JP2001501479A

JP2001501479A - アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合の同定

Info

Publication number: JP2001501479A
Application number: JP10517291A
Authority: JP
Inventors: シュミット、グンテル; トムソン、アンドリュー、ヒュージン
Original assignee: ブラックスグループリミテッド
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-06
Publication date: 2001-02-06
Also published as: AU4565297A; CN1232510A; CA2267524A1; AU732121B2; EP0956366A1; IL129312A0; NZ334987A; WO1998015651A1; CA2267524C; US6500615B1; GB9620749D0

Abstract

(57)【要約】標的mRNAに結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する方法であつて、ハイブリダイゼーション条件下で前記標的mRNAとオリゴヌクレオチドライブラリーの要素のそれぞれとを個別に接触させること、ハイブリダイズしていない材料を除去すること、およびどの要素がハイブリダイズしているかを決定することを含み、ここで、前記オリゴヌクレオチドライブラリーは、予め決定されている共通の長さを有する複数の異なるヌクレオチド配列を含み、またここで、それぞれのヌクレオチド配列は４〜８塩基の既知の配列を含み、前記既知の配列の可能なすべての組み合わせが前記ライブラリー中に存在する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの同定方法。

Description

【発明の詳細な説明】アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合の同定発明の分野本発明は、アンチセンス剤がRNA分子内においてアクセスする部位を同定するための方法、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定するための方法に関する。発明の背景 RNAに結合するオリゴヌクレオチド（ON）を同定するために使用されるほとんどのライブラリーストラテジーは、それらの選択方法の主要構成要素として、RN Ase Hによる標的mRNAの切断に依存している。しかし、これは、正常なWatson-Cr ick相互作用によって標的物と結合するONを対象に選択するに過ぎない。標的RNA に結合するONは、RNAse Hによる切断を仲介することができ得られたフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によって単離することができる。好結果をもたらすONの正確な配列は、フラグメントの配列を決定することによって決まる。MishraおよびToulme（１）は、標的物に結合するODN（オリゴデオキシヌクレオチド）の選択的増幅に基づく別の選択手順を開発し、その結合に非Watson-Crick相互作用があることを明らかにしている。彼らのプロトコルにおいては、RNAse Hストラテジーとちようど同じ配列決定が必要とされるが、彼らの決定するものはODNの配列であり、標的RNAフラグメントの配列は決定していない。更に、ほとんどのライブラリーストラテジーでは、溶液中で遊離のライブラリーを使用するが、これは、ライブラリー内のONのクロスハイブリダイゼーションの問題を伴う。このことは、クロスハイブリダイゼーションが最小限に抑えられたサブセットの多数のライブラリーを使用することによって解決することができるが、このことにより有効なアンチセンス特性を有するODNを選択しなければならず労力がかかる。発明の概要本発明は、標的mRNAに結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する方法を提供し、該方法は、ハイブリダイゼーション条件下で標的mRNAとオリゴヌクレオチドライブラリーの要素のそれぞれとを個別に接触させること、ハイブリダイズしていない材料を除去すること、およびどの要素がハイブリダイズしているかを決定することを含み、ここで、オリゴヌクレオチドライブラリーは、予め決定されている共通の長さを有する複数の異なるヌクレオチド配列を含み、またここで、それぞれのヌクレオチド配列は４〜８塩基の既知の配列を含み、該既知の配列の可能なすべての組み合わせがライブラリー中に存在する。オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素を個別の容器内の標的mRNA に接触させ得、該標的mRNAは該容器内に固定され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素をハイブリダイゼーションアレイ上の個別の位置で固定化してもよい。好ましくは、既知の配列の長さは４〜６である。オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素は、１組のヌクレオチド配列を含んでもよい。それぞれのヌクレオチド配列は、既知の配列を含むウインドウ領域および８塩基以下の隣接領域を有してもよく、ここで、隣接領域内における塩基の可能なすべての組み合わせがそれぞれの組に存在し、ヌクレオチド配列の共通の長さは12塩基以下、好ましくは10塩基以下である。ヌクレオチドは、DN Aアナログから作製してもよい。１つの構成において、どの要素がハイブリダイズするかを決定する工程は、より迅速にハイブリダイズする要素を決定することを含む。ハイブリダイズする要素のそれぞれの配列を、標的mRNAに関する配列情報と比較し、標的mRNAにおいて１つ以上のアンチセンス結合部位を同定してもよい。好ましい実施態様の説明本発明は、mRNA内のアクセス部位を同定する問題を意図しているが、この技術の目的は、任意のRNA分子に適用可能で、配列決定を必要とせず、RNAse Hの使用によって左右されない系においてアクセス部位を見出すことである。本特許において強調したい点は、短いオリゴヌクレオチド（ON）プローブ、好ましくは４マーのONプローブライブラリーを使用することである。本発明は、ライブラリーにおけるプローブのそれぞれと標的物とのハイブリダイゼーション反応を追跡することによって、短いONプローブに対するRNAのアクセス部位を決定する方法を提供する。