL酶解液为基准，所述酶解液中包括2～3wt％的纤维素酶、2～3wt％的果胶酶、2～3wt％的离析酶、2～3wt％的崩溃酶、9～13wt％的甘露醇。
优选的，所述显微研究是将酶解得到的橡胶树乳管网络依次经30％、50％、70％、80％、90％、100％的乙醇室温下逐级脱水，每级脱水时间为15min，再经乙醇醋酸混合液、醋酸各处理20min，溴碘溶液染色2min后置于显微镜下观察。
优选的，所述超微研究是将酶解得到的橡胶树乳管网络依次经0％、50％、70％、80％、90％丙酮4℃下逐级脱水，每级15min，再用无水丙酮脱水3次，每次20min，将得到的橡胶树乳管网络放入包埋液进行渗透与聚化，切成50nm薄片载于镍网中，用1％醋酸双氧铀室温下染色20min，双蒸水清洗3次，每次5min，再用柠檬酸铅染色液室温下染色15min，双蒸水清洗3次，每次5min，烤干切片，透射电镜下观察。
本申请提供了一种橡胶树乳管网络的分离方法，其先将橡胶树树皮样品采用固定液固定，再将得到的橡胶树树皮在酶解液中进行酶解；本申请采用特定的酶解液，通过酶解处理，酶解液中的纤维酶、果胶酶将薄壁细胞胞壁解离掉，而乳管细胞的胞壁结构特殊，不受任何酶类的影响，保持完整。因此，橡胶树树皮样品在酶解过程中会变软化，薄壁细胞被解离掉，很容易将乳管分离出来。
综上，本申请提供的橡胶树乳管网络的分离方法能够快速分离出橡胶树乳管网络完整结构，不会对乳管细胞的胞壁和其内部的细胞器造成任何损坏；以分离的乳管网络进行乳管显微结构、超微结构等方面的研究，可以排除其他类型树皮细胞的干扰，能获得更多的乳管解剖学方面信息；以分离的乳管网络进行乳管结构研究，可避免组织制片环节，化学染色时间也较短，因此具有操作便捷、用时短的优势。
附图说明
图1为本发明实施例1分离的橡胶树初生乳管网络的显微照片；
图2为本发明实施例2分离的橡胶树初生乳管网络的显微照片；
图3为本发明实施例3分离的橡胶树初生、次生乳管网络的超微结构照片；
图4为本发明对比例1、2分离的橡胶树初生、次生乳管网络显微照片。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
鉴于橡胶树乳管网络研究的需求以及现有技术橡胶树乳管不能单独分离出来的问题，本申请提供了一种橡胶树乳管网络的分离方法，该方法能够获得分离的乳管网络，基于分离的乳管网络可进行乳管显微结构和超微结构的研究。具体的，本申请提供了一种橡胶树乳管网络的分离方法，包括以下步骤：
将橡胶树树皮样品采用固定液进行固定，再将得到的橡胶树树皮样品采用酶解液进行酶解；
以100mL酶解液为基准，所述酶解液中包括2～3wt％的纤维素酶、2～3wt％的果胶酶、2～3wt％的离析酶、2～3wt％的崩溃酶、9～13wt％的甘露醇。
按照本发明，首先将橡胶树树皮样品采用固定液进行固定，具体是将小块的橡胶树树皮样品置于固定液后在压力为350mmHg条件下真空抽气15～35h，再固定3～5h。在本申请中，所述固定液选自75％的乙醇或4％的戊二醛；若乳管网络结构用于超微结构制片，则采用4％的戊二醛于4℃下先固定4h，再在1％锇酸中与4℃下固定4h。
本申请然后将固定好的树皮样品采用PBS缓冲液清洗3～4次，每次10～15min。上述清洗以去除树皮样品的固定液。
