NL9002033A - Werkwijze voor het bepalen van de hybride zuiverheid van f1 hybriden van tomaten. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bepalen van de hybride zuiverheid van F1 hybriden van tomaten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van de hybride zuiverheid van F1 hybriden van tomaten door scheiding van de allelische varianten ADH-1+ en ADH-11, gevolgd door kleuring voor alcohol dehydrogenase activiteit en visuele detectie.

De hybride zuiverheid van F1 hybriden van tomaten is een wezenlijk kenmerk van zaadpartijen, welke van bijzonder groot belang is voor het zaadbedrijf. Gedurende de laatste tien, twintig jaren heeft het gebruik van hybride zaden in het algemeen een enorme vlucht genomen. Tegenover de zaden van open bestoven rassen bieden de zaden van F1 hybride rassen bijzondere voordelen. Dit hangt samen met de manier van ontwikkeling en produktie van hybride rassen. In het eenvoudigste geval gaat men uit van twee verschillende ouderlijnen (de mannelijke ouder welke het pollen levert en de vrouwelijke lijn, welke bestoven wordt en waarvan uiteindelijk het zaad geoogst wordt), welke door recombi-natie, selectie en inteling verkregen zijn. Door het proces van inteling of zelfbevruchting zijn de ouders van hybriden homozy-goot voor de meeste eigenschappen. Doordat beide ouders die gebruikt worden voor het produceren van hybriden, door het proces van zelfbevruchting zo homogeen zijn, zal het uiteindelijk te oogsten hybride zaad ook zeer homogeen van genetische samenstelling zijn. Het uiteindelijke gewas dat uit het hybride zaad groeit is dan ook bijzonder uniform, ten aanzien van eigenschappen zoals morfologie, opbrengst, oogsttijdstip, teeltwijze, etc. Naast uniformiteit geven hybride rassen ook vaker een meeropbrengst tegenover open bestoven rassen. Deze voordelen van de hybride rassen zijn voor de koper van de hybride zaden van groot belang (bijvoorbeeld mechanische oogst is mogelijk geworden door de uniformiteit van het gewas). Daarmede is ook het belang van de hybride kwaliteit van het gewas aangetoond. Als de moederlijn van de hybride door welke oorzaak dan ook zelfbevrucht wordt, leidt dit tot moederzaad in plaats van hybride zaad. Ook zelfbevruchting van de vaderlijn kan voorkomen en door omstandigheden kan zaad van de vader geoogst worden. Zelfbevruchting van de moederlijn leidt tot inteeltzaad in het hybride zaad. Dit is slechts in zeer geringe mate aanvaardbaar voor de koper van het hybride zaad. Daarom wordt de hybride kwaliteit van zaad in de praktijk vastgesteld door een steekproef te nemen. Die bestaat hieruit, dat men een bepaald aantal zaden uitzaait, de planten onder de juiste omstandigheden laat groeien tot volwassen vruchtdragend stadium, en vervolgens een gedetailleerde analyse van alle eigenschappen van de hybride planten uitvoert. Omdat de hybride een "som" is van beide ouders, en de ouders in de meeste gevallen verschillen in eigenschappen zal een dergelijke analyse een betrouwbaar resultaat opleveren. Maar deze methode is langdurig en kostbaar. Doordat het verkrijgen van de gegevens aangaande de hybride kwaliteit van het zaad lang (enige maanden) op zich kan doen wachten, kan het zaad niet direct na de oogst verkocht worden. Dat betekent dat het zaad in veel gevallen heel lang, wel langer dan een jaar, opgeslagen moet worden, met alle kosten van dien. Dat veroorzaakt niet alleen meerkosten door opslag op zich, maar ook door kwaliteitsverlies, het missen van verkoopmogelijkheden, en een moeilijker planning van volgende produkteies.

