CN105684904A

CN105684904A - 一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法

Info

Publication number: CN105684904A
Application number: CN201610076172.6A
Authority: CN
Inventors: 曲冠证; 赵曦阳; 李莹; 李开隆; 由香玲
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2036-02-03
Also published as: CN105684904B

Abstract

本发明提供了一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法。首先确定花药中小孢子处于单核靠边期后,采集雄穗经消毒，用普通豆浆机粉碎。在超净工作台内分别以40目和60目网筛过筛,除去大于和小于花药的杂质，快速获得大量无菌花药。花药接种于在MS+40mg/L蔗糖+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT条件下培养4周获得的愈伤组织最好；该愈伤组织在MS+30mg/L蔗糖+2.0mg/L BA+0.5mg/L KT分化培养条件下分化的不定芽最多；不定芽在WPM+0.4mg/L IBA+0.2mg/L NAA培养基中诱导生根。将根尖取下用饱和对二氯苯预处理4h后，经染色制片，光学显微镜观察到染色体收缩效果最佳且分散。获得3个染色体数为14的单倍体株系。

Description

一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法

技术领域

本发明涉及一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法。本发明属农业生物技术领域。

背景技术

白桦(Betulaplatyphylla)为桦木科桦木属落叶乔木。自然分布主要在东北地区的北部：大小兴安岭、完达山等林区。因其姿态优美，树皮光滑洁白，作为庭园树、行道树及街心绿地栽培，具独特的观赏价值。白桦属强阳性树种，耐贫寒、生长快、材质优良，为重要工业用材树种之一。

花药培养能够获得纯系育种材料，进行单倍体育种，缩短育种年限和提高育种效率，而且在基础生物科学领域具也有广泛应用(王延玲等，山东农业大学学报(自然科学版)，2006，37(1)：149～151)。花药培养建立的双单倍体群体DH群体，具有遗传学上的纯合基因组，是AFLP,RAPD,SSR等分子标记和基因图谱的理想材料，能极大提高基因定位、标图的准确性。从20世纪60年代，Nitshc通过花药培养得到烟草的单倍体植株后，花药培养得到了很大的发展并于70年代达到了高速发展阶段。自1964年印度的Guha和Maheshwari(GuhaandMaheshwari,Nature,1964,204:497)首次成功地从毛叶曼陀罗离体花药培养中获得单倍体植株，并随后证实是由胚状体途径获得的单倍体花粉植株，从此开创了利用花药培养诱导单倍体的新途径。之后，花药培养诱导单倍体在许多重要作物上获得成功，如在小麦(倪胜利等，甘肃农业大学学报，2004，39(2):141～145)、玉米(付迎军，延边大学农学学报，2004，26(1)：1～5)、水稻(赵海岩等，辽宁农业科学，2005(1)：5～7)、茄子(Miyoshi，PlantCellReports，1996，15(6)：391～395)、草莓(Rosati等，HortScience，1975，10(2)；119～120)等农作物上都有成功的报道。

到目前为止，白桦花药培养体系及单倍体植株还未有报道。由于小孢子处于单核靠边期的白桦花药很小，约1.5-2.0mm，无菌接种操作较困难。根据相关研究研究报道(李同华，东北林业大学硕士论文，2004)，白桦小孢子在每年的8月下旬发育到小孢子，9月份完发育到单核靠边期越冬，第二年再继续发育成熟。本发明的目的是建立一种培养白桦花药获得单倍体的技术体系，为白桦单倍体育种及基础研究提供原始研究材料。

