JP4510080B2 - エポキシ基含有重合体がコーティングされたプラスチック基板を利用したｐｎａチップ、該ｐｎａチップの製造方法、及び該ｐｎａチップを利用した単一塩基遺伝子変異の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＮＡチップに係り、さらに具体的に、エポキシ基を有する重合体がコーティングされたプラスチック基板上に、所望のＤＮＡ配列を含むプローブＰＮＡが固定化されたことを特徴とするＰＮＡチップに関する。

ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）は、遺伝子ターゲットドラッグ（Ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｒｕｇ）として初めて開発された、ＰＮＡと相補的なＤＮＡとのすぐれた混成化性質により、多くの研究が発表されている。ＰＮＡ／ＤＮＡ混成化の基本は、それに相補的なＤＮＡ単一鎖と強い塩基結合（ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）を介して相互作用を行うことである。換言すれば、ＰＮＡの最も大きい特徴は、相補的なＤＮＡとの安定した混成化により、ＤＮＡ認知度にきわめてすぐれるということである。ＰＮＡの構造は、ＤＮＡの構造と非常に類似している。ＰＮＡの構造は、負電荷を帯びるＤＮＡの糖−リン酸塩骨格の代わりに、中性のペプチド骨格を有しており、アミド結合によって連結された反復ユニットであるＮ−（２−アミノエチル）グリシンを有している。ＰＮＡに存在する４個の核酸塩基は、ＤＮＡの塩基と類似した空間を占めており、全体的な分子間距離も、ほぼ似たように配列されているということが知られている。かようなＰＮＡの構造は、ＤＮＡとは異なり、ヌクレアーゼやプロテアーゼによる分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）がなされず、高い生物学的安定性を提供している。また、ＤＮＡ重複部位（ｄｕｐｌｅｘ）の熱的安定性は、負電荷に帯電したＤＮＡ骨格によって、塩濃度により影響されるが、ＰＮＡ／ＤＮＡ重複構造の熱的安定性は、ＰＮＡの中性骨格によって根本的に塩濃度とは関係がなくなる。かような性質は、ＤＮＡとの静電気的反発作用を低下させ、ＰＮＡ／ＤＮＡ重複部位の熱的安定性を高める。かかる多様なＰＮＡの利点により、ＤＮＡが行えない重要な生物学的応用や診断用において重要になってきている。

ＰＮＡ固定化技術は、ＤＮＡ固定化技術と類似した方法で研究されている。これまでのＤＮＡ固定化方法は、分析しようとする試料と混成化できる単一鎖ＤＮＡを固定する方法がほとんどである。それらの方法は、ＤＮＡを固体表面に吸着させる方法（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５）が主に使われ、一部の混成重合方法（Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８；Ｒｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９）や、複合体形成方法（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５）などが開発されている。主に合成を介して作られるオリゴヌクレオチドを固定化する方法としては、フォトリソグラフィ（Ｇｅｒｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９９）が広く知られており、オリゴヌクレオチドの合成時に導入した反応基と支持体との共有結合を利用する方法としては、シラン単層膜（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９）または自己組立単層膜（Ｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．１９９９）を利用した方法が使われている。以上の方法で、吸着のような物理的な方法でもって固定化された生体物質には、固定化による空間的、構造的制約があり、非特異的吸着による背景信号が高く示されるなど、分析上の困難さがある。また、エポキシシランをコーティングする場合、ガラス基質だけにコーティングが可能であり、プラスチック基板にコーティングし難く、基質の成形に制限をもたらす。

生体物質、あるいは高分子アレイを形成する方法には、マイクロロボットが三次元的に動きつつ、所望の位置に選択的に生化学物質を落とすスポッティング（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ）方式、万年筆のペン先のような形のピンを利用してアレイするマイクロアレイ方式、所望の位置に選択的に光を当てることによって表面を変化させ、表面と生体分子との結合反応が特定位置にだけ起こさせるフォトリソグラフィ方式、微小電極アレイの電極電圧を調節し、生体分子を特定電極だけに固定させる電子アドレシング（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）方式がある。本発明は、非接触インクジェット印刷スポッティング（ｎｏｎ−ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ ｉｎｋｊｅｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｓｐｏｔｔｉｎｇ）法を利用してＰＮＡをアレイした。

本発明者らは、前記従来技術の問題点を克服するために、鋭意研究努力した結果、汎用プラスチック基板にエポキシ基を有する重合体を導入したり、またはコーティングすれば、ＰＮＡをプラスチック上に低廉であり、かつ効果的に固定化できるということを発見し、本発明を完成するに至った。
ＤＮＡを固体表面に吸着させる方法（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５）

本発明の主な目的は、汎用プラスチック基板にＰＮＡを低コストで効果的に固定化できる新しいＰＮＡチップを提供するところにある。

本発明の他の目的は、前記本発明のＰＮＡチップを効果的に製造する方法を提供するところにある。

本発明のさらに他の目的は、前記本発明のＰＮＡチップを利用して単一塩基遺伝子変異（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出する方法を提供するところにある。

本発明の目的を達成するために、本発明は、エポキシ基を有する重合体がコーティングされたプラスチック基板上に、所望のＤＮＡ配列を含むプローブＰＮＡが固定化されたことを特徴とするＰＮＡチップを提供する。

