ITTO20110854A1 - Dispositivo e metodo per misurare la concentrazione di materiali biologici, in particolare l'ormone di stimolazione della tiroide, in un campione - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

del brevetto per invenzione industriale dal titolo: “DISPOSITIVO E METODO PER MISURARE LA CONCENTRAZIONE DI MATERIALI BIOLOGICI, IN PARTICOLARE L'ORMONE DI STIMOLAZIONE DELLA TIROIDE, IN UN CAMPIONEâ€

La presente invenzione riguarda un dispositivo ed un metodo per rilevare la concentrazione di materiali biologici, in particolare TSH (ormone di stimolazione della tiroide), in un campione.

Le procedure tipiche per analizzare materiali biologici, quali acido nucleico, proteine, lipidi, carboidrati e altre molecole biologiche, comportano numerose operazioni partendo da materiale non trattato. Queste operazioni possono comprendere diversi gradi di purificazione o separazione cellulare, lisi cellulare, amplificazione o purificazione, e l’analisi dei prodotti di purificazione o amplificazione ottenuti.

Come esempio, nell’analisi ematica a base di DNA, i campioni vengono spesso purificati mediante filtrazione, centrifugazione o elettroforesi in modo da eliminare tutte le cellule non nucleate che generalmente non sono utili per l’analisi del DNA. Quindi, i rimanenti leucociti vengono rotti o lisati usando mezzi biologici o termici o chimici per liberare il DNA da analizzare. In seguito, il DNA viene denaturato mediante processi termici, biologici o chimici e amplificato mediante una reazione di amplificazione, quale PCR (reazione a catena della polimerasi), LCR (reazione a catena della ligasi), SDA (amplificazione per spostamento del filamento), TMA (amplificazione mediata da trascrizione), RCA (amplificazione "rolling circle", e simili). La fase di amplificazione permette all’operatore di evitare la purificazione del DNA che viene studiato poiché il prodotto amplificato supera di gran lunga il DNA di partenza nel campione.

Se deve essere analizzato l’RNA, le procedure sono simili, ma si pone più enfasi sulla purificazione o altri mezzi per proteggere la molecola di RNA labile. L’RNA viene generalmente copiato in DNA (cDNA) e quindi l’analisi procede come descritto per il DNA.

Infine, il prodotto di amplificazione viene sottoposto ad una qualche analisi, generalmente basata sulla sequenza o dimensione o una qualche loro combinazione. In un’analisi mediante ibridazione su micromatrice, ad esempio, il DNA amplificato viene fatto passare su una pluralità di rilevatori costituiti da singoli frammenti di rilevatore oligonucleotidico che sono ancorati, ad esempio, su elettrodi. Se i filamenti di DNA amplificato sono complementari a sonde o rilevatori oligonucleotidici, in condizioni di temperatura specifiche si formeranno legami stabili tra essi (ibridazione). I rilevatori ibridati possono essere letti mediante osservazione usando un’ampia varietà di mezzi, inclusi mezzi ottici, elettromagnetici, elettromeccanici o termici.

Altre molecole biologiche sono analizzate in modo simile, ma generalmente la purificazione delle molecole sostituisce l’amplificazione, e i metodi di rilevamento variano in base alla molecola da rilevare. Ad esempio, un comune metodo diagnostico comporta il rilevamento di una proteina specifica mediante il legame al suo anticorpo. Tale analisi richiede diversi gradi di separazione cellulare, lisi, purificazione e analisi del prodotto mediante legame con l’anticorpo, che di per sé può essere rilevato in numerosi modi. I lipidi, i carboidrati, i farmaci e le piccole molecole provenienti dai fluidi biologici sono trattati in modo simile.

Attualmente, gli immunosaggi di tutti i tipi dominano il mercato IVD. Nel 2005, secondo Kalorama Information (New York City), il mercato dell’immunosaggio globale ha generato 5,8 miliardi di dollari statunitensi di ricavi totali. La nuova crescita negli immunosaggi à ̈ legata allo sviluppo di marcatori autoimmuni, cardiaci e tumorali che svolgono un ruolo significativo nel monitoraggio e nella diagnosi della patologia. Nel 2010 si prevede che il mercato dell’immunosaggio raggiunga 8,1 miliardi di dollari con un tasso di crescita annuale del 7%.

In seguito, si farà riferimento alla misura delle proteine/carboidrati in un liquido biologico, generalmente siero o urine, in test biochimici definiti immunosaggi che usano la reazione delle proteine/carboidrati con uno o più anticorpi come base per la valutazione del saggio.

Più in particolare, nel seguito si farà riferimento alla misura della concentrazione dell’ormone di stimolazione della tiroide (TSH), ma considerazioni simili e gli stessi metodi e apparecchiature si applicano a numerosi saggi biologici, ad esempio per la misura dell’emoglobina glicosilata e CDT (l’ultimo test essendo utile per distinguere tra il bevitore occasionale e quello abituale).