在上述清洗之后，则将得到的橡胶树树皮样品于酶解液进行酶解，以分离得到完整的乳管网络。在本申请中，以100mL酶解液为基准，所述酶解液具体包括2～3wt％的纤维素酶、2～3wt％的果胶酶、2～3wt％的离析酶、2～3wt％的崩溃酶、9～13wt％的甘露醇。在上述酶解液的原料中，所述纤维素酶、果胶酶主要起到解离树皮薄壁细胞的作用，崩溃酶解离纤维素、果胶的能力最强；离析酶具有辅助作用；甘露醇具有调节溶液渗透压的效果，起到保持乳管细胞完整性的作用。因此，上述酶解液中的纤维素酶、果胶酶、崩溃酶、离析酶和甘露醇共同作用，能够显著提高解离效果。若缺少纤维素酶、崩溃酶或果胶酶，酶解效率会大大降低，酶解效果不好，在12h不能将树皮薄壁细胞完全解离掉，不能分离出乳管细胞。在具体实施例中，所述酶解液中包括2wt％的纤维素酶、2w％的果胶酶、2wt％的离析酶、2wt％的崩溃酶、9wt％的甘露醇。所述酶解液的pH为6.0～6.5，更具体的，所述酶解液的pH为6.2。在上述酶解的过程中，所述酶解的温度为40～50℃，转速为60～70rmp，时间为12～24h；在具体实施例中，所述酶解的温度为48℃，转速为60rmp，时间为12h。在上述酶解温度下，纤维素酶、果胶酶等的活性最强，酶解效果最好，而在上述转速下酶解，酶解液可以最大程度的渗透至树皮细胞中，促进树皮细胞酶解。
在上述酶解之后，则得到分离的乳管网络，其可进行显微研究或超微研究。所述显微研究是将分离得到的乳管网络直接或进行溴碘溶液染色后置于显微镜下观察。更具体的，所述溴碘溶液染色是将酶解得到的橡胶树乳管网络依次经30％、50％、70％、80％、90％、100％的乙醇室温下逐级脱水，每级脱水时间为15min，再经乙醇醋酸混合液、醋酸各处理20min，溴碘溶液染色2min后置于显微镜下观察。所述超微研究是将酶解得到的橡胶树乳管网络依次经0％、50％、70％、80％、90％丙酮4℃下逐级脱水，每级15min，再用无水丙酮脱水3次，每次20min，将得到的橡胶树乳管网络放入包埋液进行渗透与聚化，切成50nm薄片载于镍网中，用1％醋酸双氧铀室温下染色20min，双蒸水清洗3次，每次5min，再用柠檬酸铅染色液室温下染色15min，双蒸水清洗3次，每次5min，烤干切片，透射电镜下观察。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的橡胶树乳管网络的分离方法和研究方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1橡胶树初生乳管网络的分离及显微结构研究
1、实验条件：用直径为0.3cm树皮打孔器对处于叶片稳定期的热研7-33-97枝条取树皮，树皮样品立即放入75％乙醇中，在压力为350mm Hg条件下真空抽气15min，室温下再固定4h；采用PBS缓冲液冲洗树皮样品3遍，每次10min，再将其放入含有2％纤维素酶、2％果胶酶、2％离析酶、2％崩溃酶、9％甘露醇且pH为6.2的酶解液，48℃下60rmp振荡条件下处理12h；去除酶液，PBS缓冲液冲洗树皮样品3遍，每遍10min，再置于含有PBS缓冲液的培养皿中在解剖镜下用解剖针轻轻地将乳管周边其他类型细胞去除，分离到完整的乳管网络；
将所分离的乳管网络直接置于载玻片上，在光学显微镜下观察：将所分离的乳管网络室温下经30％、50％、70％、80％、90％、100％、100％乙醇逐级脱水，每级脱水时间为15min，再经乙醇醋酸混合液(乙醇：醋酸＝1：1)、醋酸各处理20min，溴碘溶液染色2min后置于载玻片上，光学显微镜下观察，如图1所示，图A为未经染色处理的橡胶树初生乳管网络的显微结构，图B为经溴碘溶液染色的橡胶树初生乳管网络显微结构，图C为橡胶树初生乳管网络3D显微结构，标尺：A＝200μm，B＝100μm，C＝40μm。
2、实验结果：结果表明，橡胶树枝条的树皮经酶解液处理后变得酥软，用解剖针很容易去除初生乳管周围的其他类型细胞，从树皮中分离出完整的初生乳管网络，如图1A所示；初生乳管经溴碘溶液染色后显示为棕色，乳管细胞胞壁间有些颗粒状凸起，未见细胞间存在节状结构，如图1B、C所示。
实施例2橡胶树次生乳管网络的分离及显微结构研究
