CN109601062A - 一种粉防己种子的催芽方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粉防己种子的催芽方法，包括如下步骤：（1）种子选取；（2）低温沙藏；（3）暖温光照。本发明通过选取粉防己雌性缠绕植株上果皮泛红的成熟核果，保证足够的成熟度，并对粉防己种子先低温无光照沙藏处理，再经暖温光照湿沙层积处理；种子选取阶段尤其需要保留果皮和果肉为种子完成胚后熟提供营养，结合低温沙藏的消毒处理，再进行光照暖温层积从而使得胚后熟过程提速。本方法处理后的种子露白后测定萌发率可达65%，其萌发率较自然环境提高7.6倍；萌发时间由120天缩短至75天，缩短1.6倍。

Description

一种粉防己种子的催芽方法

技术领域

本发明涉及中药材栽培技术领域，具体而言，涉及一种粉防己种子的催芽方法。

背景技术

粉防己，又名汉防己、白木香，为防己科，千金藤属植物，多年生落叶缠绕藤本，茎纤细，有纵条纹。粉防己药用部分为粉防己干燥肉质直根，粉防己性寒，味苦，利水消肿，祛风止痛，用于水肿脚气、小便不利、风湿痹痛、湿疹疮毒、高血压症。2015版《中华人民共和国药典》规定中药防己来源于防己科植物粉防己Stephania tetrandra S. Moore的根。

植物粉防己为多年生缠绕草质藤本植物，雌雄异株，分布于长江以南的皖南山区、浙江、江西等省份的低山丘陵区，安徽省是其主产区之一。但由于植物粉防己资源主要来源于野生，前期大量收购，忽视了粉防己的可持续利用，目前产量一直呈下滑趋势，药材供求矛盾比较突出，加之过度采挖，资源更新存在障碍。通过样地调查、走访，发现样地中已经发育成熟的粉防己野生居群中，实生苗仅有1～2株，由此得出野生状态下粉防己的自然生殖（种子生殖）力低，即使种子形态成熟后，也需半年左右时间低温贮藏才能萌发，而且在低温贮藏过程中出现了瘪壳、空胚现象。

目前粉防己主要以野生资源供给为主，难以满足市场需求；现有人工栽培技术主要为分根繁殖，其次为组织培养扩增种苗，而种子育苗因种子萌发率低，目前未见有报道。

根据《现代中药研究与实践》2005,第19（4）期，刘隆洪、项曙红、张西平等著《粉防己家种技术初探分根繁殖》说明，粉防已因其对块根需求量大，栽培过程至少需达5年以上才可形成药材产量，生长周期长，且容易造成品种退化、病虫害加重，最终经济效益差，难以形成大规模种植。

为进行粉防已规模化种植，国内也有少量研究，比如公开号为CN107873518A的一种粉防己种苗的组培方法，包括选取粉防己带腋芽茎段作为外植体，灭菌后接种到MS培养基中进行培养，然后进行诱导培养、继代培养、生根培养和炼苗。本发明通过诱导培养、继代培养和生根培养几个阶段的培养的组织培养方法及各组织培养阶段选择适宜的培养基，有效缩短粉防己育苗时间，提高粉防己种苗质量，在短时间内获得大量优质粉防己种苗，且该方法有效解决了粉防己繁育对块根需求量大、种子育苗发芽率低的问题。但上述方案在实际工作中，还是有诸多不便。同时目前利用粉防己带腋芽茎段作为外植体，通过组织培养扩增种苗仅停留在炼苗阶段，尚未大规模得到应用。因此，种苗问题成为制约粉防己规模化种植的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种操作性高、有效缩短萌发所需时间、提高粉防已种子萌发率的催芽方法。

本发明采用的技术方案是：一种粉防己种子的催芽方法，包括如下步骤：（1）种子选取：于当年10～11月下旬前，采集多年生草质藤本植物粉防己雌性缠绕植株上的核果，选择果皮由绿泛红时摘取，洗净果皮，保留果皮和果肉；（2）低温沙藏：选取直径0.5～1mm的河沙，用消毒液百菌清进行消毒，以消毒湿沙为床；粉防己种子与河沙之比为1:5～1:3，种子埋藏的位置距离湿沙与空气界面的位置在5～10cm；湿沙相对湿度在60～70％，调控湿沙的PH值在5～6，温度控制在4℃左右浮动，层积25～35天，光照0勒克斯（LX）；（3）暖温光照：将步骤（2）层积处理后的种子再进行暖温湿沙光照层积，温度控制在15～25℃，光照2000～3000勒克斯（LX），调控湿沙PH值在6～7，沙藏40～50天，层积和湿度处理方式同前。

