CN102919117A - 一种快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法：以具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料为母本，以染色体组类型与所选母本不同的纯合芸薹属育种材料为父本，进行种间杂交，通过胚挽救技术得到种间杂种F₁植株，后以其父本连续回交，通过田间选择和染色体鉴定，快速获得细胞质雄性不育系。本发明的有益效果在于：1）利用芸薹属蔬菜白菜类、芥菜类、甘蓝类三组染色体组的种间杂交特性，加速了芸薹属细胞质雄性不育系的育种进程；2）选用菜心或芥蓝为细胞质雄性不育源的来源，形成覆盖全部芸薹属蔬菜染色体组类型的细胞质雄性不育系快速转育方法体系；3）菜心或芥蓝不需通过春化而直接抽薹开花，缩短了不育系转育时间。

Description

一种快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法

技术领域

本发明涉及十字花科蔬菜育种技术，具体是一种快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法。

背景技术

十字花科芸薹属蔬菜种类丰富，包括白菜类（Brassica rapa,染色体组AA，2n=20）（如大白菜、油菜、菜心、菜薹等）、甘蓝类（Brassicaoleracea，染色体组CC，2n=18）（如结球甘蓝、花椰菜、青花菜等）、芥菜类等（Brassica juncea，染色体组AABB，2n=36）（如叶芥、根芥、茎芥菜等），是我国目前分布最广泛、栽培面积最大、食用人群最普遍的一大类蔬菜作物，在我国的蔬菜生产中占据着举足轻重的地位。

十字花科芸薹属蔬菜杂种优势明显，目前，生产上使用的优良品种多为杂种一代。在育种上广泛采用的是利用自交不亲和系制种，该方法存在着原种生产成本高以及长期连续自交双亲生活力易衰退、杂交率达不到100%等问题。利用雄性不育系生产一代杂种则能有效克服上述问题，在简化杂种优势育种上具有重要意义。与细胞核雄性不育相比，细胞质雄性不育属于母性遗传，具有不育性稳定、容易保持等优点，特别是对知识产权的保护上能有效发挥作用，受到众多育种工作者的重视。

目前在芸薹属蔬菜育种工作中，利用常规的回交转育方法，从转育获得细胞质雄性不育源到回交纯化获得遗传稳定的纯合不育系至少需要7-8代，育种周期长，因而，构建芸薹属蔬菜作物快速的细胞质雄性不育转育、纯化体系，缩短育种进程，提高杂种一代的制种质量，使细胞质雄性不育系在芸薹属蔬菜育种中得以广泛应用具有十分重要的意义。

发明内容

为解决目前芸薹属蔬菜育种材料回交转育周期长的问题，本发明利用芸薹属蔬菜AA、AABB、CC三组染色体组的种间杂交特性，提供一种快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法。

发明人在不同基因组的芸薹属作物中进行种间杂交，并随之以相应的父本对F₁代进行回交转育，回交所得植株的植物学性状并不是随回交代数的增加逐步接近回交父本，而是在回交二代（BC₂）便发生明显分离，并出现综合性状与回交父本非常接近的单株。以AA和CC基因组的种间杂交为例，获得的F₁代植株以AA基因组为父本回交，回交二代（BC₂）田间观察发生明显分离，出现植物学性状与回交亲本AA基因组材料非常接近的单株，推测在回交二代已有部分分离单株的C基因组大部分或整体丢失，发明人通过染色体压片检测对此进行验证，在回交三代（BC₃）的染色体压片检测中获得了完全的父本AA基因组类型的植株。发明人利用芸薹属蔬菜不同染色体组的种间杂交特性，提供一种快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，具体步骤如下：

1）以具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料为母本，以染色体组类型与所选母本不同的纯合芸薹属育种材料为父本，进行种间杂交，通过胚挽救技术获得具细胞质雄性不育源的种间杂种F₁植株；