发明内容

本发明主要涉及快速获得大量小孢子处于单核靠边期的白桦花药，花药植株再生及单倍体植株的鉴定。具体如下：

(1)小孢子处于单核靠边期白桦花药的大量获得

在8月下旬到9月初，不断取材，利用醋酸洋红法于光学显微镜下观察花药中小孢子的发育时期。当小孢子发育到单核靠边期时,采集雄穗在超净工作台内用70％消毒3分钟。普通豆浆机的刀片和杯也事先在超净工作台内经70％酒精经消毒后，将花穗放入豆浆机的杯中，拧上刀片，然后拿出超净工作台，插入电机粉碎。之后取下杯和刀片在超净工作台内打开，取出物分别以40目和60目网筛过筛，除去大于和小于花药的杂质获得大量无杂质、无菌花药。

(2)花药植株再生

将上述花药接种到添加40g/L蔗糖和0-3.0mg/L2,4-D，0.5mg/LKT的MS培养基中诱导愈伤组织。培养四周，在40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下获得大量愈伤组织。然后转入添加0.5-2.0mg/LBA，0.1-0.5mg/LNAA，30g/L蔗糖的MS培养基进行分化。培养四周后，在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT最多。分化出的不定芽在WPM+0.4mg/LIBA+0.2mg/LNAA培养基中诱导生根培养。

(3)单倍体植株的鉴定

当根长约为0.5cm～1.0cm时，在上午9:00～12:00取样，用蒸馏水仔细洗去根上残存的培养基。用0.2％秋水仙素、饱和对二氯苯对根尖分别进行预处理：1.5h-4.0h。将预处理好的根尖放入到卡诺氏液(冰乙酸1份，无水乙醇3份)中固定2～4h。然后根尖经70％的酒精转入蒸馏水中漂洗5～6遍，洗去表面的酒精，使着色更加充分，在1mol/LHCl中处理2～3min，用蒸馏水漂洗5～6遍后，用刀片把根尖的分生区切下并移至载玻片上，用刀片将分生区压扁，滴上1～2滴卡宝品红，染色5～10min。然后进行压片和制片。将制好的装片在光学显微镜60×和100×的油镜下进行染色体数目的观察、计数和显微拍照。发现用饱和对二氯苯溶液对白桦的根尖进行预处理4h，染色体收缩效果最佳，且最分散。共查到有3个株系染色体数是14条。

本发明中所用的培养基都先调整pH值为5.8，经过高温高压灭菌(121℃、1.5个大气压、15分钟)后使用的。本发明的培养环境是在常规组织培养室(温度24～26℃，光照强度1000～1500Lx,光/暗周期16h/8h,湿度60％～70％)中进行的。

本发明的特点：

1、快速获得大量干净无杂质、无菌白桦花药，为白桦花药培养提供了充足的外植体材料，极大提高了接种效率。

2、建立了花药再生培养体系，为白桦单倍体育种及基础研究奠定基础。

3、建立了白桦组织培养植株根尖染色体杂片技术。

附图说明：

图1普通豆浆机的主要组成：刀片、杯和电机

图2经豆浆机粉碎雄穗后经网筛筛选，并接种的白桦花药

图3花药愈伤组织的诱导：A、B分别为在MS+40mg/L蔗糖+3.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT、MS+40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下诱导的愈伤组织；C为B中愈伤组织在同样条件下继代培养的愈伤组织

图4花药愈伤组织在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT条件下分化的不定芽

图5经根尖染色体制片技术观察到的染色体图片

具体实施方式

实例1、小孢子处于单核靠边期白桦花药的大量获得

在2014和2015年8月下旬到9月初，采集东北林业大学校内的白桦雄花穗，取出花药，用卡诺固定液固定。然后红醋酸洋红观察花药中小孢子的发育情况。当小孢子发育到单核靠边期时,采集雄穗在超净工作台用70％酒精消毒3分钟后，用灭菌的蒸馏书冲洗5遍，用灭菌滤纸将雄穗上的水吸干净。普通豆浆机的杯子和刀片也事先在超净工作台内用70％酒精经消毒。将花穗放入豆浆机的杯中，拧上刀片，然后拿出超净工作台，插入电机粉碎。再在超净工作台内分别以40目和60目网筛过筛,除去大于和小于花药的杂质，获得大量无杂质、无菌花药。

