JP3607199B2 - Dna固定化用固体状基体、dnaを固定化したdna固定化チップ及びdnaを増幅する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、分子生物学分野や生化学関連分野において用いられるDNA等を固定化するための基体に関し、より詳しくは、熱伝導性に優れた基体に関し、さらに詳しくは、末端に水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基等を有する化学修飾された基体及びその基体にDNA等を固定化したチップに関する。
【0002】
【背景技術】
従来、DNAの増幅反応等においては、目的とするDNAを特定量得るために、
1)二本鎖DNAの水素結合をほどくために試料の温度を95℃に上昇させる、
2)次いでDNAを複製するためのプライマーと再結合させるために試料の温度を45℃に下降させる、
3)さらに耐熱性ポリメラーゼによりプライマーを伸長させてDNAを複製させるために試料の温度を74℃に上昇させる、といった1)〜3)のヒートサイクルを幾度も繰り返す必要があった。
このような、いわゆるPCR法を用いたDNAの増幅反応では、試料を反応溶液とともにチューブ状プラスチック反応容器などに入れ、この容器をアルミブロックに収容し前記ヒートサイクルを行っていた。
しかし、前記増幅反応はDNAを反応溶液とともに加熱・冷却を行うために、目的とする量のDNAを得るには多大な時間を要していた。また、反応溶液の温度制御の精度が低いために、目的とする以外のDNAも複製されるという問題点もあった。
本発明は、このような問題点に鑑み、DNA等を容易に固定化できて、DNA増幅反応によりDNAを複製するために最適な固体状基体、その基体にDNA等を固定化したチップ、及びDNAを増幅する方法を提供することを技術的課題とする。
【0003】
【発明の開示】
請求項1に記載の基体は、DNAを固定化して増幅するための熱伝導性に優れていることを特徴とする。これらの基体はダイヤモンド、窒化アルミニウム、炭化チタン、タングステン又はアルミナであり、末端に水酸基を有するように化学修飾がされたものであることを特徴とする。
請求項2に記載の基体は、基体がダイヤモンド、窒化アルミニウム、炭化チタン、タングステン又はアルミナであり、カルボン酸ソーダがエステル結合又はペプチド結合を介して基体表面に結合し、末端にカルボキシル基を有するように化学修飾がされたものであることを特徴とする。
請求項3に記載の基体は、基体がダイヤモンド、窒化アルミニウム、炭化チタン、タングステン又はアルミナであり、基体表面の水酸基にシランカップリング剤によりエポキシ基が導入され、末端にエポキシ基を有するように化学修飾がされたものであることを特徴とする。
請求項4に記載の基体は、基体がダイヤモンド、窒化アルミニウム、炭化チタン、タングステン又はアルミナであり、基体表面の水酸基にシランカップリング剤によりアミノ基が導入され、末端にアミノ基を有するように化学修飾がされたものであることを特徴とする。
請求項5に記載のDNA固定化チップは、請求項1〜4のいずれかに記載の基体にDNAを固定化したものであることを特徴とする。
請求項6に記載のDNAを増幅する方法は、請求項1〜4のいずれかに記載の基体又は請求項5記載のチップを用いてDNAを増幅する方法であることを特徴とする。
【0004】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の基体は、DNAを固定化して増幅するために用いる固体状の基体であって、熱伝導性に優れたものであることが望ましい。例えば、ダイヤモンドは物質の中でも抜群の熱伝導率を有しており急速に加熱冷却させることが可能であるため、本発明の基体を用いれば、DNA増幅反応のように、加熱冷却を繰り返すヒートサイクル時間をきわめて短縮できる。
また、本発明の基体は、表面を水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基等で化学修飾してあるので、DNA等の固定化を容易に行え、DNA増幅反応によりDNAを複製するためのチップなどに最適である。
また、本発明のチップは、表面が汚染された場合に、加水分解させて化学修飾を再生させることができる。
【0005】
本発明に用いる基体は、例えば、固体状の基体は熱伝導率が0.1W/cm・K以上であることが望ましい。