2）种植步骤1）中获得的F₁植株，以步骤1）中的父本为父本，连续回交2代，获得回交二代（BC₂）种子；

3）种植步骤2）中获得的回交二代（BC₂）种子，通过田间选择获得与步骤1）中的父本植物学性状相近植株，以步骤1）中的父本为父本，继续回交1-2次，获得回交三代（BC₃）或回交四代（BC₄）种子；

4）种植步骤3）中获得的回交三代（BC₃）或回交四代（BC₄）种子，通过田间株选和染色体鉴定，获得细胞质雄性不育系。

其中，步骤1）所述的以具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料为母本，以染色体组类型与所选母本不同的纯合芸薹属育种材料为父本，具体为：①以具有细胞质雄性不育源、染色体组类型为AA的芸薹属育种材料为母本，以染色体组类型为CC的纯合芸薹属育种材料为父本；②以具有细胞质雄性不育源、染色体组类型为CC的芸薹属育种材料为母本，以染色体组类型为AA或AABB的纯合芸薹属育种材料为父本。

其中，步骤1）所述的具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料，优选为具有细胞质雄性不育源的菜心（染色体组类型为AA）或芥蓝（染色体组类型为CC），更优选为Ogura CMSR₃104白花芥蓝不育系或Ogura CMSR₃四九菜心不育系。

其中，步骤1）所述的细胞质雄性不育源，可为任意的细胞质雄性不育源，优选为Ogura CMSR₃。

其中，步骤1）所述的纯合芸薹属育种材料，为自交8代以上的纯合芸薹属育种材料或游离小孢子培养获得的DH系。

其中，步骤1）所述的胚挽救技术，具体为：

a）种间杂交时，母、父本进行人工蕾期授粉，人工蕾期授粉方法为将父本新鲜花粉涂抹于母本花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天；

b）授粉7-12天后，取子房已隆起的角果，消毒灭菌后用改良B5固体培养基进行组织培养；

c）组织培养10-15天后，剥取绿色种胚，继续用改良B5固体培养基进行组织培养，直至获得具根、茎、叶的F₁植株。

其中，步骤b）所述的消毒灭菌，具体方法为：用体积百分含量75%的酒精浸泡，用体积百分含量7％的次氯酸钠溶液洗涤，无菌蒸馏水冲洗。

其中，步骤b）、c）所述的改良B5固体培养基，是以B5固体培养基为基本培养基，含有6-苄氨基嘌呤（6-BA）的浓度为1.5mg/L，含有α-萘乙酸（NAA）的浓度为0.05mg/L，pH值为5.8-6.0的培养基。

其中，步骤b）、c）所述的组织培养，培养条件为：温度25℃，光照强度1000-1500lx，每天光照时间为14h。

其中，步骤4）所述的染色体鉴定，具体方法为：

取待鉴定植株的根尖，用饱和对二氯苯水溶液浸泡2.5h，蒸馏水冲洗后置于卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸=3：1，体积比）中4℃固定24-48h，作为固定后的根尖待用；

切取1-2㎜固定后的根尖，在0.075mol/L的KCl溶液中前低渗30min，蒸馏水清洗后，用纤维素酶质量百分含量为2.5%、果胶酶质量百分含量为2.5%的混合酶液在37℃下酶解55min，以蒸馏水清洗后，用蒸馏水在4℃下后低渗30min；

取上述处理后的根尖于载玻片上，加卡诺固定液，火焰干燥，得到制好的染色体标本，在相差显微镜下观察鉴定。

本发明还包括所述细胞质雄性不育系的扩繁方法，具体为：将步骤4）获得的细胞质雄性不育系用相应父本回交扩繁，获得大量的细胞质雄性不育种子。

本发明还提供上述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法在芸薹属蔬菜育种中的应用。

本发明的有益效果是：

（1）本发明利用芸薹属白菜类、芥菜类、甘蓝类蔬菜AA、AABB、CC三组染色体组的种间杂交特性，进行种间杂交，通过回交、田间株选、染色体鉴定确认，大大加速了目前芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的育种进程。

