KR100608152B1 - 고체 지지체 상에 핵산을 고정시키기 위한 기판 - Google Patents

고체 지지체 상에 핵산을 고정시키기 위한 기판 Download PDF

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Abstract

고체 지지체 상에 핵산을 고정시키는 기판 및 방법이 개시되어 있다. 활성화된 에스테르를 함유하는 다중음이온은 고체 지지체에 공유적으로 부착된다. 하나의 바람직한 구체예에서, 다중음이온은 폴리아크릴산이다.
핵산고정, 기판

Description

고체 지지체 상에 핵산을 고정시키기 위한 기판{SUBSTRATES FOR NUCLEIC ACID IMMOBILIZATION ONTO SOLID SUPPORTS}
본 발명은 DNA 칩 생산에 사용되는 핵산 고정용 기판에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 기판에 핵산을 고정시키는 방법 및 그 기판 상에서 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 유기체의 게놈 구조는 게놈 분석 기술에 따라 밝혀졌다. 이와 병행하여, 게놈 기능을 분석하는 기술이 개발되고 있다. 이러한 상황에서, DNA 칩(DNA 마이크로어레이)은 매력적인 기술이다. DNA 칩은 유리 슬라이드와 같은 고체 기판의 표면 상에 고정된 많은 서로 다른 유전자 또는 단편(DNA 단편)을 갖는 마이크로어레이이다. DNA 칩(DNA 마이크로어레이)은 유전자의 발현, 돌연변이, 및 다형성의 분석에 유용하다.
기판에 표적 핵산을 고정시키는 방법은 DNA 칩의 생산에 필요한 핵심 기술이다. DNA 칩의 생산에 사용되는 두 개의 주요한 방법이 있다. 한가지 방법은 예를 들면 Science, Vol. 251, 767-773(1991) 및 Nucleic Acid Research, Vol. 20, 1679-1684(1992)에 기술된 바와 같이, 팁 상에 기판에 공유적으로 결합된 링커인 핵산의 화학적 합성을 수반한다. 이 방법에서, DNA는 올리고누클레오타이드로 한 정되고 반응을 제어하기 위해 특별한 장치가 필요하다. 그러므로, 이것은 일반적인 방법이 아니다.
또다른 방법은 예를 들면, Science, Vol. 270, 467-470(1995) 및 Nucleic Acid Research, Vol. 22, 5456-5465(1994)에 기술된 바와 같이, 예비-합성된 DNA 또는 PCR(중합효소 연쇄 반응)에 의해 제조된 DNA(PCR 증폭 생성물)가 기판에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 방법이다.
비-공유적 고정 방법에서, DNA(또는 RNA)는 변성 과정과 함께 또는 변성과정 없이 SSC(염화나트륨/소듐 시트레이트)와 같은 염 용액 내에 용해된다. DNA는 폴리라이신, 폴리에틸렌이민과 같은 염기성 다중양이온으로 피복되거나, 또는 아민-함유 실란 화합물(예를 들면 3-아미노프로필트리에톡시실란)로 실란화된 유리 슬라이드 상에 스포팅되고, UV-조사에 의해 고정된다. 모든 형태의 DNA(또는 RNA)는 이 방법으로 고정될 수 있어야 한다.
그러나, 실제로는 올리고누클레오타이드 및 짧은 길이의 DNA(0.3Kb 미만)는 이 방법을 사용하여 고정시키기 어렵다. 긴 길이 DNA(0.3 Kb 이상)가 비-공유적으로 부착된 경우조차도, 세척 및 혼성화의 공정은 DNA를 기판으로부터 제거시킬 수 있고, 이는 표적 핵산의 검출가능성을 감소시킬 수 있다.
비-공유적 고정 방법의 또다른 한계는 기판 표면 상의 잔기 염기의 반응기(양이온성) 및 프로브 핵산(음이온성)의 비특이적 결합에 기인한 증가된 배경 신호이다. 잔기 아미노 그룹은 아세틸화(숙신산 무수물과 같은 무수물을 사용하여 아민을 카복시산으로 전환시킴)에 의해 차단될 수 있다. 그러나, 전환이 언제나 완 벽한 것은 아니다.
표적 핵산의 고감도 검출에 응용될 수 있고, 짧은 길이 또는 긴 길이 핵산, 외가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, DNA, 및 RNA를 포함하는 많은 형태의 핵산의 고정에 적합한 기판의 개발이 요망된다.
발명의 요약
본 발명의 주요 목적은: (1) 고효율로 핵산을 고정시킬 수 있는 핵산 고정용 신규한 기판의 제조; (2) 핵산으로 고정된(즉 DNA 마이크로어레이에 의해 제조된) 기판; (3) 고정 핵산의 제조 방법; 및 (4) 핵산으로 고정된 기판을 사용하여 핵산을 검출하는 방법이다.
요약하면 본 발명은 주로 핵산 고정용 기판; 특히 핵산 부착용 다중음이온 기초의 표면에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 다중음이온은 폴리아크릴산이지만, 어떠한 다중음이온도 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 공유 결합을 통해 기판에 핵산을 고정시키는 것을 포함한다. 바람직한 방법은 카복시산 관능성을 활성화된 에스테르로 변환시키는 것을 포함한다. 활성화된 에스테르는 이후 아민 개질된 핵산과 반응시킨다.
첫 번째 및 두 번째 구체예에서, 기판은 비-다공성 표면이다. 바람직한 형태는 유리이다.