1、实验条件：用直径为0.3cm树皮打孔器取离地1m处的10龄的热研7-33-97树干树皮，立即置于75％乙醇中，在压力为350mm Hg条件下真空抽气15min，室温下再固定4h；采用PBS缓冲液冲洗已固定的树皮样品3遍，每次10min，再将树皮样品置于含有2％纤维素酶、2％果胶酶、2％离析酶、2％崩溃酶、9％甘露醇且pH为6.2的酶解液，48℃下60rmp振荡条件下处理12h；去除酶液，PBS缓冲液冲洗树皮样品3遍，每遍10min，再置于含有PBS缓冲液的培养皿中在解剖镜下用解剖针轻轻地将乳管周边其他类型细胞去除，分离到完整的乳管网络；
将所分离的乳管网络直接置于载玻片上，在光学显微镜下观察：同时，将所分离的乳管网络室温下经30％、50％、70％、80％、90％、100％、100％乙醇逐级脱水，每级脱水时间为15min，再经乙醇醋酸混合液(乙醇：醋酸＝1：1)、醋酸各处理20min，溴碘溶液染色2min后置于载玻片上，光学显微镜下观察，如图2所示，图2中，A是未经染色处理的橡胶树次生乳管网络显微结构；B是经溴碘溶液染色的橡胶树次生乳管网络显微结构；C是橡胶树次生乳管网络3D显微结构；标尺：A＝200μm，B＝100μm，C＝40μm。
2、实验结果：结果表明，树皮经酶解液处理后变得酥软，很容易从中分离出完整的次生乳管网络。未经染色的乳管网络是乳白色，乳管间通过乳管桥连接起来，呈现网状结构，如图2A所示；经溴碘溶液染色后，次生乳管网络变为棕色，且其形态特征显得更为清晰，乳管细胞胞壁光滑，乳管细胞间有节状结构，如图2B、C所示。
实施例3橡胶树初生、次生乳管网络的分离及超微结构研究
1、实验条件：用直径为0.3cm树皮打孔器分别取处于叶片稳定期的热研7-33-97枝条的树皮和离地1m处的10龄的热研7-33-97树干树皮，树皮样品立即置于4℃的4％戊二醛中，在压力为350mm Hg条件下真空抽气15min，4℃下再固定4h；树皮样品经4℃的PBS缓冲液冲洗3遍，每遍10min，再置于4℃的1％饿酸中在压力为350mm Hg条件下真空抽气15min，4℃下再固定4h；PBS缓冲液冲洗树皮样品3遍，每次10min，再置于含有2％纤维素酶、2％果胶酶、2％离析酶、2％崩溃酶、9％甘露醇且pH为6.2的酶解液中，48℃下60rmp振荡条件下处理12h；去除酶液，PBS缓冲液冲洗树皮样品3遍，每遍10min，再置于含有PBS缓冲液的培养皿中，在解剖镜下用解剖针轻轻地将完整的乳管网络从树皮细胞中分离出来；将所分离的乳管网络在4℃下用30％、50％、70％、80％、90％丙酮逐级脱水，每级15min，再用无水丙酮脱水3次，每次20min。将脱水后的样品置入包埋液进行渗透与聚化，用钻石刀切成50nm薄片，载于镍网中；用1％醋酸双氧铀室温下染色20min，双蒸水清洗3次，每次5min，再用柠檬酸铅染色液室温下染色15min，双蒸水清洗3次，每次5min，烤干切片，透射电镜下观察，如图3所示，图3为橡胶树乳管超微结构，其中A是橡胶树初生乳管超微结构的电镜照片，B是橡胶树次生乳管超微结构，标尺＝5μm。
2、实验结果：结果显示初生、次生乳管细胞胞壁均较完整，没有任何损坏；乳管细胞内存在较多的形态正常的大、中、小尺度的橡胶粒子，如图3A、B所示。这些结果表明乳管细胞内的细胞器形态正常。
对比例1、2橡胶树初生、次生乳管网络的分离
1、实验条件：用直径为0.3cm树皮打孔器分别取热研7-33-97的叶片稳定期的枝条树皮和离地1m处的10龄的树干树皮，立即置于75％乙醇中于压力为350mm Hg条件下真空抽气15min，室温下再固定4h，PBS缓冲液冲洗树皮样品3遍，每次10min，再将树皮样品置于含有2％纤维素酶、2％果胶酶、2％离析酶、9％甘露醇且pH为6.2的酶解液，48℃下60rmp振荡条件下处理12h；去除酶液，PBS缓冲液冲洗树皮样品3遍，每遍10min，再置于含有PBS缓冲液的培养皿中在解剖镜下用解剖针分离乳管网络，再置于显微镜下观察，如图4所示，图4中，其中A为未经染色的橡胶树初生乳管网络显微结构，其中B为未经染色的橡胶树次生乳管网络显微结构，标尺＝100μm；