（2）本发明采用的具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料优选为菜心（染色体组类型为AA）或芥蓝（染色体组类型为CC）。菜心和芥蓝不同于芸薹属其他蔬菜作物，不需通过春化处理即可直接抽薹开花，便于随时获取细胞质雄性不育源，并大大缩短了细胞质雄性不育系的转育、纯化时间。

（3）本发明采用的具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料，选择菜心（AA染色体组）时可以此为细胞质雄性不育源来源，转育染色体组类型为CC的芸薹属育种材料，得到细胞质雄性不育系；选择芥蓝（CC染色体组）时可以此为细胞质雄性不育源来源，转育染色体组类型为AA或AABB的芸薹属育种材料得到细胞质雄性不育系。因此选用菜心或芥蓝为细胞质雄性不育源来源，可转育目前所有染色体组类型的芸薹属蔬菜育种材料为不育系，形成了全覆盖的芸薹属蔬菜快速转育细胞质雄性不育系的方法体系，详见图1。

（4）本发明的细胞质雄性不育源，可为任意的细胞质雄性不育源，优选为Ogura CMSR₃。Ogura CMSR₃具有低温不黄化、开花结实正常等优点，为目前可实用的细胞质雄性不育源。

附图说明

图1为芸薹属蔬菜细胞质雄性不育快速转育程序图。

图2为选育Ogura CMSR₃四九菜心不育系选育系谱图。

图3为选育Ogura CMSR₃四九菜心不育系根尖染色体相差显微镜下镜检图像。

图4为选育Ogura CMSR₃四九菜心不育系和其回交父本四九菜心的田间表现。

图5为选育Ogura CMSR₃四九菜心不育系花朵照片。

图6为G2B不育系选育系谱图。

图7为G2B不育系根尖染色体相差显微镜下镜检图像。

图8为G2B不育系和其回交父本G2B的田间表现。

图9为G2B不育系花朵照片。

图10为11球心芥菜不育系选育系谱图。

图11为11球心芥菜不育系根尖染色体相差显微镜下镜检图像。

图12为11球心芥菜不育系和其回交父本11球心芥菜的田间表现。

图13为11球心芥菜不育系花朵照片。

图14为北京早熟甘蓝不育系选育系谱图。

图15为北京早熟甘蓝不育系根尖染色体相差显微镜下镜检图像。

图16为北京早熟甘蓝不育系和其回交父本北京早熟甘蓝的田间表现。

图17为北京早熟甘蓝不育系花朵照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。所涉育种材料为：

OguCMS R₃：为美国A sgrow种子公司进行原生质体非对称融合获得的新改良萝卜胞质不育源（利用叶绿体SSR（cpSSR）标记区分三种Ogura胞质甘蓝雄性不育系，王庆彪，2010）。

萝卜胞质不育材料CMSR₃625：染色体组为CC，是美国引进的萝卜胞质甘蓝不育材料（几种类型甘蓝雄性不育的研究与显性不育系的利用，方智远，2001）。

104白花芥蓝：染色体组为CC，中国蔬菜品种资源第二册第144页V04E0082，引自亚蔬中心，繁种单位：中国农业科学院。可从国家蔬菜品种资源中期保存库引种。

四九菜心：染色体组为AA，中国蔬菜品种资源第二册第104页V02D0211，引自北京丰台，繁种单位：中国农业科学院。可从国家蔬菜品种资源中期保存库引种。

G2B：染色体组为AA，来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所，为大白菜中白78亲本之一（中白78大白菜为2005年北京市审定品种，审定编号：京审菜2005010，可市购）。

11号球心芥菜：染色体组为AABB，中国蔬菜品种资源第一册第180页V03A0077，引自广东澄海县，繁种单位：广东农科院经作所。可从国家蔬菜品种资源中期保存库引种。

北京早熟甘蓝：为地方品种，染色体组为CC，中国蔬菜品种资源第一册第226页V04A0127，引自新疆，繁种单位：新疆农科院园艺所。可从国家蔬菜品种资源中期保存库引种。