구체예의 세 번째 양상은 핵산으로 고정된 기판; 즉 핵산이 다중음이온의 활성화된 에스테르를 통해 기판에 공유적으로 결합된, 핵산으로 고정된 기판에 관한 것이다. 세 번째 구체예에서, 다중음이온은 바람직한 형태로서 폴리아크릴산이다. 바람직한 활성화된 에스테르는 다중음이온 및 펜타플루오로페놀로부터 카보디이미드 커플링을 통해 제조된 펜타플루오로 페놀 에스테르이다.
네 번째 구체예에서, 기판에 대해 핵산을 고정시키기 위한 방법, 즉 다중음이온의 활성화된 에스테르 유도체로 피복된 기판에 대한 핵산 고정 방법에 관한 것이다. 네 번째 구체예에서, 다중음이온은 폴리아크릴산이고 기판은 바람직한 형태로서 비-다공성이다; 유리가 가장 좋은 비-다공성 기판이다.
네 번째 구체예에서, 핵산은 활성화된 에스테르 유도체에 대해 반응성을 갖는 관능기로 개질되는데, 바람직한 형태에서 핵산은 아미노기로 개질된다.
다섯 번째 구체예는 표본(샘플) 중의 표적 핵산에 대한 검출 방법에 관한 것으로서 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
a) 핵산 고정용 기판이 다중음이온의 활성화된 에스테르 유도체인 공정. 다중음이온은 유리 슬라이드의 표면에 미리 공유적으로 부착시킨다.
b) 상기에서 언급된 활성화된 에스테르 유도체, 및 에스테르 유도체에 반응성을 갖는 관능기로 개질된 핵산 사이의 반응 공정.
c) 기판에 고정된 핵산(표적 핵산) 및 상보적 핵산(프로브 핵산) 사이의 혼성화 공정.
d) 혼성화된 핵산에 대한 검출 공정.
여섯 번째 구체예는 표본 내의 핵산에 대한 검출 방법에 관한 것으로서 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다:
a) 기판의 활성화된 에스테르 유도체 및, 활성화된 에스테르 유도체에 대해 반응성을 갖는 관능기로 개질된 핵산 사이의 반응.
b) 기판에 고정된 핵산 및 상보적 핵산 사이의 혼성화 공정.
c) 혼성화된 핵산에 대한 검출 공정.
다중음이온은 두 개 또는 그 이상의 음 전하를 함유한 중합체이다.
핵산이라는 용어는 올리고누클레오타이드 메신저 RNA, 안티-센스, 플라스미드 DNA, 플라스미드 DNA의 일부 또는 바이러스 선형 DNA(바이러스 DNA)로부터 유래한 유전 물질, 또는 염색체 DNA 형태의 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한다.
습도고정기는 고정된 습도 범위를 유지할 수 있는 어떤 챔버이다.
본 발명에서, 핵산 고정용 기판은 DNA 칩 또는 바이오센서에 적용할 수 있으면 제한되지 않는다. 비-다공성 및 매끄러운 표면을 갖는 고체 지지체, 예를 들면 유리 슬라이드 또는 실리카 비드와 같은 물질로 구성된 기판이 바람직한 형태에서 사용된다.
한 구체예에서, 기판은 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 처리되어다중음이온과 반응할 수 있는 관능기(이 경우 아미노기)를 기판의 표면에 제공한다. 유리 기판의 표면에 관능성을 도입할 수 있는 어떠한 실란도 본 발명에 사용될 수 있다. 다중음이온은 이후 카보디이미드 커플링 반응을 통해 기판의 실란화된 표면에 공유적으로 부착될 수 있다.
다중음이온은 카복시기, 포스페이트기, 설페이트기 등과 같이 프로브 핵산과 의 비-특이적 결합(정전기적)을 방지하는 효과를 갖는 산성 관능기를 함유한다. 다중음이온은 기판의 표면에 공유적으로 부착된다; 폴리아크릴산, 폴리글루타민산, 폴리아스파트산, 및 폴리포스페이트가 바람직한 형태이다. 이들 다중음이온은 카보디이미드 화학 반응(또는 기타 활성화된 에스테르 화학반응)을 통해 기판의 실란화된 표면에 부착된다.
표적 핵산을 다중음이온 피복된 기판에 고정시키기 위해, 다중음이온의 산성 관능기를 활성화시키는 것이 필요하다(활성화된 에스테르를 형성함). 예를 들면, 펜타플루오로페놀, N-히드록시숙신이미드 및 이미다졸 에스테르는 카복시기 및 포스페이트기에 각각 사용가능한 활성화된 에스테르 유도체이다.
기판에 고정되는 핵산에 대한 특별한 제한은 없다. 모든 활성 올리고누클레이타이드, 폴리누클레오타이드, 및 그 유도체가 사용될 수 있다. 외가닥 및 이중 가닥 형태의 핵산(DNA 또는 RNA)이 사용될 수 있다. 유도체는 기판 표면에 대한 고정을 가능하게 하는 개질기를 갖는다면 제한되지 않는다. DNA 5'말단에서 아미노기, 티올기, 포스페이트기, 및 알데하이드기로 개질된 유도체가 그 예이다. 또한, 5'말단에서 스페이서로서 알킬아민과 같은 크로스 링커 또는 링커로 개질된 유도체가 또한 사용가능하다. 본 발명에서, 5'말단에서의 개질은 올리고누클레오타이드와 같은 짧은 핵산의 고정에 특히 효과적이다. 다양한 관능기 또는 신호기를 도입하도록 공유적으로 개질된 어떠한 핵산도 또한 사용될 수 있다. Mirus'Label IT 시약이 핵산을 개질시키는데 사용될 수 있다.
