JPWO2017086199A1 - 検査キット、検査キットを使用した送液方法及び検査装置 - Google Patents

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Abstract

本発明の検査キットは、分析チップ及びピペットチップを有する。ピペットチップは、その液体吐出口がピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するようにピペットチップ挿入部に挿入された時に挿入孔密閉シールと接する第１部分と、前記第１部分より液体吐出口側に位置する第２部分とを有する。前記第２部分の外径は、前記第１部分、及び、前記第１部分と前記第２部分の間のいずれの部分の外径と同じ又はより大きくなるように形成されている。

Description

本発明は、生化学検査装置において使用される検査キットに関する。
生化学検査において抗原抗体反応等の生化学反応が利用される。これらの生化学反応は、分析チップ等を用いて行われる。分析チップには微細流路が形成されており、微細流路内には生化学反応の反応場となる抗原捕捉膜が定着されている。反応を進行させる際、ターゲット抗原を含んだ試料液が微細流路の一方の開口から微細流路へ供給される。抗原捕捉膜にはターゲット抗原を捕捉する固相抗体が固定されているため、微細流路に試料液が満たされることで試料液が抗原捕捉膜と接触し、ターゲット抗原が固相抗体と結合し捕捉される。反応に充分な時間が経過した後、微細流路から試料液が回収され、次に蛍光標識液が微細流路へ供給される。微細流路に蛍光標識液が満たされた場合に、蛍光標識液が抗原捕捉膜と接触し、抗原捕捉膜に捕捉されたターゲット抗原が、蛍光標識液に含まれる蛍光標識抗体と結合し蛍光標識される。反応に充分な時間が経過した後、微細流路から蛍光標識液が回収され反応が終了する。その後、前記ターゲット抗原を捕捉する固相抗体へのターゲット抗原の結合の有無又は結合量等は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）又は表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）等により特定される。
上記の生化学検査において、試料液と蛍光標識液はポンプによる吐出／吸引により、ピペットチップから微細流路に供給又は微細流路から回収される。また、反応が開始する前、又は各液体の回収後に、洗浄液を微細流路に供給して流路内を洗浄することもある。その場合も、洗浄液はポンプによる吸引／吐出により、ピペットチップを介して微細流路に供給され、そして微細流路から回収される。
特開２０１３−１８５９６７号公報
上述した分析チップを用いた生化学検査装置において、試料液、蛍光標識液や測定液などの反応又は測定に必要な液体は、それぞれ異なるステップでピペットチップから微細流路に供給され、一定時間経過後にまた回収される。送液の際は、図２に示すピペットチップ挿入部３１０１にピペットチップを挿入し、ピペットチップ挿入部３１０１の中に液体を吐出する。その際、微細流路による抵抗があるため、ピペットチップ挿入部３１０１に圧力をかけなければ、液体が微細流路内に入らず適切な送液を行うことができない。そのため、特許文献１では、ピペットチップ挿入部３１０１の開口に挿入孔密閉シール３１１１を貼付し、送液の際には挿入孔密閉シール３１１１を貫通してピペットチップをピペットチップ挿入部３１０１に挿入し、挿入孔密閉シール３１１１にピペットチップを密着させることでピペットチップ挿入部３１０１を密閉するようにしている。これにより、ピペットチップから液体を吐出した際には、ピペットチップ挿入部３１０１内の空気が圧縮されてピペットチップ挿入部３１０１内の空気圧が上昇し、微細流路へ液体を送り出すことが可能となる。液体吸引時も同様に、液体が吸引されると、ピペットチップ挿入部３１０１内の空気が膨張してピペットチップ挿入部３１０１内の空気圧が下降し、微細流路から液体が戻ってくる仕組みとなっている。
更に、ピペットチップをピペットチップ挿入部３１０１に挿入した時に、ピペットチップと分析チップの位置関係を把握するため、ピペットチップの垂直位置を管理する必要がある。特に、ピペットチップの液体吐出口と微細流路の底面となる導電体膜（金膜）との距離は、液体回収後の流路内の残液量に大きく影響し、測定結果の良否を大きく左右する。そのため、前記ピペットチップの液体吐出口と導電体膜との距離を精度良く制御するように、前記ピペットチップの液体吐出口と導電体膜との距離が最も小さくなった時のピペットチップの位置（以下、先端検出位置ｈ０とも呼ぶ）を検出する先端検出を行い、検出された先端検出位置ｈ０を基準にピペットチップの垂直位置を調整することが好ましい。この場合、ピペットチップは、図６Ａに示すように、液体吐出口４００２が導電体膜３２００の表面又はその近傍の先端検出位置ｈ０にまで挿入される。その後、送液が行われる際、ピペットチップ４００１は、液体吐出口４００２が導電体膜３２００の表面から離れて、かつ、ピペットチップ４００１と挿入孔密閉シール３１１１とが密着している密閉位置ｈ２に配置される。しかしながら、図示のような先端が円錐型に形成されている円錐先端型ピペットチップを使用した場合では、前記先端検出位置ｈ０配置時のピペットチップ４００１の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ０は、図６Ｂに示すように、前記密閉位置ｈ２配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１より大きくなっている。そのため、前記先端検出により、ピペットチップ４００１が貫通した挿入孔密閉シール３１１１の穴の径は径Ｄ０に拡大され、径Ｄ０より小さい前記密閉位置ｈ２配置時のピペットチップ４００１の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１では前記ピペットチップ４００１が貫通した挿入孔密閉シール３１１１の穴を塞ぐことができず、ピペットチップ挿入部３１０１を密閉することができなくなり、微細流路３１００に液体を十分に供給することができない。