实例2、花药植株再生

将上述获得的花药接种到添加40g/L蔗糖和0-3.0mg/L2,4-D，0.5mg/LKT的MS培养基中诱导愈伤组织。培养4周后，调查发现在40mg/L蔗糖+3.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下获得的愈伤组织最多，但有大量不定根产生，不能继代培养；在40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下获得的愈伤组织诱导率为31.5％，虽然不是最多，但生长松散，且在同样条件下继代仍然生长良好(见表1)。然后转入添加0.5-2.0mg/LBA，0.1-0.5mg/LNAA，30g/L蔗糖的MS培养基进行分化。培养6周后，在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT最多(见表2)。分化出的不定芽在WPM+0.4mg/LIBA+0.2mg/LNAA培养基中诱导生根培养。

表1白桦花药接种4周后诱导的愈伤组织

注：“-”表示愈伤组织生长不好；“+”表示愈伤组织生长较好。

表2愈伤组织培养6周后的再分化

实例3、单倍体植株的鉴定

当根长约为0.5cm～1.0cm时，在上午9:00～12:00取样，每个植株取5个以上的根尖，浸泡于蒸馏水中，仔细洗去根上残存的培养基，然后用对根用0.2％秋水仙素、饱和对二氯苯对根尖进行预处理1.5-4.0h。之后用于蒸馏水漂洗5～6遍，放在1mol/LHCl中处理2～3min进行解离。解离后的根尖用蒸馏水漂洗5～6遍后，用刀片把根尖的分生区切下并移至载玻片上，用刀片将分生区压扁，滴上1～2滴卡宝品红，染色5～10min后，将材料轻轻盖上盖玻片，防止空气进入，用滤纸吸干多余的染液，并用铅笔的橡皮头轻轻敲击盖玻片，使细胞均匀分散。将制好的装片分别在光学显微镜60×和100×的油镜下进行染色体数目观察、计数，并对理想的分裂相拍照。比较发现：用饱和对二氯苯预处理根尖4h时，染色体收缩较好，且较分散(见表3、4)。最终共获得3个染色体数为14条的单倍体株系。

表3白桦根尖用2％秋水仙素处理

表4白桦根尖用饱和对二氯苯预处理

Claims

1.一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法,其特征在于:

以小孢子处于单核靠边期的无菌花药为外植体，通过诱导愈伤组织、诱导分化不定芽、不定芽生根过程，获得花粉再生植株，然后利用根尖染色体制片技术，鉴定再生植株染色体倍数，获得染色体数为14条的单倍体植株；

所述内含单核靠边期小孢子无菌花药的快速获得方法为：于8月下旬到9月初期间，不断取材，利用醋酸洋红法于光学显微镜下观察小孢子的发育时期，确定花药中小孢子处于单核靠边期后,采集雄穗，在超净工作台内用70％酒精消毒3分钟，无菌水冲洗后，用灭菌滤纸吸干水份，事先将普通豆浆机的杯和刀片在超净工作台内用70％酒精消好毒，然后将雄穗放于杯内，拧好刀片，拿出超净工作台，插到电机上进行粉碎，之后在超净工作台内将粉碎物取出，分别以40目和60目网筛过筛,出去大于和小于花药的杂质，快速获得大量无菌花药用于接种；

所述的获得花粉再生植株的方法为：花药接种于在MS+40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下培养4周获得的愈伤组织最好；该愈伤组织在MS+30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT分化培养条件下分化的不定芽最多；不定芽在在WPM+0.4mg/LIBA+0.2mg/LNAA培养基中诱导生根，形成再生植株；

所述的再生植株根尖染色体制片技术为:将上述诱导的根尖取下，用饱和对二氯苯预处理4h后，经染色制片，经光学显微镜观察到染色体收缩效果最佳、且分散。