앞에서 언급된 개질된 핵산은 20mM MOPS(3-모르폴리노 프로판 설페이트) 버퍼(pH 7.5) 또는 50 mM 카보네이트 버퍼(pH 9.5)와 같은 적절한 고정용 용액 내에 0.01-2.0 mg/ml, 바람직하게는 0.1-1.0mg/ml의 농도에서 용해된다. 변성 공정과 함께 또는 없이, 소기의 핵산은 표면 처리에 의해 활성화된 에스테르 관능기를 갖는 기판에, 접촉을 통해 고정될 수 있다. 즉, 마이크로피펫 또는 DNA 칩 제조 장치(DNA 어레이어)를 사용하여, 상기에서 언급된 DNA 용액의 일정한 양이 상술된 표면 처리에 의해 활성화된 에스테르 관능기를 갖는 기판 표면에 스포팅된다. 30-60분 동안 습도고정기 내에 보존시키고, 2% SDS(소듐 도데실 설페이트) 및 증류수 각각으로 세척시켰다. 더나아가, 필요한 경우, 핵산으로 고정된 기판은 실온에서 5분 동안0.3 M MaOH 내에 담그거나, 또는 끓는 물 내에 2분 동안 담궈 핵산을 변성시키고, 증류수 및 무수 에탄올로 세척시키고, 건조시킨다. 이 처리에 의해, 활성화된 에스테르 그룹은 핵산과 반응하지 않고, 카복시산 부분으로 다시 가수분해된다(즉 음 전하를 띰). 산 그룹은 프로브 핵산 및 기판 사이의 비특이적 정전기적 결합을 방해한다. 일반적으로, 폴리라이신 슬라이드에 대해 필요한 숙산산 무수물 블로킹 공정은 생략될 수 있다. 이들 산 그룹은 또한 배경 신호를 낮춘다.
기판에 고정되는 핵산의 양은 형광적으로-표지된 핵산을 사용하여 측정될 수 있다. 표지된 핵산은 공유적으로 고정되고 잔류 형광 신호가 검출될 수 있다. 본 발명에서 고정 방법은 유전자 내의 발현 수준, 돌연변이, 다형성 등의 고감도 검출을 할 수 있는데, 왜냐하면 이 방법은 고효율의 고정을 제공하기 때문이다. 더나아가, 고정된 핵산은 혼성화 조건 하에서 떨어지지 않는다(왜냐하면 핵산이 기판에 공유적으로 부착되기 때문이다).
유전자 혼성화 기술은 기판(DNA 칩과 같이)에 공유적으로 부착된 표적 핵산의 검출에 사용된다. 프로브 핵산은 형광표지염료(fluorophore) 또는 기타 신호 그룹으로 표지되고 알칼리 또는 열에 의해 변성된다. 표지된 프로브 핵산은 혼성화 용액에 첨가된다. 5 μl 내지 20μl의 혼성화 용액을 어레이의 표면에 점적하고, 공기 방울이 커버 유리 밑에 생기지 않도록 주의하면서 커버 유리로 덮었다. 이것을 적절한 온도 및 시간에서 습도고정기 내에서 보존시켰다. 커버 유리를 제거시키고, 슬라이드를 철저히 세척하고, 습기를 제거하여 최종적으로 형광 신호를 형광 스캐너(형광 판독기)에 의해 검출한다.
본 발명에서 특이적인 다중음이온 피복된 유리 슬라이드는 효율적으로 핵산을 고정할 수 있다. 공유적으로 부착된 다중음이온에 의해 기판의 표면에 형성된 3차원 매트릭스는 증가된 수의 핵산이 고정되는 것을 허용하다.
본 발명에서 기판 및 고정된 핵산은 핵산의 고감도 검출 신호 및 낮은 배경 신호 검출을 제공한다. 표적 핵산과 반응하지 않는 다중음이온의 활성화된 에스테르 유도체는 활성화된 에스테르가 가수분해될 때 다중음이온으로 되돌아가므로, 음 전하를 띤 프로브 핵산이 기판에 비특이적 결합하는 것이 저해된다.
본 발명을 사용하여, 핵산 검출의 향상된 감도가 다음의 결과로서 얻어진다: (1) 표적 핵산(올리고누클레오티드를 포함)이 고감도로 기판에 부착되고, (2) 블로킹 공정이 고정 후에 생략될 수 있고, (3) 표적 핵산 및 기판 사이의 비특이적 결합이 최소로 유지되고, (4) 다중음이온 처리의 3차원 효과가 고효율 혼성화를 허용함.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 상세히 설명된다. 그러나, 본 발명은 이들 상세한 실시예에 제한되지 않는다.
실시예(예시) #1
(1) 서열 목록의 서열 #1 및 #2 각각에서 도시된 두 종류의 파지 DNA 단편(1.0 Kb 및 0.3 Kb, 각각, 후자는 전자의 일부임)이 표준 DNA로서 PCR에 의해 제조되었다.
PCR은 파지 DNA를 주형으로서 사용하여 다음의 프라이머의 두가지 조합을 가지고 수행하였다; 서열 목록에서, 서열 #3 및 #4 각각에 도시된 Primer S 및 Primer A1000의 조합, Primer S 및 서열 #5로서의 Primer A300의 조합. PCR 후, Qiaquick PCR 정제 키트 96(Qiagen)를 사용하여, 사용 설명서에 따라서, 각 증폭된 단편을 정제시켰다. 칼럼으로부터 DNA를 용리시키기 위해, 증류수가 사용되었다. DNA는 동결건조에 의해 농축시켰다.