なお、前記先端検出の後に、ピペットチップの液体吐出口４００２を前記密閉位置ｈ２に配置した時（以下、先端検出後の送液時）に、前記先端検出においてピペットチップにより貫通された挿入孔密閉シール３１１１の穴の径は、挿入孔密閉シール３１１１に使用している後述する弾性シートの材料特性によって、必ずしも前記径Ｄ０に留まるわけではない。例えば、前記先端検出後の送液時に、前記挿入孔密閉シール３１１１の穴の径が、その時のピペットチップ４００１の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１より小さく縮まる材料を選択すれば、送液時の密閉性喪失問題の解決は可能である。ただし、前記先端検出後の送液時に、前記挿入孔密閉シール３１１１の穴の径が前記外径Ｄ１より大きく拡大されている場合は、前記径Ｄ０にまで拡大されていなくても送液時の密閉性喪失の課題が生じる。
また、前記液体は、微細流路に供給され、一定時間経過後にまた回収されるが、微細流路から前記液体を完全に回収することは困難である。例えば、特許文献１には、液体回収時に、検査チップ（以下、分析チップとも呼ぶ）の挿入孔にノズルを送液時よりも深く挿入して微細流路から液体をなるべく完全に回収しようとする生化学検査装置が開示されている。しかしながら、特許文献１の生化学検査装置を使用しても、微少量の液体が流路内に残存することがある。このような前工程の残液１０が微細流路３１００内に存在する場合に、次工程の送液のためにピペットチップ挿入部３１０１にピペットチップ４００１を挿入すると（図８Ａ参照）、挿入孔密閉シール３１１１にピペットチップ４００１が密着してからは、図８Ｂに示すように、ピペットチップ挿入部３１０１の開口が密閉状態となるため、ピペットチップ４００１の更なる下降又は液体の吐出によりピペットチップ挿入部３１０１内に圧力がかかり、前工程の残液１０が微細流路３１００の下流側へ押し出される。そのまま次工程の液体を吐出し続けると、図８Ｃに示すように、吐出された次工程の液体と前工程の残液１０の間に気泡２０が挟まれ、次工程の液体と共に微細流路３１００の下流側へ進行していく。前記気泡２０が微細流路内の抗原捕捉膜がある位置で留まってしまうと、抗原抗体反応の進行や表面プラズモン励起蛍光の検出等の工程が阻害され、正確な計測ができない一因となる。
上述した送液時の密閉性を確保するため、本発明の検査キットは、分析チップとピペットチップからなる検査キットであって、前記分析チップは、密閉シールにより密閉されたピペットチップ挿入部と、前記ピペットチップ挿入部の底面で接続された微細流路とを有し、前記ピペットチップの前記ピペットチップ挿入部に挿入される先端部は、液体吐出口が前記ピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するように前記ピペットチップ挿入部に挿入された時に前記密閉シールと接する第１部分と、前記第１部分より液体吐出口側に位置する第２部分とを有し、前記第２部分の外径は、前記第１部分、及び、前記第１部分と前記第２部分の間のいずれの部分の外径と同じ又はより大きくなるように形成されている。
また、上述した送液時の密閉性を確保すると同時に、気泡形成問題の解消も図るため、本発明の送液方法は、
密閉シールにより密閉されたピペットチップ挿入部と前記ピペットチップ挿入部の底面で接続された微細流路とを有する分析チップと、
ピペットチップの液体吐出口が前記ピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するように前記ピペットチップ挿入部に挿入された時に前記密閉シールと接する第１部分と、前記第１部分より液体吐出口側に位置する第２部分と、前記第１部分より外径が小さい第３部分とを有し、前記第２部分の外径は、前記第１部分、及び、前記第１部分と前記第２部分の間のいずれの部分の外径と等しい又は大きくなるように形成されたピペットチップと、
からなる検査キットを使用し、
前記微細流路内に第１の液体を供給する第１工程と、前記微細流路内に供給された前記第１の液体を前記微細流路内から回収する第２工程と、前記ピペットチップの第３部分を前記密閉シールの位置に配置した状態で前記ピペットチップ挿入部の中に第２の液体を第１量吐出する第３工程と、前記第２の液体を前記第１量吐出した後に、前記ピペットチップの第２部分を前記密閉シールに密着するように配置し、前記ピペットチップ挿入部の中に前記第２の液体を第２量吐出して前記微細流路内に供給する第４工程と、を有する。
また、上述した送液時の密閉性を確保すると同時に、気泡形成問題の解消も図るため、本発明の検査装置は、
密閉シールにより密閉されたピペットチップ挿入部と前記ピペットチップ挿入部の底面で接続された微細流路とを有する分析チップと、
ピペットチップの液体吐出口が前記ピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するように前記ピペットチップ挿入部に挿入された時に前記密閉シールと接する第１部分と、前記第１部分より液体吐出口側に位置する第２部分と、前記第１部分より外径が小さい第３部分とを有し、前記第２部分の外径は、前記第１部分、及び、前記第１部分と前記第２部分の間のいずれの部分の外径と等しい又は大きくなるように形成されたピペットチップと、
からなる検査キットを着脱自在に搭載可能なように構成されており、
前記ピペットチップ挿入部に挿入したピペットチップから前記微細流路内に液体を供給する送液手段であって、前記送液手段は、前記微細流路内に第１の液体を供給し、供給された前記第１の液体を前記微細流路内から回収した後に、前記ピペットチップの第３部分を前記密閉シールの位置に配置した状態で前記ピペットチップ挿入部の中に第２の液体を第１量吐出し、前記第２の液体を前記第１量吐出した後に、前記ピペットチップの第２部分を前記密閉シールに密着するように配置し、前記ピペットチップ挿入部の中に前記第２の液体を第２量吐出して前記微細流路内に供給する送液部と、
前記微細流路の内部に固定されている反応場の反応結果を検出する検出部と、
を有する。