实施例1选育菜心细胞质雄性不育系——Ogura CMSR₃四九菜心不育系

采用本发明的方法，按照图2所示的系谱图选育Ogura CMSR₃四九菜心不育系：

1）以具有细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的改良的萝卜胞质不育材料CMSR₃625（染色体组类型为CC）为母本，以四九菜心（染色体组类型为AA，2n=20）为父本，2000年春季于中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室进行种间杂交，通过胚挽救技术获得具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的种间杂种F₁植株。

上述胚挽救技术，具体为：

a）种间杂交时，母、父本进行人工蕾期授粉，人工蕾期授粉方法为将父本四九菜心的新鲜花粉涂抹于母本改良的萝卜胞质不育材料CMSR₃625花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天。

b）授粉10天后，取子房已隆起的角果，在超净工作台上用体积百分含量75%的酒精浸泡30s，用体积百分含量7％的次氯酸钠溶液洗涤15min，无菌蒸馏水冲洗3遍，用改良B5固体培养基进行组织培养，培养条件为25℃培养室，光照强度1000-1500lx，每天光照14h。

改良B5固体培养基的配置方法为：参照文献Nutrient requirementsof suspension cultures of soybean root cells（Gamborg,O.L.,et al.,1968，.Exp.Cell Res.50,151-158.）中所述的B5培养基配置方法，先配制大量元素（浓缩20倍）、微量元素（浓缩200倍）、铁盐（浓缩200倍）及除蔗糖之外的有机物质（浓缩200倍）浓缩贮备液，然后取1L容量瓶，取大量元素浓缩贮备液50ml、微量元素、铁盐及上述有机物质浓缩贮备液各5ml；此外加入以下物质，使其浓度为6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L，α-萘乙酸（NAA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.0g/L，蒸馏水定容，调整溶液pH值为5.8-6.0，分装于100ml三角瓶中，高压灭菌（121℃，15min）后，冷却凝固，得到改良B5固体培养基。

c）组织培养12天后，在超净工作台上用消毒的解剖针剥取绿色种胚，继续用改良B5固体培养基进行组织培养，培养条件同b），组培继代一个月后获得具根、茎、叶的F₁组培苗植株。

2）种植步骤1）中获得的具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的F₁植株，以其父本四九菜心连续回交2代，获得BC₂种子；

3）种植步骤2）中获得的BC₂种子，通过田间选择获得与其父本四九菜心植物学性状相近植株，以其父本四九菜心继续回交1次，获得BC₃种子；

4）种植步骤3）中获得的BC₃种子，通过田间株选和染色体鉴定，选出纯合稳定的具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的Ogura CMSR₃四九菜心不育系。

染色体鉴定为常规方法，具体为：

取待鉴定Ogura CMSR₃四九菜心不育系的根尖，用饱和对二氯苯水溶液浸泡2.5h，蒸馏水冲洗后置于卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸=3：1，体积比）中4℃固定24h，作为固定后的根尖待用；

切取2mm固定后的根尖，在0.075mol/L的KCl溶液中前低渗30min，蒸馏水清洗后，用纤维素酶质量百分含量为2.5%、果胶酶质量百分含量为2.5%的混合酶液在37℃下酶解55min，以蒸馏水清洗后，用蒸馏水在4℃下后低渗30min；

取上述处理后的根尖于载玻片上，加卡诺固定液，火焰干燥，得到制好的Ogura CMSR₃四九菜心不育系的根尖染色体标本，在相差显微镜下观察鉴定。

Ogura CMSR₃四九菜心不育系根尖染色体在相差显微镜下镜检结果参见图3，染色体组类型为AA，2n=20。

将鉴定得到的Ogura CMSR₃四九菜心不育系用其父本四九菜心再回交，扩繁获得大量具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的纯合Ogura CMSR₃四九菜心不育系种子。