プローブは個別に単離され、反応中に存在し、そしてプローブまたは標的RNAのいずれか一方が固定化される。４マーという短いウインドウを有するプローブを用いる理由には、ある所定の４マーはそのほとんどが２次または３次構造上に出現することが仮定されていることにある。個々のハイブリダイゼーションによって得られるデータは、１次構造を対象に解釈される:RNAの１次構造内に４マーが重複して偏在することによって、いくつかの４マーのアクセス領域へのハイブリダイゼーションが顕著になる。曖昧さ（Ambiguities）は、一部に、結合の動力学の解析により解決することができるはずであり、４マーが１回を超えて生じる場合でさえもなお、ほとんどの場合、RNA中に存在するほとんどのアクセス領域を同定することが可能であるはずである。短いプローブを使用することの重要性は、それによりライブラリーのすべての要素のハイブリダイゼーションの挙動を較正し、そして規準化できることにある。何故なら、ライブラリーは、実際的でないほどには大きくはないからである。４マーライブラリーは256の要素を有し、これは適度の数字であり、そして系を較正するために多数のモデル分子に対してそのようなライブラリーを試験するのに現実的である。ほとんどの４マーは所定の程度のアクセス容易度に対して異なる結合エネルギーを有するため、較正は重要である。ハイブリダイゼーション動力学に基づきアクセス可能である分子の領域を同定するためには、個別の重複した４マーが異なる動力学を有する同じアクセス部位に結合することを考慮して、規準化された動力学データを比較し得ることが必要である。プローブの空間的単離を所望する場合、構築および操作するためには小さなアレイのプローブがより安価である。更に、短いプローブの方が、ハイブリダイゼーション反応の解析を複雑にするそれ自体の任意の２次または３次構造を有し難い。ハイブリダイゼーション時間は、それぞれのハイブリダイゼーション反応についての動力学データを取るために変化し得る。所定の時間後にハイブリダイズしたプローブONの量から、標的物に対するそのプローブの結合親和性についての定量的データが得られる。ハイブリダイゼーション期間を変化させることによって、それぞれのプローブのハイブリダイゼーションに要する経過時間を知ることができる。構造の任意の領域のアクセス容易性は、その相補的プローブが結合するのにかかる時間と逆関数関係にあり、それゆえ、このアプローチによって、２次構造についての詳細な情報を獲得することができる。シンチレーション近接アッセイ（Scintillation Proximity Assay(Amesham社製)）と組み合わせると、以下に記載のように、洗浄する必要がなく、より短いプローブを使用することができ、そしてそれぞれのハイブリダイゼーション反応を実時間で追跡することができるという点で、この系はより効果的である。 RNA構造の分子プローブプローブの空間的単離および固定化により、溶液中で遊離しているオリゴヌクレオチドライブラリーの使用に伴うクロスハイブリダイゼーションの問題が避けられ、結果の解釈が簡単になる。この方法では、RNAse Hによる最も効果的な切断部位を決定する必要がなく、標的RNAの構造についての詳細な情報が得られ、効果的なアンチセンス剤を開発することができる標的化した分子の合理的な設計を可能にし、RNAse Hによって仲介されたRNAの崩壊に基づいて操作する必要がない。これまでのライブラリーストラテジーを超える利点：本発明は、ONのランダムライブラリーを使用する。何故なら、所定の長さのON のランダムライブラリーにおいて、その長さにおいて可能な配列が全て提示され、それゆえ、所定の標的RNAを含むその長さのすべてのサブ配列も提示されるからである。このことは、ランダムライブラリーが任意のRNAに適用可能であり、RNA内のすべての標的配列を含有することを意味する。ONは独立して監視されることから、このことは、このアプローチが先行する特許PCT/GB96/02275 に記載の標的化されたライブラリーを必要とし、それらについての詳細な動力学的挙動を提供することを意味する。従ってこの系により、正常なWatson-Crick相互作用に対するRNAのサブ領域のアクセス容易性に関する明確なデータを取ることができる。非Watson-Crick相互作用は、正常な相補的相互作用に比べて一般的ではないかもしれないが、これに類似の系において提示される。標的RNAに対して部分的に相補的である領域との相互作用が予想される。Watson-Crick相互作用がここで起こり得る唯一の潜在的な相互作用であるならば、そのような部分的なハイブリダイゼーションは弱いものであることが予想されるが、MishraおよびToulmeが提唱している（１）ように非Watson-Crick相互作用が役割を果たしているならば、これらの相互作用のサブセットは標的RNAとより強い相互作用を有することが予想される。従って、このストラテジーは、非Watson-Crick相互作用である潜在的に特異的な相互作用を同定する。ランダムライブラリーで実施した実験と標的化したライブラリーで実施した実験との結果には差異が認められるようである。本発明者らの先行の特許出願PCT/ GB96/02275で実施した実験のそれぞれのライブラリーによって、異なる切断部位が同定された。それらの実験において、標的化されたライブラリーは、標的RNA 、TNFaの３つの特異的サブ領域しか含まなかった。しかし、このライブラリーによって同定された部位は、ランダムライブラリーでは同定されなかった。このことは、おそらく、標的化したライブラリーがより少ない要素しか有さず、ここで、それぞれの要素は、ランダムライブラリーの要素である場合より高い相対濃度で存在することによるものであろう。従って、ランダムライブラリーは、標的化されていないライブラリーには含まれていない領域において、より多くのアクセス部位を選出したが、標的化されたライブラリーにおいて使用される領域に対応するONは同じ切断部位を選出しなかった。標的化されたライブラリーによって選出された切断部位は、それらの相対的に高い濃度によるものと思われたことから、これらは、最もアクセス容易なものではなかったかもしれない。クロスハイブリダイゼーションの問題も、これらの系において評価するのは困難であり、この効果の影響は、ライブラリーのそれぞれのタイプに対して異なると思われる。この新規のアプローチによりこれらの効果のすべてが規準化されるはずであり、更により多くの重要なデータが得られる。このアプローチにより動力学的データも得られるはずであり、下記の通り、標的RNAの構造に関する詳細なデータが得られる。