Come noto, la ghiandola tiroide produce ormoni che controllano la velocità del metabolismo ed influenzano lo sviluppo e la funzionalità di molte altre funzioni corporee. I due più importanti disturbi tiroidei sono l’ipertiroidismo (tiroide iperattiva) e ipotiroidismo (tiroide ipoattiva). L’ormone di stimolazione della tiroide (TSH) prodotto dalla ghiandola pituitaria anteriore regola la produzione di due ormoni (T3 - triiodotironina e T4 -tiroxina) da parte della tiroide in un meccanismo a feedback negativo. Quando i livelli di T3 e T4 sono bassi, il TSH viene stimolato a produrre più T3 e T4. In modo simile, quando i livelli sono elevati, la produzione di TSH à ̈ ridotta, il che a sua volta riduce i livelli di T4 e T3.

In passato, la concentrazione del TSH veniva misurata usando tecniche radioimmunologiche di prima generazione che avevano una sensibilità abbastanza bassa e non permettevano di distinguere i valori bassi, ancora all’interno dei valori normali, da quelli leggermente più bassi, correlati all’ipotiroidismo.

Circa a metà degli anni ottanta, sono state sviluppate tecniche immunologiche di seconda generazione che usavano due anticorpi anti-TSH, e il sistema a doppio anticorpo aveva migliorato alquanto la sensibilità. In seguito, negli anni novanta, queste tecniche sono state ancora migliorate dall’arrivo di metodi di terza generazione che hanno una sensibilità molto più elevata e permettono la valutazione del TSH anche per pazienti che hanno atipie sierologiche legate alle diverse patologie tiroidee. I test per il TSH di terza generazione sono saggi immunoassorbenti legati all’enzima su fase solida, che usano un anticorpo anti-TSH monoclonale murino per l’immobilizzazione su fase solida e l’anticorpo di capra anti-TSH legato generalmente alla perossidasi di rafano, permettendo così l’amplificazione del segnale.

I metodi di terza generazione hanno una sensibilità funzionale (indicando con questo termine la concentrazione più bassa che permette al dosaggio di mantenere un coefficiente di variazione di dosaggio di circa il 20% o meno) da circa 0,01 a 0,02 µIU/mL e pertanto in grado di fornire risultati abbastanza precisi per i pazienti ipertiroidei.

Gli immunosaggi tradizionali, quali ad esempio ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - saggio immunoassorbente legato all’enzima) sono basati sull’uso di anticorpi primari, insieme ad un secondo anticorpo enzimatico e substrati associati per generare un segnale finale che può essere confrontato con soglie note.

Queste soluzioni note sono completamente manuali, in quanto esse richiedono l’inserimento manuale dei campioni, degli anticorpi e dei liquidi di lavaggio e richiedono un lettore ottico; inoltre esse richiedono personale specializzato per eseguire le diverse fasi di legame e lavaggio, cosicché esse permettono soltanto l’esame clinico in laboratori centralizzati. Inoltre, sono complesse, comportando procedure a lungo termine e l’uso di materiali costosi e potenzialmente pericolosi.

Pertanto, scopo dell’invenzione à ̈ fornire un dispositivo ed un metodo che permettano il rilevamento di materiali biologici obbiettivo e che siano semplici, riproducibili e abbastanza affidabili da usare sul campo o in ambiente ospedaliero, quali ambulatori, farmacie, negozi e simili.

Secondo la presente invenzione, sono previsti un dispositivo ed un metodo per rilevare la concentrazione di materiali biologici, come rivendicato nelle rivendicazioni 1 e, rispettivamente, 12.

Per la comprensione della presente invenzione, una sua forma di realizzazione sarà ora descritta, puramente come esempio non limitativo, con riferimento ai disegni, in cui:

- la figura 1 Ã ̈ una vista parzialmente in spaccato in prospettiva di un dispositivo di analisi biochimica per rilevare la concentrazione di materiali biologici, secondo una forma di realizzazione;

- la figura 2 Ã ̈ una sezione trasversale ingrandita di una porzione del dispositivo della fig.

1;

- la figura 3 à ̈ una vista dall’alto della porzione della fig. 2;

- le figure 4-7 sono rappresentazioni delle celle del dispositivo di fig. 1, in fasi successive del presente metodo;

- la figura 8 Ã ̈ una curva di misura usata in questo metodo;

- la figura 9 Ã ̈ un diagramma di flusso di una forma di realizzazione del presente metodo; e

- la figura 10 mostra un apparecchio per misurare la concentrazione di materiali biologici.

Con riferimento alle Figure 1-3, un dispositivo di rilevamento concentrazione 1, di tipo monouso, comprende un corpo 2, ad esempio un corpo stampato plastico, e una struttura a multi-microbilance 3 collegabile al corpo 2 per mezzo di graffe 4.

Il corpo 2 ha una pluralità di percorsi fluidici 9 (qui cinque) che hanno la stessa struttura (soltanto uno completamente visibile nella fig. 1), che si estendono affiancati uno all’altro e sono collegabili fluidicamente alle proprie microbilance 8 della struttura a multi-microbilancia 3, in modo da definire cinque celle 5A-5E da caricare con i diversi campioni, come spiegato in seguito. Il corpo 2 può essere un parallelepipedo o una scatola di plastica stampata, e ha ad esempio dimensioni totali di 2 x 5 x 1,5 cm3 (larghezza x profondità x altezza).