さらに、好ましくは熱伝導率が0.5W/cm・K以上であることが望ましい。さらに、より好ましくは熱伝導率が1W/cm・K以上であることが望ましい。基体の熱伝導率が0.1W/cm・K以上であると、DNAを本発明の基体に固定化させて、PCR(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション)反応を行う場合等において、加熱・冷却の追随性が優れているからである。
【0006】
熱伝導性がよいものの例としては、ダイヤモンド、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属などがあげられる。また、アルミナ、窒化アルミニウム、炭化チタン、炭化珪素、シリコン、等のセラミックスがあげられる。また、上記の金属とセラミックスとの混合体も適用出来る。また、ポリカーボネートやフッ素樹脂等のプラスチックなども適用できる。また、化学的に安定なものであれば、上記した金属、セラミックス、プラスチックスに限定されない。例えば、ダイヤモンドやダイヤモンドライクなとも適用できる。また、プラスチックスと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体でもよい。
ダイヤモンド基体の素材としては、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、あるいは天然のダイヤモンドなどを用いることができる。またそれらの単結晶体あるいは多結晶体のいずれの構造を有していても差し支えない。生産性の観点から、マイクロ波プラズマCVD法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンドを用いることが好ましい。
【0007】
本発明の基体の形成方法は適宜選択できる。例えば、マイクロ波プラズマCVD法、ECRCVD法、高周波プラズマCVD法、IPC法、直流スパッタリング法、ECRスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、EB蒸着法、抵抗加熱蒸着法などがあげられる。また、金属粉末やセラミックス粉末等に、樹脂をバインダーとして混合して結合形成したものがあげられる。また、金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機を用いて圧粉したものを高温で焼結したものもあげられる。
【0008】
本発明の基体表面は、意図的に粗面化されていることも望ましい。このような粗面化表面は基体の表面積が増えて、多量のDNA等を固定化させることに好都合だからである。基体の形状は、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。さらにこれらの基体と他の物質との複合体(例えば2層体)であってもよい。
【0009】
本発明の基体は、基体表面を化学修飾されたものであり、化学修飾の末端に極性基、水酸基又はカルボキシル基を有するものであることが好ましい。すなわち、上記の基体の表面に特定の基を付加(化学修飾)させる。この化学修飾によって、DNAが基体の表面に固定化されやすくなる。基体表面に付加(化学修飾)され、末端に極性基を有する特定の基としては、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基、アミノ基、エポキシ基などの基があげられる。また、この他、有機カルボン酸も含まれる。前記の基のうち、カルボキシル基は、ダイヤモンドなどの基体に直接付加させてもよいが、基体との間に他の炭化水素基を介し、末端にカルボキシル基を有することとしてもよい。
【0010】
この場合の炭化水素基は炭素数1〜10のものが、DNAの固定化にあたって好ましい。炭化水素基となりうるような酸は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸などのモノカルボン酸や、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸などのジカルボン酸や、トリメリット酸などの多価カルボン酸などがあげられる。
PCR法などを用いて、DNAの増幅反応に本発明の基体を適用する場合、耐加水分解性が必要とされる場合と、加水分解させて化学修飾を再生させる必要がある場合との2通りの適用ケースがある。
耐加水分解性が必要とされる場合は、耐アルカリ性を付与するために、上記の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基を、ペプチド結合を介して基体表面に結合させることが好ましい。
