CN105349676A - 一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的ssr分子标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，其方法步骤为：A、利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种和高感黑斑病梨品种的叶片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照，提取RNA；B、上机测序混合RNA样品制备；C、测序序列组装及差异表达基因分析；D、抗黑斑病紧密相关基因的筛选；E、抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选；F、砂梨抗黑斑病紧密相关的SSR分子标记筛选。使用本方法筛选的鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记可以为砂梨抗黑斑病分子育种和抗黑斑病机理的研究奠定理论基础。

Description

一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法
技术领域
本发明属于果树分子遗传育种技术领域，提供了一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，可用于砂梨品种抗黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病育种，以提高砂梨抗病育种效率，适用于从事梨科研、育种及生产的科研单位和公司。
背景技术
梨是世界上重要的水果之一，它已经在世界范围内50个国家进行很长时间的商业化栽培。但梨树病害是制约梨产业发展的一个重要因素。由互隔交链孢菌（Alternairiaalternata）引起的梨黑斑病是砂梨重要的病害之一。梨黑斑病主要危害梨树叶片、果实和新梢。叶部受害，幼叶先发病、褐色或黑褐色圆形斑点，后逐渐扩大，形成近圆形或不规则形病斑，病叶即焦枯、畸形，引起早期脱落。果实受害，果面出现一个至数个黑色斑点，逐渐扩大，颜色变浅，形成浅褐至灰褐色圆形病斑，略凹陷。发病后期病果畸形、龟裂，裂缝可深达果心，果面和裂缝内产生黑霉，并常常引起落果。果实近成熟期染病，前期表现与幼果相似，但病斑较大，黑褐色，后期果肉软腐而脱落。梨黑斑病的潜伏侵染能够引起梨果在贮藏期的腐烂，因此在梨的进出口贸易中受到进口国的严密关注。
梨黑斑病防治不当造成梨树叶片提前脱落，容易使梨树形成二次花，严重影响次年梨果产量，给梨农造成严重的经济损失。目前防治梨黑斑病的方法是使用甲基托布津、代森锰锌和苯醚甲环唑等化学药剂，长期使用这些化学药剂，必然会引起病原菌对化学药剂产生抗药性、污染环境和对人体健康产生危害等问题。
植物抗病育种是一种有效经济的防治病害的手段，由于梨树的童期长，遗传背景复杂等造成传统的抗病育种效率较低，而采用分子育种则可以避开童期的干扰，向现有栽培品种引入抗病基因（R-gene）的同时，不会形成基因的大规模重组。抗病基因在分析植物抗病机理中具有重要作用，一大批的抗病基因在水稻、小麦、大豆、苹果和葡萄等植物中被分离出来。近年来梨科研工作者已经从梨中分离出梨火疫病、疮痂病等抗病相关的抗病基因，但目前还没有梨黑斑病相关的抗病基因被分离克隆出来。转录组测序分析能够在基因表达水平反映植物在生长发育或由外界环境诱导所产生的变化，最新的双末端测序技术能够提高DNA的测序效率和提高测序片段的长度，提供更好的转录组分析。基因水平的表达、基因表达的功能注释、新基因的挖掘、SSR筛选和SNP的发现等转录组信息利用生物信息学手段进行研究，以便更好深入了解生物进程。这些信息有助于预测单个基因的作用，也能阐述更为复杂的信号途径和揭示潜在的网络关系。
多年来，我们一直围绕确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记的分离工作进行研究，利用转录组测序技术，通过对抗梨黑斑病种质和感梨黑斑病的种质的接种后的差异表达基因的分析，筛选鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的SSR分子标记。本研究为砂梨品种抗黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病分子育种奠定理论基础。
发明内容
本发明的目的是针对梨树的童期长，遗传背景复杂等造成传统的抗病育种效率较低的问题，提供鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的SSR分子标记分子标记，以提高砂梨品种抗黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病育种的效率。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
本发明是通过对高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”离体叶片接种病原和无菌水后进行转录组测序分析，获取响应病菌诱导和品种之间的差异表达基因，再通过差异基因的基因序列，筛选SSR位点，并根据SSR位点序列设计SSR引物，通过对抗病梨品种“金晶梨”和感病品种“红粉梨”的PCR扩增来确定鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的SSR分子标记。