本発明において、プラスチック基板は、重合体がコーティングされうるいかなるものでもよく、望ましくは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリノルボルネン、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ：Ｃｙｃｌｉｃ Ｏｌｅｆｉｎ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、フッ素化ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、スチレン−ブタジエン共重合体（ＳＢＣ：Ｓｔｙｒｅｎｅ−Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ：Ａａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ）、スチレンアクリトニトリル（ＳＡＮ：Ｓｔｙｒｅｎｅ Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、及びポリスルホンからなる群から選択される材質により製造された透明なプラスチック基板であることを特徴とする。既存のグラス基板に比べてプラスチック基板は、さらに低コストの方法で提供され、表面処理を別途に行う必要がないという長所がある。また、割れやすいグラス基板よりもさらに柔軟なプラスチック基板を使用することにより、運搬及び保存が容易であり、かつユーザが扱いやすいという長所がある。また、透明なプラスチック基板は、蛍光を発しないために、ＰＮＡの信号検出が容易である。

本発明において、エポキシ基を有する重合体は、エポキシを作用基として有するいかなる重合体でもよいが、望ましくは、エポキシ基を有するアクリレートモノマーと、エポキシ基を有さないアクリレートモノマーとの共重合体であることを特徴とする。かような共重合体は、選択される基板によって自由に選択され、特に、エポキシを有するモノマーの重量比を調節することにより、所望のエポキシ含有量を有する共重合体を製造できる。そして、ＰＮＡとの接近性もまた適切なモノマーを使用することによって向上させることができる。

本発明の一具現例として、エポキシ基を有する重合体は、下記化学式１で示される、エポキシ基を有するアクリレートモノマーと、粘性の高いアクリレートモノマーとの共重合体であることを特徴とする。
−［ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^１Ｒ^３−Ｘ］_ｎ− ［化学式１］
前記式で、Ｒ^１はエポキシ基を有するエステルであり、Ｒ^３は水素またはアルキル基であり、Ｘは粘性の高いアクリレート系化合物である。

本発明において、粘性の高いアクリレートモノマーは、アクリレートの紫外線硬化法でコーティング性を向上させるために使われうるいかなるものでも可能であるが（Ｔ．Ｊａｗｏｒｅｋ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｓｙｍｐ．，１５９，１９７，２０００；Ｃｌｉｆｆ Ｒｏｆｆｅｙ，”Ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｏｒ ＵＶ ｃｕｒｉｎｇ”，１９９７参照）、望ましくは、粘度が８〜６，０００ｃｐ（２５℃）範囲のアクリレートモノマー、さらに望ましくは、ジペンタエリスリトールヒドロキシペンタアクリレート（ＤＰＨＡ）、９−エチレングリコールジアクリレート（９−ＥＧＤＡ）、ペンタエリスリトールトリテトラアクリレート（ＰＥＴＡ）、ポリエチレングリコール４００ジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、及びジペンタエリスリトールヘキサアクリレートからなる群から選択されることを特徴とする。

本発明の他の具現例で、エポキシ基を有する重合体は、下記化学式２で示される、エポキシ基を有するアクリレートモノマーと、プラスチック基板とが接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）可能であるアクリレート誘導体との共重合体であることを特徴とする。
−［ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^１Ｒ^３−ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^２Ｒ^３］_ｎ− ［化学式２］
前記式で、Ｒ^１はエポキシ基を有するエステルであり、Ｒ^２はアルキルエステルであり、Ｒ^３は水素またはアルキル基である。

本発明において、プラスチック基板と接着可能であるアクリレート誘導体は、プラスチック基板とモノマーの種類が類似していて重合体の物性が似ており、コーティング時に基板との接着が容易であるいかなるアクリレート誘導体であってよいが、望ましくは、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、エチルアクリレート、エチルメタクリレート（ＥＭＡ）、ｎ−プロピルアクリレート、ｎ−プロピルメタクリレート、イソプロピルアクリレート、イソプロピルメタクリレートからなる群から選択されることを特徴とする。前記メチルメタクリレート（ＭＭＡ）は、基質がポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）であるとき、その物性がほぼ同一であり、特に有利である。

本発明において、エポキシ基を有する重合体で、エポキシ基の含有量、すなわち、重合体で、エポキシ基を有するアクリレート単量体の占める重量％は、０．１−１００重量％まで可能であるが、望ましくは、１０重量％以上、さらに望ましくは、２０−３０重量％であることを特徴とする。エポキシ基が１０重量％より少ない場合には、低いエポキシ基の密度により、ＰＮＡを狭い領域に集積し難しくて蛍光信号が弱く示され、一方、４０重量％より多い場合には、ＰＮＡの固定化率がエポキシ基の密度上昇と共に増大しないということが分かった。これは、相対的に多くなったエポキシ基により、コーティング表面のエポキシ基が表面に突出できずに埋められる結果となり、ＰＮＡと効果的に反応できないためであると考えられる。

本発明において、プローブＰＮＡは、そのアミン末端が直にプラスチック基板にコーティングされた重合体のエポキシ基と結合されもするが、望ましくは、プローブＰＮＡのアミン末端にアミン作用基を有し、エーテル含有または非含有のＣ_５−Ｃ_８のカルボン酸がリンカーとして追加されたことを特徴とする。前記リンカーは、プローブＰＮＡの空間方向性を増大させ、ＰＮＡ／ＤＮＡ混成化を極大化できる。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、エポキシ基を有するアクリレートモノマー、粘性の高いアクリレートモノマー及び、光開始剤を１０〜９０：８０〜５：１〜１０の割合で混合する段階と、前記混合液をプラスチック基板上にコーティングする段階と、紫外線を利用して硬化させる段階と、プローブＰＮＡプリンティング溶液をスポッティングする段階とを含むＰＮＡチップの製造方法を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、エポキシ基を有するアクリレートモノマー、プラスチック基板と物性の類似したアクリレート誘導体、及びラジカル開始剤を１０〜９９：１〜８９：０．１〜０．５の割合で混合する段階と、前記混合液をラジカル重合させる段階と、前記重合体を溶解剤に溶解させた溶液をプラスチック基板上にコーティングする段階と、プローブＰＮＡプリンティング溶液をスポッティングする段階とを含むＰＮＡチップの製造方法を提供する。

