JPH04501957A - インビトロ変異導入法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インビトロ変異導入法 本発明はインビトロ変異導入法に関するものであり、部位特異的変異導入を達成 するための簡単で迅速な方法並びにキットを供する。

従来の部位特異的変異導入は一本鎖ＤＮＡを作るために親遺伝子又は他のＤＮ’ ＾配列を単離し必要に応じて変性することによって行われてきた。また、別の手 段としては、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡをＭ　１．３フアージに組み込み、一本 鎖ＭＩ３を得るためクローニングする。１箇所以上の所望の塩基改変部位を有し 、しかも塩基対のミスマツチにもかかわらず選択部位に結合できるような十分な 長さをもつオリゴヌクレオチドブライマーを一本鎖ＤＮＡに添加する。適当なり ガーゼとポリメラーゼをヌクレオチドと共に加える。１箇所以上の所望の塩基改 変部位を有する新しイＤＮＡ鎖が合成される（２ｏ１１ｅｒ、　Ｍ、Ｊ、ｌ　Ｓ ｍ１ｔｈ、　Ｍ。

（ＩＨ３）　Ｍｅｓｈ、　！＋＋ｘ７ｍｏｌ、第１００巻４６ｇ−５００頁参照 ）。

部位特異的変異導入の手順を簡略化し、かかる変異導入を迅速化することが望ま れている。

さらに従来技術では、変異を導入したＤＮＡから親ＤＮＡをクローニングに先立 って取り除くことが困難であるので、親プラスミドの増幅を最小限に抑えるよう に特別に構築された宿主細菌株を必要とする。

本発明は１箇所以上の塩基改変部位を含む一本鎖ＤＮＡを作製するための核酸の インビトロ変異導入法を供するが、本発明の方法は以下の段階を含む：ｉ）変異 を導入すべき核酸を保有する不溶性担体の調製段階、 ｂ）所望の１箇所以上の塩基改変部位を有してはいるが上記１番目の核酸上の適 当な部位とハイブリダイズするに十分な相同性を有するＤＮＡオリゴヌクレオチ ドオプライマーを添加し、該プライマーを上記核酸に結合させる段階、 Ｃ）必要に応じて上記核酸の合成の開始される末端に対応するプライマーとさら にハイブリダイゼーションさせ、所望の変異を有するＤＮＡ鎖を合成するために ポリメラーゼ又は逆転写酵素及びヌクレオチドを添加し、該ＤＮＡ鎖をプライマ ーと結合させるためのりガーゼを添加する段階、 ｄ）合成されたＤＮＡ鎖から上記１番目の核酸を除去する段階、及び Ｃ）液体を除去する段階。

変異を導入すべき核酸は不溶性担体に結合した核酸プローブにハイブリダイズさ せることによって不溶性担体に結合させることができる。このプローブはＤＮＡ 合成用プライマーとして役立てることができる。或いは、核酸を担体に直接結合 させてもよい。

鋳型核酸がハイブリダイゼーションによって結合している場合、合成された鎖は 通常はプローブに共有結合するので、合成されたＤＮＡを粒子から取り除（のは 容易ではない。従って、二本鎖ＤＮＡを合成する場合、その核酸の好ましくは後 段のクローニングのための領域付近に制限酵素ＣＲＥ）部位を導入して二本鎖ｆ ｉｌｌ＾を取り除くことができるようにすると有用である。

核酸が直接結合している場合、もし結合部分にプライマー配列がなければ、合成 を開始させるためにプライマーが加えられるが、この場合、合成されたＤＩＩＡ 鎖は変性によって鋳型から取り外すことができ、例えば上清の除去などによって 担体に結合した鋳型から分離することができる。次いで、所望により２番目の鎖 を溶液中で合成することができる。

二本鎖を生じさせるための２番目のＤＮＡ鎖の合成には、最初に合成したＤＮＡ 鎖の３′末端領域に対応する適当なプライマーの添加が必要である。

変異を導入すべき核酸は極く微量でしか入手できない場合が多（、ＰＣＲ（ポリ メラーゼチェーンリアクション）法を用いて効果的に増幅することが多い。り？ ｌＡの場合、未増幅の二本鎖（ｄｓｌＤＮ＾を変性し、コード鎖と非コード鎖の 両方にプライマーをアニールさせる。プライマーはポリメラーゼを用いるプライ マーの伸長の際に各々の鎖のＩ）ＮＡ鎖の配列全体が複製されるようにＤＮＡの ５′末端配列に対応するものが好ましい。このようにして作製した二本鎖ＤＮＡ は温度を上昇させた後急冷することによって変性させる。過剰なプライマー分子 を存在させ、新たなコード鎖及び非コード鎖にアニールさせる。ポリメラーゼを 用いる伸長反応によってさらに二本鎖が作られる。