Een in de aanhef beschreven werkwijze is bekend uit Hort. Science 16(2) blz. 179-181, 1981 (Application of Alcohol Dehydrogenase Allozymes in Testing the Genetic Purity of FI Hybrids of Tomato). Bij deze bekende werkwijze wordt de scheiding van de allelische varianten ADH-1+ en ADH-11 tot stand gebracht met behulp van zetmeelgelelektroforese. Bovendien wordt daarbij het extract van het geïmbibeerde tomatenzaad op een strook fil-terpapier gebracht, dat als drager voor het extract dient. Daarna wordt het filterpapier in een gleuf van de gel geplaatst, waarbij het filterpapier ongeveer loodrecht op de gel staat. Deze procedure is uiterst tijdrovend en derhalve in economisch opzicht ongunstig.

Een ander nadeel van zetmeelgelelektroforesetechniek is de omslachtige bereidingswijze van de zetmeelgel, terwijl bovendien de reproduceerbaarheid van de zetmeelgel te wensen over laat, omdat de kwaliteit van het uitgangszetmeel niet constant is.

Voorts neemt tengevolge van de naar verhouding grote dikte van de zetmeelgellaag van ca. 0,5 mm het aantonen van de alcohol dehydrogenase een tamelijk lange tijd in beslag.

De uitvinding beoogt thans een werkwijze te verschaffen, waarbij de bovengenoemde nadelen zijn opgeheven.

Hiertoe verschaft de uitvinding een werkwijze voor het bepalen van de hybride zuiverheid van F1 hybriden van tomaten door scheiding van de allelische varianten ADH-1+ en ADH-11, gevolgd door kleuring voor alcohol dehydrogenase activiteit en visuele detectie, met het kenmerk, dat de scheiding van ADH-1+ en ADH-11 wordt uitgevoerd door isoelektrische focussering.

Experimenteel is vastgesteld, dat ADH-1+ en ADH-11 een isoelektrisch punt hebben van respectievelijk 5,5 en 5,7.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt het zaadex-tract met behulp van een pipet rechtstreeks op de gel aangebracht zonder gebruikmaking van filterpapier. Het een en ander wordt gerealiseerd door gebruik te maken van een flexibele aanbreng-strip van bij voorkeur silicone rubber, die is voorzien van op regelmatige afstand van elkaar aangebrachte openingen. Deze strip wordt dan nabij de positieve elektrode op de gellaag gelegd, waarna het zaadextract in de afzonderlijke openingen wordt gepi-petteerd en wel zodanig, dat in elke opening het extract van een ander zaad terechtkomt.

Gunstig is bij de onderhavige werkwijze, dat de daarbij toegepaste gellaag slechts een geringe dikte heeft van ca. 0,1 mm, waardoor het aantonen van de alcohol dehydrogenasebanden binnen 1 a 2 minuten mogelijk is.

Een ander voordeel is, dat bij de isoelektrische focussering gebruik wordt gemaakt van een gel, die op eenvoudige wijze wordt bereid uit polyacrylamide. Een dergelijke gel is goed reproduceerbaar en kan bovendien in een koelkast gedurende lange tijd worden bewaard in tegenstelling tot de zetmeelgelen.

Tenslotte is op verrassende wijze gebleken, dat volgens de onderhavige werkwijze een persoon per dag de hybride zuiverheid van meer dan 1000 zaden kan bepalen, terwijl bij de bekende methode men slechts 500 zaden kan onderzoeken. Het spreekt derhalve vanzelf, dat de uitvinding een snel en economisch instrument verschaft voor het bepalen van de hybride zuiverheid van F1 hybriden van tomaten.

Opgemerkt wordt, dat de techniek van isoelektrische focussering voor het bepalen van de hybride zuiverheid van zaden, waarbij men van zaadeiwitten uitgaat, bekend is uit het artikel van R.J. Cooke en S.R. Draper uit J. natn.Inst.agric.Bot. (1983), 16, 173-181. In dit artikel wordt een methode beschreven voor de toepassing van ultradunne-laag isoelektrische focussering voor het karakteriseren van zaden, waartoe de afzonderlijke zaden worden fijngemaakt, waarna het fijngemaakte zaad of gedeelten daarvan worden geëxtraheerd in een gering volume (100-250 μΐ) 1,0 M ureum met of zonder 2 volumeprocent 2.mercaptoethanol (afhankelijk van de soorten) in een polypropyleen centrifugebuis.