1.一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，其特征在于，包括如下步骤：
A、梨黑斑病接种
利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”的叶片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照；接种后分别在0天，1天，2天，3天和4天进行取样，提取RNA；
B、上机测序RNA样品制备
每个处理样品的RNA使用TRIzol方法进行提取，RNA的纯度检测使用Nanodrop分光光度计进行检测；先将每个处理样品的RNA浓度都稀释到750ng/μl，然后将0天，1天，2天，3天和4天的RNA分别取40μl混合成200μlRNA混合液，得到四个处理的RNA样品；用带有Oligo的磁珠富集真核生物的mRNA；
加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模版，用randomhexamers合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、3’加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的文库用IlluminaHiSeqTM2000进行测序；
C、测序序列组装及差异表达基因分析
利用已发表梨基因组作为参照基因组，使用快速拼接程序Bowtie对测序片段进行组装，原始的基因表达数据使用RPKM进行标准化计算；
为了比较处理与对照样品的差异基因，筛选差异显著性P-value<0.005、错误率FDR≤0.01且倍数差异在2倍以上的做为差异表达基因（DEGs）；
D、抗黑斑病紧密相关基因的筛选
使用EBSeq软件检测4个样品中的差异表达基因（DEGs）；
“红粉梨”接种菌株与“红粉梨”接种清水样品比较获得差异表达基因，“金晶梨”接种
菌株与“金晶梨”接种清水样品比较获得差异表达基因；比较来自“红粉梨”与来自“金晶梨”之间的差异表达基因，获得了抗黑斑病紧密相关基因DEGs；
E、抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选
基于上述筛选的抗黑斑病紧密相关基因DEGs，利用MIcroSAtellite(MISA)软件筛选出SSR位点；
F、砂梨抗黑斑病紧密相关的SSR分子标记筛选
基于上述SSR位点，利用引物设计软件Primer3进行引物设计，每个SSR位点设计2对引物；然后利用设计的SSR引物对“红粉梨”和“金晶梨”的DNA进行扩增，筛选出引物能够区分高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”（如表1）。
上述的砂梨抗黑斑病的SSR分子标记在梨树育种上的应用。
使用上述方法可以确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，以提高砂梨抗黑斑病育种的效率，为砂梨抗黑斑病分子育种和抗黑斑病机理的研究奠定理论基础。
附图说明
图1“红粉梨”与“金晶梨”接种梨黑斑病的发病症状；
图2“红粉梨”与“金晶梨”样品间比较获得差异表达基因分析的韦恩氏图；
图3“红粉梨”与“金晶梨”基于11对SSR引物扩增的电泳图。
具体实施方式
一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，是通过下列步骤获得：
1、梨黑斑病接种
利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”的叶片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照。接种后分别在0天，1天，2天，3天和4天进行取样，提取RNA。
2、上机测序RNA样品制备
每个处理样品的RNA使用TRIzol方法进行提取，RNA的纯度检测使用Nanodrop分光光度计进行检测。先将每个处理样品的RNA浓度都稀释到750ng/μl，然后将0天，1天，2天，3天和4天的RNA分别取40μl混合成200μlRNA混合液，得到四个处理的RNA样品。用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模版，用randomhexamers（六碱基随机引物）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、3’加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的文库用IlluminaHiSeqTM2000进行测序。
3、测序序列组装及差异表达基因分析
利用已发表梨基因组作为参照基因组，使用快速拼接程序Bowtie对测序片段进行组装，原始的基因表达数据使用RPKM进行标准化计算。为了比较处理与对照样品的差异基因，筛选差异显著性P-value<0.005、错误率FDR≤0.01且倍数差异在2倍以上的做为差异表达基因（DEGs）。
4、抗黑斑病紧密相关基因的筛选