この温度サイクルは何回も繰り返すことができ、多数のＤＩｉＡコピーが作られ る。好ましくは、用いるポリメラーゼは該サイクルの最高温度に耐性のもの（通 常はＴａｇポリメラーゼ）であるが、さもないと昇温段階前に毎回ポリメラーゼ と核酸を分離するか、或いは冷却段階後に毎回ポリメラーゼを補充する必要があ る。かかるＰＣＲ増幅によって、用いたプライマーに対応する目的ＤＮＡが得ら れる。これらの一つは不溶性担体（例えば磁性粒子）に結合させてもよいし、或 いは例えばビオチン基などの後段の結合操作のための手段を与えてもよい。この ようにして、本発明の変異導入法に用いる担体に結合した目的ＤＮＡを容易に得 ることができる。

後でプラスミドもしくはその他のベクターに組み込んでクローニングするために 、通常は二本鎖ＤＮＡを合成する。しかし、鋳型核酸を直接担体に結合させる場 合には、変異ＤＮＡのクローニングの前段の二本鎖ＤＮＡの合成を省略すること ができる。直線状ベクターの一本の鎖の末端領域と相同な末端領域を鋳型核酸に 与えて、合成された一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡが直線状ベクター鎖の対応する末端領 域とハイブリダイズするような末端を有するようにしてもよい。変異５ｓＤＮＡ の合成後、これを例えば融解によって遊離させ、直線状ベクター鎖と接触させて 、変異ｃＤＮ＾とベクターに由来する２つの一本鎖領域及び末端領域が重複・ハ イブリダイズした２つの二本鎖領域とを有する環状生成物を作製し得る。アニー ルした後は、かかる環状生成物は意外にもＥ、ｃｏｌｉなどの適当な宿主の形質 転換に直接使用できる。宿主生体中のネイティブなポリメラーゼによって上記環 状生成物の個々の不完全鎖が伸長し、複製可能な二本鎖プラスミドが生ずる。

この手法の一つの変法においては、変異を導入すべきＤＮＡ配列を含んだ二本鎖 プラスミドは、このＩＩＮＡ配列の両側に２箇所のＲＥ部位と、さらにそれらの 内側であって外側のＲＥ部位とは離れた箇所に２つのＲＥ部位を有する。

そのプラスミドを内側ＲＥ部位の一方の部位で切断し、ビオチン化する。続いて もう一方の内側ＲＥ部位で切断する。

この操作は直線状二本鎖ベクターを与えるが、このベクターを次にアビジン又は ストレプトアビジンでコートされた不溶性担体に結合させる。こうすることによ って直線状ベクターの一本の鎖は担体に結合するが、もう１本の鎖は結合せずに 変性によって溶液中へ遊離させることができる。変異を導入すべき切断されたＤ ＮＡ配列を含む短い配列の方は結合されない。元のプラスミドのまた別の試料は 、続いて最初に切断したＲＥ部位の外側にある外側ＲＥ部位のうちの一方の部位 で切断し、付着末端をビオチン化することもできる。最後に第４のＲＥ部位で切 断することによって二本鎖の変異導入用鋳型ＤＮＡができる。

そのうちの１本の鎖の一端はビオチン化されており担体に結合し得る。変性によ って結合していない鎖を取り除いても、ビオチン化された鎖は固定されたまま残 る。ＲＥ部位は固定鏡が遊離ベクター鎖に対応するように選択しなければならな い。このように選択することによって、合成すべき変異ｃＤＮＡ鎖はベクター鎖 とＲＥ部位の間のフランキング部分で相補的になる。次に、ビオチン化されたフ ランキング領域に対応するプライマーを、所望のＤＮＡ変異を導入した変異プラ イマーと共に加える。ポリメラーゼを使った伸長反応と連結反応によって、変性 で鋳型から取り外すことのできる一本鎖変異ｃＤＮＡ鎖が得られる。

一本鎖型の直線状ベクターの末端領域は変異ＤＮＡ配列の両端のフランキング領 域と相補的で、接触させてアニールした時に環状ＤＮＡを生ずるが、この環状Ｄ ＮＡは上述の通り宿主に形質転換でき、完全で複製可能なプラスミドへ変換され ることが理解されるだろう。

