CN110387433B - 鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及后代材料a03和c03染色体分离情况的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况的分子标记和方法，属于植物遗传育种领域。该标记是一对共显性分子标记，利用该标记鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种的真伪，也可用于鉴定和追踪远缘杂种的自交后代、回交后代、染色体附加系、以及重组分离群体和植株的A03和C03染色体分离情况。
Description
技术领域
本发明涉及遗传育种领域，具体而言，涉及远缘杂种植物鉴定和选育方法。
背景技术
远缘杂交是创制植物新种质、拓展育种资源的重要手段。由于物种生殖隔离，远缘杂交往往需要人工授粉和胚拯救等技术，耗时费力，且需要一定科学训练。在远缘杂交过程中，由于去雄不彻底、雌配子发育成植株，以及其他原因可能造成假杂种植株的产生。因而，远缘杂交获得的植株需要通过分子、细胞学等方法检测是否为真杂种。远缘杂种的自交、回交后代需要通过分子或细胞学方法追踪染色体或染色体片段，用以创制异源多倍体、染色体附加系、导入系等遗传材料。与细胞学方法相比，分子标记具有快速、操作简单、对实验操作者技术要求低、不需要昂贵仪器、可用于大群体筛查等优点。随着测序技术的发展，高通量测序和生物芯片也可以用于远缘杂种的分子检测。但是，由于简单快速和成本低廉等原因，分子标记仍然在远缘杂种快速筛选和大规模群体初筛上具有使用价值。
白菜属于起源于我国的十字花科蔬菜，具有种类多、品质优、产销广的优点。埃塞俄比亚芥是起源于非洲的油料作物，具有优良的抗病、抗逆特性。白菜属于A基因组，埃塞俄比亚芥属于BC基因组；通过远缘杂交合成ABC基因组植物具有重要的农业应用前景。通过杂交后回交转育，将A、B、C基因组间染色体重组，将提高白菜和油菜的遗传多样性和抗病、抗逆潜力。
白菜的A03和埃塞俄比亚芥的C03染色体是部分同源(homeologous)染色体。二者之间既含有部分同源区段，也含有大量物种分化后产生的特异基因。利用白菜的A03和埃塞俄比亚芥的C03染色体在杂交后代中的重组可以获得新的农艺性状，提高蔬菜和油料作物的抗病、抗逆、及营养品质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况的分子标记、引物及方法。
本发明的技术方案为：
鉴定白菜和埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况的SSR分子标记，该SSR分子标记由引物C03B2扩增得到，引物C03B2的前向引物序列为C03B2-F:5’-CCTCCGCTAAGGTAAATCTCG-3’(SEQ ID No.1)，引物C03B2的后向引物序列为C03B2-R:5’-GCCGGAAGAAGAGATCAGTTT-3’(SEQ ID No.2)。
该SSR分子标记PCR片段预期长度：190-280bp。真实的，白菜(A)基因组中扩增片段的预期长度为271bp，埃塞俄比亚芥(C)基因组中的扩增片段预期长度为193bp。应当知道，不同品种间SSR重复数可能不同，扩增片段长度在不同品种间可以有差异。
该SSR分子标记在白菜和埃塞俄比亚芥的染色体位置：在白菜(A)基因组中位于A03 染色体17.23Mb处(根据Chiifu白菜V1.0基因组；下载地址： http://brassicadb.org/brad/datasets/pub/BrassicaceaeGenome/Brassica_rapa/V1.0/)，在埃塞俄比亚芥(C)基因组中位于C03染色体17.00Mb处(根据甘蓝Bol_Chromosome_V1.1基因组；下载地址：http://brassicadb.org/brad/datasets/pub/BrassicaceaeGenome/Brassica_oleracea/Bol_Chromosome_ V1.1/)。应当知道，由于不同研究者对染色体的编号可能不同，不同基因组组装版本中该标记位置也可能不同，本专利应当包括检测编号不同但实质等同的染色体及位置。
鉴定白菜和埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况的 SSR分子标记的引物C03B2，引物C03B2的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，引物 C03B2的后向引物序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的SSR分子标记或引物C03B2在鉴定白菜和埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况上的应用。
具体地，用引物C03B2作为PCR扩增的引物，以待鉴定的植株及白菜与埃塞俄比亚芥亲本DNA为模板进行PCR扩增，检测PCR扩增产物进行条带统计和基因型分析。
条带统计和基因型分析的方法为：
待鉴定的植株为白菜与埃塞俄比亚芥杂交的F1植株时，若F1植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株为真杂种；若检测的F1植株只显示白菜带型或只显示埃塞俄比亚芥带型，则该植株为假杂种。
待鉴定的植株为白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种自交后代植株时，若检测的远缘杂种自交后代植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株为白菜A03染色体和埃塞俄比亚芥 C03染色体整条或部分杂合；若检测的远缘杂种自交后代植株只显白菜带型，则该植株不含埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分；若检测的远缘杂种自交后代植株只显埃塞俄比亚芥带型，则该植株不含白菜A03染色体整条或部分。