【0011】
一方、生成した化学修飾を加水分解させて除去し再生させる必要がある場合は、アルカリ溶液で加水分解可能とするために、上記の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基を、エステル結合を介して基体表面に結合させることが好ましい。
【0012】
炭化水素基の末端に水酸基を基体表面に結合させる方法としては、基体表面を酸素プラズマで酸化し、次いで水蒸気処理する方法、または塩素ガス中で紫外線照射して基体表面を塩素化した後アルカリ溶液中で加水分解してヒドロキシル化する方法、さらに基体表面を酸素プラズマで酸化し、次いで塩素化した後アルカリ溶液中で加水分解してヒドロキシル化する方法を挙げることができる。
【0013】
なお、基体表面に水酸基が結合されている場合は、シランカップリング剤、チタンカップリング剤、アルミカップリング剤などをその上に処理すると、カルボキシル基などとの化学修飾がより強固なものになる。
【0014】
また、炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基をペプチド結合を介して基体表面に結合させる方法としては、塩素ガス中で紫外線照射して基体表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、非水溶媒中でカルボン酸クロライドと反応させ、次いで弱アルカリ溶液中で中和させる方法を挙げることができる。
【0015】
また、炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基をエステル結合を介して基体表面に結合させる方法としては、塩素ガス中で紫外線照射して基体表面を塩素化し、次いで非水溶媒中でカルボン酸ソーダと反応させ、次いで弱酸溶液中で中和させる方法、または、基体表面を酸素プラズマで酸化し、次いで塩素化した後アルカリ溶液中で加水分解してヒドロキシル化した後、非水溶媒中でカルボン酸クロライドと反応させ、次いで弱アルカリ溶液中で中和させる方法を挙げることができる。以下、実施例にて本発明を詳細に説明する。
【0016】
(実施例1)
マイクロ波プラズマCVD法を用いて、直径が64mm、厚さが0.3mmのダイヤモンドを気相合成した後、全体が均一な0.25mmの厚さとなるよう表面を研磨した。このようにして研磨した表面の10mm×10mmの面積において、FTIR法(フーリエ変換赤外分光分析法)により炭素―水素の伸縮の振動に由来する2879cm−1の吸収強度を測定したところ、ほぼ一定の値が得られた。このダイヤモンドからレーザーにより10mm角の試料を切り出し、以下の実施例1〜6の試料として用いた。実施例1においては、マイクロ波により励起した酸素プラズマでダイヤモンド表面を酸化した後、セパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気を水蒸気で置換した後、水蒸気を流入させながら400℃に加熱し30分間保持した後放冷した。
次いで試料を取り出し乾燥し、末端に水酸基を有するダイヤモンドを得た。また、SIMS法(二次イオン質量分析法)により、表面研磨後、酸素プラズマ処理後、および水蒸気処理後の水素、水酸基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を1とした場合の水酸基のピーク強度比は、下記の表1に示す値となった。
【0017】
【表1】
表1に示すように、水酸基のピーク強度比は、酸素プラズマ処理、それに続く水蒸気処理により増加しており、ダイヤモンド表面が水酸基により化学修飾されていることが確認された。
【0018】
(実施例2)
実施例1で得られた気相合成ダイヤモンドを表面研磨し、レーザーにより10mm角の試料を切り出した。この試料をセパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、塩素ガスを1SCCMの流量で流入させながらHg−Xeランプを用い、主波長が3600オングストロームの紫外線を60分間照射してダイヤモンド表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、10重量%の水酸化ナトリウム水溶液中で15分間煮沸し、さらに水洗した後乾燥し、末端に水酸基を有するダイヤモンドを得た。また、SIMSにより、表面研磨後、塩素化後、および水酸化ナトリウム処理後の水素、水酸基および塩素基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を1とした場合の、水酸基、塩素基のピーク強度比は下記の表2に示す値となった。