さらに別の手法によれば、標準的な直線状ベクターが上述の通り溶液中で調製で きる。変異を導入すべきＤＮＡ配列を含むプラスミドは一本鎖直線状ベクターの 末端領域に対応する配列を両側に有する。さらに、変異を導入すべき目的ＤＮＡ 配列の両側にあるプライマーを使って、該プラスミドを１回もしくは２回のＰＣ Ｒ増幅に付すことができる。これらのプライマーは直線状ベクターの末端領域と 相同である。かかるプライマーの一つは、担体に結合するための手段（例えばビ オチン基など）を与えたものであってもよいし、或いは予め担体に結合させたも のであってもよい。鎖の伸長反応によって、最後の鎖の分離の後、一端で担体に 結合した一本鎖型の目的ＤＮＡが得られる。伸長反応開始用の３′末端のもう一 方のプライマーと、所望の変異の導入された変異用プライマーとのハイブリダイ ゼーションによって、変異が導入されかつ直線状ベクターの末端配列と相補的な 配列ではさまれたｃＤＮＡ鎖のポリメラーゼ存在下での合成が可能となる。例え ばアルカリ処理などの鎖分離処理を行うと、変異を含む鎖は溶液中に遊離するが 鋳型は固定されているので、容易に分離することができる。変異一本鎖ｃＤＮ＾ を次に直線状ベクターと接触させてアニールすると上述の環状生成物が得られる 。

上述のどの系においても、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジンのアフィ ニティ一対を、比較的小さな分子とその結合用パートナ−（例えばその抗体）を 用いた他の対で置き換え得ることは理解されるだろう。

担体へのＤＮＡの直接的な結合は、例えばビオチン−アビジン結合のような親和 性結合によるものであっても後述するような共有結合によるものであってもよい 。

本発明の優れた点は、合成ＯＮ＾から鋳型を完全に取り除くのが容易で未変異Ｄ ＮＡによる汚染を防ぐことができることである。

上述の通り、プローブはＲＮＡもしくはＤＮＡにハイブリダイズするようなりＮ Ａ部分である。これらには、ネイティブなｍＲＮＡ上に普遍的に存在するポリＡ テイルとハイブリダイズするオリゴｄＴ、目的とするＩ）ＮＡやＲＮＡ分子中の 特定の配列とハイブリダイズする特定のＤＮＡ配列を有するプローブが含まれる 。各々のプローブは、直接結合させるような一本ｍＤＮＡ（これはオリゴｄＴ又 は特定ＤＮＡ配列でもよい）からなるものでもよいし、或いはＤ？ｌ＾の二本鎖 部分を介して不溶性担体に結合させてもよい。

変異導入やその後のｃＤＮＡ合成のためにｍＲＮＡを単離したい場合、用いるプ ローブとして特に有用なものは、その３′末端が重複しか一２５′末端とハイブ リダイズして５′末端領域の残りの部分が目的の核酸とパイプリダイズできる付 着末端として残っているようなりＮＡ配列である。付着末端から離れた位置にア ミノ基のような官能基が存在すれば、そのループは例えばカルボキシル基などを 介して不溶性担体へ共有結合し得る。或いは、ビオチン基をそのループに結合さ せて、プローブをストレプトアビジンでコートされた粒子へ結合させてもよい。

従って、付着末端に対応するような末端領域をもつＤＮＡは、ＤＮＡを共有結合 で結合させることが必要であれば、そのループの隣接部分に連結できる可能性を 有している。後でＤＮＡを脱離させるために、ＲＥ部位をプローブの重複領域に 導入することもできる。

本発明の方法をｍＲＮＡ材料（例えば細胞溶解物から得られるもの）に変異を導 入するために用いる場合、プローブとしては例えば２０乃至２００塩基のデオキ シチミジン単位の比較的短い鎖であるオリゴｄＴが有用である。かかる鎖は容易 かつ安価に調製でき、デオキシチミジン単位の酵素を用いる重合又はＤＮＡ合成 装置を用いて例えば２０乃至２０Ｇ塩基、簡便には約２５塩基のものが調製でき る。

目的の核酸が特定の核酸もしくは公知の保存領域を有する核酸ファミリーの一つ である場合は、プローブ／プライマーは従来法で合成し得る特定オリゴヌクレオ チドの配列を含み得る。不活性担体が水酸基を保有する場合、担体上に直接合成 することが可能である。

不必要な核酸の非特異的なハイブリダイゼーションを避け、ハイブリダイゼーシ ョン溶液の残留成分を完全に除去するため、分離後生なくとも一回は不溶性担体 を洗浄するのが望ましい。ランダムな部分的相同性によって結合した核酸を除去 するため、洗浄は温度を上げるか或いはハイブリダイゼーションで用いた時より 低い塩濃度（例えば　０．５ＭＮｍＣ／もしくはそれと同等の溶液）を用いるよ うな厳しい条件下で行い得る。

その条件の厳しさは通常はプローブの長さとＧ：Ｃ含量によって計算される。プ ローブオリゴヌクレオチドと目的核酸との相同性が正確でない場合には、洗浄は あまり厳しい条件で行うべきでない。一般には、洗浄は二重らせんの融解温度（ Ｔｌｌ）よりも１２℃低い温度で行われるべきである。およそのＴｆｆｉは以下 の関係式に従って簡便に計算される（Ｍｘｎｉ［ｉ３　Ｔ、他（１９８２）　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ　１ｏｂｏｒｘｔｏｒ７　ｍｇ＋＋ｕａ ｌ　３ｇＢ−３１℃９頁から抜粋）。