ハイブリダイゼーション実験からの動力学的データ：それぞれのハイブリダイゼーション反応についての動力学的データを取るために、ハイブリダイゼーション時間を変更することができる。所定の時間後のハイブリダイズしたプローブONの量は、標的物へのそのプローブの結合親和性についての定量的データを提供する。ハイブリダイゼーション期間を変更することによって,ハイブリダイゼーション反応についての時間経過を取ることができる。構造の任意の領域のアクセス容易性は、その相補的プローブが結合するのにかかる時間と逆関数関係にあり、それゆえ、このアプローチによって、２次構造についての詳細な情報が獲得されるはずである。必要とされるONの量のために大きなONのライブラリーを使用する場合、この手順は不可能である。大きなライブラリーのそれぞれのプローブの較正には、大きな労力がかかるが、コンビナトリアルにより合成したチップの自動化画像解析により、それは容易であり得る。しかし、大きなオリゴヌクレオチドを使用する必要もなく、望ましくもない。リアルタイム重力学的アッセイ：放射性標識は、所望の特性、特に、³³Ｐ等のような短い経路長の低いエネルギー放射を生じる放射性同位元素を有する好ましい標識スキームである。放射性標識により、近接アッセイの開発が可能にとなる。放出された放射線は、シンチレーションを含む様々な手段またはガイガーカウンターによって検出することができる。近接検出系および相当する近接アッセイは、標識から信号の強度を測定し、検出器からの標識の距離の測定値を示す。例えば、シンチレーション近接アッセイは放射線同位元素から放出される放射線の検出に基づく。シンチレーションの光増幅によって、シンチラント表面に到達する放射線の量を検出する。放射線の特定の形態の平均の経路長はかなり短い。³³Ｐからのβ放射線は、比較的エネルギーが低く、経路が短い。このことは、プローブが検出表面に比較的近い場合にのみ³³Ｐで標識したプローブが検出されることを意味する。放射源から遠い程、測定される強度は低い。RNA分子を³³Ｐで標識し、表面を有するシンチラント上に固定化したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせるか、またはその逆の場合、プローブにハイブリダイズしたRNAの量が増加するとシンチレーションのカウントが増加することが予測される。検出しようとするシンチラント表面の十分近くの溶液における遊離の分子からのバックグランドカウントがあることから、実際のアッセイにおいて標識しようとするRNAまたはプローブに依存して、標識RNAまたはプローブとの対照実験反応を実施しなければならない。この種の系では、プローブの空間的解離が必須である。何故なら、単一の放射性標識しか一度に使用することができず、そのため、単一のプローブまたはRNAしか一度に標識できないからである。放射性標識に基づいたシステムの主な利点は、リアルタイムでハイブリダイゼーション反応を測定して詳細な動力学的データを得ることができることである。リアルタイムでの分析は、Amersham Cytostar-T シンチレーションマイクロプレート等の適切なシグナル処理電子装置に連結した光増幅および検出系によりシンチレーションを検出することによって達成することができる。ハイブリダイゼーションプローブ：短いONのライブラリーを使用する場合は、相補性に関する困難が２つ生じる。固定化したRNAへのプローブのハイブリダイゼーションが十分に強力であることを確実にするためには、合理的な程度のハイブリダイゼーションを確実にするためにオリゴヌクレオチドが十分に長い必要があるが、プローブが長いほど、個々のライブラリーの要素の挙動を解析する労力が大きくなる。RNA/DNAハイブリダイズは、RNA/RNAまたはDNA/DNA二重鎖よりも高い結合エネルギーを有しそれらはいずれのホモ二重鎖よりも安定であるため、より短いプローブ鎖を使用することができ、それを相同的相互作用について使用し得、天然の核酸に対して天然の核酸を含むプローブより高い結合親和性を有する非天然のアナログを使用することができる。非天然の核酸アナログ：本アプローチはRNAse Hによる認識を必要としないため、非天然バックボーンの使用においてより高い柔軟性を有する。任意の相互作用の結合エネルギーを増大するために非天然の塩基アナログを使用することができる。この系の目的のために、メチルホスホノジエステル結合またはペプチド核酸のように天然のホスホジエステル結合より低い荷電のバックボーンを使用し得る。プローブの結合相互作用のエネルギーの増加は、より容易に固定化され、プローブ化されたオリゴヌクレオチドによって二重鎖領域の鎖の侵入を可能にするのに有用であり得る。その動力学は、侵入された領域の構造についての有用な情報を示すはずである。ON プローブの「結合」時間の増加本実施態様で直面する弱いハイブリダイゼーションの問題は、ONが短いほど容易に分子がその標的RNAから解離するという観点から見ると、極めて深刻である。短いONを用いる構造プローブを実施する場合、多数のプローブオリゴヌクレオチドを、固定化したRNAのウェルのそれぞれに添加する。このことにより、ハイブリダイゼーションに好ましいハイブリダイゼーション平衡が誘導され、それにより有意義なハイブリダイゼーションが生じ得る。しかし、一旦非結合のオリゴヌクレオチドが洗い流されると、平衡は、ハイブリダイズしたプローブの解離に好ましく劇的に移行する。相互作用の結合エネルギーを増加させることによって、「現時点の」結合オリゴヌクレオチドを増加させるために、様々な測定を行うことができる。上記の最初の実施態様に記載の非天然の核酸アナログについての類似の考慮が、ここでも当てはまる。この段階では架橋エフェクターを簡便に含み得、このエフェクターは、ハイブリダイズしたプローブが「固定される」ことを確実にするために光活性である。短いONプローブのライブラリーを使用することで、良好なハイブリダイゼーションを得るために合理的な長さの核酸を必要とするが、プローブに追加されるそれぞれの更なる塩基はライブラリーのONの数を指数的に増加することが問題である。それぞれの組が、既知の配列の定められた数の塩基を含み、該配列は一方または他方または両側に更なる定められた数の塩基が結合するような組でオリゴヌクレオチドを構築することによって、オリゴヌクレオチドの短さに伴うハイブリダイゼーションの弱さの問題を克服することができ、ここで、ヌクレオチドの可能なすべての組み合わせが提示され、これらは、ユニバーサル塩基であり得る：上記の例は、Nで表した任意の塩基であり既知の「ウインドウ」配列XXXXの両側に隣接する２つの塩基を有している。