2004年秋季，种植Ogura CMSR₃四九菜心不育系于中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场，以四九菜心为对照，结果表明，OguraCMSR₃四九菜心不育系的育性表现为细胞质雄性不育，其它表现型同四九菜心，Ogura CMSR₃四九菜心不育系和其回交父本四九菜心的田间表现具体见图4，Ogura CMSR₃四九菜心不育系花朵照片见图5。

实施例2选育白菜细胞质雄性不育系——G2B不育系

采用本发明的方法，按照图6所示的系谱图选育G2B不育系：

采用传统方法选育Ogura CMSR₃104白花芥蓝不育系：以104白花芥蓝为父本，以改良的萝卜胞质不育材料CMSR₃625为母本杂交后，以104白花芥蓝为父本连续回交8代，获得遗传稳定的OguraCMSR₃104白花芥蓝不育系，具有细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃，为早熟材料，生育周期短，无需春化即抽薹开花，可随时种植，提供不育源转育花器官。

1）以具有细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的Ogura CMSR₃104白花芥蓝不育系（染色体组类型为CC）为母本，以G2B（染色体组类型为AA，2n=20）为父本，2002年春季于中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室进行种间杂交，通过胚挽救技术获得具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的种间杂种F₁植株。

上述胚挽救技术，具体为：

a）种间杂交时，母、父本进行人工蕾期授粉，人工蕾期授粉方法为将父本G2B的新鲜花粉涂抹于母本Ogura CMSR₃104白花芥蓝不育系花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天。

b）授粉10天后，取子房已隆起的角果，在超净工作台上用体积百分含量75%的酒精浸泡30s，用体积百分含量7％的次氯酸钠溶液洗涤15min，无菌蒸馏水冲洗3遍，用改良B5固体培养基进行组织培养，培养条件为25℃培养室，光照强度1000-1500lx，每天光照14h。

改良B5固体培养基的配置方法参照实施例1。

c）组织培养12天后，在超净工作台上用消毒的解剖针剥取绿色种胚，继续用改良B5固体培养基进行组织培养，培养条件同b），组培继代一个月后获得具根、茎、叶的F₁组培苗植株。

2）种植步骤1）中获得的具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的F₁植株，以其父本G2B连续回交2代，获得BC₂种子；

3）种植步骤2）中获得的BC₂种子，通过田间选择获得与其父本G2B植物学性状相近植株，以其父本G2B继续回交1次，获得BC₃种子；

4）种植步骤3）中获得的BC₃种子，通过田间株选和染色体鉴定，选出纯合稳定的具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的G2B不育系。

染色体鉴定为常规方法，具体为：

取待鉴定G2B不育株根系的根尖，用饱和对二氯苯水溶液浸泡2.5h，蒸馏水冲洗后置于卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸=3：1，体积比）中4℃固定24h，作为固定后的根尖待用；

切取2mm固定后的根尖，在0.075mol/L的KCl溶液中前低渗30min，蒸馏水清洗后，用纤维素酶质量百分含量为2.5%、果胶酶质量百分含量为2.5%的混合酶液在37℃下酶解55min，以蒸馏水清洗后，用蒸馏水在4℃下后低渗30min；

取上述处理后的根尖于载玻片上，加卡诺固定液，火焰干燥，得到制好的G2B不育系的根尖染色体标本，在相差显微镜下观察鉴定。

G2B不育株根尖染色体在相差显微镜下镜检结果参见图7，染色体组类型为AA，2n=20。

将鉴定得到的G2B不育系用其父本G2B再回交，扩繁获得大量具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的纯合G2B不育系种子。

2006年秋季，种植G2B不育系于中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场，以G2B为对照，结果表明，G2B不育系的育性表现为细胞质雄性不育，其它表现型同G2B，G2B不育系和其回交父本G2B的田间表现具体见图8，G2B不育系花朵照片见图9。