각 DNA 단편을 20mM MOPS 버퍼(pH 7.5) 내에 용해시키고, 어레이는 표면에 아미노기를 가진 시판되는 유리 슬라이드 상에 GMS 417 어레이어 (Genetic MicroSystems)에 의해 만들어졌다. 사용된 유리 슬라이드는 폴리-L-라이신 피복된 POLY-PREP-SLIDES(Sigma: PLL피복된 슬라이드 유리로 축약됨) 및 MAS, 아미노 알킬 실란군, 피복된 슬라이드(Matsunami Glass Ind.: MAS 피복된 슬라이드 유리로 축약됨)이고, 이들 슬라이드는 DNA 칩의 제조용으로 널리 사용된다. 스폿은 각각 150μm, 375μm의 크기 및 간격으로 이루어졌다. 동일 DNA의 다섯 개의 스폿이 어레 이되었다.
DNA 스포팅 후, 각 슬라이드는 37℃ 및 90% 습도로 조절된 인큐베이터 내에서 1시간 동안 보존시키고, 이후, 60 mJ/cm2에 의해 UV 가교 결합시켰다. 슬라이드는 0.2% SDS로 한번 세척시키고 증류수로 두번 세척시키고, 저속(약 1,000 rpm)에서 원심분리에 의해 수분을 제거시키고, 이후 공기 건조시켰다. 미리 처리시킨 상기에서 언급된 슬라이드를 증류수로 철저히 세척시키고, 수욕조에서 3분 동안 끓이고, 얼음 냉각된 에탄올 내에 노출시켜 DNA를 변성시켰다. 에탄올을 저속 원심분리에 의해 제거시켰다. 이후, 슬라이드를 공기 건조시키고 데시케이터 내에 저장시켰다.
슬라이드들 중 일부를 숙신산 무수물로 처리하여 기판 표면 상의 자유 아미노산을 숙신화에 의해 블로킹시켰다. 블로킹 용액은 89.5 ml의 N-메틸-2-피롤리돈 내의 분해된 1.5g 숙신산 무수물을, 9 ml의 1M 보레이트 버퍼(pH 8.0)와 함께 혼합시켜 제조되었고, 상기 슬라이드는 블로킹 용액에 실온에서 20분간 담갔다. 처리된 슬라이드를 증류수로 철저히 세척시키고, 3분 동안 수욕조 내에서 끓이고 얼음 냉각된 에탄올에 노출시켜 DNA를 변성시켰다. 에탄올은 저속 원심분리에 의해 제거시켰다. 이후, 슬라이드는 공기 건조시키고 데시케이터 내에 저장시켰다.
(2) 시판되는 아미노 알킬 실란 유리 슬라이드(In situ PCR 유리 슬라이드, PE Biosystems; AAS 슬라이드 유리로서 축약됨)를 2.5% 글루타르알데히드 용액에 1시간 동안 담그고, 증류수로 세 번 세척시키고, 이후 공기 건조시켜 알데히드기로 피복된 슬라이드를 얻었다.
5'말단에서 사슬 길이 6의 알킬 아미노 링커(PE Biosystems)에 결합된, 서열 목록에서 서열 #6로 도시된 24 mer 올리고누클레이티드(NH2-F Oligo로 축약됨)는 DNA 합성기 상에서 제조되었다. 이후, 20mM MOPS 버퍼(pH7.5) 내에 용해시켜 최종 농도를 10mM로 맞추었다. 이 합성된 DNA를 글루타르알데히드 처리된 슬라이드에 실시예 예시 #1-(1)에서 언급된 것과 동일한 방법으로 GMS 417 어레이어를 사용하여 스포팅시켰다. 이후, 슬라이드 유리를 0.2% SDS 로 2분동안 세척시키고, 증류수로 연속적으로 세척시켰다. 기판 상의 알데히드기와 DNA 상의 아미노기 사이의 공유 결합에 의해 형성되는 Schiff-염기를 안정한 아민으로 환원시켜, 슬라이드를 PBS-100% 에탄올을 함유한 0.25% 소듐 보로하이드라이드(Wako Pure Chemical Industries)(부피비 3:1) 내에 5분 동안 담그고, 공기 건조시켰다.
(3) 다중음이온을 고체 지지체에 공유적으로 부착시키기
유리 현미경 슬라이드를 초음파에 의해 2M 질산, 2M 수산화 나트륨, 순수한 물, 및 아세톤 내에서 각각 10분 동안 세정시켰다. 세정된 슬라이드는 95% 에탄올 내에 용해된 4% 3-아미노프로필트리에톡시실란 내에서 2분 동안 아미노실란화되었고, 이후 100℃에서 10분 동안 인큐베이션시켜 그 표면을 아미노프로필실레이트화시켰다. 폴리아크릴산을 디메틸포름아미드 내에 용해시켜 최종 농도 5mg/ml가 되게 하고, 또한 1-[(3-디메틸아미노)프로필-3-에틸카보디미드 염산(EDC로 축약됨)을 최종 농도 4.0 g/100ml에서 부가시켰다. 아미노실란화된 슬라이드를 이 용액 내에 밤새 담그고, 디메틸포름아미드, 메탄올, 순수한 물, 및 아세톤으로 헹궜다. 폴리아크릴산으로 피복된 슬라이드를 진공 하에서 건조시켰다.