本発明において、望ましくは、プローブＰＮＡのアミン基と重合体のエポキシ基との親核性置換反応を効果的に行うために、プローブＰＮＡプリンティング溶液に適当な濃度、望ましくは、０．０１〜１．０Ｍ、特に望ましくは、０．０５〜０．５Ｍ濃度の塩基を添加してプローブＰＮＡの固定化を助けることを特徴とする。前記塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ルイス酸のような一般的な塩基を使用できる。

本発明において、望ましくは、プローブＰＮＡプリンティング溶液をスポッティングする前に、重合体のコーティングされたプラスチック基板を３０％以上の湿度が維持されるところに４時間以上保管する段階をさらに含むことを特徴とする。湿度が３０％未満の低い条件で、重合体がコーティングされたプラスチック基板を保管する場合、エポキシとアミンとの反応効率が低下し、シグナル減少として示されることがある。湿度は、望ましくは、５０％以上から９５％まで可能である。保管時間を４時間以上としたのは、有機溶媒を蒸発させるためであり、湿度が維持される限り、数十時間まで保管が可能である。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明によるＰＮＡチップに標的ＤＮＡを含んだ反応試料を適用する段階と、プローブＰＮＡと標的ＤＮＡとを混成化させる段階と、非特異的反応産物を除去するためにＰＮＡチップを洗浄する段階と、ＰＮＡ／ＤＮＡ混成化による蛍光シグナルを検出する段階とを含む単一塩基遺伝子変異（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の検出方法を提供する。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

前記目的を達成するために、本発明は、下記化学式１または化学式２で示される、生体物質を固定するためのエポキシ基を有する高分子物質を提供する。
−［ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^１Ｒ^３−Ｘ］_ｎ− ［化学式１］
−［ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^１Ｒ^３−ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^２Ｒ^３］_ｎ− ［化学式２］

前記式で、Ｒ^１はＣ_３−１２のエポキシ基を有するエステルであり、Ｒ^２はＣ_２−１６のアルキルエステルであり、Ｒ^３は水素及びＣ_１−１６のアルキル基であり、Ｘは粘性の高いアクリレート系化合物であり、ｎはモノマー濃度と反応時間とに依存するが、望ましくは、１０〜２，０００である。

前記高分子物質は、アクリレート系化合物を使用し、ｉ）紫外線硬化法（Ｔ．Ｊａｗｏｒｅｋ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｓｙｍｐ．，１５９，１９７，２０００；Ｃｌｉｆｆ Ｒｏｆｆｅｙ，’Ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｏｒ ＵＶ ｃｕｒｉｎｇ’，１９９７参照）、またはｉｉ）ラジカル重合（Ｂｅｖｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｉｎ ‘Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ’，Ｖｏｌ ３，６５ １９８９；Ｔｅｄｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２１，４０１，１９８２参照）により合成される。

前記高分子物質は、二種以上のアクリレート系モノマーを使用し、多様な組み合わせのモノマー使用により、エポキシ基の比率を多様に調節できるので、適したエポキシ基を有する高分子物質を提供できる。

紫外線硬化法によって提供されるコーティング層形成用の高分子フィルムは、エポキシ基を有するアクリレートモノマーと、粘性の高いアクリレートモノマー一つ以上とを使用する。アクリレートモノマーは、２個以上のビニル基を有するモノマーを使用する。本発明は、紫外線硬化時に使われるコーティング溶液の組成と、アクリレート化合物の組成比とを提供し、紫外線硬化時に効果的なコーティング方法を提供する。

ラジカル重合法によって提供されるコーティング層形成の高分子フィルムは、同様に、エポキシ基を有するアクリレート、プラスチック基板と物性が類似したアクリレート誘導体、及び一般的なラジカル開始剤（アゾ化合物、過酸化物、レドックス開始剤）を使用し、ラジカル重合を行って提供する（Ｇｒａｅｍｅ ｍｏａｄ，’ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ’，１９９５）。同様に、エポキシ基を有するアクリレートの重量比によってエポキシ基の比率を決定でき、それによる高分子合成方法を提供する。

熱重合法を利用したコーティング層形成の高分子化合物では、エポキシ基を有するアクリレート以外に、アルキルエステルを有するアクリレート系モノマーを使用した。

紫外線を利用したコーティング層形成用の高分子化合物で使われるエポキシ基を有するアクリレート系以外のアクリレート系モノマーは、ジペンタエリスリトールヒドロキシペンタアクリレート（ＤＰＨＡ）、９−エチレングリコールジアクリレート（９−ＥＧＤＡ）、ペンタエリスリトールトリテトラアクリレート（ＰＥＴＡ）、ポリエチレングリコール４００ジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、及びジペンタエリスリトールヘキサアクリレートのような粘性の高いアクリレートモノマーを主に使用する。