このように、256の異なる８マーの組が存在し、固定化したRNAに結合するプローブとして使用し得る。これは、４マーをプローブとした時と効率的に同一であるが、隣接する塩基は相互作用の安定性を増大する。非天然の核酸アナログを組み合わせる場合は、この代替物は複合体の安定性を十分に増大し得、洗浄および定量的測定の実施を可能にする。４マーという短いウインドウを有するプローブを使用することは、それらがあまりにも頻繁にRNA内に出現し得る点で問題となり得、それにより動力学的データの解析をより困難にし得る。何故なら、単一のRNAにおいて、任意の所定の４マーが２回を超えて存在する可能性があるからである。安定化する隣接領域を伴い、５マーまたは６マーをウインドウとして使用することは、任意の所定のRNA にこれらが１回だけ出現する時に追加される労力に対処するために自動化された系が利用可能であるならば、解析をより容易にし得る。プローブのアレイ：マイクロウエルプレート上の個別のウェル内にプローブを空間的に単離することによって、個々にオリゴヌクレオチド（ON）を試験することができる。標的RN Aを固定化し、このRNAに個々に蛍光標識したONを試すことができる。このように４ntのONについては、等量のRNAが固定化されている256個のウェルのアレイが必要である。それぞれのウェルに異なる標識ONが試みられる。ONを予め定められた時間ハイブリダイズさせ、次いで、ハイブリダイズしなかったONを洗い流し得る。それぞれのウェルの蛍光を測定することによって、ハイブリダイズしONの量を決定する。このアプローチでは、例えば、T7ファージRNAポリメラーゼ系を使用して、容易に作製することができる有意な量のRNAが必要である。この他にも、O Nプローブを固定化して、これらに標識したRNAを試す方法がある。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーは、一方で、アレイの異なる領域がライブラリー内で異なるオリゴヌクレオチドを有するようにガラス表面上に固定化されながら構築され得る(２)。可能なすべての配列が提示される場合、８ntの ONのランダムライブラリーには、４⁸の要素が存在し得る。ONはアレイ上ですべて固定化されるため、クロスハイブリダイゼーションは起こらない。３次構造が不明であるRNAをクローニングし、例えば、T7ファージRNAポリメラーゼ系を使用してインビトロで多量に産生させることができる。RNAを蛍光標識で標識することができる。次いで、RNAが正常な３次構造を取る条件への適用に好ましい条件下、即ち、インビボでの細胞質条件でこれを用いて、固定化されたライブラリーに試みることができる。RNAを予め定められた期間、アレイ上でハイブリダイズさせ、次いで、ハイブリダイズしなかったRNAを洗い流す。蛍光を検出することによって、ハイブリダイゼーションが生じている場所が視覚化される。蛍光が検出されるアレイの領域は、どのONにRNAがハイブリダイズするかを示す。これらのアプローチは、短いONプローブのハイブリダイゼーションの強度が弱いという問題に直面する；プローブONのサイズの最小値は、大きな分子の RNAをアレイに固定化するのに必要な相互作用の強さによって決定され、RNAが洗い流されないようにする。このことは実験により試験しなければならないが、RN Aが可動性の要素である場合、解離が速いという問題は緩和されるはずである。何故なら、その分子のサイズでは、先に述べられた実施態様で使用された小さな ONよりも解離が若干緩慢になるはずだからである。既知配列の短いウインドウおよびランダム配列の隣接領域を有するONを作製する同じアプローチを本実施態様に容易に適用することができ、非天然の核酸アナログについても同様に適用できると考えられる。ヌクレアーゼ耐性のアナログを使用する場合、再利用が可能であるという点でホスホジエステル結合よりも有利である。何故なら、DNAのアレイに損傷を与えるヌクレアーゼなどの混入を完全に除くことはできないからである。それぞれのRNA分子が単一の蛍光タグを有する限り、本実施態様も定量的である。従って、最も強い蛍光を示すアレイの領域は、最も強力にRNAがハイブリダイズしているアレイである。予め定められた期間ではなく、時間を変えてアレイに標的RNAを反復して試みることによって、アレイのそれぞれの点で生じるハイブリダイゼーション反応についての詳細な動力学的情報を得ることができる。蛍光標識の使用に代わる方法としては、アレイにプローブ結合するために使用されるRNAに切断可能に連結した質量標識を使用する方法がある。ニコチン酸、シナピン酸、ケイ皮酸等のGB 9700746.2に記載の種の光励起性化合物の誘導体である質量標識は光切断され、理想的にはレーザーを用いて適切な振動数の光を適用することによって気相に励起され得る。そのような標識は、例えば、ターミナルトランスフェラーゼ反応または末端連結を用いてRNA分子に取り込まれる。この種のレーザー励起性質量標識で標識されたRNA分子がオリゴヌクレオチドプローブのアレイにハイブリダイズする場合、アレイの異なる領域に対するRNAのハイブリダイゼーションは、個々のオリゴヌクレオチドについて、MALDI（Matrix Assisted Lasser Desorption Ionisation）によって決定され得る。より簡単で非励起性の質量標識も使用され得る。本実施態様において、RNAはアレイとハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション後、上清を除去して、アレイは上記に挙げた類の励起性の薬剤中に入り、そして切断された標識のイオン化は、マトリックスの励起によって間接的に仲介され得る。合理的な薬物の設計とそのプロセス：３次構造の決定：核酸の２次構造の設計方法はよく発達しており、これに類似の系由来のデータと組み合わせて、標的RNAの３次構造の良好なモデルを開発し得る。これは、「合理的な」薬物設計をより定量的なプロセスにするために開始する。NMR等の他の方法と組み合わせれば、おそらく完全な構造決定が可能であろう。少なくとも、正確な２次構造の予測が達成されるはずである。任意の所定のRNAについての構造を決定するために更に必要な情報は、おそらく最小限であろう。データベースおよび薬物の選択：この系は、使用の際に、RNAの３次構造についての情報の総合的データベースを提供し、これは、RNA構造のより良好な理論的モデルをもたらし、効果的なアンチセンス剤の設計のためのより特異的な標的化されたアプローチを可能にする。Wagnerら（３）の証拠は、短いオリゴヌクレオチドが標的RNAに対して特異性を示し得る事を示唆する。