【0019】
【表2】
表2に示すように、水酸基のピーク強度比は、塩素化処理、それに続く水酸化ナトリウム処理により増加しており、ダイヤモンド表面が水酸基により化学修飾されていることが確認された。また、塩素基が減少していることがら水酸基により置換されたことが確認された。
【0020】
(実施例3)
実施例1で得られた気相合成ダイヤモンドを表面研磨し、レーザーにより10mm角の試料を切り出し、マイクロ波により励起した酸素プラズマで表面を酸化した後、実施例2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、10重量%の水酸化ナトリウム水溶液中で15分間煮沸し、さらに水洗した後乾燥し、末端に水酸基を有するダイヤモンドを得た。また、SIMSにより、表面研磨後、酸素プラズマ処理後、塩素化後、および水酸化ナトリウム処理後の水素、水酸基、塩素基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を1とした場合の、水酸基、塩素基のピーク強度比は、表3に示す値となった。
【0021】
【表3】
上記表3に示すように、水酸基のピーク強度比は、酸素プラズマ処理、それに続く塩素化、さらにそれに続く水酸化ナトリウム処理により増加しており、ダイヤモンド表面が水酸基により化学修飾されていることが確認された。また、塩素基が減少していることから水酸基により置換されたことが確認された。
【0022】
(実施例4)
実施例1で得られた気相合成ダイヤモンドを表面研磨し、レーザーにより10mm角の試料を切り出し、セパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、塩素ガスをISCCMの流量で流入させなからHg−Xeランプを用い、主波長が3600オングストロームの紫外線を60分間照射してダイヤモンド表面を塩素化した。再びフラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、1重量%のセバシン酸ソーダのN,N−ジメチルホルムアミド溶液100mlを添加し、セパラブルフラスコにコンデンサを設置し、2時間還流した。次いで試料を取り出し、1重量%の酢酸水溶液で洗浄し、さらにアセトンで洗浄した後乾燥し、セバシン酸がエステル結合を介して結合した、末端にカルボキシル基を有するダイヤモンドを得た。また、SIMSにより、表面研磨後、塩素化後、およびセバシン酸ソーダ処理後の水素、水酸基、塩素基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を1とした場合の、水酸基、塩素基のピーク強度比は、表4に示す値となった。
【0023】
【表4】
表4に示すように、水酸基のピーク強度比は、塩素化、さらにそれに続くセバシン酸ソーダ処理により増加していること、またFTIR法を用いてで試料表面の炭素―水素の伸縮振動に由来する吸収強度、および炭素―酸素の伸縮振動に由来する吸収強度を測定したところ、いずれの吸収強度も増大していた(ダイヤモンドブランクに対する吸収強度の増大率は約30%であった)。
このことから、ダイヤモンド表面がセバシン酸の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基により化学修飾されていることが確認された。
また、塩素基が減少していることから水酸基により置換されたことが確認された。
【0024】
(実施例5)
実施例1で得られた気相合成ダイヤモンドを表面研磨し、レーザーにより10mm角の試料を切り出し、マイクロ波により励起した酸素プラズマで表面を酸化した後、実施例2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、10重量%の水酸化カリウム水溶液中で15分間煮沸してダイヤモンド表面をヒドロキシル基で置換した。乾燥した後、上部に塩化カルシウム乾燥管を備えたコンデンサを設置したセパラブルフラスコ中に試料を配置し、クロロホルム50mlとトリエチルアミン1gを添加し、フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した。次いで、セパラブルフラスコを氷冷しながら、クロロホルム50mlに塩化スクシニル10gを溶解させた溶液を徐々に添加した。その後4時間還流した後試料を取り出し、10重量%の炭酸カリウム水溶液で洗浄し、さらにアセトンで洗浄した後乾燥し、マロン酸がエステル結合を介して結合した、末端にカルボキシル基を有するダイヤモンドを得た。また、SIMSにより、表面研磨後、酸素プラズマ処理後、塩素化後、ヒドロキシル化後、および塩化スクシニル処理後の水素、水酸基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を1とした場合の水酸基のピーク強度比は、表5に示す値となった。