従って、コーティング層形成用の高分子化合物は、エポキシ基を有するアクリレート以外に、前記アクリレート系モノマーの一種以上により構成される。

前記紫外線を利用したコーティング層形成の高分子合成では、エポキシ基を有するアクリレートと、粘性の高いアクリレートとの重量比を０．１：９９．９から１００：０として製造でき、生体物質を固定するためのエポキシ基を有するアクリレートの重量％は、１０重量％以上が望ましい。

ラジカル重合は、エポキシ基の開環を防止するために、９０℃以下で行うことが望ましい。

ラジカル重合時に反応時間を調節することにより、高分子の平均分子量調節が可能であるが、コーティング溶液の製造と、コーティング時の透明度確保や割れ防止とのために、１時間ないし６時間ほど反応させることが望ましい。

ラジカル重合は、過量のメチルアルコールなどのアルコール類を使用して沈殿させることによって終了する。

乾燥されたコーティング層形成用の高分子は、テトラヒドロフラン、ジクロロメタンなどを利用し、０．１％〜５％のコーティング溶液を製造でき、割れを防止したり透明度を提供するために、１〜３％のコーティング溶液を使用することが望ましい。

前記コーティング層形成用の高分子化合物によりコーティングされる基板としては、一般的なシリコンウェーハ、ガラスも使用されうるが、望ましくは、プラスチック基板、さらに望ましくは、透明なプラスチック基板を使用できる。既存のチップ基板は、主に十分に加工された高価なガラスを使用していたが、本発明では、廉価であり、かつ取り扱いやすい一般的なプラスチック基板を使用してガラス基板の有する短所を克服できた。一般的に、透明なプラスチックというのは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリノルボルネン、ＣＯＣ（Ｃｙｃｌｉｃ Ｏｌｅｆｉｎ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、フッ素化ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、ＳＢＣ（Ｓｔｙｒｅｎｅ−Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ＡＢＳ（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ）、ＳＡＮ（Ｓｔｙｒｅｎｅ ＡｃｒｙｌｏＮｉｔｒｉｌｅ）またはポリスルホンにより製造された基板を含む。

前記コーティング層形成用の高分子化合物のコーティングは、ディッピング法、スプレイ法、及びプリンティング法など、汎用コーティング法のうちいずれの方法を使用してもよい。前記コーティング時に、ＰＭＭＡ含有コーティング溶液は、湿度が５０％以上である条件での保管後に使用することが好ましいが、低湿度の条件で保管する場合、ＰＮＡの固定化効率が落ちることがある。

本発明における、プラスチック基板上に誘導されたエポキシ基と生体物質であるＰＮＡとの強い固定化は、適当な濃度の塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ルイス酸）の存在の下における、マイクロアレイを利用したスポッティングにより、容易かつ低コストの方法で提供される。

本発明は、ＰＮＡのアミン基を、前記基板上にコーティングされたエポキシ基に結合させるために、塩基性触媒を使用したプリンティングバッファを製造し、インクジェットアレイを利用した注入によって表面に固定させることにより、容易かつ低コストの方法を提供する。前記ＰＮＡの固定化は、２３℃ほどの温度と５０％−６０％の湿度とが維持される条件で行われることが望ましい。

本発明は、前記方法により製造されたＰＮＡアレイを利用し、ＰＮＡとＤＮＡとの特異的な混成化を行うのに必要な最適の混成化のためのバッファ溶液、反応条件、及び効果的な洗浄方法を提供する。

混成化のためのバッファ溶液組成としては、５Ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％のＳＤＳ、及び０．１％ ＢＳＡを含み、反応前に非特異的混成化を防止するための別途のブロッキング過程を含まない。

混成化後の洗浄のためバッファ溶液としては、１Ｘ、０．１Ｘ、０．０１Ｘ及び０．００１Ｘ ＳＳＣを使用し、それぞれ５分ずつ洗浄した。

本発明によれば、汎用プラスチック基板上に効果的であり、かつ低コストでプローブＰＮＡを固定化させ、多様な遺伝子の変異を探索でき、優秀なＰＮＡの物理的化学的性質により、既存のＤＮＡチップの短所を克服できるものと予想される。

以下、実施例を介して本発明をさらに詳細に説明する。それらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例により制限されるものと解釈されるものではない。

実施例１：紫外線硬化法によるエポキシ基含有重合体でコーティングされた基板の製造

エポキシ基を導入するためのグリシドキシメチルメタアクリレート（ＧＭＡ）、９−エチレングリコールジアクリレート（９−ＥＧＤＡ）、及び光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ １８４、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を適当な比率（１０〜９０：８０〜５：１〜１０）で混合する。光開始剤を完全に溶かした後、ポリメチルメタクリレート基板にスピンコータで、５００ｒｐｍで６秒間コーティングし、連続的に１，０００〜４，０００ｒｐｍで２０秒間コーティングする。そして、結果として得られた基板を窒素雰囲気で２５４ｎｍの紫外線を利用して硬化した後、乾燥したところに保管する。該方法は、前記アクリレートモノマーとプラスチック基板とに限定されるものではなく、多様なモノマーと基板とに適用できる。結果として得られたエポキシ基を有する重合体の化学式は、次の通りである：−［ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_２ＣＨＣＨ_２）ＣＨ_２ＣＨ（Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_９Ｃ（Ｏ）ＣＨＣＨ_２）］_ｎ−。前記のような紫外線硬化法により、９−ＥＧＤＡの代わりに、ＤＰＨＡまたはＰＥＴＡを使用すれば、ＧＭＡと、ＤＰＨＡまたはＰＥＴＡとの重合体を製造できる。図１は、本発明で、汎用プラスチック上にエポキシ基を有する重合体をコーティングし、エポキシ基を有する重合体層上にＰＮＡを固定化した模式図である。