（１）　Ｔｍ・６９Ｊ　＋　０．４１　（Ｇ＋Ｃ）Ｘ　−６５０／Ｌ式中、しは ヌクレオチド中のプローブの平均長に等しい。

（ｂ）二重らせんＤＮＡのＴＩ、はミスマツチの塩基対の数が１％上昇するごと に１℃減少する。

（ｃ）　（Ｔａｇ）　ｖ２−　（Ｔｍ）旧＝　１８．５　ｌｏｇｔｏ　（ｏｘ／ ｕ＋）式中、ＤＩとｕ２は２つの溶液のイオン強度である。

小さいオリゴヌクレオチドでは、融解温度は以下のように摂氏で見積もられる。

Ｔｆｆｌ　＝　２　（＾＋Ｔ塩基数）　＋４　（Ｇ＋Ｃ塩基数）ハイブリダイゼ ーション反応は、好ましくはＩＭＮａＣｊもしくは公知のそれと同等の溶液中で 行う（Ｎｕｃｌｅｔｃ＾ｃｉｄ　ｆ１７ｂｔｉｄｉｓａｔｉｏｎ、Ｂ、Ｄ、Ｈａ ａ＋ｅｓ及び　Ｓ、Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ社１９８５年発行参照）。

本発明の方法を行う前に目的の核酸を前処理しなければならないことがある。例 えば目的の核酸がｄｓＤＮ＾である場合、５ｓＤＮＡを与えるために最初に融解 し、次いで急冷することが必要である。丁、の決定に関しては上述の通りである 。ｍＲＮＡプールのある特定のｍＲＮＡに変異を導入する場合、ｍＲＮＡはＤＮ Ａによりも安定性が低いため、特異的プローブで目的核酸を選択するに先立って すべてのｍＲＮ人種について先ずｃＤＮＡを合成するのが好ましい。目的の核酸 が比較的少量しかない場合、２つの間隔を置いた特異的配列が既知である場合に 限られるのは無論であるが、ＰＣＲ法で増幅するのが好ましい。

プローブ及びプローブオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置、例えば＾ｐ ｐｌｉｅｌ　ＢｉｏＢｇｊｅｍｇ、Ｉｎｃ、社製のもの（８５０−Ｔ、カリフォ ルニア州フォスター・シティ、リンカーン・ドライブ９４４０４）を使フて調製 することができる。

従来の方法では、酵素反応は同一の緩衝液中で行うことが多く、個々の反応に対 しては最適でない。しかしながら、本発明の方法においては緩衝液の交換が可能 で、所望の変異を含むｃＤＮＡの作製を最適化することができる。

さらに、従来の一本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　１．の合成法では、ヌクレオチド試薬のｍＲ ＮＡに対する割合は後段において過剰の試薬による汚染を防ぐためにほぼ化学量 論量に保つのが一般的である。本発明においては目的核酸が固定化されているこ とから簡単かつ迅速に洗浄できるので、過剰の試薬を用いることができ、それに 伴って効率を上げることができる。

不溶性担体としては多種多様なものを選択できる。例えば、マイクロ滴定用のウ ェル、セルロースもしくはナイロン製のフィルター、又はセファデックスもしく はセファロースビーズもしくはポリスチレンラテックス粒子などの粒子が挙げら れる。本発明の好ましい態様として磁性粒子の使用が挙げられるが、かかる磁性 粒子は表面に集合させたり、その後の処理のために容易に再分散（例えば物理的 撹拌によって）させたりできる。

好適には、上記粒子は単分散型及び／又は超常磁性である。これらの性質は共に その粒子の関与する反応速度を著しく促進する。本発明の驚くべき一面として、 上記粒子に担持されているプローブはあたかも溶液中に自由に存在している如く 速やかに反応する。例えば、ハイブリダイゼーション及び精製は１５分未満で達 成できるが、この事実はポリｄＴアフィニティーカラム上でのｍＲＮＡのハイブ リダイゼーション及び精製に２時間を必要とするのと著しく対照的である。単分 散粒子（即ち、実質的に同じ大きさの粒子）を用いると、反応速度及び他のパラ メーターは特に均一になる。超常磁性粒子（即ち、常磁性を維持するのに必要な ドメインサイズより小さい強磁性材料でできた亜粒子を含有した粒子）を用いる と、反応中の粒子の磁気的凝集を防ぐことができるので、この場合も均一かつ迅 速な反応速度が確保される。

本発明で用いることのできる好ましい磁性粒子は欧州特許第８３９０１４０６． ５号明細書（Ｓｉｎｔｅｌ）に従って製造された単分散型超常磁性ビーズである 。その開示内容は本明細書中に参照により組み込まれる。これらのビーズにおい て鉄は非常に均一に分布しており磁場に対して非常に均一な応答をする。この特 性によってすべてのビーズが同じ速度で移動するので、この特性は再現性のある 手順（特に自動化されたもの）を設計する上で重要である。