【0025】
【表5】
表5に示すように、水酸基のピーク強度比は、酸素プラズマ処理、それに続く塩素化、さらにそれに続くヒドロキル化、さらにそれに続く塩化スクシニル処理により増加していること、またFTIR法を用いて試料表面の炭素―水素の伸縮振動に由来する吸収強度、および炭素―酸素の伸縮振動に由来する吸収強度を測定したところ、いずれの吸収強度も増大していた(ダイヤモンドブランクに対する吸収強度の増大率は約25%であった)。
このことから、ダイヤモンド表面がマロン酸の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基により化学修飾されていることが確認された。
【0026】
(実施例6)
実施例1で得られた気相合成ダイヤモンドを、レーザーにより10mm角の試料を切り出し、マイクロ波により励起した水素プラズマで表面を処理した後、実施例2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。
試料が配置されたセパラブルフラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、アンモニアガスを1SCCMの流量で流入させなからHg―Xeランプを用い、主波長が3600オングストロームの紫外線を60分間照射してダイヤモンド表面をアミノ化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後、セパラブルフラスコ上部に塩化カルシウム乾燥管をそなえたコンデンサを設置し、クロロホルム50mlを添加し、再び雰囲気をアルゴンガスで置換した。
次いで、セパラブルフラスコを氷冷しながら、クロロホルム50mlに塩化スクシニル10gを溶解させた溶液を徐々に添加した。その後4時間還流した後試料を取り出し、10重量%の炭酸カリウム水溶液で洗浄し、さらにアセトンで洗浄した後乾燥し、マロン酸がペプチド結合を介して結合した、末端にカルボキシル基を有するダイヤモンドを得た。また、SIMSにより、各種処理前、塩素化後、アミノ化後、および塩化スクシニル処理後の水素、水酸基、塩素基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を1とした場合の水酸基、塩素基のピーク強度比は、表6に示す値となった。
【0027】
【表6】
表6に示すように、水酸基のピーク強度比は、水素プラズマ処理、それに続く塩素化、さらにそれに続くヒドロキル化、さらにそれに続く塩化スクシニル処理により増加していること、またFTIR法を用いて試料表面の炭素―水素の伸縮振動に由来する吸収強度、および炭素―酸素の伸縮振動に由来する吸収強度を測定したところ、いずれの吸収強度も増大していた(ダイヤモンドブランクに対する吸収強度の増大率は約25%であった)。このことから、ダイヤモンド表面がマロン酸の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基により化学修飾されていることが確認された。
実施例1〜6のようにして得られた末端にカルボキシル基を有する化学修飾されたダイヤモンドチップを用いてDNAの増幅反応を実施したところ、約1時間で目的とする量のDNAを得ることができた。
さらに本発明の化学修飾されたダイヤモンドチップを用い、末端水酸基または末端カルボキシル基に、水素結合でオリゴ核酸の末端塩基を固定化し、さらに、このオリゴ核酸と相補的塩基配列を有するDNAを固定して、DNAライブラリチップとして用いることもできる。また、DNAのかわりに、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNAフラグメント等を、ダイヤモンド表面に固定化して、ライブラリーとすることもできる。
【0028】
(実施例7)