実施例２：ラジカル重合法によるエポキシ基含有重合体でコーティングされた基板の製造

エポキシ基を導入するためのグリシドキシメチルメタクリレート（ＧＭＡ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ラジカル開始剤（２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノール：ＴＭＰＯ）、そして分子量調節剤を適当な比率（９９〜１０：１〜８９：０．１〜０．５：０．１〜０．５）で混合する。混合された溶液は、７５℃のオーブンで２時間放置した後、連続的に９０℃で０．５〜３時間放置する。メチルメタクリレートの重量比によって粘性に大きい違いができるので、完全に固体になる前に反応を終了する。反応混合物が適当な粘性になったとき、メチルアルコールを過量添加し、強く撹拌して再結晶を行う。採取した結晶は、一日真空乾燥する。得られた重合体は、ＮＭＲ分析を介してエポキシ基の含有量を決定し、ＧＰＣを利用して平均分子量を測定した。以上で合成された重合体を重量比０．１〜５％でテトラヒドロフランに溶解する。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）基質をスピンコータに固定し、コーティング溶液２ｍｌを分取してスピンコーティングを行った（図１参考）。結果として得られたエポキシ基を有する重合体の化学式は、次の通りである：−［ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_２ＣＨＣＨ_２）ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_３）］_ｎ−、平均分子量Ｍｗ：７５，０００〜２５，００００。前記のようなラジカル重合法により、ＭＭＡの代わりにＥＭＡを使用すれば、ＧＭＡとＥＭＡとの重合体を製造できる。

前記コーティングされた基板は、５０％以上の湿度が維持されるところに４時間以上保管した後で使用する。低湿度条件でコーティング基板を保管する場合、エポキシとアミンとの反応効率が低下し、シグナル減少として現れることがある。図４は、エポキシ基を有する重合体でコーティングされたプラスチック基板を多様な湿度（１０％、２０−３０％、＞５０％）の下に露出した後、ＰＮＡアレイのＰＮＡ／ＤＮＡ混成化結果を示したものであり、ＰＮＡ固定化前の本発明のコーティングプラスチック基板の最適保管条件を表す。測定値（ＰＭ／ＭＭ ｒａｔｉｏ）は、ＤＮＡ／ＰＮＡ混成化で、ＰＭ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ）の平均蛍光シグナルをＭＭ（ＭｉｓＭａｔｃｈ）の平均蛍光シグナルで割った比を示し、ＰＭとＭＭとのシグナル差は、一個の塩基差により示される結果である。ＰＭ／ＭＭ比が大きいほど、標的ＤＮＡに対するプローブＰＮＡの優秀な特異性を示すことである。図４で分かるように、３０％以上の湿度、さらに望ましくは、５０％以上の湿度でコーティング基板を保管したとき、シグナル感度（ＰＭ／ＭＭ ｒａｔｉｏ）がはるかに良好であった。

実施例３：ＰＮＡ−Ｃｙ３の固定化

前記で製造されたプラスチック上のエポキシ基フィルムにＰＮＡを固定させるために、ＧＭＡの含有量によるＰＮＡの固定化程度に係る実験を進めた。使用したＰＮＡは、ｒｔＬ１８０ｗ（ＰＮＡＧＥＮＥ．Ｉｎｃ）であり、Ｃ末端に蛍光体であるＣｙ３が結合されているものである。プリンティング溶液の製造とスポッティングは、以下の実施例４のような方法で製造した。プラスチック基板は、ＧＭＡの含有量の調節により、エポキシ基の含有量がそれぞれ２０％、３０％、４０％、５０％となるようにした。使用したＰＮＡは、ｒｔＬ−１８０ｗの末端に蛍光体が結合されており、直接固定化される程度を検出できるようにした。使用したＰＮＡの濃度について、それぞれ５００、４００、３００、２００、１００ｎＭに対して固定化程度を実験した。図２Ａは、本発明で、フィルムのエポキシ基含有量による最適のＰＮＡの固定化率を求める実施例の蛍光イメージであり、図２Ｂは、そのスポットアレイである。図３は、図２Ａの蛍光イメージ定量分析データである。Ｙ軸のＳ／Ｂ ｒａｔｉｏは、ＰＮＡ−Ｃｙ３を添加していないスポット組成物の蛍光強度を背景信号としたものである。図３から、フィルムのエポキシ含有量が２０％と３０％とで、最大の固定化がなされるということを示し、残りの含有量でも固定化が問題ないということが分かった。前記実験で使用したＰＮＡであるｒｔＬ１８０ｗの配列は、次の通りである。

ｒｔＬ１８０ｗ：Ｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ−（５’）ＧＴＴＴＣＴＣＣ＊ＴＧＧＣＴ−Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ（３’）−Ｃｙ３［配列番号２］