Ciascun percorso fluidico 9 comprende un foro di ingresso 10; un foro di sfiato 17; un condotto di ingresso 11; un condotto di scarico 13; una camera di scarico 14; ed un condotto di pompaggio 15. In dettaglio, ciascun condotto di scarico 13 si estende dal rispettivo foro di ingresso 10 e una rispettiva cavità di reazione 16 à ̈ rivolta verso una rispettiva camera di reazione 12 formata in una rispettiva microbilancia 8. Ciascun condotto di scarico 13 si estende all’interno del corpo 2 dalla rispettiva porzione di reazione 16 e la rispettiva camera di scarico 14 ed ha una forma serpeggiante con alcune porzioni che si estendono su un livello inferiore rispetto alle altre porzioni; e ciascun condotto di pompaggio 15 si estende tra la rispettiva camera di scarico 14 e il rispettivo foro di sfiato 17.

In alcune forme di realizzazione, il condotto ha una porzione 13a che à ̈ più alta della rispettiva camera di scarico 14 (e delle camere 12 e 16); pertanto i fluidi possono essere attivamente pompati oltre questo massimo di gravità per raggiungere la camera di scarico 14. Questa caratteristica protegge contro il ritorno del flusso dalla camera di scarico, e serve anche per minimizzare la contaminazione.

In una forma di realizzazione, i fori 10, 11, i condotti 11, 13, 15 e le camere 12, 14 di uno stesso percorso fluidico sono disposti generalmente complanari ed hanno uno spessore (parallelo alla dimensione D) di circa 0,5 - 0,8 cm.

Il corpo 2 può comprendere una prima faccia 2a collegabile con la struttura a multi-microbilance 3 e una seconda faccia 2b, contigua, che si estende generalmente perpendicolare alla prima faccia 2a. La seconda faccia 2b à ̈ destinata, nell’uso, ad essere la faccia superiore del dispositivo di rilevamento concentrazione 1, come sarà chiarito in seguito. I fori di ingresso 10 sono formati sulla seconda faccia o faccia superiore 2b e i condotti di ingresso 11 si estendono generalmente verso il basso fino alle cavità di reazione 16. Le cavità di reazione 16 si aprono sulla prima faccia 2a del corpo 2 nelle rispettive camere di reazione 12 formate nella struttura a multi-microbilance 3.

I fori di sfiato 17 si estendono anch'essi attraverso la seconda faccia 2b. Uno strato sigillante intermedio 18, ad esempio gomma biocompatibile, poliuretano, silicone o colla, Ã ̈ disposto tra il corpo 2 e la struttura a multimicrobilance 3.

La struttura a multi-microbilance (presentata in maggiore dettaglio nella fig. 2) comprende un substrato 20, ad esempio una scheda in plastica del tipo usato per i circuiti stampati. Il substrato 20 ha una prima parete 20a che guarda verso il corpo 2 e che porta una pluralità di microbilance 8 (una per ciascun cella di misura 5, come indicato precedentemente).

Ciascuna microbilancia 8 può avere la struttura descritta in EP-A-2204641 e può comprendere una matrice 21, di materiale semiconduttore, ad esempio, silicio, comprendente un diaframma 23 che porta una pila di strati 22 comprendente uno strato piezoelettrico (non illustrato) interposto tra una coppia di elettrodi (anch'essi non illustrati) ed uno strato sensibile (anch'esso non illustrato) in grado di legarsi con sostanze chimiche target. Ciascuna matrice 21 può avere un’area di 200x200 o 300x300 µm2. La pila 22 à ̈ collegata ad un oscillatore (integrato nella stessa matrice o esterno alla matrice) per formare un risonatore, la cui frequenza dipende dalla massa della microbilancia, come spiegato in dettaglio in EP-A-2204641 precedentemente citato e illustrato schematicamente nella fig. 10. Pertanto, il legame della sostanza chimica target può essere rilevato dalla variazione di frequenza delle microbilance 8. Tuttavia, altri tipi di microbilance possono essere usate.

La matrice 21 ha attenuatori 25 collegati, attraverso fili 26 e connessioni 27 e il primo e il secondo attenuatore 28a, 28b sono collegati ad una seconda faccia 20b del substrato, per la connessione all’esterno.

Uno strato di rivestimento 30, ad esempio uno strato isolante protettivo (glob top) o altra resina biocompatibile usata nelle schede a circuito stampato per rivestire piastrine, si estende sulla prima faccia 20a del substrato 20 ma non sulle pile 22 e incorpora i fili 26. Uno strato trasparente 31 (ad esempio, di vetro o di plastica) circonda lo strato di rivestimento 30 e ha finestre o aperture nelle camere di reazione 12. Lo strato trasparente 31 à ̈ attaccato al corpo 2 attraverso lo strato sigillante intermedio 18. Uno strato di sigillatura bilance 32 à ̈ interposto tra lo strato trasparente 31 e lo strato di rivestimento 30. Le aperture o le cavità dello strato di rivestimento 30, dello strato trasparente 31 e dello strato di sigillatura bilance 32 formano le camere di reazione 12 (si veda anche la fig. 3). Nel complesso, ciascuna camera di reazione 12 à ̈ capace di contenere almeno 20 µl di liquido da analizzare.