高周波プラズマCVD法を用いて、直径が64mm、厚さが0.1mmの表面粗さがRaで0.1mmの炭化チタンの円板を気相合成した。この円板からレーザーにより3×5mm角の試料を切り出し、熱伝導率を測定した結果、0.44W/cm・Kの値が得られた。
実施例7においては、高周波により励起した酸素プラズマで試料表面を酸化した後、セパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気を水蒸気で置換した後、水蒸気を流入させながら400℃に加熱し30分間保持した後放冷した。次いで試料を取り出し乾燥し、末端に水酸基を有する基体を得た。さらにこの基体表面をシランカップリング溶液中にディップして基体表面にシランカップリング剤を被覆した基体を得た。この基体を加熱冷却手段であるペルチェ素子に直接接触させて基体の温度制御ができるようにして、以下のPCR法を行った。
【0029】
(DNAの固定化)
まず、基体表面に、mRNA(messenger RNA:メッセンジャーRNA)の場合はオリゴ−dT16−20を固定化した。一方gDNA(genomic DNA:染色体DNA)の場合は目的の制限酵素部位を持ったオリゴヌクレオチドを、化学的なエステル結合反応によって固定化した。次に、cDNA(complementary DNA)固定化の場合は、組織・細胞から抽出した全RNA溶液を加えて0〜4℃の低温でmRNAを固定化オリゴ−dT16−20にハイブリダイズさせた後に、基体温度を37〜60℃に温度制御して、逆転写酵素(Reverse Transcriptase:RT)によってcDNA合成を行った。このときのcDNAは、固定化オリゴ−dT16−20の5’へ向けての延長反応させ固定化したものを用いた。
合成された固定化cDNAとmRNAとのハイブリダイズ状態にある溶液を90℃に昇湿させてmRNAを脱ハイブリダイズした後、反応溶液をTris−EDTA(TE)緩衝液に交換し、再度0〜4℃の低温にしてエタノール洗浄し、一本鎖DNAの状態の精製された固定化cDNAチップを作製した。
【0030】
gDNA固定化の場合は、まず、目的の制限酵素部位を持った固定側オリゴヌクレオチドを上記のオリゴ−dT16−20の場合と同様に本発明の基体表面に固定化した。次に、その化学的な固定化のための反応溶液を0〜4℃の低温でハイブリ側オリゴヌクレオチドと目的の制限酵素を含む反応溶液に交換した。そして、オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション後、37℃にまで昇温して半固定化されたオリゴヌクレオチドの制限酵素切断を行った。
制限酵素切断後に、基体温度を0〜4℃の低温にして、目的の制限酵素で断片化したgDNAとライゲーション酵素(Ligase)を含む反応溶液に交換し、再び基体温度を37℃にまで上昇させてライゲーション反応を行い、一本鎖DNAの状態のgDNA固定化チップを作製した。
【0031】
なお、基体表面上に上記作製されたcDNA固定化チップ或いは上記作製されたgDNA固定化チップを、
(1)多検体での同種の組織・細胞の遺伝子変異の比較、
(2)同一検体での各組織・細胞の遺伝子発現変動の比較、
(3)同一検体での治療・手術等に伴う余後経過に対応する遺伝子発現変動の比較、等を目的として、それぞれを別の容器内に設置することもできる。
たとえば、(1)の場合は、同種の組織・細胞の遺伝子変異の比較をするために、多検体(複数のDNA固定化チップ)を、別の容器中に設置し、これらの複数の容器を連結した1カセットとする。そしてこれらのカセットを反応器本体に埋設する。さらにこれらのカセットを2カセット以上を系統的に作れば、効率的に多検体の比較を行うことができる。
上記、複数の容器を連結した1カセットあるいは複数のカセッカセットを集合体にして、これらのそれぞれの容器内にDNA固定化チップを設置したものを、カセット型DNAライブラリーとすることができる。
【0032】
これらのカセット型DNAライブラリーを用いて、前記(1)〜(2)の比較を系統的に行うことによって、遺伝子の変動を効率的に調査することもできる。
そして、本発明のDNA固定化チップを、TE緩衝液及び70〜75%のエタノール水溶液で十分に洗浄後、100%エタノールに浸潤して冷凍保存すれば、比較データ等の要求に応じて半永久的に利用可能である。
【0033】
(DNA固定化チップを用いての遺伝子増幅)