Na eventueel ontvetten wordt de ureumoplossing behandeld met Amberlite MB-1, waarna de uiteindelijk verkregen heldere supernatant werd gebruikt voor de focussering.

Naast zaden, zoals van tarwe, haver, luzerne en raapzaad kan men ook de zaadeiwitten van erwten en bonen bepalen.

Een gebruikelijke techniek is hierbij het gebruik maken van amfolyten voor het creëren van de pH-gradient in de gel, waardoor de resolutie van de eiwitten wordt bevorderd.

Volgens dit artikel heeft de bekende werkwijze het voordeel, dat er een uitstekende resolutie van de zaadproteinen wordt verkregen op een veel snellere wijze dan in het geval van de conventionele gelelektroforesetechnieken.

Van de toepassing van een dergelijke isoelektrische focusseringsmethode voor het bepalen van de hybride zuiverheid van tomatenzaden is in dit artikel met geen woord gerept.

In het algemeen omvat de procedure van de onderhavige werkwijze het overbrengen van tomatenzaden in microtiterplaten en wel telkens één zaad in een holte. Dan worden de holtes met water gevuld. Na incubatie gedurende de nacht (16-20 uur) teneinde de novo synthese van ADH-1 onder anaerobe omstandigheden te induceren, werd het water verwijderd, waarna in elk van de holtes 80 μΐ vers water werd overgebracht. Dan werden de zaden gehomogeniseerd met behulp van een in huis vervaardigde inrichting, die aan een boormachine was bevestigd. Van het aldus verkregen homo-genaat werd een hoeveelheid van 7 μΐ met behulp van een pipet op het geloppervlak overgebracht onder gebruikmaking van een mon-steropbrengstrook. Deze strook is voorzien van een aantal openin-gen en bevindt zich op ca. 5 mm afstand van de anode, waarna de isoelektrische focussering als volgt werd uitgevoerd.

Er werd gebruik gemaakt van een Desaga elektroforese inrichting (DESAPHOR HE 200), die was voorzien van een gekoelde plaat van 200 x 265 x 1 mm en die was aangesloten op een Pharmacia constante stroomtoevoer ECPS 3000/150 en een Lauda RC3 koel-apparaat (bij een temperatuur van 10eC). De gelen werden op de koelplaat gelegd met een paar druppels kerosine om een goed contact te waarborgen. De elektrodestroken werden geweekt in 0,5 M aspartinezuur en 0,5 M glutaminezuur (anodestroken) en kathode-vloeistof 10 (kathodestroken) . De elektroden werden op de stroken geplaatst en daarna bedekt met een glasplaat als gewicht om een goed elektrisch contact te waarborgen. Er werden drie elektroden op de gel geplaatst in het geval dat de gel werd ingedeeld in twee delen voor de analyse van 2 x 96 zaden. Vooraf focussering werd uitgevoerd bij een opstelling van 10 W, 1500 V en 17 mA. De vooraf focussering begon bij ca. 280 V, totdat de spanning ca. 720 V (150 Vh) bereikte. Na het aanbrengen van de monsters werd de focussering voortgezet bij dezelfde opstellingen voor 2000 Vh (50-60 min.). In het geval dat de gel werd verdeeld in drie delen voor de analyse van 3 x 96 zaden werden op de gel vier elektroden geplaatst. Dan werd de vóórfocussering uitgevoerd bij een opstelling van 7 W, 1250 V en 30 mA. De vóórfocussering startte bij ca. 180 V totdat de spanning opliep tot ca. 400 V (15) Vh). Na het opbrengen van het monster werd de focussering voortgezet bij 5 Vh bij 50 V, 7 W, 1250 V, dan bij vooraf focussering gedurende 1 uur en 15 min (1500 Vh).