(4) 다중음이온 피복된 고체 지지체의 활성화
폴리아크릴산 피복된 슬라이드를 다음의 방법으로 활성화된 에스테르 피복된 슬라이드로 전환시켰다. 1.8 g 펜타플루오로페놀, 2.0 g EDC, 및 13 mg 디메틸아미노피리딘을 50 ml 디메틸포름아미드 내에 용해시켰다. 실시예 예시 #1-(3) 에서 제조된 폴리아크릴산 피복된 유리 슬라이드를 이 용액 내에 5시간 동안 담그고, 디메틸포름아미드 및 메틸렌 클로라이드로 헹구고, 진공 하에서 건조시키고, 최종적으로 데시케이터 내에 저장시켰다.
실시예 (예시) #2
(1) 두가지 크기의 람다 파지 DNA 단편(1.0Kb 및 0.3Kb)을 실시예 #1-(1)에서와 동일한 방법에 의해 제조시켰다. 이 합성법에서, 말단에서 아미노기를 갖는 DNA 단편을 5'말단에서 사슬 길이 6의 알킬 아미노 링커(PE Biosystems)와 결합된 아민 함유 Primer S를 사용하여 증폭시켰다.
정제 후, 각 아민-함유 DNA 단편을 20 mM MOPS 버퍼(pH 7.5) 내에 용해시켜 최종 농도 0.5 mg/ml가 되게 하고, 이후 실시예#1-(4) 의 방법에 의해 활성화된, 활성화된 에스테르로 피복된 유리 슬라이드 상에 3벌씩 스포팅시켰다. 대조구로서, PLL 피복된 슬라이드 유리 상에서 동일한 어레이가 제조되었다.
DNA로 스포팅된, 활성화된 에스테르 피복된 유리 슬라이드를 37℃ 및 90% 습도로 제어된 인큐베이터(Tokyo Rikakikai: Eyela 모델 KC-1000) 내에 30분 동안 보존시키고, 이후, 0.2% SDS 내에서 실온에서 인큐베이션시켜 과량의 염을 제거하고 증류수로 세척시켰다. 이후, 슬라이드를 0.3 N NaOH 내에 5분 동안 담궈 DNA를 변 성시키고, 증류수로 철저히 세척시키고, 약 1,000rpm에서 원심분리에 의해 건조시키고, 데시케이터 내에 저장시켰다.
(2) 혼성화
각 유리 슬라이드 상에 제조된 핵산 어레이를 형광표지염료로 표지된 핵산 프로브로 혼성화시키고 관찰하였다. 각 DNA 어레이를 50% 포름아미드, 0.2% SDS, 5x Denhardt'용액, 0.1 mg/ml 연어 정자 DNA, 및 6x SSC로 구성된 예비 혼성 버퍼 내에서 42℃에서 1시간 동안 예비-혼성화시켰다.
실시예 #1-(1)에서 제조된 1.0 Kb 람다 파지 DNA 단편을 Label IT™Cy5™ Labeling Kit(Mirus)를 사용하여 Cy5™로, 사용 설명서에 따라서 표지시켰다. 표지된 핵산을 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 이 Cy5™ 표지된 핵산 프로브는 예비-혼성화 버퍼로 희석시켜 20, 2 및 0.2ng/ml의 최종농도로 하고, 95℃에서 2분 동안 가열시키고, 실온까지 냉각시켰다. 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거시켰다. 약 5 ul의 혼성화 용액을 핵산 어레이 상에 점적하였다. 공기 방울이 형성되지 않도록 주의하면서 유리 커버슬립으로 겹치고, 42℃, 습도고정기 내에서 20 시간 동안 인큐베이션시켰다. 커버 유리는 2x SSC 용액 내에서 실온에서 제거시키고, 2x SSC 함유 0.2% SDS로 65℃에서 5분 동안 두번 및 55℃에서 30분 동안 세번 세척시켰다. 이후, 실온에서 10분 동안 0.05x SSC로 세척시키고, 약 1,000 rpm에서 원심분리에 의해 수분을 제거시키고, 공기-건조시켰다.
혼성화 후, 핵산 어레이를 방출 파장 635 nm 및 여기(excitation) 파장 660 nm로 GMS 418 어레이 스캐너(GMS)를 사용하여 판독하였다. 검출된 신호 강도는 이 미지 분석 소프트웨어 ImaGene(Biodiscovery)에 의해 분석하였다. 얻어진 결과는 표 1에 요약되었다.
표 1
프로브 고정된 DNA 단편 DNA 고정용 기판
농도 (mg/ml) 크기(bp) 활성화된 에스테르 피복된 슬라이드 유리 PLL 피복된 슬라이드 유리
0.2 1000 1484 889
300 988 856
2 1000 6640 2702
300 2635 1077
20 1000 27383 14310
300 7099 3824
표 1에 나타낸 바와 같이, 모든 프로브 농도에서, 활성화된 에스테르 피복된 유리 슬라이드 상의 각각의 크기의 고정된 DNA로부터의 신호가 PLL 피복된 유리 슬라이드 상의 것보다 높았다. 즉, 표적 PCR 증폭된 핵산 단편의 검출에서, 활성화된 에스테르 피복된 유리 슬라이드를 사용하여 제조된 DNA 칩이 통상의(PLL) 피복된 유리 슬라이드 상에서 제조된 것보다 더 높은 신호를 제공한다.