本発明によれば、生化学検査装置において使用されるピペットチップの形状は、分析チップの寸法に合わせて設計される。当該ピペットチップにより、ピペットチップの先端検出により挿入孔密閉シールの穴が拡大された場合においても、密閉位置配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径で密閉シールの穴を塞ぐことができ、送液に必要な圧力を確保することができる。このことにより、微細流路内への確実な送液が可能となる。
図１は、生化学検査装置の構成を示す模式図である。 図２は、分析チップの断面図である。 図３は、試薬チップを説明するための説明図である。 図４は、制御演算部のブロック図である。 図５は、生化学検査の手順を示すフローチャートである。 図６ＡとＢは、円錐先端型ピペットチップの動作を説明するための説明図である。 図７Ａ〜Ｃは、円柱先端型ピペットチップの動作を説明するための説明図である。 図８Ａ〜Ｃは、気泡形成に係るメカニズムを説明するための説明図である。 図９Ａ〜Ｃは、多段階送液方法を説明するための説明図である。
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について詳細に説明する。本実施形態は、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）によりターゲット抗原の結合を検出する生化学検査装置に使用する検査キットに関する。
（生化学検査装置の概略）
図１は、生化学検査装置の構成を示す模式図である。
図１に示すように、生化学検査装置１０００は、励起光光学系２１００、計測部２３００、フォトダイオード２２００、搬送機構２４００、ポンプユニット２５００、分析チップ３０００、試薬チップ４０００、及び制御演算部５０００を備える。
励起光光学系２１００は、光源であるレーザーダイオード等を備え、分析チップ３０００の反射面３１２３への入射角が角度θになるように励起光９０００を照射する。
計測部２３００は、受光素子である光電子増倍管等を備え、表面プラズモン励起蛍光９２００の光路上に配置され、表面プラズモン励起蛍光９２００及び散乱光９３００の光量を測定する。表面プラズモン励起蛍光９２００の光量は、ターゲット抗原の結合の有無、又はターゲット抗原の結合量の特定に用いられる。散乱光９３００の光量は、励起光の入射角θの検出に用いられる。その場合、散乱光９３００の光量が極大になる入射角の角度θが増強角θｒとして検出される。ただし、励起光の入射角θを、下記フォトダイオード２２００を用いて以下に説明するように検出しても良い。その場合、散乱光９３００の光量による増強角θｒの検出を行う必要はない。
フォトダイオード２２００は、励起光９０００の反射光９４００の光路上に配置され、反射光９４００の光量を測定する。この場合、反射光９４００の光量が極小になる共鳴角が検出され、励起光の入射角θの特定に用いられる。反射光９４００の光量による励起光の入射角θの特定を行わない場合、フォトダイオード２２００を省略し、光吸収体等のものに置き換えても良い。
搬送機構２４００には、分析チップ３０００が装着される。搬送機構２４００は、分析チップ３０００を、反応進行時の反応位置Ｂと測定光路上の測定位置Ａとの間を往来させる。ポンプユニット２５００は、ピペットチップを所定の位置に移動させる移動機構、ピペットチップを介して空気又は液体を吐出又は吸引する送液機構、及び、ピペットチップ内の空気圧を検出する感圧センサーを備える。試薬チップ４０００は、生化学反応において使用する各液体をそれぞれ収容する各液体収容部を備える。
制御演算部５０００は、前記各部の動作を制御する制御演算ブロック群を備える。
（分析チップ）
図２は、分析チップ３０００の断面図である。
図２に示すように、分析チップ３０００には、微細流路３１００が形成されている。微細流路３１００の一方端は、ピペットチップを挿入するためのピペットチップ挿入部３１０１と接続され、他方端は、液体を流路内を往復させる時に液体が撹拌されるための撹拌槽３１０２と接続される。ピペットチップ挿入部３１０１と撹拌槽３１０２の、微細流路３１００と接続しない開口には、挿入孔密閉シール３１１１及び撹拌槽シール３１１２がそれぞれ貼り付けられている。撹拌槽シール３１１２には通気孔３１１３が設けられている。
図示は省略するが、挿入孔密閉シール３１１１は、弾性シートと粘着シートとの二重層からなり、粘着シートを介して弾性シートがピペットチップ挿入部３１０１の微細流路３１００と接続しない開口の周囲に接合されるように形成されている。前記弾性シートは、ポリウレタンからなるフィルムであり、引張弾性定数が０．０５〜２ＧＰａ、引張破断伸度が２００〜２０００％、引裂強度が８０〜３０００ｍＮであることが好ましい。ただし、ピペットチップと弾性シートとが互いに密着することができれば、弾性シートの材料は特に限定しない。例えば、ポリウレタン以外の弾性シートの材料例として、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、ナイロン、無延伸ポリプロピレン（ＣＰＰ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、シリコーン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）等が挙げられる。弾性シートの厚みは１００μｍである。ただし、所望の弾性を得ることができれば、弾性シートの厚みも特に限定せず、弾性シートの材料に応じて適宜設定すれば良い。
また、挿入孔密閉シール３１１１によりピペットチップ挿入部３１０１が密閉されるが、ここでいう密閉とは、挿入孔密閉シール３１１１の貼付によりピペットチップ挿入部３１０１が完全に密閉状態になる場合とは限らない。例えば、ピペットチップが貫通するための微細な貫通孔を予め設けて、ピペットチップの挿入により前記貫通孔が閉塞されピペットチップ挿入部３１０１が密閉状態になるように、挿入孔密閉シール３１１１が形成されていても良い。その場合、貫通孔は、弾性シートに形成される第１貫通孔と粘着シートに形成される第２貫通孔からなる。第１貫通孔の大きさは、ピペットチップの挿入によりピペットチップ挿入部３１０１が密閉されるように形成される。例えば、本実施形態では、挿入孔密閉シール３１１１に外径が１．２ｍｍの初期穴を設けている。第２貫通孔は、粘着シート上の第１貫通孔に対応する位置に形成される。このとき、第２貫通孔の径は、前記密閉位置ｈ２配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１より長いことが好ましい。これにより、ピペットチップが粘着シートに触れることはない。