さらに、ある量の鉄を再現性をもって個々の粒子に導入することができるので、 その量を比較的低いレベルに調節でき、その粒子の比重を後述の範囲内に抑える ことが可能となる。従来、均一性に欠ける粒子もしくは小さな粒子はいずれも極 く僅かな量の鉄しか含んでいないために磁石を利用してもブラウン力に抗するこ とができなかったり、その物質の比重によって大きな粒子が沈降してしまったり した。若干の自動化された系では溶液通過時に粒子を反応領域内にとどまらせる ため磁場を用いており、かかる系に用いる磁性粒子には均一な磁気的特性及び流 体力学的特性が欠かせない。

本明細書中で用いる「単分散」という用語は５％未満の直径の標準偏差を有する 粒度分布を包含する意味で用いる。

比重１．１乃至１．８のビーズの使用が好ましいが、最も好ましいものは比重１ ．２乃至１．５のものである。本発明で用いる単分散型ビーズの比重は特に均一 で、均一かつ予想可能な速度論的性質が得られる。

上記単分散型粒子は、直径１ミクロン以上、好ましくは２ミクロン以上で、好ま しくは１０ミクロン以下、最も好ましくは６ミクロン以下（例えば３ミクロン） の球状ビーズである。粒子が小さいほどゆっくりと沈降するので、沈降時間が反 応時間より長くなるような場合もあり、この場合物理的撹拌を行う必要はなくな る。しかし、先行技術で用いられるような、もっと直径の小さい微細粒子を含ん だ平均直径［１，１乃至１．５ミクロンのビーズは磁化に対する応答に信頼性の 欠ける挙動が見られる。

プローブの上記粒子への結合は直接的な化学結合並びにストレプトアビジン／ビ オチン複合体などによる親和性結合で行うことができる。

プローブの結合用に、磁性粒子は水酸基、カルボキシル基、アルデビド基又はア ミノ基などの官能基を保有し得る。これらの官能基は一般に未被覆単分散型超常 磁性ビーズにこのような官能基の１つを保有するポリマーの表面コートを与える ような処理を施すことによって与えられ、例えば、水酸基を与えるにはポリグリ コールとポリウレタン、又はセルロース誘導体で、カルボキシル基を与えるには アクリル酸又はメタクリル酸の重合体又は共重合体で、アミノ基を与えるにはア ミノアルキル化ポリマーで処理する。かかる表面被覆導入法は米国特許第４６５ ４２６７号明細書に記載されている。

本発明で用いる好ましい被覆粒子は米国特許第４３３６１７３号、同第４４５９ ３７８号及び同第４６５４２６７号明細書に記載されたビーズの修飾によって調 製し得る。これらの開示内容は参照により本明細書中に組み込まれる。例えばス チレン−ジビニルベンゼンから作られる直径３．１５ｐｍのマクロ網状多孔質ポ リマー粒子をＨＮＯ３で処理すると細孔表面に−ＮＯ２基が導入される。次いで この粒子をＦｅ”の水溶液に分散させる。Ｆｅ”が−？＋０２基によって酸化さ れて、細孔内部で不溶性のオキシ−ヒドロキシ化合物の沈殿が起きる。加熱処理 すると、鉄は多孔質粒子粒子内金体に磁性鉄酸化物の微細粒子として存在する。

ＮＯ２基はＦｅ”との反応によって還元されてＮｌ２基となる。

細孔を満たし、表面に所望の官能基を導入するため、種々のモノマーを細孔内部 及び表面で重合させる。好ましい種類の粒子においては、表面は−（Ｃｔ１２Ｃ ＩｈＯ）　５−ｔｏ結合を介してポリマー主鎖に連結した一〇Ｈ基を保有する。

その他の好ましいビーズにおいてはメタクリル酸の重合によって得られるＣｏｏ ｌ基を保有する。

従って、例えばビーズに最初から存在する　ＮＯｘ基を米国特許第４６５４２６ ７号明細書に記載されているようにジエポキシドと反応させ、続いてメタクリル 酸と反応させると末端ビニル基が得られる。メタクリル酸との溶液共重合によっ て後述のＲ４５２ビーズにおけるような末端にカルボキシル基を有するポリマー コートが得られる。同様にして、ジエポキシドとの反応による上述の生成物とジ アミンとの反応によってＲ２４０、Ｒ４４２及びＲ４３９ビーズにおけるように アミノ基が導入され、アミノグリセロールのようなヒドロキシルアミンとの反応 によって旧５０及びＲ２５５ビーズにおけるように水酸基が導入される。