실시예(예) #3
(1) 올리고누클레오티드-DNA 어레이로 DNA 칩의 축조
24 누클레이티드 길이의 두 개의 올리고누클레오티드를 DNA 제조기 상에서 제조하였다; 서열 목록에서 서열 #6로 표시된 올리고누클레오티드, 하나의 올리고누클레오티드는 사슬 길이 6의 알킬 아미노 링커(PE Biosystems)로써 5' 말단에서 개질되고(NH2-F Oligo로 축약됨), 다른 올리고누클레오티드는 5' 말단에서 히드록시기를 함유하도록 개질된다(OH-F Oligo로 축약됨). 24 누클레이티드 길이의 두개의 다른 올리고누클레오티드가 또한 합성되었다; 하나의 올리고누클레오티드는 5'말단에서 Cy3™과 함께, 서열 #7에 도시된 첫번째 올리고누클레오티드에 대해 상보적인 서열을 갖고(Cy3-R Oligo); 다른 올리고누클레오티드는 5'말단에서 알킬 아미노 링커(NH2-N Oligo)와 함께 서열 #14에 도시된 비관련 서열을 갖는다(NH2-N Oligo).
OH-F Oligo, NH2-F Oligo, 및 NH2-N Oligo는 20 mM MOPS 버퍼(pH7.5) 내에 최종 농도 5, 50, 및 500μm에서 용해되었고, 이후 실시예#1-(4)의 방법에 의해 활성화된 에스테르로 피복된 유리 슬라이드 상에 어레이시켰다. 이 때, 각 DNA의 7개의 스폿을 어레이시켰다. 스포팅 후, 슬라이드를 실시예 #2에서 기술된 바와 같이 건조시키고, 최종적으로 올리고누클레오티드 칩으로서 처리시켰다. 대조구로서, 동일한 올리고누클레오티드 어레이를 실시예#1-(2)에서 기술된 바와 같은 글루타르알데히드 상에서 제조시켰다.
(2) 올리고누클레오티드 칩의 혼성화
각 슬라이드 상에 제조된 올리고누클레오티드 칩은 프로브로서 별도로 제조된 Cy3-R Oligo와 함께 혼성화시켜 결과적인 형광 신호가 관찰되었다. 간단히, 1 mM Cy3-R Oligo, 0.2% SDS, 5x Denhardt'용액, 0.1 mg/ml 연어 정자 DNA, 및 6x SSC로 구성된 약 5 ul의 혼성화 용액을 올리고누클레오티드 어레이에 부가시켰다. 이것을 공기 방울이 형성되지 않도록 주의하면서 유리 커버슬립과 겹치고, 42℃, 습도고정기 내에서 20시간 동안 인큐베이션시켰다. 커버 유리는 2x SSC 용액 내에서 실온에서 제거시키고, 2x SSC 내에서 실온에서 두번 세척시켰다. 이후, 약 1,000 rpm에서 원심분리에 의해 수분을 제거시키고, 공기-건조시켰다. 혼성화 후, 올리고-DNA 칩에 대한 총 형광을 방출 파장 635 nm 및 여기(excitation) 파장 660 nm로 GMS 418 어레이 스캐너(GMS)를 사용하여 측정하였다. 검출된 신호 강도는 이미지 분석 소프트웨어 ImaGene에 의해 분석하였다. 얻어진 결과는 표 2에 요약되었다.
표 2
올리고누클레이티드 스포팅 용액의 농도 (μM) 올리고-DNA 활성화된 에스테르 피복된 슬라이드 유리 글루타르알데히드 처리된 슬라이드 유리
5 OH-F Oligo 19.8 0.0
NH2-F Oligo 5516.7 0.9
NH2-N Oligo 0.0 0.0
50 OH-F Oligo 2067.0 0.0
NH2-F Oligo 12104.1 0.0
NH2-N Oligo 0.0 0.0
500 OH-F Oligo 4385.8 1113.5
NH2-F Oligo 14828.7 201.9
NH2-N Oligo 0.0 8.5
표 2에 나타낸 바와 같이, 활성화된 에스테르로 피복된 슬라이드 유리 상에서, 5'말단에서 아미노기를 갖는 올리고누클레오티드의 스폿은 아미노기가 없는 것보다 더 강한 신호를 나타내었다. 이것은 슬라이드 유리 상의 활성화된 에스테르기가 올리고누클레오티드의 아미노기와 반응함을 나타낸다. 모든 올리고누클레오티드에서, 활성화된 에스테르로 피복된 유리 슬라이드 상의 스폿으로부터의 신호는 글루타르알데히드로 처리된 유리 슬라이드 상의 것보다 더 높았다.