この示唆に適合させなければならない基準は、短いON が構造的に高い特異性を有するべきであることである。どのような構造的特徴が広範に存在するかおよび何がまれであるかが一旦確立されれば、RNAの構造の総合的データベースによって、これに類似の系は実際に直接潜在的な薬物を正確に指摘し得る。それゆえ、まれな特徴について直接検索することは、薬物の候補の選択をより簡単にし得る。より一般的なアンチセンス標的物：この系は、RNAse H感受性部位を検出するのに特異的ではなく、細胞中の様々なRNAにおいてより一般的なアンチセンス剤を標的化するために使用され得る。従って、この系は、リボソームなどのインビボでのより一般的な機能性RNA、スプライシング装置および性決定との関与が最近示唆されている活性型RNAの標的化を目的として、治療剤および研究用ツールの開発においてより一般的なアプリケーションのための能力を有する。自動化：両実施態様とも、自動化液体処理システムにより実施され得る。何故なら、手順が簡単であり、かつ反復性があるからである。ハイブリダイゼーションアレイアプローチはおそらく、試薬がより安価であるが、アレイと標的RNAとの間の相互作用の結合力が小さすぎてアレイの洗浄が可能でない場合は、実施は困難であるかもしれない。第１の実施態様は、試薬をより多く必要とするが、この要件を抑制するために、ウェルのマイクロアレイを構築することができる。実施例２TNFα cDNAサブフラグメントに対する４マーオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション： TNFα cDNAクローンのサブクローニング：ベクターpFC54.t中にTNFaの全長cDNA配列を含有するクローン番号53007(pAW73 1)を、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,Maryland,USAより購入した。凍結乾燥した細菌を２mlのLB培地中に再懸濁し、100μｌを100μｇ/m lのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上に広げた。次いで、そのプレートを30℃で一夜インキュベートした。次いで、プレート由来の単一のコロニーを用いて100μｇ/mlのアンピシリンを含有する100mlのLB培地に播種し、これを225rpmで振盪しながら30℃で一夜インキュベートした。この後、Hereau s 17R3遠心分離機において溶液を5300rpmで15分間スピンすることによって、細菌培養物をペレット化した。次いで、Qiaprep Midi Plasmid Purification Kit( Qiagen Ltd.)を製造者の指示に従って使用して、プラスミドを抽出した。次いで、２μｌのプラスミドを10単位のBamHIおよびHindIII（Boehringer Mannheim）で消化し、２μｌのプラスミドを20μｌ中10単位のHindIIIで37℃で２時間消化した。BamHIおよびHindIIIで消化するとTNFa挿入物（ATCC）が放出される。次いで、消化したプラスミドを１％寒天ゲル上で泳動させた。HindIII消化物は約700 bpのサイズのバンドを放出し、BamHIおよびHindIII消化物は約700bpのサイズのバンドおよび約800bpのサイズのバンドを放出した。700bpのフラグメントはHind IIIにより放出されたが、TNFa挿入物の3'末端側に相当する。HindIIIおよびBamH Iにより放出された800bpのフラグメントはTNFa挿入物の5'末端側に相当する。次いで、これらの２つのバンドを滅菌済み外科用メス刃でゲルから切り出し、製造者の指示に従ってGenElute Agarose Spin Columns（Supelco,USA）によりスピンし、DNAを抽出した。DNAを2.5容量の100％エタノールおよび0.1容量の３Ｍ酢酸ナトリウムで沈殿させた。次いで、溶液を-20℃で30分間インキュベートし、次いで、Heraeus A13ベンチトップ型遠心分離機において13000rpmで15分間スピンしてDNAを沈殿させた。次いで、上清を注ぎ出し、ペレットを100μｌの70％エタノールで洗浄して空気乾燥させた。次いで、乾燥ペレットを30μｌの水に再懸濁した。５μｇのプラスミドpBluescript SK(+)(Stratagene)を、10単位のBamHIおよびHindIIIで、５μｇをHindIII（Boehringer Mannheim）で、それぞれ50μｌ中37℃で２時間かけて消化し、次いで製造者の指示に従いChromospin-100カラム（Clonetech）で精製した。Pharmacia Genequant分光光度計において260nmおよび230nmでの吸収を読み取ることによって、精製したバンドおよび消化したバンドのDNA濃度を測定した。次いで、700および800bpのバンドを、 800bpのフラグメントには400単位のT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を、また700bpのフラグメントにはRapid Ligation Kit(Boehringer Mannheim)を用いて、適切に消化したpBluescriptにライゲーションした。DNAを細胞とともに30分間氷上でインキュベートし、続いて45秒間42℃での熱ショックして更に２分間氷上に置くことにより、２μｌのそれぞれの連結物を50μｌのXL-1BLUEコンピテント細胞（Stratagene）に形質転換した。この後、450μｌのSOC培地を添加し、細胞を250rpmで振盪しながら37℃で１時間インキュベートした。次いで、100μｌの形質転換体を、100μｇ/mlのアンピシリン、0.1mM IPTGおよび40μｇ/mlのX-GALを含有する寒天プレート上にプレーティングした。次いで、プレートを37℃で一夜インキュベートした。白色のコロニーを拾い、これを用いて100μｇ/mlのアンピシリンを含有する2. 5mlのLB培地に播種し、250rpmで振盪しながら37℃で７時間インキュベートした。次いで、１mlの細菌培養物をエッペンドルフチューブにスピンし、Qiaprep Sp in Plasmid Kit（Qiagen）でプラスミドを抽出した。小規模で調製したそれぞれのプラスミドの20％を適切な酵素で消化し、寒天ゲル上で泳動することによって正確なフラグメントの存在を確認した。次いで、700bpのフラグメントを含有するプラスミドおよび800bpのフラグメントを含有するプラスミド由来の残りの細菌培養物をそれぞれ使用して、100μｇ/mlのアンピシリンを含有する250mlのLB 培地に播種し、次いで、250rpmで振盪しながら37℃で一夜インキュベートした。