2、实验结果：结果表明在不含崩溃酶的酶液的处理中，橡胶树枝条树皮的初生乳管和树干树皮的次生乳管周围部分其他类型的细胞尚未能被完全降解，它们与乳管紧密粘合在一起，很难将这些细胞从乳管周边去除掉，导致不能分离出完整的乳管网络，如图4A、B所示。
同样，在缺少酶解液中任意一种其他组分时，橡胶树的初生、次生乳管周围部分其他类型的细胞均未能被完全降解，不能分离出完整的乳管网络。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种橡胶树乳管网络的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
将橡胶树树皮样品采用固定液进行固定，再将得到的橡胶树树皮样品采用酶解液进行酶解；
以100mL酶解液为基准，所述酶解液中包括2～3wt％的纤维素酶、2～3wt％的果胶酶、2～3wt％的离析酶、2～3wt％的崩溃酶、9～13wt％的甘露醇。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述固定液为75％的乙醇或4％的戊二醛。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述固定的过程具体为：
将橡胶树树皮样品置于固定液，在压力为350mm条件下真空抽气15～35min，再固定3～5h。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述酶解前还包括：
将固定后的橡胶树树皮样品采用PBS缓冲液冲洗3～4次，每次10～15min。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述酶解液中包括2wt％的纤维素酶、2w％的果胶酶、2wt％的离析酶、2wt％的崩溃酶、9wt％的甘露醇。
6.根据权利要求1或5所述的分离方法，其特征在于，所述酶解液的pH为6.0～6.5。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述酶解的温度为40～50℃，转速为60～70rmp，时间为12～24h。
8.一种橡胶树乳管网络的研究方法，包括以下步骤：
将橡胶树树皮样品采用固定液进行固定，再将得到的橡胶树树皮样品采用酶解液进行酶解；
将酶解得到的橡胶树乳管网络进行显微研究或超微研究；
以100mL酶解液为基准，所述酶解液中包括2～3wt％的纤维素酶、2～3wt％的果胶酶、2～3wt％的离析酶、2～3wt％的崩溃酶、9～13wt％的甘露醇。
9.根据权利要求8所述的研究方法，其特征在于，所述显微研究是将酶解得到的橡胶树乳管网络依次经30％、50％、70％、80％、90％、100％的乙醇室温下逐级脱水，每级脱水时间为15min，再经乙醇醋酸混合液、醋酸各处理20min，溴碘溶液染色2min后置于显微镜下观察。
10.根据权利要求8所述的研究方法，其特征在于，所述超微研究是将酶解得到的橡胶树乳管网络依次经0％、50％、70％、80％、90％丙酮4℃下逐级脱水，每级15min，再用无水丙酮脱水3次，每次20min，将得到的橡胶树乳管网络放入包埋液进行渗透与聚化，切成50nm薄片载于镍网中，用1％醋酸双氧铀室温下染色20min，双蒸水清洗3次，每次5min，再用柠檬酸铅染色液室温下染色15min，双蒸水清洗3次，每次5min，烤干切片，透射电镜下观察。
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