실시예(예시) #4
폴리아크릴산의 3차원 효과
서로 다른 길이의 형광 표지된 핵산이 스포팅되고, 핵산 어레이로부터의 혼성화 신호가 고정된 핵산 길이 당 신호로서 계산된다. 인간 트렌스페린 수용체(TFR로 축약됨)의 cDNA 단편이 다음과 같은 방법에 의해 제조되었다. 인간 세포 라인 K562(Dainippon Pharmaceutical)로부터의 mRNA 추출 및 TFR의 cDNA의 제조가 통상의 방법에 따라서 수행되었다. 주형으로서의 상기 cDNA와 함께, TFR(GeneBank No. X01060) 특이적 프라이머인, 서열 목록의 서열 #8 및 #9인 Primer S7 및 Primer AS7 를 사용하여 4,738 bp PCR 생성물이 제조되었다. 재조합 플라스미드 pT7TFR이 상기 PCR 단편과 pT7Blue 벡터(Novagen)의 결찰(ligation)에 의해 얻어졌다. 서로 다른 길이의 형광표지된 PCR 단편들이, 5'말단에서 Rhodamine X(PE Biosystems; ROX로 축약됨)로 표지된 쌍의 하나의 프라이머 및 pT7TFR을 각각 프라이머 및 주형으로서 사용하여 PCR에 의해 제조되었다; 즉, PCR은 ROX로 표지된 S7(서열 #8) 및 AS4(서열 #10), AS3(서열 #11), AS2(서열 #12), 또는 AS1(서열 #13)을 사용하여 수행되었다. 결과적으로 각각 1.0, 0.5, 0.2 및 0.1 kb 단편이 제조되었다.
정제 후, 각 DNA 단편은 20 mM MOPS 버퍼(pH 7.5) 내에 용해시키고 Amino Label IT™ 시약을 사용하여 아민화시켰다; 즉, Amino Label IT™ 시약은 디메틸 설폭사이드 내에 용해시키고정제된 DNA 용액 내로 1/5O(W/W)의 비로서 부가시키고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 아민화된 DNA는 에탄올 침전 방법에 의해 정제되었다.
아미노 Label IT 시약은 특허 출원 WO98/52961에 기술된 바와 같이, 플루오 로기를 아미노기로 치환시키면서 제조되었다.
아민화된 TRF 단편은 최종 농도 0.5 mg/ml에서 20 mM MOPS 버퍼(pH7.5) 내에 용해시키고, 이후 각 서열을 일곱개 점을 실시예#1-(1)의 방법에 의해 실시예 #1-(4)와 같이 활성화된 활성화된 에스테르로 피복된 유리 슬라이드 상으로 스포팅되었다. 스포팅 후, 실시예#3에서 기술된 바와 같이 세척하고 건조시켰다. 대조구로서, 동일한 어레어가 실시예 #1-(1)로서 MAS 피복된 슬라이드 유리 상에서 제조되었고, 고정 후 자유 아미노 기를 블로킹하는 숙신산 무수물과 함께 또는 숙신산 무수물 없이 처리시켰다.
각 슬라이드 유리 상에서 제조된 DNA 칩은 ROX와 서로 다른 형광 파장을 갖는, Cy5 표지된 DNA 프로브와 함께 혼성화되었고, 그 신호를 관찰하였다. 즉, 상기에서 제조된 1.0 Kb TFR 단편이 Cy5 Label IT™ Kit(Mirus)를 사용하여, 제조자 추천에 따라서 Cy5™로써 표지되었다.
Cy5로 표지된 20 ng/ml DNA 프로브, 0.2% SDS, 5x Denhardt'용액, 0.1 mg/ml 연어 정자 DNA, 및 6x SSC로 구성된 약 5 ul의 혼성화 용액을 칩 상에 고정된 DNA 영역에 부가시켰다. 이것을 커버 유리로 겹치고 습도고정기 내에서 65℃, 20시간 동안 인큐베이션시켰다. 커버 유리는 2x SSC 용액 내에서 실온에서 제거시키고, 2x SSC 함유 0.2% SDS로 65℃에서 5분 동안 두번 및 55℃에서 30분 동안 세척시켰다. 이후, 실온에서 10분 동안 0.05x SSC로 세척시키고, 약 1,000 rpm에서 원심분리에 의해 수분을 제거시키고, 공기-건조시켰다.
혼성화 후, 에레이 DNA의 말단에서 ROX 표지된 형광 신호 및 DNA 칩 상의 혼 성화 프로브에서 Cy5 표지된 형광 신호는 GMS 418 어레이 스캐너(GMS)를 사용하여 측정되었다. 얻어진 이미지는 이미지 분석 소프트웨어 ImaGene에 의해 분석되었고 형광 신호는 수치적 데이타로 전환되었다. 각 DNA 크기에서 Cy5의 신호 강도를 ROX의 신호 강도로 나눈 값이 DNA 당 신호 강도로서 간주되었다. 결과는 표 3에 요약되었다. 높은 배경 신호 때문에, 자유 아미노기의 블로킹 없이 MAS 피복된 슬라이드 유리 상에서 제조된 DNA 칩으로부터의 신호를 측정하는 것이 불가능하였다.
표 3
DNA 크기(bp) DNA 당 신호 강도 (A)/(B)
활성화된 에스테르로 피복된 슬라이드 유리(A) MAS 피복된 슬라이드 유리(B)
1000 26.77 9.09 2.9
500 9.61 4.17 2.3
200 0.46 0.43 1.1
100 0.30 0.18 1.7
표 3에 나타낸 바와 같이, 모든 DNA 단편 길이에서, 활성화된 에스테르로 피복된 슬라이드 유리 상의 DNA 당 스폿의 신호 강도가 MAS 피복된 슬라이드 유리 상의 그것보다 더 높았다. 이 결과는 활성화된 에스테르로 피복된 슬라이드 유리가 더 높은 효율로 혼성화를 허용함을 나타낸다. 공유적으로 부착된 다중음이온에 의해 만들어진 3-차원 격자는 부착된 표적 핵산으로의 더 큰 접근성을 허용할 수 있다.