この後、Hereaus 17RS遠心分離機において5300rpmで15分間溶液をスピンすることによって、細菌培養物をペレット化した。次いで、製造者の指示に従い、Qiap rep Midi Plasmid Purification Kit（Qiagen Ltd.）を用いてプラスミドを抽出した。インビトロでの転写 25μｇのそれぞれのプラスミドを、１×緩衝液H（Boehringer Mannheim）の50 μｌ中50単位のClaＩで37℃で３時間消化することにより線状化した。次いで、製造者の指示に従い、Chromospin-100カラム（Clonetech）を用いて消化したプラスミドを精製した。次いで、製造者の指示に従い、RiboMax Large Scale T3 RNA産生システム（Promege）を用いて、40μｌのそれぞれのプラスミドを使用して200μｌのインビトロ転写反応を設定した。次いで、製造者の指示に従い、RiboMax Large Scale T3 RNA産生システム（Promege）を用いて、残りの10μｌのそれぞれのプラスミドを使用して50μｌのインビトロ転写反応を設定したが、この時、RNAを蛍光標識するために、0.25μｌのフルオロセイン-12-UTP （Boehringer Mannheim）をそれぞれの反応に含めた。すべてのインビトロ転写反応物を37℃で３時間インキュベートした。 RNAがビオチン化オリゴにより捕捉され得ることの実証 5'CCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGG3ビオチンの配列を有する3'ビオチン化オリゴ（cap 53B）(pBluescript SK(+)のT3 RNAプロモーターから産生されるRNAの 5'末端側に相補的である)および5'ビオチン-CCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAG3' の配列を有する5'ビオチン化オリゴ（cap 35B）を、黒色ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Boehringer Mannheim）に固定化した。 50μｌの10×SSC中200pmolのそれぞれのオリゴを、室温で１時間ハイブリダイズさせることによって、これを達成した。次いで、それぞれのウェルを100μｌの10×SSCで２回洗浄した。次いで、700および800bpのフラグメントから産生されるフルオロセイン標識RNAを、65℃で５分間の熱処理により変性した。それぞれのRNAの６分の１（50μlの10×SSC中）を、cap 35Bおよびcap 53Bを含有するウェルに添加した。次いで、RNAを氷上で３０分間インキュベートし、RNAをオリゴにハイブリダイズさせた。次いで、ウェルを100μｌの10×SSCで３回洗浄し、 Xperiment 1.1.0ソフトウェアを用いるBiolumin 960（Molecular Dynamics）で蛍光を測定した。次いで、ウェルを100μｌの５×SSCで３回、100μｌの0.1×SSCで３回洗浄し、この５×SSCおよび0.1×SSCの３回洗浄後に、前記と同様に蛍光を測定した。読み取り値は相対蛍光単位で、バックグランドを差し引いている。cap 35B: 10×SSC ５×SSC 0.1×SSC 800bpフラグメント 66974 220 0 700bpフラグメント 44350 133 0cap 53B: 10×SSC ５×SSC 0.1×SSC 800bpフラグメント 50734 5136 686 700bpフラグメント 42660 1438 217 上記のデータは、マイクロタイタープレートに固定化されたcap53Bオリゴは、 pBluescript SK(+)のT3 RNAプロモーター部位から産生されるRNAを捕捉することができることを示す。このデータはまた、このRNAが高いストリンジェントの洗浄で洗浄され得ることも示す(例えば、0.1×SSC)。 cap53BによるRNAの捕捉および４マーによるプロービング 200pmolのcap53Bオリゴを含有する100μｌの15×SSCを黒色ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Boehringer Mannheim）の64ウェルのそれぞれに移し、室温で２時間インキュベートした。次いで、ウエルを150μｌの15×SSCで２回洗浄した。200μｌの反応中の700および800bpクローンから転写されたRNA（上記を参照のこと）を85℃で２分間変性させた。次いで、700および800bp RNA（産生については上記を参照のこと）の両方を、16単位のリボヌクレアーゼ阻害剤（Boehringer Mannheim）を伴う100μｌの15×SSC中24ウェル間でそれぞれ小分けし、氷上で１時間ハイブリダイズさせた。次いで、ウエルを150μｌの氷冷15×SSCで２回洗浄した。100μｌの15×SSC 中200pmolのそれぞれの４マーを、RNAの両種について４つのウエル（３つはRNAを伴い、１つはcap 53Bのみを伴う）に添加し、氷上に一時間置いてハイブリダイズさせた。次いで、それぞれのウェルを150μｌの氷冷1 5×SSCで３回洗浄し、上記のように蛍光を読み取った(上記を参照のこと)。再度、ウェルを150μｌの氷冷15×SSCで洗浄し、蛍光を測定した。４マーの配列（すべてフルオロセイン標識）TACT、TACA、TAAA、TGTC、GTCA、 ACCA、TGAA、CACG。すべてのデータ値を相対蛍光単位で表す。これらは、３つのウェルの平均値からRNAを伴わないウェルから得られる読み取り値を差し引いた値である。800bp のフラグメントについて 700bp のフラグメントについて上記のデータは、４マーTACA、TGTCおよびGTCAが強さの低い順に800bpのフラグメントから転写されたRNAにハイブリダイズすることを示す。これらのオリゴは、TNFaの開始コドンの「A」を塩基１として用いている１次配列において以下の番号を付した位置に相当する。800bp のフラグメントについて３つのすべてのオリゴの群が明らかに存在し、塩基250〜280付近で結合する。配列中に同配列が認められるが、結合はしなかったオリゴは以下の通り。 700bp のフラグメントについてオリゴTAAA、TACAおよびTGAAは、強さの低い順に700bpのフラグメントから転写されたRNAにハイブリダイズする。