実施例４：プリンティング溶液の製造及びＰＮＡアレイの製作

１３ｍｅｒのＰＮＡオリゴヌクレオチド（ＰＡＮＡＧＥＮＥ，Ｉｎｃ．）を、５０μMの蒸溜水に溶かす。ＰＮＡオリゴヌクレオチドとしては、ＰＮＡ Ａ、ｒｔＬ１８０ｗ、及びｒｔＬ１８０ｍを用いた。ＰＮＡ Ａは、ＤＮＡとの混成化を定性的に確認するための対照群配列であり、ｒｔＬ１８０ｗは、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）のＲＮＡポリメラーゼの特異的配列である（ＧｅｎｅＩｎ，Ｉｎｃ．）。ｒｔＬ１８０ｍは、ラミブジン耐性を示すＨＢＶのＲＮＡポリメラーゼの配列であり、ｒｔＬ１８０ｗとｒｔＬ１８０ｍとの配列差は、１塩基である（Ｃ−Ａ）。ｒｔＬ１８０ｗとｒｔＬ１８０ｍの配列は、ＳＮＰ確認のため実験群配列として使われた。固定化のために、塩基としては、０．１Ｎ濃度のＮａＯＨ溶液が使われた。以上で製造した二溶液を１：１〜０．５の割合で混合して９６ウェルのプレートに調製する。調製した試料をインクジェット方式のアレイ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）を介してＰＭＭＡ基板にスポッティングした後、湿度５０％以上、温度２３−２４℃で１６時間ほど保管し、エポキシとアミンとの反応を十分に行う。スポッティング時のスポットのサイズを一定にするために、湿度を高める必要がある。

以下は、前記実験で固定されたプローブＰＮＡ配列（ＰＮＡオリゴヌクレオチド配列−１３ｍｅｒ）を示す。

プローブＡ（人為的配列）：Ｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ（５’）−ＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＧＧ−Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ（３’）［配列番号１］

プローブＷ（ｒｔＬ１８０ｗ）：Ｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ（５’）−ＧＴＴＴＣＴＣＣ＊ＴＧＧＣＴ−Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ（３’）［配列番号２］

プローブＭ（ｒｔＬ１８０ｍ）：Ｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ（５’）−ＧＴＴＴＣＴＣＡ＊ＴＧＧＣＴ−Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ（３’）［配列番号３］

実施例５：オン・チップ反応とＳＮＰ検出

ＰＮＡの固定されたＰＭＭＡ基板は、５分間の蒸溜水洗浄を介し、残っているＮａＯＨを除去した後、別途のブロッキング過程なしにすぐに混成化を行う。混成化バッファは、５Ｘ ＳＳＣ（塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとから構成されたｐＨ７．０バッファ）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ ＳＤＳ、０．１％ ＢＳＡから構成されており、標的は、蛍光発色染料の種類であるＣｙａｎｉｎｅ３が標識されたＤＮＡ（１ｐＭ〜１００ｎＭ）を利用した。標的の含まれた混成化溶液は、９４℃で５分間熱変成した後、４２℃で６０分間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。一般的に、ＰＮＡは、ＤＮＡに比べて１個の塩基当たり１度ほど高いＴｍ値を有する。非特異的ＰＮＡ／ＤＮＡ混成化反応を除去するための洗浄は、１Ｘ ＳＳＣ、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．０１Ｘ ＳＳＣ、０．００１Ｘ ＳＳＣバッファを使用し、それぞれ５分間おこなった。洗浄の終わったＰＮＡアレイは、湿気を完全に除去した後、蛍光検出用のレーザスキャナ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を使用し、焦点位置６５、ＰＭＴ ４００の条件でシグナルを確認する。図５Ａは、標的ＤＮＡによるＰＮＡ／ＤＮＡ混成化の結果を示す蛍光イメージ分析データであり、図５Ｂは、そのスポットアレイである。（Ａ）は、ポジティブコントロールであり、人為的ＰＮＡ配列に対する相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドを、（Ｂ）は、一般ＨＢＶ感染を確認するためのＰＮＡ配列に対する相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドを、（Ｃ）は、ラミブジン耐性を有するＨＢＶ感染を確認するためのＤＮＡオリゴヌクレオチドをそれぞれ標的ＤＮＡとして使用した。図５から、それぞれのＰＮＡプローブと標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドとが特異的に混成化するということが分かる。図６Ａ及び図６Ｂは、エポキシ基含有量によるｒｔＬ１８０ｗとｒｔＬ１８０ｍとのＰＮＡ／ＤＮＡ混成化結果を示す定量分析データである。図６から、重合体のエポキシ含有量が２０％と３０％とで混成化が最も好ましく起こるということが分かった。

以下は、反応に使われた標的ＤＮＡ配列（ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列−１３ｍｅｒ）を示す。
Ａ標的配列：５’Ｃｙ３−ＣＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡ−３’［配列番号４］
Ｗ標的配列：５’Ｃｙ３−ＡＧＣＣＡＧ＊ＧＡＧＡＡＡ−３’［配列番号５］
Ｍ標的配列：５’Ｃｙ３−ＡＧＣＣＡＴ＊ＧＡＧＡＡＡ−３’［配列番号６］