실시예(예시) #5
말단에서 아미노기를 갖는 두 종류의 1.0 Kb 및 0.3Kb 람다 파지 DNA 단편이 실시예 #2-(1)에서와 동일한 방법에 의해 제조되었다. 일부분의 DNA는 실시예 #4에서 기술된 바와 같은 Amino Label IT™ 시약을 사용하여 아민화되었다. 각 DNA 단편은 최종 농도 0.5 mg/ml에서 20 mM MOPS 버퍼(pH7.5) 내에 용해시켰고, 활성화된 에스테르로 피복된 슬라이드 유리 및 MAS 피복된 슬라이드 상에 서로 다른 7 개의 장소로 스포팅되었다.
각 슬라이드 유리 상에서 제조된 핵산 어레이는 형광 Cy3-표지된 DNA 프로브로 혼성화되었고, 결과의 신호가 분석되었다. 즉, 상기에서 제조된 1.0 Kb 람다 파지 단편이 Label IT™ Cy3 Labeling Kit(Mirus)를 사용하여, 제조자의 추천에 따라서 Cy3로 표지되었다. 이 Cy3 표지된 DNA 프로브를 사용하여, 혼성화 및 세척이 실시예#4에 기술된 바와 같이 수행되었다.
혼성화 후, DNA 칩 형광(즉, 신호 강도)은 532 nm로서의 방출 파장 및 570 nm로서의 여기 파장에서 GMS 148 어레이 스캐너를 사용하여 측정되었다. 얻어진 이미지가 분석되었고 신호 강도 값은 이미지 분석 소프트웨어 ImaGene을 사용하여 수치적 데이터로 전환되었다. 상대적인 형광 강도는 MAS 피복된 슬라이드 유리 상의 스폿의 형광 강도를 100으로 하여 계산되었다. 얻어진 결과는 표 4와 같이 요약되었다.
표 4
표적 DNA 신호의 상대 강도
크기(bp) Label IT에 의한 아미노 개질 MAS 피복된 슬라이드 유리 활성화된 에스테르로 피복된 슬라이드 유리
1000 - 100 183
1000 + 100 276
300 - 100 945
300 + 100 2492
표 4에 나타낸 바와 같이, DNA 단편의 모든 스폿에서, 활성화된 에스테르로 피복된 슬라이드 유리로부터의 신호 강도가 MAS 피복된 슬라이드 유리로부터의 그 것보다 더 높았다. 특히 300 bp 짧은 DNA 단편에 대한 신호는 MAS 슬라이드 상의 그것보다 훨씬 높았다.
활성화된 에스테르로 피복된 슬라이드 유리상에서 스포팅될 때, 아민 개질된 표적이 아민 개질이 없는 것보다 더 강한 신호를 생성하였다. 이는 Amino Label IT™로 아미노 개질시키는 것이 활성화된 에스테르로 피복된 유리 슬라이드에 대해 표적의 증가된 부착성을 제공하는 것을 입증한다.
선행하는 실시예들은 본 발명의 원리를 단지 예시하는 것으로 간주된다. 더나아가, 수치적 개질 및 변화는 본 업계의 숙련자에게 용이하게 일어나므로, 본 발명을 도시되거나 기술된 정확한 축조 및 조작에 제한하는 것은 의도하는 바가 아니다. 따라서, 모든 적절한 개질 및 동등물은 본 발명의 범위 내에 속한다.









서열목록 전자파일 첨부

Claims (19)

  1. 유리로 구성된 고체 지지체를 포함하고, 공유적으로 부착가능한 다중음이온으로 피복된 표면을 갖는, 샘플 핵산을 검출하기 위해 사용되는 핵산 고정용 기판.
  2. 제 1항에 있어서, 다중음이온이 폴리아크릴산으로 구성된 기판.
  3. 제 1항에 있어서, 다중음이온이 활성화된 에스테르를 함유하는 기판.
  4. 제 3항에 있어서, 활성화된 에스테르가 펜타플루오로페놀 및 N-히드록시숙신이미드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 기판.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 유리로 구성된 고체 지지체를 포함하고, 공유적으로 부착가능한 다중음이온으로 피복된 표면을 가지며, 표적 핵산에 상보적인 핵산 프로브가 상기 다중음이온에 부착된 표적 핵산 검출용 기판.
  8. 제 7항에 있어서, 다중음이온이 폴리아크릴산으로 구성된 기판.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. a) 고체 지지체를 공유적으로 부착가능한 다중음이온으로 피복하고;
    b) 상기 고체 지지체상의 다중음이온을 활성화된 에스테르로 활성화시키고;
    c) 핵산을 b)에서 얻어진 고체 지지체와 접촉시키고; 및
    d) 핵산과 반응하지 않은 활성화된 에스테르를 가수분해시키는 것을 포함하는,
    핵산을 기판에 고정시키는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 다중음이온이 폴리아크릴산으로 구성된 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 고체 지지체가 비-다공성인 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 고체 지지체가 유리로 구성된 방법.
  16. 삭제
  17. 제 12항에 있어서, 핵산이 활성화된 에스테르와 반응시키기 위한 아미노기를 함유하는 방법.
  18. 삭제
  19. a) 제7항의 기판상의 핵산 프로브를 표본 중의 핵산과 혼성화시키고; 및
    b) 혼성화된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는,
    표본에서 표적 핵산을 검출하는 방법.
KR1020017016656A 1999-07-07 2000-07-06 고체 지지체 상에 핵산을 고정시키기 위한 기판 KR100608152B1 (ko)

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