Come indicato, le celle 5A-5E sono destinate ad essere caricate con campioni diversi in modo da definire una cella di calibrazione 5A, una prima cella di riferimento 5B, una seconda cella di riferimento 5C, una prima cella di misura 5D ed una seconda cella di misura 5E, in cooperazione con le rispettive microbilance 8, pertanto definite anche come microbilancia di calibrazione 8A, prima microbilancia di riferimento 8B, seconda microbilancia di riferimento 8C, prima microbilancia di misura 8D ed seconda microbilancia di misura 8E. Naturalmente, i campioni possono essere preparati in due o tre copie per maggiore precisione, e il numero di celle deve essere regolato in conformità. Inoltre, molteplici celle di calibrazione possono essere necessarie per preparare una curva standard. Tuttavia, queste cinque celle possono dimostrare i principi di base del dispositivo di misura.

Sarà ora descritto il metodo per misurare la concentrazione dell’ormone TSH con riferimento alle Figure 4-9. In particolare, le figg. 4-7 mostrano l’alimentazione di ciascuna delle celle 5A-5E in fasi successive del presente metodo.

Inizialmente, prima di montare le microbilance 8 sul corpo 2, fase 60 di fig. 9, un anticorpo primario 40 (ad esempio, l’anticorpo murino anti-h TSH 5405 SP-1) à ̈ depositato sugli strati sensibili 22 di tutte le microbilance 8A-E, usando una tecnica di spotting (fase di funzionalizzazione). Questa può essere eseguita come fase di fabbricazione, in modo che le microbilance 8 specifiche per alcuni test comuni siano vendute pronte all’uso, o queste possono essere eseguite dall’utente, in modo che lo stesso hardware possa essere usato per qualsiasi test.

Quindi, fase 62, le microbilance 8 sono assemblate con il corpo 2 usando le graffe 4 o altri elementi di fissaggio, per ottenere il dispositivo di rilevamento della concentrazione 1 di fig. 1.

Dopodiché, viene eseguita una misura di calibrazione, senza introdurre liquidi nelle celle 5A e 5E, fase 64, generando cinque valori di frequenza f1A-f1E, uno per ciascuna cella 5A-5E. La misura può essere eseguita come descritto in EP-A-2204641, precedentemente citato. La misura di calibrazione ha lo scopo di permettere la calibrazione e la normalizzazione del dispositivo di rilevamento concentrazione 1, con la misura della frequenza della cella 5A di calibrazione usata per calibrare le altre celle 5B-5E, per compensare qualsiasi margine di produzione e i risultati delle misurazioni sono memorizzati per normalizzare le letture seguenti.

Quindi, i campioni di riferimento 41A-41C e i campioni di misura 41D e 41E vengono introdotti nelle celle 5A-5E attraverso i fori di ingresso 10, ad esempio, usando siringhe 42 con i campioni, fase 66. Naturalmente, l’applicazione del/dei campione/i può essere preceduta da un tampone di bloccaggio, come usuale per ridurre il legame non specifico verso gli anticorpi.

In dettaglio, come illustrato in fig. 4, la cella di calibrazione 5A à ̈ alimentata con un campione vuoto 41A, che comprende soltanto un veicolo liquido quale acqua o siero e/o tampone, quando adatto; la prima cella di riferimento 5B à ̈ alimentata con un primo campione di riferimento 41B, che contiene il veicolo liquido e una concentrazione bassa nota del materiale target 44. La seconda cella di riferimento 5C à ̈ alimentata con un secondo campione di riferimento 41C, contenente il veicolo liquido e una concentrazione elevata nota del materiale target 44; la prima cella di misura 5D à ̈ alimentata con un primo campione di misura 41D (campione da analizzare, ad esempio un liquido organico quale sangue, urina, saliva o altri campioni biologici) che à ̈ stato diluito in modo noto (ad esempio, 1:4) e contiene pertanto una concentrazione bassa non nota del materiale target 44. La seconda cella di misura 5E à ̈ alimentata con un secondo campione da analizzare 41E, che non à ̈ diluito, e contiene pertanto una concentrazione elevata non nota del materiale target 44. I materiali target 44 nel primo e nel secondo campione di riferimento 41B, 41C possono essere sintetici o possono essere campioni internazionali standard di concentrazione nota.

Le siringhe per i campioni 42 possono essere azionate simultaneamente mediante un sistema di azionamento esterno (non illustrato). I campioni 41A-41E viaggiano lungo i condotti di ingresso 11 e raggiungono le camere di reazione 12 delle rispettive celle 5A-5E. Qui, l’ormone TSH 44 si lega agli anticorpi primari 40 prima di raggiungere i condotti di collegamento 13 e quindi le camere di scarico 14, come illustrato nei dettagli ingranditi. Il primo e il secondo campione di misura 41D, 41E possono anche contenere molecole indesiderate 45 che hanno epitopi simili al TSH e possono anche legarsi con gli anticorpi primari 40 o possono legarsi in modo non specifico allo strato sensibile di pila 22, come anche illustrato nei dettagli ingranditi.

Il trasporto dei campioni 41A-41E lungo i condotti 11, 13 avviene parzialmente per gravità, ma può essere aiutato dalla bassa pressione nei condotti di pompaggio 15 generata da pompe di aspirazione 43 collegate ai fori di sfiato 17, che sono progettati in modo da evitare il ritorno di flusso inavvertito dei fluidi. In particolare, le pompe di aspirazione 43 possono essere inattive durante l’iniezione dei campioni 41 ed essere attivate simultaneamente per tutte le celle 5 dopo un tempo prestabilito, per sì che i campioni 41A-41E rimangano nelle camere di reazione 12 per un breve periodo di tempo, prima di essere scaricati nella camera di scarico 14.