微細流路３１００内には、反応場となる抗原捕捉膜３３００が定着されている。生化学反応が進行する際、ポンプユニット２５００により試料液、蛍光標識液又は洗浄液等の液体が微細流路３１００に順次供給され、抗原捕捉膜３３００と接触させられる。
分析チップ３０００の底面には、表面プラズモン共鳴を発生させるための導電体膜３２００とプリズム３４００が備わる。導電体膜３２００は、金からなる薄膜である。ただし、導電体膜３２００が銀、銅、アルミニウム等の金属又はこれらの金属を含む合金からなっても良い。プリズム３４００は、励起光９０００に対して透明な材質からなる誘電体媒体である。
（試薬チップ）
図３は、試薬チップ４０００を説明するための説明図である。
図３に示すように、試薬チップ４０００は、洗浄液収容部４１００、検体収容部４２００、希釈液収容部４３００、試料液収容部４４００、蛍光標識液収容部４５００、測定液収容部４６００及び廃液収容部４７００を備える。前記各液体収容部４１００〜４７００には、洗浄液、検体、希釈液、試料液、蛍光標識液、測定液及び廃液がそれぞれ収容される。生化学反応を進行させる際、前記各液体収容部４１００〜４６００から分析チップ３０００の微細流路３１００へ各液体がポンプユニット２５００により供給される。また、微細流路３１００から回収された使用済みの液体は廃液収容部４７００に収容される。前記各液体収容部４１００〜４６００の開口が形成されている前記試薬チップ４０００の表面には、前記洗浄液収容部４１００、希釈液収容部４３００、試料液収容部４４００、蛍光標識液収容部４５００、測定液収容部４６００及び廃液収容部４７００の開口を覆うように、図示しない封止シールが貼付されている。ただし、前記封止シールが貼付されていない状態でも測定を行うことは可能である。
微細流路３１００へ液体を供給する際に、ポンプユニット２５００は、制御演算部５０００の制御に従ってピペットチップ４００１を所定の位置（位置Ｐ１からＰ６のいずれか）に移動させ、所定の液体収容部の中に下降させ所定の液体を吸引する。例えば、試料液を微細流路３１００へ供給する場合、ポンプユニット２５００はピペットチップを試料液収容部４４００の上方の位置Ｐ４に移動させ、試料液に浸漬するようにピペットチップを下降させ試料液を吸引する。次に、所定量の液体を吸引した後、ポンプユニット２５００はピペットチップ４００１を上昇させ、分析チップ３０００のピペットチップ挿入部３１０１の上方の位置Ｐ８に移動させ、ピペットチップ挿入部３１０１の中にピペットチップ４００１を挿入する。ピペットチップ４００１の送液時のピペットチップ挿入部３１０１への挿入深さは制御演算部５０００の制御に従って調節されるが、その詳細については後述する。
液体を微細流路３１００から回収する場合、ポンプユニット２５００はまず流路内の液体を吸引する。流路内の液体の大部分が吸引された後、ポンプユニット２５００は、制御演算部５０００の制御に従ってピペットチップ４００１を上昇させ、試薬チップ４０００の廃液収容部４７００の上方の位置Ｐ７に移動させる。次に、ポンプユニット２５００はピペットチップ４００１を廃液収容部４７００の中に下降させ、吸引した液体を全て吐出する。
（制御演算部）
図４は、制御演算部のブロック図である。
図４に示すように、制御演算部５０００は、ＣＰＵ５１００、励起光制御部５３００、フォトダイオード動作制御部５４００、搬送機構制御部５５００、ポンプユニット移動制御部５２０１、液体供給・回収制御部５２０２、ピペットチップ先端検出部５２０３及び計測制御・演算部５６００を備える。
ＣＰＵは、生化学検査全体の制御を行う。励起光制御部５３００は、励起光の照射に関する制御を行う。フォトダイオード動作制御部５４００は、フォトダイオード２２００の動作を制御する。搬送機構制御部５５００は、後述する反応位置Ｂと測定位置Ａの間を分析チップ３０００を搬送するように搬送機構２４００を制御する。
ポンプユニット移動制御部５２０１は、ピペットチップの位置及び高さを決定し、ピペットチップを所定の位置及び高さに移動させるようにポンプユニット２５００の移動機構を制御する。液体供給・回収制御部５２０２は、液体の吐出又は吸引の動作を決定し、所定の量の液体を吐出又は吸引するようにポンプユニット２５００の送液機構を制御する。ピペットチップ先端検出部５２０３は、後述するようにピペットチップの先端を検出する。計測制御・演算部５６００は、表面プラズモン励起蛍光の光量の測定等、測定に関する制御を行う。
（生化学検査の概略）
生化学検査とは、生化学反応により検出対象であるターゲット抗原を捕捉し、その後捕捉したターゲット抗原に蛍光標識を付加し、付加された蛍光標識からの蛍光の光量から検出対象の有無や捕捉量等を特定する検査方法である。図５は、生化学検査の手順を示すフローチャートである。以下、図５を参照しながら、生化学検査の手順について説明する。
検査を開始する際に、まずはピペットチップの先端検出を行う（ステップＳ１０１）。ピペットチップの先端検出を行う時に、制御演算部５０００の制御に従ってピペットチップがポンプユニット２５００に装着される。ピペットチップがポンプユニット２５００に装着された後、ピペットチップは分析チップ３０００のピペットチップ挿入部３１０１の上方の位置Ｐ８に移動され、下降され、そして挿入孔密閉シール３１１１を貫通してピペットチップ挿入部３１０１に挿入される。次に、ポンプユニット２５００は空気を吐出しながらピペットチップを下降させ、ピペットチップ挿入部３１０１の底面となっている導電体膜（金膜）３２００の表面に近づける。それと同時に、ポンプユニット２５００の感圧センサーはピペットチップ内の空気圧を検出する。ピペットチップ内の空気圧は、ピペットチップの液体吐出口が導電体膜３２００に近づくに伴い高くなる。制御演算部５０００のピペットチップ先端検出部５２０３は、予め登録された導電体膜表面近傍のピペットチップ内の空気圧の登録値と、前記ポンプユニット２５００の感圧センサーにより検出されたピペットチップ内の空気圧の実測値とを比較する。感圧センサーにより検出された前記実測値が予め登録された前記登録値以上になり始めた時に、ピペットチップ先端検出部５２０３はその時のピペットチップの液体吐出口の垂直位置を先端検出位置ｈ０として記憶しピペットチップの下降を停止する。その時、ピペットチップの液体吐出口は、導電体膜３２００の表面又はその近傍に位置する。また、その時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径を径Ｄ０と称する（図６Ａ参照）。