待鉴定的植株为以白菜为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株含有埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分；若只显示白菜带型，则该植株不含埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分。
待鉴定的植株为以埃塞俄比亚芥为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株含有白菜A03染色体整条或部分；若只显示埃塞俄比亚芥带型，则该植株不含白菜A03染色体整条或部分。
PCR扩增的反应体系：10-50μL，其中包括：1×PCR含Mg2+ Buffer，0.5-100ng模板DNA，0.2mM dNTPs，0.5μM SEQ ID No.1primer，0.5μM SEQ ID No.2primer，1U Taq酶； PCR扩增的反应程序：94-95℃0.5-3min；94-95℃30s,55-60℃30S,72℃30S,35循环； 72℃5-10min。
检测PCR扩增产物的方法包括但不限于PAGE胶电泳检测，毛细管电泳检测，测序检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况的共显性分子标记和方法，该方法能快速、准确的鉴定出白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及其后代材料A03和C03部分同源(homeologous)染色体的重组和分离。该方法鉴定白菜和埃塞俄比亚芥远缘杂交及其回交后代，可以拓展白菜和埃塞俄比亚芥的遗传资源，转育新性状，丰富蔬菜类型，丰富人民的日常膳食营养。与细胞学方法相比，该方法具有快速、操作简单、对实验操作者技术要求低、不需要昂贵仪器、可用于大群体筛查等优点。与高通量测序和生物芯片方法相比，该方法具有简单快速和成本低廉的优点。与使用两套分子标记相比，该方法使用一套共显性分子标记既可以降低人力、物力成本又可以显著降低假阳性和假阴性。该方法在远缘杂种及后代材料中快速筛选和大规模群体初筛上具有使用价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种F1植株的鉴定结果之聚丙烯凝胶电泳图；泳道4是白菜，泳道5是埃塞俄比亚芥，泳道6是白菜×埃塞俄比亚芥F1杂种。A3是白菜A03染色体特征条带，C3是埃塞俄比亚芥C03染色体特征条带。
图2是实施例1的白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种F1植株及其亲本的表型对比图。
图3是实施例1的白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种F1植株及其亲本的流式细胞检测图。
图4是实施例2的白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种BC1F2植株的鉴定结果之聚丙烯凝胶电泳图；A3是白菜A03染色体特征条带，C3是埃塞俄比亚芥C03染色体特征条带。可知，3、10、14、27号植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，表明这些植株含有白菜A03和埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分；第1、2、4、5、6、7、8、9、11、12、13、15、16、 17、19、22、24、25、26号植株只显埃塞俄比亚芥带型，表明这些植株含有埃塞俄比亚芥 C03染色体但不含有白菜A03染色体整条或部分；第18、20、21、23、28号植株只显示白菜带型，表明这些植株含有白菜A03染色体但不含有埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分。
图5是实施例2高通量测序染色体覆盖图。
具体实施方式
下面对本发明的鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况的分子标记和方法进行具体说明。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况的分子标记和方法，鉴定方法包括以下步骤：
提取待检测植株及其亲本的基因组DNA；
合成引物：
C03B2-F:5’-CCTCCGCTAAGGTAAATCTCG-3’(SEQ ID No.1)；
C03B2-R:5’-GCCGGAAGAAGAGATCAGTTT-3’(SEQ ID No.2)。
PCR扩增。以待检测植物及其亲本DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增反应。反应体系为10-50μL，其中包括：1×PCR Buffer(含Mg2+ )，0.5-100ng模板DNA，0.2mM dNTPs，0.5μM primer C03B2-F，0.5μM primer C03B2-R，1U Taq酶。PCR反应条件：94- 95℃0.5-3min；94-95℃30s,57-60℃30S,72℃30S,35循环；72℃5-10min。