これらのオリゴは、TNFaの開始コドンの「A 」を塩基１として用いている１次配列において以下の番号を付した位置に相当する。TACAはpBluescript SK(+)のT3 RNAプロモーター部位内に認められる。配列中に同配列が認められるが、結合はしなかったオリゴは以下の通り異なる組の４マーが２つの異なるRNA種にハイブリダイズするという事実は、得られるシグナルが真のハイブリダイゼーションの生成物であり、特定の４マーの非特異的結合特性によるものではないことを証明している。このことは、ＡＴ含有量100％、即ち最も低いＴ_m値を有する４マーがハイブリダイズしたが、ＧＣ 75％含有量、即ち極めて高いＴ_m値を有する４マーはハイブリダイズしなかった事実からも更に認められる。また、すべてのオリゴ配列が両RNA種に認められるが、オリゴの選択物のみは結合し得、一例としては特定の配列の付近に群をなす。このように４マーが群をなすことは、このRNAの切片は単一鎖であるかまたはアクセス可能であり、即ち、アンチセンスに対する明確な標的物である。従って、本実験はRNAの単一鎖部分がプローブ化され得、４マーのハイブリダイゼーションによって配列情報を得ることができることを証明する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１１月１６日（１９９８．１１．１６）【補正内容】請求の範囲１．標的ｍＲＮＡに結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する方法であって、ハイブリダイゼーション条件下で前記標的ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドライブラリーの要素のそれぞれとを個別に接触させること、任意にハイブリダイズしていない材料を除去すること、およびどの要素がハイブリダイズしているかを決定することを含み、ここで、前記オリゴヌクレオチドライブラリーは、予め決定されている共通の長さを有する複数の異なるヌクレオチド配列を含み、またここで、それぞれのヌクレオチド配列は４または５塩基の既知の配列を含み、前記既知の配列の可能なすべての組み合わせが前記ライブラリー中に存在する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの同定方法。２．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素が個別の容器内の前記標的ｍＲＮＡに接触する、請求項１に記載の方法。３．前記標的ｍＲＮＡが前記容器内に固定化される、請求項２に記載の方法。４．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素がハイブリダイゼーションアレイ上の個別の位置で固定化される、請求項１に記載の方法。５．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素が１組のヌクレオチド配列を含み、それぞれのヌクレオチド配列は前記既知の配列を含むウインドウ領域および８塩基以下の隣接領域を有し、ここで、隣接領域内における塩基の可能なすべての組み合わせがそれぞれの組に存在し、前記ヌクレオチド配列の共通の長さは１２塩基以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．前記ヌクレオチド配列の共通の長さが１０塩基以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．どの要素がハイブリダイズするかを決定する前記工程が、より迅速にハイブリダイズする要素を決定することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．前記標的ｍＲＮＡにおいて１つ以上のアンチセンス結合部位を同定するために、ハイブリダイズするそれぞれの要素の前記配列が前記標的ｍＲＮＡに関する配列情報と比較される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．前記ヌクレオチド配列がＤＮＡアナログから作製される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。１０．前記標的ｍＲＮＡまたは前記オリゴヌクレオチドライブラリーの要素が標識で標識され、前記標識の検出によりハイブリダイゼーションが決定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。１１．前記標識が蛍光標識または質量標識を含む、請求項１０に記載の方法。１２．検出表面を使用してその付近の前記標識を検出する、請求項１０に記載の方法。１３．前記標識が放射性標識を含み、前記検出表面がシンチラントを含む、請求項１２に記載の方法。１４．標的ｍＲＮＡに結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する方法におけるオリゴヌクレオチドライブラリーの使用であって、該オリゴヌクレオチドライブラリーは、予め決定されている共通の長さを有する複数の異なるヌクレオチド配列を含み、ここで、それぞれのヌクレオチド配列は４または５塩基の既知の配列を含み、前記既知の配列の可能なすべての組み合わせは前記ライブラリー中に存在し、そして前記ライブラリーのそれぞれの要素が空間的に相互に区別されている、オリゴヌクレオチドライブラリーの使用。１５．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素が個別の容器内に存在する、請求項１４に記載の使用。１６．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素がハイブリダイゼーションアレイ上に個別に位置する、請求項１４に記載の使用。１７．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素が１組のヌクレオチド配列を含み、それぞれのヌクレオチド配列は前記既知の配列を含むウインドウ領域および８塩基以下の隣接領域を有し、ここで、隣接領域内における塩基の可能なすべての組み合わせがそれぞれの組に存在し、前記ヌクレオチド配列の共通の長さは１２塩基以下である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。１８．前記ヌクレオチド配列の共通の長さが１０塩基以下である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の使用。１９．