CN110438254B - 鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料a06和c07染色体分离情况的分子标记和方法 - Google Patents

鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料a06和c07染色体分离情况的分子标记和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情况的SSR分子标记和方法，属于植物遗传育种领域。该分子标记能快速、准确的鉴定出芸薹属A基因组(如白菜、红菜苔等)与C基因组(如芥蓝、埃塞俄比亚芥(含C基因组的))植物的种间杂种及其后代材料。该方法能鉴定芸薹属A基因组与C基因组植物远缘杂交及其回交后代，可以拓展芸薹属蔬菜的遗传资源，转育新性状，丰富蔬菜类型，丰富人民的日常膳食营养。

Description

鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情 况的分子标记和方法
技术领域
本发明涉及遗传育种领域，具体而言，涉及远缘杂种植物鉴定和选育方法。
背景技术
远缘杂交是创制植物新种质、拓展育种资源的重要手段。由于物种生殖隔离，远缘杂交往往需要人工授粉和胚拯救等技术，耗时费力，且需要一定科学训练。在远缘杂交过程中，由于去雄不彻底、雌配子发育成植株，以及其他原因可能造成假杂种植株的产生。因而，远缘杂交获得的植株需要通过分子、细胞学等方法检测是否为真杂种。远缘杂种的自交、回交后代需要通过分子或细胞学方法追踪染色体或染色体片段，用以创制异源多倍体、染色体附加系、导入系等遗传材料。与细胞学方法相比，分子标记具有快速、操作简单、对实验操作者技术要求低、不需要昂贵仪器、可用于大群体筛查等优点。随着测序技术的发展，高通量测序和生物芯片也可以用于远缘杂种的分子检测。但是，由于简单快速和成本低廉等原因，分子标记仍然在远缘杂种快速筛选和大规模群体初筛上具有使用价值。
芸薹属蔬菜包含A、B、C三个基因组，其中A基因组蔬菜有白菜、红菜苔等，C基因组蔬菜有芥蓝、甘蓝等，AB基因组蔬菜有芥菜，BC基因组作物有埃塞俄比亚芥，AC基因组作物有油菜。这些蔬菜和油料作物在我国广泛栽培。通过A和C基因组间远缘杂交及回交转育可以拓展蔬菜遗传瓶颈，创制优良蔬菜遗传资源，转育稀缺的抗性基因，改良蔬菜营养品质。红菜苔属于白菜的一个变种(A基因组)，以湖北省武汉市洪山区出产的品质最优。是长江流域的一种特色薹用蔬菜。芥蓝属于起源于我国的甘蓝类蔬菜(C基因组)，具有抗性好、品质优、采收快的优点。是我国南方地区的重要薹用蔬菜。通过芥蓝和红菜苔远缘杂交，可以拓展芥蓝和红菜苔的遗传资源，转育新性状，丰富蔬菜类型，丰富人民日常膳食营养。
白菜属于起源于我国的十字花科蔬菜，具有种类多、品质优、产销广的优点。埃塞俄比亚芥是起源于非洲油料作物，具有优良的抗病、抗逆特性。白菜属于A基因组，埃塞俄比亚芥属于BC基因组；通过远缘杂交合成ABC基因组植物具有重要的农业应用前景。通过杂交后回交转育，将A、B、C基因组间染色体重组，将提高白菜和油菜的遗传多样性和抗病、抗逆潜力。
芸薹属A06和C07染色体是部分同源(homeologous)染色体。二者之间既含有部分同源区段，也含有大量物种分化后产生的特异基因。利用A06和C07染色体在杂交后代中的重组可以获得新的农艺性状，提高蔬菜和油料作物的抗病、抗逆、及营养品质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06 和C07染色体分离情况的分子标记和方法。
本发明的技术方案为：
鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情况的SSR分子标记，该 SSR分子标记由引物C07D扩增得到，引物C07D的前向引物序列为C07D-F:5’-GGAGAAGAAAACAGCGATGC-3’(SEQ ID No.1)，引物C07D的后向引物序列为C07D- R:5’-GGAATAGCTCTTGACGCTCG-3’(SEQ ID No.2)。
该分子标记PCR片段预期长度：190-210bp。真实的，芸薹属蔬菜A基因组中扩增片段的预期长度为205bp，C基因组中的扩增片段预期长度为193bp。应当知道，不同品种间SSR重复数可能不同，扩增片段长度在不同品种间可以有差异。
该分子标记在蔬菜A基因组中位于A06染色体24.99Mb处(根据Chiifu白菜V1.0基因组；下载地址： http://brassicadb.org/brad/datasets/pub/BrassicaceaeGenome/Brassica_rapa/V1.0/)，在C基因组中位于C07染色体48.19Mb处(根据甘蓝Bol_Chromosome_V1.1基因组；下载地址： http://brassicadb.org/brad/datasets/pub/BrassicaceaeGenome/Brassica_oleracea/Bol_Chromosome_ V1.1/)。应当知道，由于不同研究者对染色体的编号可能不同，不同基因组组装版本中该标记位置也可能不同，本专利应当包括检测编号不同但实质等同的染色体及位置。
鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情况的SSR分子标记的引物C07D，引物C07D的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，引物C07D的后向引物序列如 SEQID No.2所示。
本发明的SSR分子标记或引物C07D在鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情况上的应用。
具体地，用引物C07D作为PCR扩增的引物，以待鉴定的植株及亲本DNA为模板进行PCR扩增，检测PCR扩增产物进行条带统计和基因型分析，所述亲本为含有A基因组的芸薹属蔬菜与含有C基因组的芸薹属植物。
条带统计和基因型分析的方法为：
待鉴定的植株为A基因组与C基因组或BC基因组的F1植株时，若F1植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株为真杂种；若检测的F1植株只显示A基因组带型或只显示C基因组带型，则该植株为假杂种。
待鉴定的植株为A基因组蔬菜与C基因组或BC基因组植物远缘杂种自交后代植株时，若检测的远缘杂种自交后代植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株为A基因组蔬菜A06染色体和C基因组植物C07染色体整条或部分杂合；若检测的远缘杂种自交后代植株只显A基因组带型，则该植株不含C基因组植物C07染色体整条或部分；若检测的远缘杂种自交后代植株只显C基因组带型，则该植株不含A基因组蔬菜A06染色体整条或部分。
待鉴定的植株为以A基因组蔬菜为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株含有C基因组植物C07染色体整条或部分；若只显示A 基因带型，则该植株不含C基因组植物C07染色体整条或部分。
待鉴定的植株为以C或BC基因组植物为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显C 基因组带型和A基因组带型，则该植株含有A基因组蔬菜A06染色体整条或部分；若只显示C基因组带型，则该植株不含A基因组蔬菜A06染色体整条或部分。
PCR扩增的反应体系：10-50μL，其中包括：1×PCR含Mg2+ Buffer，0.5-100ng模板DNA，0.2mM dNTPs，0.5μM SEQ ID No.1primer，0.5μM SEQ ID No.2 primer，1U Taq酶；PCR扩增的反应程序：94-95℃0.5-3min；94-95℃30s,55-60℃30S,72℃30S,35循环； 72℃5-10min。
检测PCR扩增产物的方法包括但不限于PAGE胶电泳检测，毛细管电泳检测，测序检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情况的 SSR分子标记和方法，该方法能快速、准确的鉴定出芸薹属蔬菜A基因组和C基因组种间杂种及其后代材料。该方法鉴定芸薹属蔬菜A基因组和C基因组远缘杂交及其回交后代的A06和C07染色体的重组和分离，可以拓展芸薹属蔬菜的遗传资源，转育新性状，丰富蔬菜类型，丰富人民的日常膳食营养。与细胞学方法相比，该方法具有快速、操作简单、对实验操作者技术要求低、不需要昂贵仪器、可用于大群体筛查等优点。与高通量测序和生物芯片方法相比，该方法具有简单快速和成本低廉的优点。与使用两套分子标记相比，该方法使用一套共显性分子标记既可以降低人力、物力成本又可以显著降低假阳性和假阴性。该方法在远缘杂种及后代材料中快速筛选和大规模群体初筛上具有使用价值。
附图说明
图1是实施例1提供的白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种F1植株的鉴定结果之聚丙烯凝胶电泳图；泳道4是白菜，泳道5是埃塞俄比亚芥，泳道6是白菜×埃塞俄比亚芥F1杂种。A6是白菜A06染色体特征条带，C7是埃塞俄比亚芥C07染色体特征条带。
图2是实施例1提供的白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种F1植株及其亲本的表型。
图3是实施例2提供的芥蓝与红菜苔远缘杂种F1植株的鉴定结果之聚丙烯凝胶电泳图；泳道1是红菜苔，泳道2是芥蓝，泳道3是芥蓝×红菜苔F1杂种。C07是芥蓝第7染色体特征条带，A06是红菜苔第6染色体特征条带。
图4是实施例2提供的芥蓝与红菜苔远缘杂种F1植株及其亲本的表型。
图5是实施例3的白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种BC2植株的鉴定结果之聚丙烯凝胶电泳图；泳道1-22是白菜×埃塞俄比亚芥以白菜为回交亲本的BC2植株。A6是白菜A06染色体特征条带，C7是埃塞俄比亚芥C07染色体特征条带。可知，在均含有A06染色体同时，1、 2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、16、17、18、20、21、22泳道对应的植株含有C07 染色体整条或部分，泳道3、4、9、14、15、19对应的植株不含C07染色体整条或部分。