上述PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配置8％聚丙烯凝胶，180伏电泳1-2小时，至溴酚蓝跑出电泳槽底部结束电泳。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，取出上述聚丙烯酰胺凝胶，银染显色，
条带统计和基因型分析：若F1植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株为真杂种；若检测的F1植株只显示白菜带型或只显示埃塞俄比亚芥带型，则该植株为假杂种。若无条带，则实验失败。若检测的远缘杂种自交后代植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株为白菜A03染色体和埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分杂合；若检测的远缘杂种自交后代植株只显白菜带型，则该植株不含埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分；若检测的远缘杂种自交后代植株只显埃塞俄比亚芥带型，则该植株不含白菜A03染色体整条或部分。在检测以白菜为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株含有埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分；若只显示白菜带型，则该植株不含埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分。在检测以埃塞俄比亚芥为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株含有白菜A03染色体整条或部分；若只显示埃塞俄比亚芥带型，则该植株不含白菜A03染色体整条或部分。
除聚丙烯酰胺凝胶电泳法外，PCR扩增产物可通过毛细管电泳检测或高通量测序检测。基因型的判断方法相同。
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1本实施例鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种F1植株
1.1提取待检测F1植株及其亲本的基因组DNA。
1.2合成引物：
C03B2-F:5’-CCTCCGCTAAGGTAAATCTCG-3’(SEQ ID No.1)；
C03B2-R:5’-GCCGGAAGAAGAGATCAGTTT-3’(SEQ ID No.2)。
1.3 PCR扩增。以待检测F1植物及其亲本DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增反应。反应体系为10μL，其中包括：1×PCR Buffer(含Mg2+ )，1ng模板DNA，0.2mM dNTPs， 0.5μM primer C03B2-F，0.5μM primer C03B2-R，1U Taq酶。PCR反应条件：94℃3min； 94℃30s,58℃30S,72℃30S,35循环；72℃5min。
1.4上述PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配置8％聚丙烯凝胶，180伏电泳1.5小时，至溴酚蓝跑出电泳槽底部结束电泳。
1.5取出上述聚丙烯酰胺凝胶，银染显色。
1.6条带统计和基因型分析：共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，见图1，该F1植株为真杂种。
1.7表型鉴定
该F1植株及亲本的表型如图2所示，从图中看出，F1植株的表型与亲本存在明显差异，证明F1植株为真杂种。
1.8流式细胞鉴定(图3)表明，该植株细胞核染色质含量介于双亲的均值，证明该F1植株是真杂种。
由此可见，本发明的分子标记能鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种F1植株。
实施例2本实施例鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种回交再自交后代(BC1F2)材料
1.1提取待检测植株及其亲本的基因组DNA。
1.2合成引物：
C03B2-F:5’-CCTCCGCTAAGGTAAATCTCG-3’(SEQ ID No.1)；
C03B2-R:5’-GCCGGAAGAAGAGATCAGTTT-3’(SEQ ID No.2)。
1.3 PCR扩增。以待检测植物及其亲本DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增反应。反应体系为15μL，其中包括：1×PCR Buffer(含Mg2+ )，1ng模板DNA，0.2mM dNTPs， 0.5μMprimer C03B2-F，0.5μM primer C03B2-R，1U Taq酶。PCR反应条件：95℃3min； 95℃30s,58℃30S,72℃30S,35循环；72℃10min。
1.4上述PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配置8％聚丙烯凝胶，180伏电泳1-2小时，至溴酚蓝跑出电泳槽底部结束电泳。
1.5取出上述聚丙烯酰胺凝胶，银染显色，见图4。
1.6条带统计和基因型分析：检测以埃塞俄比亚芥为回交亲本的回交BC1再自交的后代 (BC1F2)，所检测的第3、10、14、27号植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，表明这些植株含有白菜A03和埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分；所检测的第1、2、4、5、6、 7、8、9、11、12、13、15、16、17、19、22、24、25、26号植株只显埃塞俄比亚芥带型，表明这些植株含有埃塞俄比亚芥C03染色体但不含有白菜A03染色体整条或部分；所检测的第18、20、21、23、28号植株只显示白菜带型，表明这些植株含有白菜A03染色体但不含有埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分。