实施例3选育芥菜细胞质雄性不育系——11号球心芥菜不育系

采用本发明的方法，按照图10所示的系谱图选育11号球心芥菜不育系：

采用传统方法选育Ogura CMSR₃104白花芥蓝不育系：以104白花芥蓝为父本，以改良的萝卜胞质不育材料CMSR₃625为母本杂交后，以104白花芥蓝为父本连续回交8代，获得遗传稳定的OguraCMSR₃104白花芥蓝不育系，具有细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃，为早熟材料，生育周期短，无需春化即抽薹开花，可随时种植，提供不育源转育花器官。

1）以具有细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的Ogura CMSR₃104白花芥蓝不育系（染色体组类型为CC）为母本，以11号球心芥菜（染色体组类型为AABB，2n=36）为父本，2006年春季于中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室进行种间杂交，通过胚挽救技术获得具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的种间杂种F₁植株。

上述胚挽救技术，具体为：

a）种间杂交时，母、父本进行人工蕾期授粉，人工蕾期授粉方法为将父本11号球心芥菜的新鲜花粉涂抹于母本Ogura CMSR₃104白花芥蓝不育系花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天。

b）授粉7天后，取子房已隆起的角果，在超净工作台上用体积百分含量75%的酒精浸泡30s，用体积百分含量7％的次氯酸钠溶液洗涤15min，无菌蒸馏水冲洗3遍，用改良B5固体培养基进行组织培养，培养条件为25℃培养室，光照强度1000-1500lx，每天光照14h。

改良B5固体培养基的配置方法参照实施例1。

c）组织培养15天后，在超净工作台上用消毒的解剖针剥取绿色种胚，继续用改良B5固体培养基进行组织培养，培养条件同b），组培继代一个月后获得具根、茎、叶的F₁组培苗植株。

2）种植步骤1）中获得的具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的F₁植株，以其父本11号球心芥菜连续回交2代，获得BC₂种子；

3）种植步骤2）中获得的BC₂种子，通过田间选择获得与其父本11号球心芥菜植物学性状相近植株，以其父本11号球心芥菜继续回交2次，获得BC₄种子；

4）种植步骤3）中获得的BC₄种子，通过田间株选和染色体鉴定（具体方法参加实施例1），选出纯合稳定的具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的11号球心芥菜不育系。

11号球心芥菜不育系根尖染色体在相差显微镜下镜检结果参见图11，染色体组类型为AABB，2n=36。

将鉴定得到的11号球心芥菜不育系用其父本11号球心芥菜再回交，扩繁获得大量具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的纯合11号球心芥菜不育系种子。

2011年秋季田间种植11号球心芥菜不育系，以11号球心芥菜为对照，结果表明，11号球心芥菜不育系的育性表现为细胞质雄性不育，其它表现型同11号球心芥菜，11号球心芥菜不育系和其回交父本11号球心芥菜的田间表现具体见图12，11号球心芥菜不育系花朵照片见图13。

实施例4选育甘蓝细胞质雄性不育系——北京早熟甘蓝不育系

采用本发明的方法，按照图14所示的系谱图选育北京早熟甘蓝不育系：

1）以具有细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的Ogura CMSR₃四九菜心不育系（染色体组类型为AA）为母本，以地方品种北京早熟甘蓝（染色体组类型为CC，2n=18）为父本，2007年春季于中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室进行种间杂交，通过胚挽救技术获得具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的种间杂种F₁植株。

上述胚挽救技术，具体为：

a）种间杂交时，母、父本进行人工蕾期授粉，人工蕾期授粉方法为将父本北京早熟甘蓝的新鲜花粉涂抹于母本Ogura CMSR₃四九菜心不育系花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天。

b）授粉12天后，取子房已隆起的角果，在超净工作台上用体积百分含量75%的酒精浸泡30s，用体积百分含量7％的次氯酸钠溶液洗涤15min，无菌蒸馏水冲洗3遍，用改良B5固体培养基进行组织培养，培养条件为25℃培养室，光照强度1000-1500lx，每天光照14h。