ダイナビーズ（Ｄｙｎｘｂｅｘｄｓ）　Ｍ４５０　（直径４．５ミクロン、Ｄ７ ｎａ１社（ノルウェー、オス口）から入手可能）は単量体エポキシドでコートさ れており、エポキシ基と水酸基の混合体を生ずる。しかし、水と接触させるとエ ポキシ基は水酸基に変化する。

ダイナビーズＭ２８０　（直径２．８ミクロン）は水酸基を有するポリスチレン ビーズであるが、ｐ−トルエンスルホニルクロライドとの反応でトシルオキシ基 へ変化する。

本発明者らは上述の官能基コーティング法を用いると、特にカルボキシル化ビー ズの場合、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの非特異的結合が非常に低いことを発見した 。

上述の通り、プローブ及びＲＥリンカ−は好ましくはカルボキシル基を介して磁 性粒子に結合させる。最初にＤＮＡに５′末端のアミノ基を与えてカルボジイミ ドカップリング試薬でカルボキシル基とアミド結合を生ずることができるように する。ＤＮＡの５′末端での結合は、５′−アミノＤＮＡと反応できるようにＣ ＮＢ＋で活性化された水酸基保有磁性粒子を用いても行い得る。

オリゴヌクレオチドＤＮＡの３′末端における結合も化学合成によって行い得る 。前述の通り、単分散粒子は非常に均一な特性を有するので、ジーン・アセンブ ラ−（Ｇｅｎｅ　Ａ＠ｓｅｍｂｌｅｒ、　Ｐｈｘｒｍｘｃｉｓ社製）のような自 動合成装置における合成に特に適した一定の反応速度を与える。

上記磁性粒子は最初に水酸基か又は保護された水酸基を持つ必要がある。Ｄ７ｎ １１社製のダイナビーズＭ２８０はこの目的に大変適している。しかし、必要に 応じて、カルボキシル基のようなその他の表面官能基を、水酸基を有するリンカ −１或いは３′−結合ヌクレオチドの結合に用いることができる。

５′末端での結合は、５′−アミノ−オリゴヌクレオチドをトシル−活性化磁性 粒子にカップリングさせることによって達成し得る。後者はＤｙ＋ｔ１社製のダ イナビーズＭ２８０のような水酸化磁性粒子をトシル化することにより調製し得 る。トシル基の置換によって、磁性ビーズに直接結合した５′アミノ基が残る。

ビオチン標識ヌクレオチドが市販されており、Ｄ　Ｎ　Ａ断片の３′末端をＤＮ Ａポリメラーゼによりラベルすることができる。これらは、例えば水酸基などを 介して磁性粒子に結合したアビジンや又はストレプトアビジンに簡便に結合させ 得る。このビオチン標識は立体的障害を最小限に抑えるために１個以上のε−ア ミノカプロン酸部分のようなスペーサーアームによってヌクレオチドに結合させ てもよい。

一般にビーズの官能化とその後のプローブの結合は好適には個々の磁性粒子が１ ０３〜１０５個のプローブ（１〜３００　ｐｍａｌ／■）を保有する。磁性粒子 が均一な粒度を有していれば、プローブが該粒子と反応する際にプローブの密度 が均一になるという利点がある。プローブの密度の均一性は、それらが使用され る種々のプロセスにおいてすべてのプローブが実質的に同じ挙動をとるようにす るために重要である。

磁性粒子の優れた特徴の一つは酵素活性が粒子表面に非常に近い場所（例えば７ 塩基以内の場所）で起こっていると思われることである。従って、後述するよう にリンカ−配６列内に１つのＲＥ部位が存在し、該プローブをプライマーとして 続いて用いれば、５ｉｃＤＮ＾及びｄ　ｓ　ｃＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼによ ってＲＥ部位を通ってビーズ表面に向かう方向に合成され、従ってそれ自体適当 なエンドヌクレアーゼによって容易に切断できる。カルボキシル化ビーズの場合 、ビーズの微細表面は著しく不規則で、表面付近でのハイブリダイゼーション及 び酵素活性に対する立体的な障害を低減するような非常に大きな表面積が呈する 。その一方で、かかるカルボキシル化ビーズへの非特異的結合は増加しない。

本発明のもう一つの態様において、本発明者らは核酸のインビトロ変異導入用の キットにして、（Ｉ）変異を導入すべき核酸を担持するための改良不溶性担体、 （ｂ）ポリメラーゼ又は逆転写酵素、及び下記　（ｃ）〜（ｄ）の１もしくはそ れ以上を含んでなるキットを供する。

（ｃ）　ｃＤＮＡ合成開始用のプライマー、（ｄ）デオキシヌクレオチド、及び （ｔ）適当な緩衝液。

変異導入に付す目的ＤＮＡを固定する前にＰＣＲ増幅を行うため、該キットは、 特に （ｉ）２１１類のＰＣＲプライマーにして、その１種類は該担体への結合能をも つ親和性結合分子を保有するもの、 （１１）鎖分離用のアルカリ溶液 をさらに含んでいてもよい。