作为本发明的进一步改进，所述步骤（1）中所摘取的粉防己雌性植株上的核果，其果皮由绿泛红的果实数量占整个植株果实总量的80%以上，果皮洗净，并保留果皮和果肉。

作为本发明的进一步改进，所述步骤（2）中粉防已种子与河沙之比为1:3，沙藏30天。

作为本发明的进一步改进，所述步骤（3）中光照为2500勒克斯（LX），沙藏45天。

本发明采用的有益效果是：本发明通过选取粉防己雌性缠绕植株上果皮泛红的成熟核果，保证足够的成熟度，并对粉防己种子先低温无光照沙藏处理，再经暖温光照湿沙层积处理；种子选取阶段尤其需要保留果皮和果肉为种子完成胚后熟提供营养，结合低温沙藏的消毒处理，再进行光照暖温层积从而使得胚后熟过程提速。本方法处理后的种子露白后测定萌发率可达65%，其萌发率较自然环境提高7.6倍；萌发时间由120天缩短至75天，缩短1.6倍。本发明可有效解决粉防己繁育种子苗紧缺的问题，并克服了组培苗炼苗成活率低、分根繁殖而种苗紧缺的难题。

具体实施方式

为便于理解本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1，一种粉防己种子的催芽方法，包括如下步骤：

（1）种子选取：于当年10～11月下旬前，采集多年生草质藤本植物粉防己雌性缠绕植株上的核果，选择果皮由绿泛红时摘取，洗净果皮，保留果皮和果肉；（2）低温沙藏：选取直径0.5mm的河沙，用消毒液百菌清进行消毒，以消毒湿沙为床；粉防己种子与河沙之比为1:5，种子埋藏的位置距离湿沙与空气界面的位置在5cm；湿沙相对湿度在65％，调控湿沙的PH值在6，温度控制在4℃左右浮动，层积25天，光照0勒克斯（LX）；（3）暖温光照：将步骤（2）层积处理后的种子再进行暖温湿沙光照层积，温度控制在15℃，光照2000勒克斯（LX），调控湿沙PH值在7，沙藏40天，层积和湿度处理方式同前。

实施例2，一种粉防己种子的催芽方法，包括如下步骤：

（1）种子选取：于当年10～11月下旬前，采集多年生草质藤本植物粉防己雌性缠绕植株上的核果，其果皮由绿泛红的果实数量占整个植株果实总量的80%以上，洗净果皮，保留果皮和果肉；（2）低温沙藏：选取直径1mm的河沙，用消毒液百菌清进行消毒，以消毒湿沙为床；粉防己种子与河沙之比为1:3，种子埋藏的位置距离湿沙与空气界面的位置在10cm；湿沙相对湿度在70％，调控湿沙的PH值在6，温度控制在4℃左右浮动，层积35天，光照0勒克斯（LX）；（3）暖温光照：将步骤（2）层积处理后的种子再进行暖温湿沙光照层积，温度控制在25℃，光照3000勒克斯（LX），调控湿沙PH值在6，沙藏50天，层积和湿度处理方式同前。

实施例3，一种粉防己种子的催芽方法，包括如下步骤：

（1）种子选取：于当年10～11月下旬前，采集多年生草质藤本植物粉防己雌性缠绕植株上的核果，其果皮由绿泛红的果实数量占整个植株果实总量的80%以上，洗净果皮，保留果皮和果肉；（2）低温沙藏：选取直径0.8mm的河沙，用消毒液百菌清进行消毒，以消毒湿沙为床；粉防己种子与河沙之比为1:3，种子埋藏的位置距离湿沙与空气界面的位置在8cm；湿沙相对湿度在65％，调控湿沙的PH值在6，温度控制在4℃左右浮动，层积30天，光照0勒克斯（LX）；（3）暖温光照：将步骤（2）层积处理后的种子再进行暖温湿沙光照层积，温度控制在20℃，光照2500勒克斯（LX），调控湿沙PH值在7，沙藏45天，层积和湿度处理方式同前。

本发明的步骤（1）中，在进行种子催芽方法之前，所摘取的粉防己雌性植株上的核果，其果皮由绿泛红的果实数量占整个植株果实总量的80%以上，以确保该植株处于健康状态；采取该植株的果实，将果皮洗净，并保留果皮和果肉，从而为完成胚后熟提供营养，当果实与湿沙层积的后期，种子萌动露白时，其果肉已干瘪不见。现有技术中，目前对果实的处理皆是去除果皮和果肉，对种子进行消毒；发明人在经过长期的观察和总结中发现，如若保留果皮和果肉，同时结合变温催芽的方式，从而使得粉防已种子出现胚后熟过程提速，保留的果皮和果肉能够为完成胚后熟提供营养。