改良B5固体培养基的配置方法参照实施例1。

c）组织培养10天后，在超净工作台上用消毒的镊子取绿色种胚，继续用改良B5固体培养基进行组织培养，培养条件同b），组培继代一个月后获得具根、茎、叶的F₁组培苗植株。

2）种植步骤1）中获得的具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的F₁植株，以其父本北京早熟甘蓝连续回交2代，获得BC₂种子；

3）种植步骤2）中获得的BC₂种子，通过田间选择获得与其父本北京早熟甘蓝植物学性状相近植株，以其父本北京早熟甘蓝继续回交1次，获得BC₃种子；

4）种植步骤3）中获得的BC₃种子，通过田间株选和染色体鉴定（具体方法参加实施例1），选出纯合稳定的具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的北京早熟甘蓝不育株。

北京早熟甘蓝不育株根尖染色体在相差显微镜下镜检结果参见图15，染色体组类型为CC，2n=18。

将鉴定得到的北京早熟甘蓝不育株用其父本北京早熟甘蓝再回交，扩繁获得大量具细胞质雄性不育源Ogura CMSR₃的纯合北京早熟甘蓝不育系种子。

2011年秋季田间种植北京早熟甘蓝不育系，以北京早熟甘蓝为对照，结果表明，北京早熟甘蓝不育系的育性表现为细胞质雄性不育，北京早熟甘蓝不育系和其回交父本北京早熟甘蓝的田间表现具体见图16，北京早熟甘蓝不育系花朵照片见图17。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）以具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料为母本，以染色体组类型与所选母本不同的纯合芸薹属育种材料为父本，进行种间杂交，通过胚挽救技术获得具细胞质雄性不育源的种间杂种F₁植株；

2）种植步骤1）中获得的F₁植株，以步骤1）中的父本为父本，连续回交2代，获得回交二代种子；

3）种植步骤2）中获得的回交二代种子，通过田间选择获得与步骤1）中的父本植物学性状相近植株，以步骤1）中的父本为父本，继续回交1-2次，获得回交三代或回交四代种子；

4）种植步骤3）中获得的回交三代或回交四代种子，通过田间株选和染色体鉴定，获得细胞质雄性不育系。

2.如权利要求1所述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，步骤1）所述的具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料，为具有细胞质雄性不育源的菜心或芥蓝。

3.如权利要求1所述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，步骤1）所述的细胞质雄性不育源为Ogura CMSR₃。

4.如权利要求3所述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，步骤1）所述的具有细胞质雄性不育源的芸薹属育种材料为Ogura CMSR₃104白花芥蓝不育系或Ogura CMSR₃四九菜心不育系。

5.如权利要求1所述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，步骤1）所述的胚挽救技术，具体为：

a）种间杂交时，母、父本进行人工蕾期授粉；

b）授粉7-12天后，取子房已隆起的角果，消毒灭菌后用改良B5固体培养基进行组织培养； 

c）组织培养10-15天后，剥取绿色种胚，继续用改良B5固体培养基进行组织培养，直至获得具根、茎、叶的F₁植株。

6.如权利要求5所述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，步骤a）所述的人工蕾期授粉方法，为将父本新鲜花粉涂抹于母本花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天。

7.如权利要求5所述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，步骤b）所述的消毒灭菌，具体方法为：用体积百分含量75%的酒精浸泡，用体积百分含量7％的次氯酸钠溶液洗涤，无菌蒸馏水冲洗。

8.如权利要求5所述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，所述的改良B5固体培养基，是以B5固体培养基为基本培养基，含有6-苄氨基嘌呤的浓度为1.5mg/L，含有α-萘乙酸的浓度为0.05mg/L，pH值为5.8-6.0的培养基。

9.扩繁权利要求1所述的细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，具体为：将权利要求1所述的获得的细胞质雄性不育系用相应父本继续回交扩繁，获得大量的细胞质雄性不育种子。

10.权利要求1-8任一项所述快速转育芸薹属蔬菜细胞质雄性不育系的方法在芸薹属蔬菜育种中的应用。 

Images