以下の例は説明のみを目的として挙げるものである。

（１）カルボキシルビーズへのプローブの結合に用いた反応は以下の通りである 。プローブの５′末端へのアミノ基の導入をＣＩａｎ他の一段階反応法（Ｃｈｉ 、　Ｂ、　Ｃ，Ｆ、及びＯｒｇｅｌ、　Ｌ、　Ｅ、　（１９８５）　ＤＮＡ第４ 巻３２７−３３１頁）によって行った結果、アルキルリンカ−の末端第一アミノ 基の核性は塩基のアミノ官能基よりも増大した。従って、ビーズ上のカルボキシ ル基はこれらのアルキルリンカ−の第一アミノ基と優先的に反応するものと考え られる。

Ｒ４５２カルボキシルビーズ１■当り、５’−ＮＨ２修飾プローブ１ＧＧμｇを 含む０．１Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ７，０）と０．ＩＭＥＤＣの溶液６０　 Ｏａｌを加えた。穏やかに撹拌しながら反応混合物を室温で２０時間インキュベ ートした。

（ｂｌ　ＮＨ２修飾プローブをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｌｅｍｓ社製の合 成装置とＡｍ１ｎｏｌｉｎｋ　ＩＩを用いて合成した。

カップリング反応は以下の通りであった。

Ｒ４５２カルボキシルビーズ１■当り、５’−ＮＨ２修飾プローブ１０月を含む ０．１Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ７，０）及び０．ＩＭＥＤＣの溶液１００　 ｐｉを加えた。反応混合物をローラーミキサー（Ｃｏｕｌｌｅｒ社製）上で室温 で２０時間インキュベートし、次いで０．１Ｍ　ＮｘＣｌを含むＴＥ緩衝液（× ４）中で洗浄した。

ハイブリダイゼーション効率： 相補的な２５量体のポリｄＴプローブを用いたハイブリダイゼーション実験を様 々な量のプローブが結合したビーズで行った。

ビーズはビーズ１■当り１〜２５０ｐｍｏｌのプローブが覆っていた。２５量体 のポリｄＡオリゴヌクレオチドの量が増えるに従って、より多量の結合プローブ とハイブリダイズした。

２５０ｐｍｏｌのプローブが結合したビーズには１９３ｐｍｏｌのプローブがハ イブリダイズした。しかし、目的の分子が１０００塩基対（ｂｐ）の範囲にある 時（Ｐ＋ｏｍｅｇａ　ＢｉｏｓＨｔｅＩＩｌｓ社製の対照ｍＲＮ＾）　、Ｉｏｏ ｐｍｏｌのプローブが結合したビーズとそれより多量のプローブが結合したビー ズとの間でハイブリッド形成効率の差はなかった。

Ｇｈｏｓｈ他の方法（Ｇｈｏｓｈ、　Ｓ、　Ｓ、及びＭｕｓｓｏ、　Ｇ、Ｆ。

（１９８７）、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　第１５巻５３５３−５３７ ２頁）によって、プローブをホスフォルアミデート結合を介して３種類の異なる アミノビーズに結合させた。異なるビーズに結合したＤＮＡの量を１．４ｐｇ／ ■から１１．３ｐｇ／■まで変化させた。

ポリエチレングリコールリンカ−（８原子）の末端にアミノ基を保有するＲ４６ ９ビーズは、それより短いリンカ−（３原子）上にアミノ基を保有するＲ２４０ ビーズよりも多量のプローブと結合した。Ｒ４４２ビーズの場合のように、リン カ−がそれより長い（２０原子）場合は、ビーズに結合するプローブ量の減少が 観察される。これは恐らくリンカ−の二次構造によるもので末端のアミノ基がカ ップリングできなくなったためであると思われる。

非特異的に結合したＤｌｒ＾の量は、恐らく表面積当りのアミノ基の数によるも のと思われるが、ビーズによって異なる（７〜３０％）。最も多量のプローブ（ Ｉｆμｇ／■）と共有結合したＲ４６９ビーズが、最も少ない非特異的結合を示 した。

ホスフォルアミデート結合の酸不安定性を酸加水分解による末端結合度の測定に 用いた（Ｃｈｕ、　Ｂ、Ｃ，Ｆ、、　Ｌｈｌ。

Ｇ、　Ｍ、及び０＋ｇｅｌ、　Ｌ、　Ｅ、　（１９８３）　Ｎｕｃｌ、　＾ｃｔ ｄｔ　Ｒｅｓ、第１１巻６５１３−６５２９頁）。末端結合したプローブの量は ビーズによって異なり２０〜６５％と変化したが、この場合もＲ４６９ビーズが 好ましいビーズであると思われ、末端結合したプローブは６５％であった。