次に、測定液を微細流路３１００へ供給する（ステップＳ１０２）。この時、分析チップ３０００は反応位置Ｂに配置される。前記測定液は、洗浄液としての機能も兼ねている。前述したように、微細流路３１００内には固相抗体が固定された、反応場となる抗原捕捉膜３３００が定着されている。抗原捕捉膜３３００には、固相抗体の捕捉能力を長期間維持するための保護層が塗布されている。そのため、測定液が微細流路３１００へ供給された後には、測定液を流路内を往復させて保護層を除去する。上述洗浄は、前記測定液の代わりに専用の洗浄液を使用して行っても良い。なお、微細流路３１００及び抗原捕捉膜３３００が清浄であり、且つ、保存用の保護層等が抗原捕捉膜３３００に塗布されていない場合は、洗浄する必要はない。
保護層が除去された後、測定液を回収せず、測定液が微細流路３１００に満たされたまま次の増強測定を行う（ステップＳ１０３）。この際、分析チップ３０００が測定光路上の測定位置Ａに配置され、散乱光９３００の光量が極大になる増強角θｒ、若しくは反射光９４００の光量が極小になる共鳴角の角度が、励起光の入射角θとして検出される。増強測定終了後、ポンプユニット２５００の吸引により測定液は微細流路３１００から回収され、試薬チップ４０００の廃液収容部４７００に収容される。
次に、ターゲット抗原と固相抗体とが結合する１次反応を行う（ステップＳ１０４）。この際、分析チップ３０００が反応位置Ｂに配置され、試料液が微細流路３１００へ供給される。試料液は、受検者から直接に採取した検体を希釈液で希釈したものである。試料液が微細流路３１００に満たされた場合、試料液と抗原捕捉膜３３００とが接触し、試料液に含まれるターゲット抗原が、抗原捕捉膜３３００に固定された固相抗体と結合し捕捉される。反応に充分な時間が経過した後、試料液は微細流路３１００から回収され、試薬チップ４０００の廃液収容部４７００に収容される。
次に、流路内の洗浄を行う（ステップＳ１０５）。非特異的に吸着したターゲット抗原を除去するため、洗浄液を微細流路３１００へ供給し、往復させることで微細流路３１００を洗浄する。洗浄終了後、洗浄液は微細流路３１００から回収され、試薬チップ４０００の廃液収容部４７００に収容される。
次に、蛍光標識のための２次反応を行う（ステップＳ１０６）。この場合、蛍光標識液が微細流路３１００へ供給される。微細流路３１００に蛍光標識液が満たされた際に、蛍光標識液と抗原捕捉膜３３００とが接触し、蛍光標識液に含まれる蛍光標識抗体が、前記捕捉されたターゲット抗原と結合し、前記捕捉されたターゲット抗原に蛍光標識が付加される。反応に充分な時間が経過した後、蛍光標識液は微細流路３１００から回収され、試薬チップ４０００の廃液収容部４７００に収容される。その後、洗浄液が微細流路３１００内へ供給され、ステップＳ１０４と同様に流路内の洗浄を行う（ステップＳ１０７）。
最後に、固相抗体への、ターゲット抗原の結合の有無又は結合量等を特定するため、ターゲット抗原に付加された蛍光標識の強度、すなわち蛍光の光量を測定する（ステップＳ１０８）。この際、分析チップ３０００は測定位置Ａに配置され、分析チップ３０００の反射面３１２３に励起光光学系２１００からの励起光９０００が照射される。励起光９０００は反射面３１２３で反射され、反射する際に反射面３１２３から導電体膜３２００側にエバネッセント波がしみだす。しみだしたエバネッセント波の電場は、導電体膜３２００の表面プラズモンに共鳴し増強される。その増強された電場は、抗原捕捉膜３３００に捕捉されたターゲット抗原に付加された蛍光標識を励起する。励起された蛍光標識からは、表面プラズモン励起蛍光９２００が放射される。計測部２２００は、前記表面プラズモン励起蛍光９２００の光量を測定し、ターゲット抗原の結合の有無又は結合量等を特定する。
（密閉性を確保するためのピペットチップの動作）
図７Ａ〜Ｃは、円柱先端型ピペットチップ４００３（以下、簡単にピペットチップとも呼ぶ）の動作を説明するための説明図である。以下、図７Ａ〜Ｃを参照しながら、ピペットチップ４００３の動作について説明する。
ピペットチップ４００３は、ポリプロピレン（ＰＰ）製であるが、材料は特に限定しない。ただし、ピペットチップ４００３は、撥水性、耐薬品性、又はタンパク質吸着の抑制効果を有する材料からなることが好ましい。例えば、ポリプロピレン以外のピペットチップの材料例として、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、フッ素樹脂（ＰＦＡ）等が挙げられる。
ピペットチップ４００３は、送液の際にピペットチップ挿入部３１０１の中に挿入される先端部分に、外径が等しい円柱形状の中間部４００３ａと、前記中間部４００３ａより液体吐出口側に位置する円錐形状の吐出部４００３ｂを有する。前記外径が等しい円柱形状の中間部４００３ａの外径は、２．６ｍｍである。また、ピペットチップの剛性を確保する観点から、ピペットチップ４００３は、液体吐出口４００２の外径が０．９ｍｍ以上となるように形成されていることが好ましい。