実施例６：ＰＮＡリンカーによるＰＮＡ／ＤＮＡ混成化

ＰＮＡのアミン末端に炭素数がＣ_５−８のアミン作用基のある酸を反応させ、相補的ＤＮＡとの混成化を最大化する実験を実施した。図７Ａ及び図７Ｂは、本発明でのＤＮＡとの混成化を極大化するためのリンカーに係る模式図及び代表的なリンカーの化学構造式である。Ｏ−リンカーは、２−（２−アミノエトキシ）エトキシ酢酸塩であり、Ｍ−リンカーは、２−アミノエトキシ酢酸塩、Ｃ−リンカーは、６−アミノヘキサン酸である。ＰＮＡのアミン末端に反応させたアミン基を有する酸は、ＰＮＡと反応してペプチド結合を形成し、末端に再びアミン作用基を与え、前記実施例と同様に、エポキシ基を有するフィルムと反応して固定化される。これは、固定化されたプローブＰＮＡの空間方向性を増大させ、ＤＮＡとの混成化を極大化させると判断した。エポキシ基フィルムは、固定化と混成化とで最大値を示す２０％、３０％を使用した。実験方法は、実施例４、実施例５の方法と同じである。図８Ａは、本発明でのリンカーによるＤＮＡとの混成化を示す実施例での蛍光イメージであり、図８Ｂは、そのスポットアレイである。スポットアレイの下には、リンカータイプとＰＮＡタイプとが記載されている。Ｈ_２Ｏ＋ＮａＯＨは、ネガティブコントロールであり、ｒｔＬ−Ｗ（Ｍ）は、リンカーのない既存のワイルドタイプ（Ｗ）（ミュータント（突然変異体）（Ｍ）タイプ）ＰＮＡであり、Ｏ−Ｗ（Ｍ）は、Ｏ−リンカーの付着されたｒｔＬＷ（Ｍ）ＰＮＡであり、Ｍ−Ｗ（Ｍ）は、Ｍ−リンカーの付着されたｒｔＬＷ（Ｍ）ＰＮＡであり、Ｃ６−Ｗ（Ｍ）は、Ｃ６−リンカーの付着されたｒｔＬＷ（Ｍ）ＰＮＡである。ＰＮＡ−Ｃｙ３は、位置マーカである。図９Ａ及び図９Ｂは、図８Ａの蛍光イメージ定量分析データである。ｒｔＬＷは、リンカーのない既存のワイルドタイプＰＮＡ、ｒｔＬＷ−３はＯリンカーの付いたｒｔＬＷ ＰＮＡ、ｒｔＬＷ−４はＭリンカーの付いたｒｔＬＷ ＰＮＡ、ｒｔＬＷ−５はＣ６リンカーの付いたｒｔＬＷ ＰＮＡを示す。図９から、リンカーの結合されたＰＮＡプローブがリンカーのないＰＮＡプローブより標的ＤＮＡに対してはるかに優秀な特異性を示すということが分かる。

以下は、前記実験に使われたプローブＰＮＡ−リンカー配列を示す。
Ｗ（ｒｔＬ１８０ｗ）−リンカー配列：５’Ｃｙ３−ＡＧＣＣＡＧ＊ＧＡＧＡＡＡ−３’−Ｌｉｎｋｅｒ
Ｍ（ｒｔＬ１８０ｍ）−リンカー配列：５’Ｃｙ３−ＡＧＣＣＡＴ＊ＧＡＧＡＡＡ−３’−Ｌｉｎｋｅｒ

実施例７：ＰＮＡ／ＤＮＡ混成化の敏感度

実施例１、実施例２により調製されたコーティング基板に、ＰＮＡまたはＤＮＡプローブの濃度を、既知の濃度より低濃度である、１０μＭ、５μＭまで低下させて固定した後、実施例４、実施例５で行われた方法でＰＮＡアレイの敏感度を評価した。ＰＮＡは、ＤＮＡより高いＴｍ値を有し、電荷を帯びずに、かつ反発力を示さないので、ＤＮＡに比べて高い結合親和力（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有するので、５μＭにおいて固定されても、高いシグナル比を示す。図１０Ａ及び図１０Ｂは、プローブＰＮＡ濃度に関するＰＮＡ／ＤＮＡ混成化の検出感度を示す定量分析データである。

本発明で、汎用プラスチック基板上にエポキシ基を有するポリマー層をコーティングし、前記ポリマー層にＰＮＡを固定化させた模式図である。 本発明で、フィルムのエポキシ基含有量による最適のＰＮＡの固定化率を求める実施例の蛍光イメージである。 本発明で、フィルムのエポキシ基含有量による最適のＰＮＡの固定化率を求める実施例のスポットアレイである。 図２Ａの蛍光イメージ定量分析データである。 エポキシ基を有するポリマーでコーティングされたプラスチック基板を多様な湿度の下に露出させた後、ＰＮＡアレイのＰＮＡ／ＤＮＡ混成化結果を示したグラフである。 標的ＤＮＡによるＰＮＡ／ＤＮＡ混成化結果を示す蛍光イメージ分析データである。 標的ＤＮＡによるＰＮＡ／ＤＮＡ混成化結果を示すスポットアレイである。 ｒｔＬ１８０ワイルドに係るエポキシ基含有量によるＰＮＡ／ＤＮＡ混成化結果を示す定量分析データである。 ｒｔＬ１８０突然変異体に係るエポキシ基含有量によるＰＮＡ／ＤＮＡ混成化結果を示す定量分析データである。 本発明でのＰＮＡ／ＤＮＡの混成化を極大化するためのリンカーについての模式図である。 本発明でのＰＮＡ／ＤＮＡの混成化を極大化するためのリンカーの多様な形態についての化学構造式である。 本発明でのリンカーによるＰＮＡ／ＤＮＡの混成化を示す実施例における蛍光イメージである。 本発明でのリンカーによるＰＮＡ／ＤＮＡの混成化を示す実施例におけるスポットアレイである。 図８Ａの蛍光イメージ定量分析データである。 図８Ａの蛍光イメージ定量分析データである。 プローブＰＮＡ濃度によるＰＮＡ／ＤＮＡ混成化の検出感度を示す定量分析データである。 プローブＰＮＡ濃度によるＰＮＡ／ＤＮＡ混成化の検出感度を示す定量分析データである。