为进一步解释本发明，特选取若干对比组和实施例1～3进行对照参考。

首先，低温沙藏阶段设置三个对比组；

对比组1，为自然环境对照组。

对比组2，步骤（2）中采用低温水藏，将核果平铺在玻璃器皿底部，置入纯净水以浸没果实为限，温度控制在4℃左右浮动，调控水液PH值在6.0，培养25天，光照0勒克斯（LX），其余皆与实施例1相同。

对比组3，步骤（2）中采用低温干藏，将核果平铺在湿润的滤纸上，将滤纸折叠盖住覆盖果实，控制湿度在25%，调控湿润滤纸的PH值在6.0，培养25天，光照0勒克斯（LX），其余皆与实施例2相同。

其次，暖温光照阶段设置五个对比组；

对比组4，步骤（3）中沙床PH维持在6.5，高光照3500勒克斯（LX），温度25℃，其余皆与实施例3相同。

对比组5，步骤（3）中沙床PH维持在6，中光照2500勒克斯（LX），温度25℃，其余皆与实施例3相同。

对比组6，步骤（3）中沙床PH维持在7，中光照2500勒克斯（LX），温度15℃，其余皆与实施例3相同。

对比组7，步骤（3）中沙床PH维持在6，全暗0勒克斯（LX），温度20℃，其余皆与实施例3相同。

对实施例1-3，和对比组1-7分别进行测定。

a)低温处理阶段时，采用四唑(TTC)法测定种子生活力，每种处理组随机选取30粒种子剥取胚，放入培养皿中，加20ml0.5%TTC溶液，置30℃恒温箱中染色，4h后取出鉴定统计，共重复两次，具体见下表；

（注：不同处理组均系同一批次采自粉防己雌性植株的成熟核果，每次处理30粒，两次共计60粒。）

TTC法测试种子生活力实验表明，低温水藏（对比组2）和低温干藏（对比组3）两个处理组相较于自然环境对照组（对比组1）活力已大比例降低，胚基本不染色；低温沙藏处理组（实施例1-3）与自然环境对照组相比，胚的染色比例区别虽不显著，但空瘪粒少，活力高。

根据上述实验证明：对比组2低温水藏，对比组3低温干藏种子已经失去活力，不适合后续的对比和检测，故予以剔除。

b)去除果肉和种皮后，于暖温处理阶段后测量处理前后胚体积大小，观察种子结构变化，测定前后的各处理组在30天、45天、60天、120天后，分别取样测量，具体见下表；

c)利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对种子内源激素脱落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）提取分离鉴定，取分别经实施例1-3、对比组1、4-7处理的种子各0.5g(处理前已称重),加入少量PVP,加80%冷甲醇5 mL，冰上研磨，用80%冷甲醇洗净转入50mL烧杯，加内标[(浓度为10 ng/uL)加6uL，加4uL]浸泡过夜,真空抽滤两次弃残渣,收集滤液加一滴氨水转入浓缩瓶,35℃减压浓缩至水相。将水相倒入5 mL试管中，冻融3次后化冻离心,取上清液,重复两次。上清液用2mol/L的HCl调pH值至2.5～3.0，等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，冰冻除水，35℃浓缩至干，0.1mol/L醋酸液溶样品，过小柱(Part No.WAT051910)，收集所得洗脱液转入毛细管经甲酯化处理后, 用于GC/MS定性定量分析。

气相色谱条件：色谱柱DB-5-MS石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25µm)。载气为氦气,流速为0.8mL/min。GC程序升温条件,初始温度为50℃,以20℃/min的速率升至180℃后再以10℃/min升到220℃，保持15min，升至280℃进样，不分流，进样体积为1uL。

质谱(MS)条件：EI，70ev， 接口温度为250℃，离子源温度为200℃, EmissionCurrent: 150µA, Det:500v。全扫描，扫描速度0.4s/次，扫描范围为m/z29–450。

ABA、IAA的定量分析采用GC-MS-SIM完成，内源ABA的选择特征离子(m/z)为162和190，内标D3-ABA的选择特征离子(m/z)为165和193；内源IAA的选择特征离子(m/z)为202和261， 内标13C6-IAA的选择特征离子(m/z)为208和267。

结果：GC-MS测定表明，

实施例1脱落酸（ABA）含量由978.29 ng/g鲜重降为351.59 ng/g鲜重，吲哚乙酸（IAA）含量由148.71 ng/g鲜重增大为786.71 ng/g鲜重

实施例2的脱落酸（ABA）含量由978.29 ng/g鲜重降为301.56 ng/g鲜重，吲哚乙酸（IAA）含量由148.71 ng/g鲜重增大为787.45 ng/g鲜重。

实施例3的脱落酸（ABA）含量由978.29 ng/g鲜重降为278.20 ng/g鲜重，吲哚乙酸（IAA）含量由148.71 ng/g鲜重增大为873.30 ng/g鲜重。