图6是实施例3的高通量测序染色体覆盖图。
图7是实施例4提供的芥蓝与红菜苔远缘杂种与红菜苔回交BC1代植株的鉴定结果之聚丙烯凝胶电泳图；泳道17、19、22是(芥蓝×红菜苔)×红菜苔的BC1植株。C07是芥蓝第7染色体特征条带，A06是红菜苔第6染色体特征条带。
图8为实施例4高通量测序染色体覆盖图。
具体实施方式
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情况的SSR分子标记和方法，鉴定方法包括以下步骤：
提取待检测植株及其亲本的基因组DNA；
合成引物：
C07D-F:5’-GGAGAAGAAAACAGCGATGC-3’(SEQ ID No.1)；
C07D-R:5’-GGAATAGCTCTTGACGCTCG-3’(SEQ ID No.2)。
PCR扩增。以待检测植物及其亲本DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增反应。反应体系为10-50μL，其中包括：1×PCR Buffer(含Mg2+ )，0.5-100ng模板DNA，0.2mM dNTPs，0.5μM primer C07D-F，0.5μM primer C07D-R，1U Taq酶。PCR反应条件：94- 95℃0.5-3min；94-95℃30s,55-60℃30S,72℃30S,35循环；72℃5-10min。
上述PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配置8％聚丙烯凝胶，180伏电泳1-2小时，至溴酚蓝跑出电泳槽底部结束电泳。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，取出上述聚丙烯酰胺凝胶，银染显色。
条带统计和基因型分析：待鉴定的植株为A基因组与C基因组或BC基因组的F1植株时，若F1植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株为真杂种；若检测的F1植株只显示A基因组带型或只显示C基因组带型，则该植株为假杂种。
待鉴定的植株为A基因组蔬菜与C基因组或BC基因组植物远缘杂种自交后代植株时，若检测的远缘杂种自交后代植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株为A基因组蔬菜A06染色体和C基因组植物C07染色体整条或部分杂合；若检测的远缘杂种自交后代植株只显A基因组带型，则该植株不含C基因组植物C07染色体整条或部分；若检测的远缘杂种自交后代植株只显C基因组带型，则该植株不含A基因组蔬菜A06染色体整条或部分。
待鉴定的植株为以A基因组蔬菜为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株含有C基因组植物C07染色体整条或部分；若只显示A 基因组带型，则该植株不含C基因组植物C07染色体整条或部分。
待鉴定的植株为以C或BC基因组植物为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显C 基因组带型和A基因组带型，则该植株含有A基因组蔬菜A06染色体整条或部分；若只显示C基因组带型，则该植株不含A基因组蔬菜A06染色体整条或部分。
除聚丙烯酰胺凝胶电泳法外，PCR扩增产物可通过毛细管电泳检测或高通量测序检测。基因型的判断方法相同。
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1本实施例鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种F1植株
1.1提取待检测F1植株及其亲本的基因组DNA。
1.2合成引物：
C07D-F:5’-GGAGAAGAAAACAGCGATGC-3’(SEQ ID No.1)；
C07D-R:5’-GGAATAGCTCTTGACGCTCG-3’(SEQ ID No.2)。
1.3PCR扩增。以待检测F1植物及其亲本DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增反应。反应体系为10μL，其中包括：1×PCR Buffer(含Mg2+ )，0.5ng模板DNA，0.2mM dNTPs，0.5μMprimer C07D-F，0.5μM primer C07D-R，1U Taq酶。PCR反应条件：95℃ 3min；95℃30s,59.8℃30S,72℃30S,35循环；72℃10min。
1.4上述PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配置8％聚丙烯凝胶，180伏电泳1.5小时，至溴酚蓝跑出电泳槽底部结束电泳。
1.5取出上述聚丙烯酰胺凝胶，银染显色，见图1。
1.6条带统计和基因型分析：共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，该F1植株为真杂种。
1.7表型鉴定
该F1植株及亲本的表型如图2所示，从图中看出，F1植株的表型与亲本存在明显差异，证明F1植株为真杂种。