上記のcDNA固定化チップの複数枚を用いて反応容器を構成し、加熱・冷却手段に調節接触させた。この反応容器内面をTE緩衝液で十分に洗浄後、増幅目的のDNAに対するプライマーをセットし、4種のヌクレオチド及びDNAポリメラーゼを含むPCR反応溶液を加えた。その後、反応容器を、二本鎖のDNAを一本鎖DNAに分離させる熱変性温度(95℃)に瞬時に昇温した。そして95℃で約1.5分間保持した、次に、一本鎖DNAとDNAプライマとを結合させるアニーリング温度である45℃に瞬時に降温した。そして45℃に約1分間保持した。次に、耐熱性DNAポリメラーゼによりDNA鎖の伸長反応を行わせるDNA増幅温度である74℃に昇温した。そしてその温度で約2分間保持した。上記温度サイクルを30回繰り返しPCRを行った。PCRに要した時間は昇温、降温の時間を全く必要としなかったので、保持時間の和である約135分であった。
【0034】
(実施例8)
実施例1で得られた気相合成ダイヤモンドをレーザにより10mm角の試料に切り出し、マイクロ波プラズマにより励起した水素プラズマで表面を処理した後、実施例2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、10重量%の水酸化カリウム水溶液中で15分間煮沸してダイヤモンド表面をヒドロキシル化した。一方100ccの95%エタノール−5%水溶液を酢酸でPH5に調整し、2ccの3−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを撹拌しつつ添加した。この溶液にヒドロキシルダイヤモンドを浸して取り出し、エタノールで軽く洗浄した後、110℃で5分間処理することによりダイヤモンド表面にエポキシ基を導入した。
【0035】
(実施例9)
エポキシ基に対して、5´末端アミノ化オリゴ核酸(プライマー)を固定化して、mRNAをアニールした後逆転写酵素でcDNAレプリカ作製すると同時にチップに固定化した。
【0036】
(実施例10)
実施例1で得られた気相合成ダイヤモンドをレーザにより10mm角の試料に切り出し、マイクロ波プラズマにより励起した水素プラズマで表面処理した後、実施例2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、10重量%の水酸化カリウム水溶液中で15分煮沸してダイヤモンド表面をヒドロキシル化した。一方100ccの95%エタノール−5%水溶液に2ccの3−アミノプロピルトリメトキシシランを撹拌しつつ添加した。その溶液にヒドロキシル化ダイヤモンドを浸して取り出し、エタノールで軽く洗浄した後、110℃で5分間処理することによりダイヤモンド表面にアミノ基を導入した。
【0037】
(実施例11)
実施例10で得られたアミノ基導入ダイヤモンド表面に5´末端にカルボキシル基を修飾したオリゴ核酸をペプチド結合で固定化した後、mRNAを鋳型として逆転写酵素によりcDNAをダイヤモンドに固定化した。
【0038】
(実施例12)
アークイオンプレーティング法を用いて、直径が64mm、厚さが0.1mmの表面粗さがRaで0.3mmの窒化アルミニウム円板を気相合成した。この円板をレーザーにより3×5mm角の試料を切り出し、熱伝導率を測定した結果、1.70W/cm・Kの値が得られた。この試料をセパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、塩素ガスを1SCCMの流量で流入させながらHg−Xeランプを用い、主波長が3600オングストロームの紫外線を60分間照射して試料表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、10重量%の水酸化ナトリウム水溶液中で15分間煮沸し、さらに水洗した後乾燥し、末端に水酸基を有する基体を得た。その後、この基体を用いて、実施例1と同様にして、DNAの固定化及びPCR法を利用した増幅を行った。
【0039】
(実施例13)
粉末焼結法を用いて、直径が64mm、厚さが0.3mmの表面粗さが平均表面粗さRaで0.5mmのタングステン円板を得た。この円板からレーザーにより3×5mm角の試料を切り出し、熱伝導率を測定した結果、1.67W/cm・Kの値が得られた。そして、マイクロ波により励起した酸素プラズマで表面を酸化した後、試料表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、10重量%の水酸化ナトリウム水溶液中で15分間煮沸し、さらに水洗した後乾燥し、末端に水酸基を有する基体を得た。その後、この基体を用いて、実施例1と同様にして、DNAの固定化及びPCR法を利用した増幅を行った。
【0040】
(実施例14)