1.7测序鉴定
对分子标记鉴定共显性的第14号单株进行全基因组illumina测序，测序深度10×；将 reads比对到A,B,C参考基因组，根据覆盖度判断目标染色体是否存在于该植株中。
结果如图5所示，显示A03，C03染色体都有被密集而均匀的覆盖，表明这2条染色体存在于被检测植株中，证明分子标记鉴定结果可靠。B02染色体覆盖度低，作为阴性对照，表明该染色体不在被检测植株中。
综上所述，本发明实施例提供的鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及其后代材料的分子标记和鉴定方法，通过一对共显性SSR分子标记，可以鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂交真杂种，也可用于鉴定远缘杂种回交及自交后代的白菜A03染色体及埃塞俄比亚芥C03染色体附加系或渐渗系。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 鉴定白菜与埃塞俄比亚芥种间杂种及后代材料A03和C03染色体分离情况的分子标记
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctccgctaa ggtaaatctc g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccggaagaa gagatcagtt t 21
Claims (7)
1.鉴定白菜和埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况的SSR分子标记的引物C03B2，引物C03B2的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，引物C03B2的后向引物序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的引物C03B2在鉴定白菜和埃塞俄比亚芥种间杂种及追踪其后代材料A03和C03染色体分离情况上的应用，其特征在于，用引物C03B2作为PCR扩增的引物，以待鉴定的植株及白菜与埃塞俄比亚芥亲本DNA为模板进行PCR扩增，检测PCR扩增产物进行条带统计和基因型分析，白菜带型为271bp的扩增片段，埃塞俄比亚芥带型为193bp的扩增片段。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，条带统计和基因型分析的方法为：待鉴定的植株为白菜与埃塞俄比亚芥杂交的F1植株时，若F1植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株为真杂种；若检测的F1植株只显示白菜带型或只显示埃塞俄比亚芥带型，则该植株为假杂种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，条带统计和基因型分析的方法为：待鉴定的植株为白菜与埃塞俄比亚芥远缘杂种自交后代植株时，若检测的远缘杂种自交后代植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株为白菜A03染色体和埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分杂合；若检测的远缘杂种自交后代植株只显白菜带型，则该植株不含埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分；若检测的远缘杂种自交后代植株只显埃塞俄比亚芥带型，则该植株不含白菜A03染色体整条或部分。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，条带统计和基因型分析的方法为：待鉴定的植株为以白菜为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株含有埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分；若只显示白菜带型，则该植株不含埃塞俄比亚芥C03染色体整条或部分。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，条带统计和基因型分析的方法为：待鉴定的植株为以埃塞俄比亚芥为回交亲本的回交后代时，若检测的植株共显白菜带型和埃塞俄比亚芥带型，则该植株含有白菜A03染色体整条或部分；若只显示埃塞俄比亚芥带型，则该植株不含白菜A03染色体整条或部分。
7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于，PCR扩增的反应体系：10-50μL，其中包括：1×PCR含Mg2+ Buffer，0.5-100 ng 模板DNA，0.2 mM dNTPs，0.5 μM SEQ IDNo.1primer，0.5 μM SEQ ID No.2 primer，1U Taq酶；PCR扩增的反应程序：94-95℃ 0.5-3min；94-95℃ 30s, 55-60℃ 30S, 72℃ 30S, 35循环; 72 ℃ 5-10 min。
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