由此可见，本发明的分子标记能鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种F1植株。
实施例2本实施例鉴定芥蓝与红菜苔种间杂种F1植株
1.1提取待检测F1植株及其亲本的基因组DNA。
1.2合成引物：
C07D-F:5’-GGAGAAGAAAACAGCGATGC-3’(SEQ ID No.1)；
C07D-R:5’-GGAATAGCTCTTGACGCTCG-3’(SEQ ID No.2)。
1.3 PCR扩增。以待检测F1植物及其亲本DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增反应。反应体系为15μL，其中包括：1×PCR Buffer(含Mg2+ )，1ng模板DNA，0.2mM dNTPs， 0.5μM primer C07D-F，0.5μM primer C07D-R，1U Taq酶。PCR反应条件：94℃3min； 94℃30s,59.8℃30S,72℃30S,35循环；72℃5min。
1.4上述PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配置8％聚丙烯凝胶，180伏电泳1.5小时，至溴酚蓝跑出电泳槽底部结束电泳。
1.5取出上述聚丙烯酰胺凝胶，银染显色，见图3。
1.6条带统计和基因型分析：F1植株共显芥蓝带型和红菜苔带型，该植株为真杂种。若只显示母本带型，则为假杂种。若既不显示母本带型也不显示父本带型，则该检测失败。本实施例中，F1植株共显芥蓝带型和红菜苔带型，该F1植株为真杂种。
1.7表型鉴定
该F1植株及亲本的表型如图4，从图中看出，F1植株的表型与亲本存在明显差异，证明 F1植株为真杂种。
实施例3本实施例鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种回交后代(BC2)材料
1.1提取待检测植株及其亲本的基因组DNA。
1.2合成引物：
C07D-F:5’-GGAGAAGAAAACAGCGATGC-3’(SEQ ID No.1)；
C07D-R:5’-GGAATAGCTCTTGACGCTCG-3’(SEQ ID No.2)。
1.3 PCR扩增。以待检测植物及其亲本DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增反应。反应体系为20μL，其中包括：1×PCR Buffer(含Mg+)，10ng模板DNA，0.2mM dNTPs， 0.5μMprimer C07D-F，0.5μM primer C07D-R，1U Taq酶。PCR反应条件：94℃3min； 94℃30s,59.8℃30S,72℃30S,35循环；72℃5min。
1.4上述PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配置8％聚丙烯凝胶，180伏电泳1小时，至溴酚蓝跑出电泳槽底部结束电泳。
1.5取出上述聚丙烯酰胺凝胶，银染显色，见图5。
1.6条带统计和基因型分析：在均含有A06染色体同时，检测的第1、2、4、5、6、7、 8、10、11、12、13、16、17、18、20、21、22植株共显A6和C7带型，表明这些植株含有埃塞俄比亚芥C07染色体整条或部分，检测的第3、4、9、14、15、19只显A6带型，表明这些植株不含埃塞俄比亚芥C07染色体整条或部分。
1.7测序鉴定
对分子标记鉴定阳性的第16号单株进行全基因组illumina测序，测序深度10×；将 reads比对到A,B,C参考基因组，根据覆盖度判断目标染色体是否存在该植株中。
结果如图6所示，显示A06，C07染色体都有被密集而均匀的覆盖，表明这2条染色体存在于被检测植株中，证明分子标记鉴定结果可靠。B01染色体覆盖度低，作为阴性对照，表明该染色体不在被检测植株中。
实施例4本实施例鉴定芥蓝与红菜苔种间杂种回交后代(BC1)材料
1.1提取待检测植株及其亲本的基因组DNA。
1.2合成引物：
C07d-F:5’-GGAGAAGAAAACAGCGATGC-3’(SEQ ID No.1)；
C07d-R:5’-GGAATAGCTCTTGACGCTCG-3’(SEQ ID No.2)。
1.3 PCR扩增。以待检测BC1植物及其亲本DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增反应。反应体系为15μL，其中包括：1×PCR Buffer(含Mg+)，5ng模板DNA，0.2mM dNTPs，0.5μMprimer C07D-F，0.5μM primer C07D-R，1U Taq酶。PCR反应条件：94℃ 3min；94℃30s,59.8℃30S,72℃30S,35循环；72℃10min。
1.4上述PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配置8％聚丙烯凝胶，180伏电泳1.5小时，至溴酚蓝跑出电泳槽底部结束电泳。
1.5取出上述聚丙烯酰胺凝胶，银染显色，见图7。
1.6条带统计和基因型分析：检测以红菜苔为回交亲本的回交后代，所检测的第17和 19号植株共显芥蓝带型和红菜苔带型，表明这些植株含有芥蓝C07染色体整条或部分；所检测的第22号植株只显红菜苔带型，表明这些植株不含有芥蓝C07染色体整条或部分。