前述ステップＳ１０１においてピペットチップの先端検出が行われるが、その際、ピペットチップは、図７Ａに示すように、先端検出位置ｈ０まで挿入される。そのため、ピペットチップに貫通された挿入孔密閉シール３１１１の穴の径はその時の挿入孔密閉シールの位置のピペットチップの外径Ｄ０に拡大される。その後の各ステップにおいて、後述する多段階送液方法を利用して送液を行うが、微細流路に液体を供給する時は、図７Ｂに示すように、密閉位置ｈ２にピペットチップ４００３の液体吐出口を配置する。図示のような円柱先端型ピペットチップは、前記外径が等しい円柱形状の中間部４００３ａを有することで、前記先端検出位置配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ０と、前記密閉位置配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１とが、円柱の径Ｄと同じとなっている。このことにより、前記ピペットチップの先端検出により挿入孔密閉シールの穴が径Ｄ０に拡大された場合においても、密閉位置配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１で挿入孔密閉シールの穴を塞ぐことが可能となり、密閉性を確保した状態で液体を吐出することが可能となる。
ただし、前記先端検出位置配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ０と、前記密閉位置配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１とが、全く同じでなければいけないわけではない。径Ｄ０に拡大された挿入孔密閉シールの穴を前記外径Ｄ１で塞ぐことができるのであれば、前記径Ｄ０と前記径Ｄ１の大きさに若干差があっても送液時の密閉性を確保することはできる。
また、前記円柱先端型ピペットチップの中間部４００３ａは、必ずしも円柱形にする必要はない。前記密閉位置配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１が、前記先端検出位置配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ０、及び、前記外径Ｄ１と外径Ｄ０の間のいずれの部分の外径と同じ又はより大きくなるように形成されていれば、いずれの場合においても径Ｄ０に拡大された挿入孔密閉シールの穴を外径Ｄ１で塞ぐことができるからである。
また、挿入孔密閉シール３１１１に予めピペットチップが貫通する貫通孔を設ける場合には、前述した送液時の密閉性を確保するために、貫通孔は、前記密閉位置配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１より小さくなるように形成される。
また、前記試薬チップ４０００の表面に封止シールが貼付されている場合、ピペットチップ４００３は前記封止シールを突き破って前記洗浄液収容部４１００、希釈液収容部４３００、試料液収容部４４００、蛍光標識液収容部４５００、測定液収容部４６００又は廃液収容部４７００の中に挿入される。その時、封止シールにピペットチップ４００３が貫通した穴が開く。封止シールにピペットチップ４００３が貫通した穴が大きく開いている場合、前記各液体収容部４１００、４３００〜４７００に収容されている液体がこぼれる恐れがある。前記各液体収容部４１００、４３００〜４７００から液体がこぼれることを防止するために、ピペットチップ４００３は、液体吐出口４００２が前記各液体収容部４１００、４３００〜４７００の底面まで挿入された時に前記封止シールと接する部分から液体吐出口４００２までのいずれの部分の外径が、３ｍｍ以下であることが好ましい。
（多段階送液方法）
前述した生化学検査の手順の中で、特にステップＳ１０４の１次反応、ステップＳ１０６の２次反応、及び、ステップＳ１０８の光量測定の場合においては、抗原捕捉膜３３００がある位置に気泡が留まっていると、反応が進まなかったり、或いは励起蛍光が散乱してしまったりというように、各工程の進行が阻害され、正確な計測ができない一因となる。図９Ａ〜Ｃは、多段階送液方法を説明するための説明図である。以下に説明するように、この多段階送液方法により前述した気泡の発生を抑制することが可能となり、反応等が気泡により阻害されることのない正確かつ安定な測定が可能となる。
図９Ａに示すように、送液する時は、まずピペットチップ挿入部３１０１を密閉しないように、比較的に浅い通気位置ｈ１にまでピペットチップ４００１を挿入する。これにより、ピペットチップ４００１と挿入孔密閉シール３１１１の間に空気の逃げ道が確保される。次に、この通気位置ｈ１で第１量の液体を吐出する。この状態では空気の逃げ道が確保されるため、液体を吐出してもピペットチップ挿入部３１０１内に圧力がかかることなく、前工程の残液１０が微細流路３１００の下流側へ押し出されることはない。更に、図９Ｂに示すように、吐出された第１量の液体と前工程の残液１０とが一体化し、吐出された第１量の液体と前工程の残液の間に気泡が挟まれることがなくなり、気泡の発生が解消される。
次に、図９Ｃに示すように、挿入孔密閉シール３１１１に密着するように、前記通気位置ｈ１よりも深い密閉位置ｈ２にまでピペットチップ４００１を挿入し、第２量の液体を吐出する。この状態では、挿入孔密閉シール３１１１にピペットチップ４００１が密着することによりピペットチップ挿入部３１０１が密閉され空気の逃げ道がなくなるため、液体を吐出すれば流路内に圧力がかかり、液体を微細流路３１００内に供給することが可能となる。
（通気性を確保するためのピペットチップの動作）
本実施形態では、以下に説明するように前述した多段階送液方法に応じた動作をも行うことで、気泡の発生を抑制できるという更なる効果が得られ、微細流路内への確実な送液が可能となる。このことにより、生化学反応の進行、又は表面プラズモン励起蛍光の発生等の工程が気泡により阻害されることなく正確かつ安定な測定の実現が可能となる。
前述した多段階送液方法において、ピペットチップ挿入部３１０１を密閉して送液する前には、空気の逃げ道が確保された通気位置ｈ１で液体を一部吐出する。この場合、前記外径が等しい円柱形状の中間部４００３ａより液体吐出口側に更に円錐形状の吐出部４００３ｂを設ければ、前記円柱先端型ピペットチップは、図７Ｃに示すように、前記通気位置ｈ１配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ２が円柱の径Ｄより小さくなるため、ピペットチップ挿入部３１０１の通気性を確保することも可能となる。このことにより、空気の逃げ道が確保され、前工程の残液１０を押し出すことなく液体を吐出することが可能となり、気泡発生のない送液を実現することが可能となる。