In seguito, fase 68 (fig. 5), un liquido di lavaggio 46 del campione viene introdotto nelle celle 5A e 5E dai fori di ingresso 10, ad esempio usando una prima siringa di lavaggio 47. Il liquido di lavaggio 46 del campione può essere qualsiasi soluzione di lavaggio usata nella tecnica, ed à ̈ generalmente detergente e/o acqua tamponata. La soluzione di lavaggio per tutte le celle 5 si muove lungo i condotti 11, 13, nella camera di reazione 12 ed à ̈ scaricata nella camera di scarico 14. Di nuovo, il movimento del primo liquido di lavaggio 46 può essere aiutato con pompe di aspirazione 43. I lavaggi possono essere ripetuti quando necessario.

Quindi, dopo asciugatura delle camere di reazione 12, à ̈ eseguita una seconda misura, fase 70. La seconda misura ha lo scopo di rilevare le variazioni nella frequenza di oscillazione dalla seconda alla quinta microbilancia 8B-8E dovute al legame dei materiali target 44 (e qualsiasi molecola indesiderata 45 che possa rimanere) e genera cinque valori di frequenza f2A-f2E(f2Aessendo usato di nuovo per la calibrazione). I risultati delle seconde misurazioni sono anche memorizzati per l’uso successivo.

Successivamente, fase 72 e fig. 6, attraverso i fori di ingresso 10 viene introdotto un secondo anticorpo 48 nelle celle 5B-5E, ad esempio mediante siringhe per l’anticorpo secondario 49. Anche qui nella cella di calibrazione 5A viene introdotto un campione vuoto senza anticorpo secondario. L’anticorpo secondario può essere, ad esempio, un anticorpo secondario murino Anti-h TSH 5409 SPTNE-5 o qualsiasi anticorpo anti-TSH che preferibilmente si lega ad un epitopo sul TSH diverso rispetto al primo anticorpo. Pertanto, l’anticorpo secondario si lega preferenzialmente soltanto al materiale target 44 (ad esempio TSH), ma non alle molecole indesiderate 45. Anche in questo caso, le siringhe per l’anticorpo secondario 49 iniettano l’anticorpo secondario 48 nei condotti di ingresso 11 e questo raggiunge le camere di reazione 12 delle rispettive celle 5A-5E per gravità. Dopo un breve periodo di tempo, possono essere azionate le pompe di aspirazione 43 in modo da scaricare nella camera di scarico 42 gli anticorpi secondari 48 che non hanno reagito.

Successivamente, fase 74 e fig. 7, nelle celle 5A-5E, dai fori di ingresso 10, viene introdotto un secondo liquido di lavaggio 51, ad esempio usando una seconda siringa di lavaggio 50. Il secondo liquido di lavaggio 51 può essere lo stesso del primo liquido di lavaggio o può essere diverso e il suo movimento può essere aiutato dalle pompe di aspirazione 43. Come in precedenza, le fasi di lavaggio possono essere ripetute.

Quindi, dopo l'asciugatura delle camere di reazione 12, viene eseguita una terza misura, fase 76. La terza misura ha lo scopo di rilevare le variazioni della frequenza di oscillazione dalla seconda alla quinta microbilancia 8B-8E dovute al legame dei materiali target 44, l’anticorpo secondario 48 (e qualsiasi sostanza indesiderata 45) e genera cinque valori di frequenza fEA-f3E. I risultati della terza misura sono anche memorizzati per l’uso successivo.

Quindi, fase 78, vengono calcolate le frequenze differenziali (differenza tra i terzi e i secondi valori di frequenza misurati) per le celle campione e di riferimento 5B-5E:

Le frequenze differenziali sono direttamente correlate alla quantità di anticorpo secondario che ha reagito e sono indirettamente correlate, rispettivamente, alla quantità di materiale target 44 nei diversi campioni. Infatti, poiché il secondo anticorpo non reagisce (o reagisce minimamente) con le molecole indesiderate, le frequenze differenziali nella prima e seconda cella del campione non sono influenzate dalle molecole di legame non specifico.

Usando la frequenza di calibrazione fAe le frequenze differenziali di riferimento ΔfBe ΔfC, si ottiene una curva di riferimento 55 come illustrato in fig. 8, che mostra sulle ascisse la quantità nota di materiale target nella cella di calibrazione 5a e nella prima e seconda cella di riferimento 5B, 5C e sulle ordinate le frequenze differenziali corrispondenti, fase 78.

Quindi, fase 80, viene scelta la frequenza differenziale campione ΔfDo ΔfEche deve essere confrontata con la curva di riferimento 55. Infatti, in base alla concentrazione specifica del materiale target nel campione, una delle due letture può essere non in scala o in una parte meno precisa della curva. In particolare, se la concentrazione del materiale target à ̈ molto elevata, la misura fatta usando il campione non diluito 41E può essere più elevata rispetto al secondo valore di riferimento ΔfC, in cui la curva di calibrazione 55 à ̈ meno affidabile. In questo caso, viene usata la misura che deriva dal campione diluito 41D (frequenza differenziale diluita ΔfD). Al contrario, nel casi di bassa concentrazione del materiale target nel campione da usare, il campione diluito può avere una concentrazione di materiale target troppo bassa. In questo caso, la lettura del campione diluito viene ignorata, e vengono usati i risultati della lettura del campione non diluito.