1.7测序鉴定
对分子标记鉴定阳性的第17号植株，进行illumina测序，测序深度10×；将reads比对到A,B,C参考基因组，根据覆盖度判断目标染色体是否存在该植株中。
结果如图8所示，显示A06，C07染色体都有被密集而均匀的覆盖，平均覆盖深度8×以上；表明这2条染色体存在于被检测植株中，证明分子标记鉴定结果可靠。
综上所述，鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情况的SSR分子标记和方法，通过一对共显性SSR分子标记，可以鉴定白菜与埃塞俄比亚芥或红菜苔与芥蓝种间杂交真杂种，也可用于鉴定远缘杂种回交后代的白菜或红菜苔A06染色体及埃塞俄比亚芥或芥蓝C07染色体附加系或渐渗系。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及后代材料A06和C07染色体分离情况的分子标记和方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagaagaaa acagcgatgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaatagctc ttgacgctcg 20

Claims (7)

1.鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及其后代材料A06和C07染色体分离情况的SSR分子标记的引物C07D，其特征在于，引物C07D的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，引物C07D的后向引物序列如SEQ ID No.2所示，所述芸薹属蔬菜为A基因组的白菜或红菜苔，C基因组的芥蓝，BC基因组的埃塞俄比亚芥。
2.权利要求1所述的引物C07D在鉴定芸薹属蔬菜种间杂种及其后代材料A06和C07染色体分离情况上的应用，所述芸薹属蔬菜为A基因组的白菜或红菜苔，C基因组的芥蓝，BC基因组的埃塞俄比亚芥，其特征在于，用引物C07D作为PCR扩增的引物，以待鉴定的植株及亲本DNA为模板进行PCR扩增，检测PCR扩增产物进行条带统计和基因型分析，A基因组带型为205bp的扩增片段，C基因组带型为193bp的扩增片段。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，条带统计和基因型分析的方法为：
待鉴定的植株为A基因组与C基因组或BC基因组的F1植株时，若F1植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株为真杂种；若检测的F1植株只显示A基因组带型或只显示C基因组带型，则该植株为假杂种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，条带统计和基因型分析的方法为：
待鉴定的植株为A基因组蔬菜与C基因组或BC基因组植物远缘杂种自交后代植株时，若检测的远缘杂种自交后代植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株为A基因组蔬菜A06染色体和C基因组植物C07染色体整条或部分杂合；若检测的远缘杂种自交后代植株只显A基因组带型，则该植株不含C基因组植物C07染色体整条或部分；若检测的远缘杂种自交后代植株只显C基因组带型，则该植株不含A基因组蔬菜A06染色体整条或部分。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，条带统计和基因型分析的方法为：
待鉴定的植株为以A基因组蔬菜为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显A基因组带型和C基因组带型，则该植株含有C基因组植物C07染色体整条或部分；若只显示A基因带型，则该植株不含C基因组植物C07染色体整条或部分。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，条带统计和基因型分析的方法为：
待鉴定的植株为以C或BC基因组植物为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显C基因组带型和A基因组带型，则该植株含有A基因组蔬菜A06染色体整条或部分；若只显示C基因组带型，则该植株不含A基因组蔬菜A06染色体整条或部分。
7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于，PCR扩增的反应体系：10-50μL，其中包括：1×PCR含Mg2+ Buffer，0.5-100 ng 模板DNA，0.2 mM dNTPs，0.5 μM SEQ IDNo.1primer，0.5 μM SEQ ID No.2 primer，1U Taq酶；PCR扩增的反应程序：94-95℃ 0.5-3min；94-95℃ 30s, 55-60℃ 30S, 72℃ 30S, 35循环; 72 ℃ 5-10 min。
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