挿入孔密閉シール３１１１に予めピペットチップが貫通する貫通孔を設ける場合には、前述した送液時の通気性を確保するために、貫通孔は、貫通孔を前記通気位置配置時のピペットチップの挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ２より大きく形成されることが好ましい。ただし、前述したピペットチップの先端検出により貫通孔の径が外径Ｄ２より大きく拡大される場合においては、貫通孔は、径が外径Ｄ２より小さく形成されていても良い。
また、前述した先端検出位置ｈ０又は密閉位置ｈ２までのピペットチップの挿入により、挿入孔密閉シール３１１１はピペットチップ挿入部３１０１の内側に伸長され伸長部を形成してしまう。この場合、ピペットチップ４００３の液体吐出口４００２を前記伸長部よりも下に位置するように配置すれば、液体吐出口４００２からの液体吐出を前記伸長部が邪魔することを防止することができる。
ただし、前記円柱先端型ピペットチップは、前記密閉位置配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ１以下となっている前記通気位置配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径Ｄ２を、前記中間部４００３ａに少なくとも一箇所有するように形成されても良くて、必ずしも前記中間部４００３ａより液体吐出口側に円錐形状の吐出部４００３ｂを設ける必要はない。例えば、円錐形状の吐出部４００３ｂを設けず、円柱形状の中間部４００３ａに外径Ｄ２となる凹みを一箇所設けても良い。
また、前記吐出部４００３ｂが単なる円錐形状となっていると、前記通気位置ｈ１から前記密閉位置ｈ２までのピペットチップの移動距離が長くなる場合がある。そのため、前記吐出部４００３ｂを、液体吐出口方向へ進むに従って、一定の第１の減少率で外径が小さく変化する第１の円錐台と、前記第１減少率よりも小さい第２の減少率で外径が変化する、又は変化しなくなる（即ち、前記第２の減少率が０の場合）、前記第１の円錐台に引き続いた第２の円錐台（前記第２の減少率が０の場合は円柱になる）とを有するほぼ漏斗状に形成すれば、前記通気位置ｈ１から前記密閉位置ｈ２までのピペットチップの移動距離を短縮することが可能となる。
また、前述した気泡の形成が発生しない、もしくは、前記気泡による影響が無視できる場合は、前述多段階送液方法を利用して送液する必要はない。その場合、前記円柱形状の中間部４００３ａよりも小さい外径Ｄ２を有する前記円錐形状の吐出部４００３ｂを設ける必要もない。
上述のように、本検査キットに備わる円柱先端型ピペットチップは、その先端部分に有する前記外径が等しい円柱形状の中間部４００３ａが、先端検出位置配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径と、密閉位置配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径とが一致しているように形成されているため、ピペットチップの先端検出により挿入孔密閉シールの穴が拡大された場合においても、送液時の密閉性を失うことはない。また、更に求めれば、前記中間部４００３ａより液体吐出口側に、密閉位置配置時の挿入孔密閉シールの位置の外径よりも小さい外径を有する円錐形状の吐出部４００３ｂを設けることで、多段階送液方法を利用して送液を行う場合には、通気性を確保することも可能となり、気泡発生のない送液を実現することが可能となる。
本出願は、２０１５年１１月１６日出願の特願２０１５−２２４２１５に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
１０ 残液
２０ 気泡
１０００ 生化学検査装置
２１００ 励起光光学系
２２００ フォトダイオード
２３００ 計測部
２４００ 搬送機構
２５００ ポンプユニット
３０００ 分析チップ
３１００ 微細流路
３１０１ ピペットチップ挿入部
３１０２ 撹拌槽
３１１１ 挿入孔密閉シール
３１１２ 撹拌槽シール
３１１３ 通気孔
３１２３ 反射面
３２００ 導電体膜
３３００ 抗原捕捉膜
３４００ プリズム
４０００ 試薬チップ
４００１ ピペットチップ
４００２ 液体吐出口
４００３ 円柱先端型ピペットチップ
４００３ａ 中間部
４００３ｂ 吐出部
４１００ 洗浄液収容部
４２００ 検体収容部
４３００ 希釈液収容部
４４００ 試料液収容部
４５００ 蛍光標識液収容部
４６００ 測定液収容部
４７００ 廃液収容部
５０００ 制御演算部
５１００ ＣＰＵ
５２０１ ポンプユニット移動制御部
５２０２ 液体供給・回収制御部
５２０３ ピペットチップ先端検出部
５３００ 励起光制御部
５４００ フォトダイオード動作制御部
５５００ 搬送機構制御部
５６００ 計測制御・演算部
９０００ 励起光
９２００ 表面プラズモン励起蛍光
９３００ 散乱光
９４００ 反射光

Claims (11)

  1. 分析チップとピペットチップからなる検査キットであって、
    前記分析チップは、密閉シールにより密閉されたピペットチップ挿入部と、前記ピペットチップ挿入部の底面で接続された微細流路とを有し、
    前記ピペットチップの前記ピペットチップ挿入部に挿入される先端部は、液体吐出口が前記ピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するように前記ピペットチップ挿入部に挿入された時に前記密閉シールと接する第１部分と、前記第１部分より液体吐出口側に位置する第２部分とを有し、
    前記第２部分の外径は、前記第１部分、及び、前記第１部分と前記第２部分の間のいずれの部分の外径と同じ又はより大きくなるように形成されていることを特徴とする検査キット。
  2. 前記ピペットチップの前記ピペットチップ挿入部に挿入される先端部は、前記第１部分より外径が小さい第３部分を更に有する、請求項１に記載の検査キット。