Claims (13)

1. エポキシ基を有する重合体がコーティングされたプラスチック基板上に、所望のＤＮＡ配列を含むプローブＰＮＡが固定化され、前記エポキシ基を有する重合体は、エポキシ基を有するアクリレートモノマーと、エポキシ基を有さないアクリレートモノマーとの共重合体であり、前記エポキシ基を有する重合体中のエポキシ基の含有量が、１０−４０重量％であることを特徴とするＰＮＡチップ。
2. プラスチック基板は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリノルボルネン（ｐｏｌｙｎｏｒｂｏｒｎｅｎｅ）、ＣＯＣ（Ｃｙｃｌｉｃ Ｏｌｅｆｉｎ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、フッ素化ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、ＳＢＣ（Ｓｔｙｒｅｎｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ＡＢＳ（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ）、ＳＡＮ（Ｓｔｙｒｅｎｅ ＡｃｒｙｌｏＮｉｔｒｉｌｅ）、及びポリスルホンからなる群から選択される材質により製造された透明なプラスチック基板であることを特徴とする請求項１に記載のＰＮＡチップ。
3. 前記エポキシ基を有する重合体は、下記化学式１で示される、エポキシ基を有するアクリレートモノマーと、２５℃における粘度が８〜６，０００ｃｐの範囲であるアクリレートモノマーとの共重合体であることを特徴とする請求項１に記載のＰＮＡチップ：
   −［ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^１Ｒ^３−Ｘ］_ｎ− ［化学式１］
   前記式で、Ｒ^１はエポキシ基を有するエステルであり、Ｒ^３は水素またはアルキル基であり、Ｘは粘性の高いアクリレート化合物である。
4. 前記２５℃における粘度が８〜６，０００ｃｐの範囲であるアクリレートモノマーは、ジペンタエリスリトールヒドロキシペンタアクリレート（ＤＰＨＡ）、９−エチレングリコールジアクリレート（９−ＥＧＤＡ）、ペンタエリスリトールトリ−テトラアクリレート（ＰＥＴＡ）、ポリエチレングリコール４００ジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、及びジペンタエリスリトールヘキサアクリレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のＰＮＡチップ。
5. 前記エポキシ基を有する重合体は、下記化学式２で示される、エポキシ基を有するアクリレートモノマーとアクリレート誘導体との共重合体であって、前記アクリレート誘導体は前記プラスチック基板を構成するモノマーの種類に類似しており、そのため前記アクリレート誘導体からなる重合体が前記プラスチック基板に類似する物性を有しており、前記プラスチック基板に対して前記重合体が容易に接着することを確実にすることを特徴とする請求項１に記載のＰＮＡチップ：
   −［ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^１Ｒ^３−ＣＲ^３Ｒ^３−ＣＲ^２Ｒ^３］_ｎ− ［化学式２］
   前記式で、Ｒ^１はエポキシ基を有するエステルであり、Ｒ^２はアルキルエステルであり、Ｒ^３は水素またはアルキル基である。
6. 前記アクリレート誘導体は、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、エチルアクリレート、エチルメタクリレート（ＥＭＡ）、ｎ−プロピルアクリレート、ｎ−プロピルメタクリレート、イソプロピルアクリレート、及びイソプロピルメタクリレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のＰＮＡチップ。
7. 前記エポキシ基を有する重合体で、エポキシ基の含有量は、２０−３０重量％であることを特徴とする請求項１に記載のＰＮＡチップ。
8. アミン作用基を有し、エーテル含有または非含有のＣ_５−Ｃ_８のカルボン酸リンカーがプローブＰＮＡのアミン末端に付着されたことを特徴とする請求項１に記載のＰＮＡチップ。
9. エポキシ基を有するアクリレートモノマー、２５℃における粘度が８〜６，０００ｃｐの範囲であるアクリレートモノマー、及び光開始剤を混合する段階と、前記混合液をプラスチック基板上にコーティングする段階と、紫外線を利用して前記混合液を硬化させる段階と、及びプローブＰＮＡプリンティング溶液を前記プラスチック基板上にスポッティングする段階とを含む、請求項１に記載のＰＮＡチップの製造方法。
10. エポキシ基を有するアクリレートモノマー、プラスチック基板と類似物性を有するアクリレート誘導体、及びラジカル開始剤を混合する段階と、前記混合液をラジカル重合させる段階と、前記重合体を溶解剤に溶解させた溶液をプラスチック基板上にコーティングする段階と、プローブＰＮＡプリンティング溶液を前記プラスチック基板上にスポッティングする段階とを含む、請求項１に記載のＰＮＡチップの製造方法。
11. 前記プローブＰＮＡプリンティング溶液に、０．０１〜１．０Ｍ濃度の塩基を添加してＰＮＡ固定化を助けることを特徴とする請求項９または請求項１０に記載のＰＮＡチップの製造方法。
12. スポッティングする前に、重合体がコーティングされたプラスチック基板を３０％以上の湿度が維持されるところに４時間以上保管する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のＰＮＡチップの製造方法。
13. 請求項１から請求項８のうちいずれか１項に記載のＰＮＡチップに標的ＤＮＡを含んだ反応試料を適用する段階と、プローブＰＮＡと標的ＤＮＡとを混成化反応させる段階と、非特異的反応産物を除去するために、前記ＰＮＡチップを洗浄する段階と、ＰＮＡ／ＤＮＡ混成化による蛍光シグナルを検出する段階とを含むＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）検出方法。