使用EBSeq软件(版本1.1.3)检测4个样品中的差异表达基因（DEGs）。“红粉梨”接种菌株与“红粉梨”接种清水样品比较获得909个DEGs，“金晶梨”接种菌株与“金晶梨”接种清水样品比较获得501个DEGs；比较来自“红粉梨”与来自“金晶梨”之间的差异表达基因，获得了152个抗黑斑病紧密相关基因DEGs。
5、抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选
基于上述筛选的152个抗黑斑病紧密相关基因DEGs，利用MIcroSAtellite(MISA)软件筛选出34个SSR位点。
6、确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记
基于34个SSR位点，利用引物设计软件Primer3进行引物设计，每个SSR位点设计2对引物；然后利用设计的68对SSR引物对“红粉梨”和“金晶梨”的DNA在3%浓度的琼脂糖胶进行扩增，筛选出5对引物能够区分高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”（见表1；图3）。引物3436a在240片段和420片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在240片段位置出现条带但在420位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种；引物6484a在280片段和350片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在280片段位置没有出现条带但在350位置有条带表明被检测品种为感黑斑病品种；引物12717a在300片段位置出现条带但在450位置没有出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在300片段和450片段位置同时出现条带表明被检测品种为感黑斑病品种；引物15001b在300片段和400片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在300片段位置出现条带但在400位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种；引物15305a在320片段没有条带但在380片段位置出现条带，表明被检测品种为抗黑斑病品种；在320片段位置出现条带但在380位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种。
因此鉴定砂梨品种同时满足引物3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等5个SSR分子标记中抗黑斑病标记的条带位置，但又不出现感黑斑病条带的位置，即可判断该品种为抗黑斑病品种；同理鉴定砂梨品种同时满足引物3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等5个SSR分子标记中感黑斑病标记的条带位置，但又不出现抗黑斑病条带的位置，则判断该品种为感病品种。
使用上述方法可以确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，以提高砂梨抗黑斑病育种的效率，为砂梨抗黑斑病分子育种和抗黑斑病机理的研究奠定理论基础。
实验例证1：采用本方法筛选5对鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，5对引物见表1：
表111对SSR分子标记引物序列
。
3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等5对引物在3%浓度的琼脂糖胶上对“红粉梨”和“金晶梨”的DNA进行扩增，可以扩增出条带，并且通过条带的片段大小，可以将高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”进行区分。表1中“+”表示在对应扩增出的片段位置有条带，“-”表示在对应扩增出的片段位置无条带，条带有无情况见图3。
引物3436a对“金晶梨”扩增在240片段和420片段位置同时出现条带表明该品种为抗黑斑病品种；对“红粉梨”扩增在240片段位置出现条带但在420位置没有条带表明该为感黑斑病品种；引物6484a对“金晶梨”扩增在280片段和350片段位置同时出现条带表明该品种为抗黑斑病品种；对“红粉梨”扩增在280片段位置没有出现条带但在350位置有条带表明该品种为感黑斑病品种；引物12717a对“金晶梨”扩增在300片段位置出现条带但在450位置没有出现条带表明该品种为抗黑斑病品种；对“红粉梨”扩增在300片段和450片段位置同时出现条带表明该品种为感黑斑病品种；引物15001b“金晶梨”扩增在300片段和400片段位置同时出现条带表明该品种为抗黑斑病品种；对“红粉梨”扩增在300片段位置出现条带但在400位置没有条带表明该品种为感黑斑病品种；引物15305a“金晶梨”扩增在320片段没有条带但在380片段位置出现条带，表明该品种为抗黑斑病品种；对“红粉梨”扩增在320片段位置出现条带但在380位置没有条带表明该品种为感黑斑病品种。

Claims (3)

1.一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、梨黑斑病接种