前記ヌクレオチド配列がＤＮＡアナログから作製される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の使用。２０．前記標的ｍＲＮＡまたは前記オリゴヌクレオチドライブラリーの要素が標識で標識され、前記標識の検出によりハイブリダイゼーションが決定される、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の使用。２１．前記標識が蛍光標識または質量標識を含む、請求項２０に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．標的ｍＲＮＡに結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する方法であって、ハイブリダイゼーション条件下で前記標的ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドライブラリーの要素のそれぞれとを個別に接触させること、任意にハイブリダイズしていない材料を除去すること、およびどの要素がハイブリダイズしているかを決定することを含み、ここで、前記オリゴヌクレオチドライブラリーは、予め決定されている共通の長さを有する複数の異なるヌクレオチド配列を含み、またここで、それぞれのヌクレオチド配列は４〜８塩基の既知の配列を含み、前記既知の配列の可能なすべての組み合わせが前記ライブラリー中に存在する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの同定方法。２．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素が個別の容器内の前記標的ｍＲＮＡに接触する、請求項１に記載の方法。３．前記標的ｍＲＮＡが前記容器内に固定化される、請求項２に記載の方法。４．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素がハイブリダイゼーションアレイ上の個別の位置で固定化される、請求項１に記載の方法。５．前記既知の配列の長さが４〜６である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素が１組のヌクレオチド配列を含み、それぞれのヌクレオチド配列は前記既知の配列を含むウインドウ領域および８塩基以下の隣接領域を有し、ここで、隣接領域内における塩基の可能なすべての組み合わせがそれぞれの組に存在し、前記ヌクレオチド配列の共通の長さは１２塩基以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．前記ヌクレオチド配列の共通の長さが１０塩基以下である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．どの要素がハイブリダイズするかを決定する前記工程が、より迅速にハイブリダイズする要素を決定することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．前記標的ｍＲＮＡにおいて１つ以上のアンチセンス結合部位を同定するために、ハイブリダイズするそれぞれの要素の前記配列が前記標的ｍＲＮＡに関する配列情報と比較される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。１０．前記ヌクレオチド配列がＤＮＡアナログから作製される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。１１．前記標的ｍＲＮＡまたは前記オリゴヌクレオチドライブラリーの要素が標識で標識され、前記標識の検出によりハイブリダイゼーションが決定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。１２．前記標識が蛍光標識または質量標識を含む、請求項１１に記載の方法。１３．検出表面を使用してその付近の前記標識を検出する、請求項１１に記載の方法。１４．前記標識が放射性標識を含み、前記検出表面がシンチラントを含む、請求項１３に記載の方法。１５．標的ｍＲＮＡに結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する方法におけるオリゴヌクレオチドライブラリーの使用であって、該オリゴヌクレオチドライブラリーは、予め決定されている共通の長さを有する複数の異なるヌクレオチド配列を含み、ここで、それぞれのヌクレオチド配列は４〜８塩基の既知の配列を含み、前記既知の配列の可能なすべての組み合わせは前記ライブラリー中に存在し、そして前記ライブラリーのそれぞれの要素が空間的に相互に区別されている、オリゴヌクレオチドライブラリーの使用。１６．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素が個別の容器内に存在する、請求項１５に記載の使用。１７．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素がハイブリダイゼーションアレイ上に個別に位置する、請求項１５に記載の使用。１８．前記既知の配列の長さが４〜６である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用。１９．前記オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの要素が１組のヌクレオチド配列を含み、それぞれのヌクレオチド配列は前記既知の配列を含むウインドウ領域および８塩基以下の隣接領域を有し、ここで、隣接領域内における塩基の可能なすべての組み合わせがそれぞれの組に存在し、前記ヌクレオチド配列の共通の長さは１２塩基以下である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の使用。２０．前記ヌクレオチド配列の共通の長さが１０塩基以下である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の使用。２１．前記ヌクレオチド配列がＤＮＡアナログから作製される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の使用。２２．前記標的ｍＲＮＡまたは前記オリゴヌクレオチドライブラリーの要素が標識で標識され、前記標識の検出によりハイブリダイゼーションが決定される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の使用。２３．前記標識が蛍光標識または質量標識を含む、請求項２２に記載の使用。