粉末焼結法によりアルミナ円板を形成し、この円板をレーザーにより3×5mm角の試料を切り出し、熱伝導率を測定した結果、0.3W/cm・Kの値が得られた。そして、セパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、塩素ガスを1SCCMの流量で流入させながらHg―Xeランブを用い、主波長が3600オングストロームの紫外線を60分間照射して試料表面を塩素化した。再びフラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、1重量%のセバシン酸ソーダのN,N−ジメチルホルムアミド溶液100mlを添加し、セパラブルフラスコにコンデンサを設置し、2時間還流した。次いで試料を取り出し、1重量%の酢酸水溶液で洗浄し、さらにアセトンで洗浄した後乾燥し、セバシン酸がエステル結合を介して結合した、末端にカルボキシル基を有する基体を得た。その後、この基体を用いて、実施例1と同様にして、DNAの固定化及びPCR法を利用した増幅を行った。
【0041】
なお、本発明の基体やDNAチップは、上記のようにサーミスタ等の加熱・冷却手段に直接接触させて用いる他に、従来のPCR法でのDNA増幅法のようにエッペン型チューブ内の反応液中に投入して用いることもできる。この場合には、前述の実施例に記載したようにきわめて短時間でPCR増幅法を終了させることはできないが、従来行われていた反応液中にDNAを投入する方法よりも迅速に終了させることができる。
【0042】
【産業上の利用可能性】
本発明においては、熱伝導率に優れた基体を用いたことにより、PCR法を用いたDNA増幅反応をきわめて短時間に終えることができる。
また、基体に直接加熱・冷却手段を接触させて基体を加熱・冷却することによって、前記PCR反応の温度制御も精度よく行えるために、増幅目的以外のDNAはほとんど複製されないという利点がある。
【0043】
また、本発明の基体は、熱伝導性に優れた固体状基体にDNAを直接固定化しているので、基体の温度を直接加熱・冷却させることによって、PCR法等によるヒートサイクルの追随性を向上させることができ、目的とする量のDNAを短時間で得ることができる。
また、本発明の基体は、表面を水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基等で化学修飾してあるので、DNA等の固定化の安定化を図れ、PCR法などを用いてDNA増幅反応によりDNAを複製するためのチップなどに最適である。
また、本発明の基体は、表面が汚染された場合に、加水分解させて化学修飾を再生させることができ、高価なDNAチップを節約できる。
Claims (6)
- DNAを固定化して増幅するための熱伝導性に優れたDNA固定化用固体状基体であって、基体がダイヤモンド、窒化アルミニウム、炭化チタン、タングステン又はアルミナであり、末端に水酸基を有するように化学修飾がされたDNA固定化用固体状基体。
- DNAを固定化して増幅するための熱伝導性に優れたDNA固定化用固体状基体であって、基体がダイヤモンド、窒化アルミニウム、炭化チタン、タングステン又はアルミナであり、カルボン酸ソーダがエステル結合又はペプチド結合を介して基体表面に結合し、末端にカルボキシル基を有するように化学修飾がされたDNA固定化用固体状基体。
- DNAを固定化して増幅するための熱伝導性に優れたDNA固定化用固体状基体であって、基体がダイヤモンド、窒化アルミニウム、炭化チタン、タングステン又はアルミナであり、基体表面の水酸基にシランカップリング剤によりエポキシ基が導入され、末端にエポキシ基を有するように化学修飾がされたDNA固定化用固体状基体。
- DNAを固定化して増幅するための熱伝導性に優れたDNA固定化用固体状基体であって、基体がダイヤモンド、窒化アルミニウム、炭化チタン、タングステン又はアルミナであり、基体表面の水酸基にシランカップリング剤によりアミノ基が導入され、末端にアミノ基を有するように化学修飾がされたDNA固定化用固体状基体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の基体にDNAを固定化したDNA固定化チップ。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の基体又は請求項5記載のチップを用いてDNAを増幅する方法。
【0001】
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