In generale, selezionando un adatto livello di diluizione del campione 41D diluito, una delle due frequenze differenziali ΔfDe ΔfEnon rientra nell’intervallo, così la selezione à ̈ fatta semplicemente confrontando le frequenze differenziali del campione ΔfDe ΔfEcon l’intervallo lineare della curva di calibrazione 55 (ad esempio, l’intervallo tra ΔfBe ΔfC) e scartando la frequenza differenziale campione che cade all’esterno dell’intervallo ammissibile.

Successivamente, la concentrazione del campione corrispondente alla frequenza campione differenziale scelta viene letta dalla curva di calibrazione 55, fase 82. Nel caso venga usata la frequenza differenziale diluita ΔfD, la lettura del valore di concentrazione della curva di calibrazione 55 viene moltiplicata per il rapporto di diluizione.

Al termine, la concentrazione rilevata può essere visualizzata o inviata in uscita in altro modo o anche memorizzata per il successivo uso o elaborazione, fase 84.

Il dispositivo di rilevamento concentrazione 1 può essere usato in combinazione con un’apparecchiatura di analisi biochimica 90 presentata in fig. 10. L’apparecchiatura 90 comprende il dispositivo di rilevamento concentrazione 1 di fig. 1 collegato ad una unità elettronica 91, che comprende uno stadio oscillatore 92 ed un convertitore 93, ad esempio un contatore. Lo stadio oscillatore 92 comprende una pluralità di oscillatori 94, uno per ciascuna microbilancia 8, e forma con esse una pluralità di risonatori, le cui frequenze sono le frequenze misurate descritte con riferimento alle figg. 4-9. In particolare, lo stadio oscillatore 92 pilota le microbilance 8 e genera una pluralità di segnali periodici (treni di impulsi) aventi frequenze uguali alle frequenze dei risonatori. Durante le fasi di misura 64, 70 e 76 il contatore 93 conta il numero N di impulsi per ciascun segnale periodico entro un intervallo T di tempo fisso e genera segnali digitali che codificano le frequenze misurate. Lo stadio oscillatore 92 può essere integrato in una propria singola piastrina connessa a tutte le microbilance 8 o integrato per ciascuna microbilancia 8 in una rispettiva matrice 21.

L’uscita dell’unità elettronica 91 à ̈ connessa ad un’unità di elaborazione 95 comprendente un microcontrollore 96 connesso ad una memoria 97, ad esempio di tipo EEPROM, ad uno stadio di alimentazione di potenza 98, ad uno stadio di entrata/uscita 99, ad esempio per visualizzare i risultati, e ad uno stadio di pilotaggio 100, per controllare il funzionamento automatico delle parti meccaniche del dispositivo di rilevamento concentrazione 1, ad esempio della pompa d’aspirazione 43. Il microcontrollore 98 acquisisce quindi le misure della frequenza, genera la curva di riferimento 55, sceglie la frequenza differenziale campione ΔfDo ΔfE, confronta la frequenza differenziale campione scelta con la curva di riferimento e controlla l’uscita dei risultati finali.

L’unità elettronica 91 e l’unità di elaborazione 95 possono essere contenute in un involucro esterno 101 che comprende una cavità (non illustrata) per inserire il dispositivo di rilevamento concentrazione 1, i connettori elettrici (non illustrati) per la connessione alle microbilance 8 nonché le parti meccaniche accoppiate allo stadio di pilotaggio 100 e utili per il funzionamento automatico o semiautomatico del dispositivo di rilevamento concentrazione 1, quali le siringhe 42, 47, 49, 50, la pompa di aspirazione 43, un attuatore per la pompa di aspirazione 49, valvole, sensori di monitoraggio e così di seguito.

Ad esempio, l’involucro esterno può comprendere emettitori luminosi e ricevitori luminosi (non illustrati), da disporre, ad esempio, sulla porzione superiore e inferiore del corpo 2 per monitorare la presenza e il passaggio dei liquidi nei percorsi fluidici 9. Inoltre, l’apparecchiatura di analisi biochimica 90 può comprendere un modulo di controllo della temperatura.

Il dispositivo di rilevamento concentrazione 1 permette la misura della concentrazione di un materiale target, quale il TSH, in modo automatico, con il rilascio di tutti i reagenti in un singolo componente (corpo 2), dopo lo spotting del primo anticorpo e l’assemblaggio della struttura a multimicrobilance 3 sul corpo 2. Infatti, tutte le operazioni successive (introduzione dei campioni e dei liquidi di lavaggio, l'avanzamento di tutti i liquidi nel percorso fluidico, l’acquisizione delle misure di frequenza e la determinazione delle concentrazioni) possono essere controllate in modo automatico mediante l’apparecchiatura di analisi biochimica 90.

Il dispositivo di rilevamento concentrazione 1 à ̈ molto sensibile e può misurare un ampio intervallo di concentrazioni di materiale target includendo una cella di campione diluito e una cella di campione non diluito.

Infatti, l’intervallo di riferimento standard per il TSH à ̈ tra 0,4 e 5 µIU/ml (in cui 1µIU ï‚» 0,5 ng), ma i valori variano leggermente da laboratorio a laboratorio ed esiste disaccordo nel campo diagnostico cosa costituisce un intervallo di riferimento normale. L’Associazione Americana degli Endocrinologi Clinici (AACE) ora raccomanda che i medici usino dallo 0,3 al 3,0 µIU/ml come intervallo normale.