利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”的叶片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照；接种后分别在0天，1天，2天，3天和4天进行取样，提取RNA；
B、上机测序RNA样品制备
每个处理样品的RNA使用TRIzol方法进行提取，RNA的纯度检测使用Nanodrop分光光度计进行检测；先将每个处理样品的RNA浓度都稀释到750ng/μl，然后将0天，1天，2天，3天和4天的RNA分别取40μl混合成200μlRNA混合液，得到四个处理的RNA样品；用带有Oligo的磁珠富集真核生物的mRNA；
加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模版，用randomhexamers合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、3’加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的文库用IlluminaHiSeqTM2000进行测序；
C、测序序列组装及差异表达基因分析
利用已发表梨基因组作为参照基因组，使用快速拼接程序Bowtie对测序片段进行组装，原始的基因表达数据使用RPKM进行标准化计算；
为了比较处理与对照样品的差异基因，筛选差异显著性P-value<0.005、错误率FDR≤0.01且倍数差异在2倍以上的做为差异表达基因（DEGs）；
D、抗黑斑病紧密相关基因的筛选
使用EBSeq软件检测4个样品中的差异表达基因（DEGs）；
“红粉梨”接种菌株与“红粉梨”接种清水样品比较获得差异表达基因，“金晶梨”接种
菌株与“金晶梨”接种清水样品比较获得差异表达基因；比较来自“红粉梨”与来自“金晶梨”之间的差异表达基因，获得了抗黑斑病紧密相关基因DEGs；
E、抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选
基于上述筛选的抗黑斑病紧密相关基因DEGs，利用MIcroSAtellite(MISA)软件筛选出SSR位点；
F、砂梨抗黑斑病紧密相关的SSR分子标记筛选
基于上述SSR位点，利用引物设计软件Primer3进行引物设计，每个SSR位点设计2对引物；然后利用设计的SSR引物对“红粉梨”和“金晶梨”的DNA进行扩增，筛选出引物能够区分高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”。
2.如权利要求1所述的砂梨抗黑斑病的SSR分子标记方法，其特征在于：步骤F中：
设计引物3436a，F：GTGGTCTTGAGGGCGTTTA；R：CGTCAGCCGGTGATACTT，在240片段和420片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在240片段位置出现条带但在420位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种；
设计引物6484a，F：ATAAGTTGCGGCACTCTG；R：CGTACCAAAAGCTAAAAT，引物6484a在280片段和350片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在280片段位置没有出现条带但在350位置有条带表明被检测品种为感黑斑病品种；
设计引物12717a，F：TTTGTGATGCCTCGATAT；R：ACCGTGATTCAATAGTTC，引物12717a在300片段位置出现条带但在450位置没有出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在300片段和450片段位置同时出现条带表明被检测品种为感黑斑病品种；
设计引物15001b，F：AGGAGGAATGAGACAATAGA；R：CATCACCGTGTACCACA，引物15001b在300片段和400片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在300片段位置出现条带但在400位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种；
设计引物15305a，F：AGCCCGTTAGAATGAGAT；R：AGCAGTATAGGCAGGGA，在320片段没有条带但在380片段位置出现条带，表明被检测品种为抗黑斑病品种；在320片段位置出现条带但在380位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种；
鉴定砂梨品种同时满足引物3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等5个SSR分子标记中抗黑斑病标记的条带位置，但又不出现感黑斑病条带的位置，即可判断该品种为抗黑斑病品种；同理鉴定砂梨品种同时满足引物3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等5个SSR分子标记中感黑斑病标记的条带位置，但又不出现抗黑斑病条带的位置，则判断该品种为感病品种。
3.如权利要求1或2所述的砂梨抗黑斑病的SSR分子标记方法在梨树育种上的应用。
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