Na de focussering werden de gelen geïncubeerd in 20% TCA gedurende 5 min.; vervolgens werden de gelen gedurende 10 min. geïncubeerd in een kleuringsoplossing (0,05% Serva Blue R in ontkleuringsoplossing; Serva Blue R werd eerst opgelost in 10 mL methanol). De gelen werden ontkleurd in drie wassingen gedurende 5 min. met een ontkleuringsoplossing (10% azijnzuur; 40% methanol; 50% water; v/v/v), totdat de achtergrondkleuring volledig was verwijdered. Na spoelen met water werden de gelen aan de lucht gedroogd en bewaard.

Dan werd het kleuren voor ADH-activiteit onmiddellijk na isoelektrische focussering als volgt gerealiseerd.

De gel werd geïncubeerd in een oplossing van 0,1 M Tris-HC1 pH 7,5 met daarin 4% alcohol. Na 5 min., wanneer de gekleurde banden zichtbaar waren, werd de gel gedurende 1 min. gewassen met een oplossing van ethanol (40%), water (50%) en azijnzuur (10%) ter voorkoming van achtergrondkleuring. Na spoelen met water werden de gelen aan de lucht gedroogd en bewaard.

Bij de isoelektrische focussering ontstaan er in een gel elektroforesepatronen, die als volgt worden geïnterpreteerd. Men gaat aan de hand van het patroon onderzoeken welke zaden F1 hybride zuiver zijn en welke niet. Bij de F1 hybride zijn de karakteristieke banden van zowel moeder als vader terug te vinden. Ontbreekt er in het referentiepatroon de vaderspecifieke band dan is het zaad genetisch niet zuiver. Wanneer we er van uitgaan dat er honderd zaden worden onderzocht, die dan ook op het isoelektrische focusseringspatroon worden meegenomen, dan is het zo, dat bij tomaten alle honderd zuiver moeten zijn wil men spreken van een goede zaadkwaliteit voor een bepaalde partij. Mocht er zelfs één niet zuiver zijn, dan is een dergelijke partij minder gewenst. In het algemeen wordt de prijs van een zaad primair bepaald door de mate van de hybride zuiverheid. De gewenste mate van hybride zuiverheid en de relatie tussen prijs is van gewas tot gewas verschillend. Bij tomaten bijvoorbeeld stelt men zeer hoge eisen aan de hybride zuiverheid.

De uitvinding wordt thans toegelicht aan de hand van de volgende figuren, waarbij

Fig. 1 een isoelektrisch focusseringspatroon voor tomaat F1 hybride Arietta aangeeft, en

Fig. 2 een schematische weergave van de hybride kwali-teitsbepaling ofwel de inteeltbepaling van zaden via isoelektrische focussering voorstelt.

In fig. 1 is het volgens isoelektrische focussering verkregen F1 hybride patroon voor de tomaat Arietta weergegeven, waarin zowel de band voor het vaderspecifieke enzym 4 als de band voor het moederspecifieke enzym 2 zijn weergegeven.

In fig. 2 wordt de bepaling van de hybride zuiverheid, ook wel de inteeltbepaling genoemd, van een partij tomatenzaden via de isoelektrische focussering schematisch weergegeven. Er wordt gebruik gemaakt van een gelplaat 5, die is voorzien van een positieve elektrode 6 en een negatieve elektrode 7. Vlak boven de positieve elektrode op ca. 5 mm bevindt zich een van openingen 11 voorziene rubber monsteropbrengstrook 8. Voorts zijn moederspecifieke, respectievelijk vaderspecifieke enzymbanden 10 en 12 afgebeeld, alsmede een F1 hybride patroon 11, waarin zowel de moeder- als vaderspecifieke enzymbanden voorkomen.

Bij de inteeltbepaling van een partij tomatenzaden wordt een waterig extract van telkens één zaad uit de partij zaden overgebracht in één opening 9 van de monsteropbrengstrook 8.