  3. 前記ピペットチップの前記ピペットチップ挿入部に挿入される先端部は、前記第１部分から前記第２部分までの部分が外径が等しい円柱形状に形成されており、
    前記第３部分が前記第２部分より液体吐出口側に位置する、
    請求項２に記載の検査キット。
  4. 前記ピペットチップの前記ピペットチップ挿入部に挿入される先端部は、前記第２部分より液体吐出口側の部分が、液体吐出口方向へ進むに従って、一定の第１の減少率で外径が小さく変化する第１の円錐台と、前記第１減少率よりも小さい第２の減少率で外径が変化する、又は外径が変化しなくなる、前記第１の円錐台に引き続いた第２の円錐台又は第２の円柱部分とからなり、
    前記第３部分は、前記第２の円錐台又は第２の円柱部分に位置する、
    請求項３に記載の検査キット。
  5. 前記ピペットチップの液体吐出口は、外径が０．９ｍｍ以上となるように形成されている、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の検査キット。
  6. 前記密閉シールに貫通孔が予め形成されている、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の検査キット。
  7. 前記貫通孔は、前記ピペットチップの前記ピペットチップ挿入部に挿入される先端部の第３部分より径が大きくなるように形成されている、請求項６に記載の検査キット。
  8. 前記貫通孔は、前記ピペットチップの前記ピペットチップ挿入部に挿入される先端部の第２部分より径が小さくなるように形成されている、請求項６又は請求項７に記載の検査キット。
  9. 密閉シールにより密閉されたピペットチップ挿入部と前記ピペットチップ挿入部の底面で接続された微細流路とを有する分析チップと、
    前記ピペットチップ挿入部に挿入され液体を吐出するピペットチップであって、前記ピペットチップの液体吐出口が前記ピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するように前記ピペットチップ挿入部に挿入された時に前記密閉シールと接する第１部分と、前記第１部分より液体吐出口側に位置する第２部分と、を有し、前記第２部分の外径は、前記第１部分、及び、前記第１部分と前記第２部分の間のいずれの部分の外径と同じ又はより大きくなるように形成されたピペットチップと、
    からなる検査キットを使用した送液方法であって、
    前記ピペットチップの液体吐出口が前記ピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するように、前記ピペットチップを前記ピペットチップ挿入部に挿入する第１工程と、
    前記第１工程の後に、前記ピペットチップの第２部分を前記密閉シールに密着するように配置し、前記ピペットチップ挿入部の中に液体を吐出して前記微細流路内に供給する第２工程と、
    を有する送液方法。
  10. 密閉シールにより密閉されたピペットチップ挿入部と前記ピペットチップ挿入部の底面で接続された微細流路とを有する分析チップと、
    前記ピペットチップ挿入部に挿入され液体を吐出するピペットチップであって、前記ピペットチップの液体吐出口が前記ピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するように前記ピペットチップ挿入部に挿入された時に前記密閉シールと接する第１部分と、前記第１部分より液体吐出口側に位置する第２部分と、前記第１部分より外径が小さい第３部分とを有し、前記第２部分の外径は、前記第１部分、及び、前記第１部分と前記第２部分の間のいずれの部分の外径と同じ又はより大きくなるように形成されたピペットチップと、
    からなる検査キットを使用した送液方法であって、
    前記微細流路内に第１の液体を供給する第１工程と、
    前記微細流路内に供給された前記第１の液体を前記微細流路内から回収する第２工程と、
    前記ピペットチップの第３部分を前記密閉シールの位置に配置した状態で前記ピペットチップ挿入部の中に第２の液体を第１量吐出する第３工程と、
    前記第２の液体を前記第１量吐出した後に、前記ピペットチップの第２部分を前記密閉シールに密着するように配置し、前記ピペットチップ挿入部の中に前記第２の液体を第２量吐出して前記微細流路内に供給する第４工程と、
    を有する送液方法。
  11. 密閉シールにより密閉されたピペットチップ挿入部と前記ピペットチップ挿入部の底面で接続された微細流路とを有する分析チップと、
    前記ピペットチップ挿入部に挿入され液体を吐出するピペットチップであって、前記ピペットチップの液体吐出口が前記ピペットチップ挿入部の底面又は底面近傍に位置するように前記ピペットチップ挿入部に挿入された時に前記密閉シールと接する第１部分と、前記第１部分より液体吐出口側に位置する第２部分と、前記第１部分より外径が小さい第３部分とを有し、前記第２部分の外径は、前記第１部分、及び、前記第１部分と前記第２部分の間のいずれの部分の外径と同じ又はより大きくなるように形成されたピペットチップと、
    からなる検査キットを着脱自在に搭載可能な検査装置であって、
    前記ピペットチップ挿入部に挿入したピペットチップから前記微細流路内に液体を供給する送液手段であって、前記送液手段は、前記微細流路内に第１の液体を供給し、供給された前記第１の液体を前記微細流路内から回収した後に、前記ピペットチップの第３部分を前記密閉シールの位置に配置した状態で前記ピペットチップ挿入部の中に第２の液体を第１量吐出し、前記第２の液体を前記第１量吐出した後に、前記ピペットチップの第２部分を前記密閉シールに密着するように配置し、前記ピペットチップ挿入部の中に前記第２の液体を第２量吐出して前記微細流路内に供給する送液部と、
    前記微細流路の内部に固定されている反応場の反応結果を検出する検出部と、
    を有する検査装置。
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