In ogni caso, una microbilancia può avere vantaggiosamente una sensibilità compresa tra 0,03 µIU/ml (un decimo del valore normale minimo) e 30-50 µIU/ml (dieci volte il valore normale massimo) e questo à ̈ un intervallo dinamico più che sufficiente per il saggio.

Il presente dispositivo e metodo coinvolgono le stesse reazioni che avvengono nel corpo umano; infatti, non sono usati cromofori, reagenti o altri materiali estranei, pertanto si ottengono risultati affidabili.

I liquidi scaricati sono raccolti nella camera di scarico 14 dalla quale essi non possono né uscire né ritornare nella camera di reazione 12 o all’esterno, a causa della forma serpeggiante del condotto di scarico 13; pertanto il dispositivo 1 impedisce qualsiasi contaminazione interna o esterna in modo affidabile.

Il dispositivo di rilevamento concentrazione 1 à ̈ del tipo monouso e forma una cartuccia che può essere inserita nell’apparecchiatura 90 e quindi eliminata per essere sostituita da una nuova, per un’ulteriore operazione di misura. Questa operazione à ̈ molto semplice, può essere controllata automaticamente e non richiede manipolazione da parte di tecnici di laboratorio altamente specializzati.

Il calcolo della curva di riferimento misurando la variazione di frequenza dei campioni di riferimento insieme ai campioni di misura tiene conto intrinsecamente dell’efficienza della reazione antigene-anticorpo.

Infine, à ̈ chiaro che numerose modifiche e varianti possono essere apportate al metodo e al dispositivo qui descritti e illustrati, tutti rientranti nell'ambito protettivo dell’invenzione, come definita nelle rivendicazioni allegate. Ad esempio, la pompa di aspirazione 43 può essere sostituita da qualsiasi altro mezzo, ad es. da una singola pompa esterna, ad es. una pompa nell’apparecchiatura 90, collegata ai fori di sfiato 17.

Inoltre, anche se il dispositivo à ̈ stato esemplificato qui solo con TSH e usando cinque celle, le celle possono essere aumentate, ed il dispositivo à ̈ predisposto in modo da rilevare uno o più tra TSH, T3, T4 e anticorpi anti-microsomi tiroidei e antitireoperossidasi (anti-TPO), determinati clinicamente adatti alla rilevazione di diverse patologie tiroidee. Inoltre, il dispositivo può facilmente essere modificato per rilevare qualsiasi altro materiale biologico rilevabile mediante anticorpi.

Claims (17)

1. RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo (1) per rilevare la concentrazione di materiali biologici, comprendente: un corpo (2) comprendente una pluralità di percorsi fluidici (9); e una struttura a multi-microbilance (3) che porta una pluralità di microbilance (8), ciascuna microbilancia avendo una porzione sensibile (22) rivolta verso una camera di reazione (12), il corpo (2) e la struttura a multi-microbilance (3) essendo configurati in modo da essere meccanicamente accoppiati insieme e ciascuna microbilancia (8) essendo configurata per essere accoppiata ad un rispettivo percorso fluidico (9), ciascun percorso fluidico (9) comprendendo un ingresso (10), un condotto (11, 13) ed uno scarico per liquido (14), ciascun condotto (11) essendo configurato in modo da essere accoppiato con una rispettiva camera di reazione (12), la pluralità di percorsi fluidici (9) e le microbilance (8) formando almeno una prima ed una seconda cella di riferimento (5B, 5C) ed una prima cella di campione (5D).
2. 2. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui la pluralità di percorsi fluidici (9) e le microbilance (8) formano inoltre una cella di calibrazione (5A).
3. 3. Dispositivo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la pluralità di percorsi fluidici (9) e le microbilance (8) formano inoltre una seconda cella di campione (5E).
4. 4. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui ciascun ingresso (10) della pluralità di percorsi fluidici (9) à ̈ configurato in modo da essere accoppiato ad un rispettivo contenitore (42, 46, 49, 50) di un liquido di riferimento o campione.
5. 5. Dispositivo secondo la rivendicazione 4, in cui i contenitori (42, 46, 49, 50) sono siringhe.
6. 6. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui i percorsi fluidici (9) hanno la stessa forma.
7. 7. Dispositivo secondo la rivendicazione 6, in cui ciascun condotto comprende un condotto di ingresso (11) collegato ad un rispettivo ingresso (10), una porzione di reazione (11A), collegata ad un condotto di ingresso e accoppiabile ad una rispettiva camera di reazione (12), un condotto di scarico (13), avente una forma serpeggiante e che si estende tra la porzione di reazione e lo scarico per liquido (14).
8. 8. Dispositivo secondo la rivendicazione 7, in cui lo scarico per liquido à ̈ una camera di scarico (14) ed à ̈ collegato ad un foro di sfiato (17) che si estende nel corpo (2), il foro di sfiato essendo configurato per essere accoppiato ad una sorgente di vuoto (43).
9. 9. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui ciascuna microbilancia (8) comprende un diaframma (23) che porta una rispettiva porzione sensibile (22) rivolta verso una propria camera di reazione (12) e configurata in modo da legarsi ad un anticorpo primario di un materiale biologico target.
10. 10. Apparecchiatura per misurare la concentrazione di un materiale biologico, comprendente il dispositivo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, e comprendente una pluralità di circuiti oscillanti (94) collegati ad una rispettiva microbilancia (8), ciascun circuito oscillante (94) formando, insieme alla rispettiva microbilancia (8), un circuito risonante collegato ad un convertitore (93) configurato in modo da generare un segnale di frequenza.
11. 11. Apparecchiatura secondo la rivendicazione 10, comprendente: una sorgente di vuoto (43) accoppiabile agli scarichi per liquidi (14) della pluralità di percorsi fluidici (9); un’unità di elaborazione (96), accoppiabile a dette microbilance (8); ed una memoria (97), collegata a detta unità di elaborazione e memorizzante valori di frequenza dei circuiti risonanti e una curva di riferimento (55); e uno stadio di pilotaggio (100) accoppiabile alla sorgente di vuoto.
12. 12. Metodo per misurare la concentrazione di materiali biologici in un dispositivo (1) di rilevamento della concentrazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, il metodo comprendendo: legare un primo anticorpo alla porzione sensibile delle microbilance; prima reazione di un primo anticorpo con un primo campione di riferimento avente una prima concentrazione nota di un materiale biologico target, un secondo campione di riferimento avente una seconda concentrazione nota, superiore alla prima concentrazione nota, del materiale biologico target, e un primo campione di misura avente una prima concentrazione non nota del materiale biologico target, in una prima e una seconda microbilancia di riferimento (8B, 8C) e in una prima microbilancia di campione (8D), rispettivamente; prima misura di una quantità riferita al peso del primo materiale che ha reagito in ciascuna microbilancia (8) per ottenere primi risultati di misura per ciascuna microbilancia; seconda reazione di un anticorpo secondario con il materiale biologico target legato, in ciascuna microbilancia; seconda misura di una quantità riferita al peso dei secondi materiali che hanno reagito in ciascuna microbilancia per ottenere secondi risultati di misura; calcolo di una prima quantità riferita al peso dei materiali target che hanno reagito in ciascuna microbilancia dai primi e secondi risultati; generazione di una curva di riferimento (55) dalle quantità riferite al peso dei materiali target che hanno reagito nella prima e nella seconda microbilancia di riferimento (8B, 8C) e confronto delle quantità riferite al peso del materiale target che ha reagito nella prima microbilancia di misura (8D) con la curva di riferimento per rilevare la concentrazione non nota del materiale biologico target.
13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, comprendente: far reagire il primo anticorpo con un secondo campione di misura avente una seconda concentrazione non nota, superiore alla prima concentrazione non nota, durante la prima reazione, in una seconda microbilancia di campione (8E); misurare una quantità riferita al peso del materiale che ha reagito nella seconda microbilancia campione, durante la prima misura, per ottenere un terzo risultato di misura di concentrazione; far reagire l’anticorpo secondario con il materiale biologico target legato nella seconda microbilancia di campione, durante la seconda reazione; misurare una quantità riferita al peso del materiale target che ha reagito nella seconda microbilancia campione, durante la seconda misura, per ottenere un quarto risultato di misura di concentrazione; calcolare una seconda quantità riferita al peso del materiale target che ha reagito nella seconda microbilancia campione dal terzo e dal quarto risultato di misura di concentrazione; confrontare la quantità riferita al peso con la curva di riferimento (55); e scaricare la prima o la seconda quantità riferita al peso esterna ad un intervallo di misura della prima e seconda microbilancia di riferimento (8B, 8C).
14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 12 o 13, comprendente: prima della prima reazione, effettuare una misura di calibrazione delle quantità riferite al peso nella prima e seconda microbilancia di riferimento (8B, 8C), nella prima microbilancia di campione (8D) e in una microbilancia di calibrazione (8A); in cui la prima reazione comprende introdurre il primo e il secondo campione di riferimento nel primo e secondo percorso fluidico di riferimento (9B, 9C), introdurre il primo campione di misura nel primo percorso fluidico di misura (9D), introdurre un campione di calibrazione con concentrazione zero del materiale target in un percorso fluidico di calibrazione (9A); e la seconda reazione comprende introdurre il secondo anticorpo nel primo e nel secondo percorso fluidico di riferimento, nel primo percorso di misura di fluidi, e nel percorso di calibrazione di fluidi.
15. 15. Metodo secondo la rivendicazione 13 o 14, comprendente accoppiare una struttura a multimicrobilance (3) comprendente le microbilance (8) con un corpo (2) dopo aver legato un primo anticorpo a porzioni sensibili (22) della prima e della seconda microbilancia di riferimento (8B, 8C) e della prima microbilancia di misura (8D) e prima della prima reazione.
16. 16. Metodo secondo qualsiasi delle rivendicazioni 12-15, in cui la prima e la seconda reazione comprendono far avanzare i rispettivi campioni da un rispettivo ingresso (10) verso una rispettiva camera di reazione (12), attendere un tempo di reazione, scaricare il rispettivo campione nei rispettivi scarichi per liquidi (14), introdurre liquidi di lavaggio nei rispettivi percorsi fluidici e scaricare i liquidi di lavaggio.
17. 17. Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui scaricare i rispettivi campioni e scaricare i liquidi di lavaggio comprendono applicare una sottopressione nei rispettivi percorsi fluidici (9).