自然环境对照组,对比组1脱落酸（ABA）含量由 978.29 ng/g鲜重降为948.38 ng/g鲜重，吲哚乙酸（IAA）含量由132.71 ng/g鲜重增大为134.25 ng/g鲜重。

对比组4脱落酸（ABA）含量由 978.29 ng/g鲜重降为351.59 ng/g鲜重，吲哚乙酸（IAA）含量由148.71 ng/g鲜重增大为756.71 ng/g鲜重。

对比组5脱落酸（ABA）含量由 978.29 ng/g鲜重降为381.69 ng/g鲜重，吲哚乙酸（IAA）含量由148.71 ng/g鲜重增大为690.31 ng/g鲜重。

对比组6脱落酸（ABA）含量由 978.29 ng/g鲜重降为410.29 ng/g鲜重，吲哚乙酸（IAA）含量由148.71 ng/g鲜重增大为631.24 ng/g鲜重。

对比组7脱落酸（ABA）含量由 978.29 ng/g鲜重降为828.29 ng/g鲜重，吲哚乙酸（IAA）含量由147.71 ng/g鲜重增大为258.71 ng/g鲜重。

上述实验表明低温沙藏组种子相比较低温水藏组、低温干藏组、自然环境对照组而言，种子由潜伏状态开始向萌动状态转变，萌动状态略显著。

经研究表明实施例3的效果最好，能够使得粉防已种子的催芽率达到最高。经多次试验认证，通过对步骤（2）步骤（3）中温度的控制、调控湿沙的PH值、控制湿沙的相对湿度、沙藏层积时间选择；特别是步骤（3）中温度的控制、光照强度的选择，能够有效使得粉防己种子的萌发率提升至65%左右。经研究发现，粉防已种子的果皮和果肉，在冷温处理阶段，处于人工控制最优的条件下：温度为4℃，相对湿度在65％，PH值为6的湿沙中，能够迅速腐烂。此时种子处于休眠期，腐烂的果皮和果肉为种子的胚后熟过程提速提供必要的物质基础。在暖温处理阶段，处于人工控制最优的条件下：温度为20℃，光照2500勒克斯（LX），调控湿沙PH值在7左右，使得粉防已种子出现胚后熟过程提速，有效缩短其萌发过程所需的时间，提高种子萌发率。

本发明通过选取粉防己雌性缠绕植株上果皮泛红的成熟核果，保证足够的成熟度，并对粉防己种子先低温无光照沙藏处理，再经暖温光照湿沙层积处理；种子选取阶段尤其需要保留果皮和果肉为种子完成胚后熟提供营养，结合低温沙藏的消毒处理，再进行光照暖温层积从而使得胚后熟过程提速。本方法处理后的种子露白后测定萌发率可达65%，其萌发率较自然环境提高7.6倍；萌发时间由120天缩短至75天，缩短1.6倍。本发明可有效解决粉防己繁育种子苗紧缺的问题，并克服了组培苗炼苗成活率低、分根繁殖而种苗紧缺的难题。

本领域技术人员应当知晓，本发明的保护方案不仅限于上述的实施例，还可以在上述实施例的基础上进行各种排列组合与变换，在不违背本发明精神的前提下，对本发明进行的各种变换均落在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种粉防己种子的催芽方法，其特征是包括如下步骤：

（1）种子选取：于当年10～11月下旬前，采集多年生草质藤本植物粉防己雌性缠绕植株上的核果，选择果皮由绿泛红时摘取，洗净果皮，保留果皮和果肉；

（2）低温沙藏：选取直径0.5～1mm的河沙，用消毒液百菌清进行消毒，以消毒湿沙为床；粉防己种子与河沙之比为1:5～1:3，种子埋藏的位置距离湿沙与空气界面的位置在5～10cm；湿沙相对湿度在60～70％，调控湿沙的PH值在5～6，温度控制在4℃左右浮动，层积25～35天，光照0勒克斯（LX）；

（3）暖温光照：将步骤（2）层积处理后的种子再进行暖温湿沙光照层积，温度控制在15～25℃，光照2000～3000勒克斯（LX），调控湿沙PH值在6～7，沙藏40～50天，层积和湿度处理方式同前。

2.根据权利要求1所述的一种粉防己种子的催芽方法，其特征是所述步骤（1）中所摘取的粉防己雌性植株上的核果，其果皮由绿泛红的果实数量占整个植株果实总量的80%以上，果皮洗净，并保留果皮和果肉。

3.根据权利要求2所述的一种粉防已种子的催芽方法，其特征是所述步骤（2）中粉防已种子与河沙之比为1:3，沙藏30天。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的一种粉防已种子的催芽方法，其特征是所述步骤（3）中光照为2500勒克斯（LX），沙藏45天。