Dan neemt men een extract van een zaad, waarin slechts moederspecifieke enzymen aanwezig zijn en van een zaad waarin slechts vaderspecifieke enzymen voorkomen en tenslotte een van een F1 hybride, waarin beide enzymsoorten aanwezig zijn. Bij het aanleggen van het gewenste spanningsverschil tussen de positieve en negatieve elektrodes 6 en 7 verkrijgt men bij een bepaalde pH-gradient en na kleuring met een geëigende kleurstof het in fig. 2 weergegeven enzympatroon. In de eerste drie openingen van links naar rechts zijn respectievelijk de moederspecifieke, F1 hybride en vaderspecifieke enzymoplossingen ondergebracht en in de overige holtes de enzymoplossingen van de zaden waarvan men de hybride zuiverheid, d.w.z. de inteelt, wil bepalen. De moederen vaderspecifieke enzymen worden ook wel markerenzymen genoemd. Mocht er een van de markerenzymen ontbreken, zoals bijvoorbeeld bij 14 (bij 14 ontbreekt het vaderspecifieke enzym) dan is er sprake van inteelt.

Op die manier kan men de hybride zuiverheid van F1 hybride tomatenzaden bepalen.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikt men gewoonlijk water, dat was gezuiverd door het Milli-Q systeem (Millipore, Bedford, Ver.Staten van Amerika).

Bovendien gebruikt men: Acrylamide, ammoniumpersulfaat, amfolyten (servalyt pH 3-10), aspartinezuur, bis, kathodevloei-stof 10 (op basis van arginine, lysine en ethyleendiamine), Coomassie Brilliant Blue R-250 (Serva Blue R), glutaminezuur, kerosine van Serva (Heidelberg, Bondsrepubliek Duitsland); Glycine, TCA, pi eiwit kit (gebied 4,75 - 10,4) van BDH (Poole, Verenigd Koninkrijk) . Azijnzuur, NADP, NBT, PMS en overige hier niet genoemde chemicaliën waren van Sigma Chem.Co. (St. Louis, USA).

De volgens de uitvinding toegepaste gelfixatie voor bekledingen en gelfixatie voor PAGE (265 x 193 mm) en elektrode-stroken (300 x 6 x 1 mm) zijn afkomstig van Serva (Heidelberg, Bondsrepubliek Duitsland),. Vlakke bodem microtiterplaten met 96 holtes zijn afkomstig van Costar (Cambridge, Ver. Staten van Amerika) . Plakband (tesa, 100 μια) was van Beun de Ronde (Abcoude, NL). Siliconen rubber opbrengstroken werden vervaardigd uit 1 mm dikke siliconen rubber vellen (Eriks, Alkmaar, NL).

De volgens de uitvinding toegepaste ultradunne laag isoelektrische focussering, afgekort UTLIEF, is een bekende methode, waarbij men aldus te werk gaat. Eerst bereidt men gelen.

UTLIEF gelen werden bereid volgens de "flap" techniek, zoals beschreven door Radola. Plakband werd gebruikt als af-standsstrook langs elke kant van de gelfixatiefilm (265 mm x 193 mm). Onder gebruikmaking van drie elektroden konden twee gelen van de afmeting 250 x 90 mm tegelijkertijd in bedrijf zijn. De gelfixatie en bekledingsfilms werden op glasplaten uitgerold met een paar druppels water tussen de glasplaat en de film. Het polymerisatiemengsel bevatte 1,68 ml acrylamide (40% T + 5% C), 0,6 ml servalyt pH 3-10, 5,72 ml 16% glycerol en 0,4 ml 1,5% ammoniumpersulfaat. De uiteindelijke acrylamideconcentratie was 8%. Dit mengsel werd grondig ontgast op een vacuumleiding gedurende 1-2 min. Na "flapping" en polymerisatie werden de gelen direct gebruikt (na tenminste 1 uur) of opgeslagen bij 4°C gedurende maximaal een week.

Claims (1)

1. Werkwijze voor het bepalen van de hybride zuiverheid van F1 hybriden van tomaten, door scheiding van de allelische varianten ADH-1+ en ADH-11, gevolgd door kleuring voor alcohol dehydrogenase activiteit en visuele detectie, met het kenmerk, dat de scheiding van ADH-1+ en ADH-11 wordt uitgevoerd door isoe-lektrische focussering.