本発明者らは、ｐＨ６、室温で２４時間の条件に代えて、イミダゾール緩衝液ｐ Ｈ７，５０℃で３時間の条件で反応を行うことにより、Ｒ４６９ビーズに２倍の プローブを結合させることができた。ＥＤＣの濃度を０．ＩＭから０．２Ｍに増 加させると、Ｒ４６９ビーズへのプローブ結合量は２０％減少した（データはこ こには示していない）。

一般的手法 ６０Ｄｐｍｏｌ　（６ｐｇ）のオリゴｄ＾（３６量体）を１ｐｌの［１，１Ｍイ ミダゾール（ｐＨ７）　、０．　ＩＭ　ＥＤＣ中に溶解し、５■のアミノビーズ と混合して５０℃で３時間インキュベートした。

５’　ＮＨ２プローブのトシル活性化ビーズへのカップリング＾ｐｐｌｉｅｄ　 ＢｉｏＢｓｌｅｍｓ社製のＤＮＡ合成装置３８１Ａと５′末端への第一アミン導 入用の　Ａｍ１ｎｏｌｉｎｋＩＩを用いてオリゴヌクレオチドの５′末端にＮＯ ３基を導入した。Ａｍ１ｎｏｌｉｎｋｌＩはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｔｅ ｍｓ社から入手したものである。合成後、これらのアミノ修飾オリゴヌクレオチ ドをカップリング実験に直接使用した。

トシル活性化ビーズはＤ７ｎａ１社（オス口）から市販されている。

カップリング法： ｌＯ■のトシル活性化ビーズを、５０μｇの　ＮＨ２修飾オリゴヌクレオチドが 溶解した０、　５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４１００ｐｌと混合し、ローラーミキサー上 で２０時間３７℃でインキュベートし、次いで０．１Ｍ　ＬＣＩを含むＴＥ緩衝 液（×４）中で洗浄した。

ダイナビーズＲ４８８を使用した。このビーズは直径が２．８ミクロンではなく ３．１５ミクロンであることを除けばＭ２Ｂ５と同じビーズで、Ｍ２８０ビーズ と同様に表面上に第一水酸基を有している。

合成装置（Ｐｈａ＋＋ｎａｃｉａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）を用いて、 ＤＮＡの３′末端を表面に結合させる。３．１５ミクロンのビーズに適合させる ためにほんの僅かな変更が必要であった。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｌｅｍｓ社製の標準小スケールカラムに３．０ミ クロンカットのテフロンフィルターを取り付け、ビーズを充填してカラムを装着 した。

この担体はジメチルトリチル基（ＤＭＴ＋）を含んでおらず、１サイクル目の第 一段階でかかる化学物質が放出されないときにはこの機械は停止してしてしまう ので、開始操作に僅か変更を加えた。合成はＤＭＴ　ｒ基が放出されるステップ まで標準ＡＢＩ小スケスケールカラムって開始した。次いでＧｅ＋＋ｅ　Ａｓｓ ｅｍｂｌｅｒを手動で停止させ、改良磁性粒子を充填したカラムをＧｅｎｅ　Ａ ｓｓｅｍｂｌｅｄに取り付けた。

製造業者の勧める標準的な合成プログラムに従って以降の操作を行った。脱保護 はＰｈａｔｍａｃｉａ社の勧める通り行った。直接合成法で、オリゴ（ｄＤ　２ ５及び以下のに軽鎖遺伝子のＣ領域の配列を合成した。

５’　−ＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧ ＴＧＣＡ−３’グイナビ一ズＭ２８０ストレプトアビジン（Ｊｎａ１社製、オス 口）を固相として使用した。このビーズは直径２．８ｐｍの単分散型超常磁性粒 子でストレプトアビジンが共有結合している。このビーズは４．３ｒｒｆ／ｇの 表面積を有する。

ビオチン結合能 ｌ　ｎｍｏｌの１４（−ビオチン（Ａｍｅ＋ｓｈｘｍ社製）を含む６ＸＳＳＰＥ （リン酸及びＥＤＴＡを含む標準塩水溶液：　Ｍａｎｉａ１口社製）１００μｌ を　０５■のビーズに加え、ローラーミキサー（Ｃｏｕｌｌｅｒ社製）上に室温 で１５分分間−た。

６ＸＳＳＰＥ中で２度に分けて洗浄した後、１４ｃｍビオチンの結合したフラク ションをシンチレーションカウンターで測定した。

デオキシオリゴヌクレオチド デオキシオリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｆｅｍｓ社製の３ ８１八ＤＮＡ合成装置で合成した。試薬はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｘＹｓｊｅｍｓ から購入した。５Ｉアミノ修飾デオキシオリゴヌクレオチドはＡｍ１−ａｏｌｉ ａｋ　ＩＩを用いて合、’３：　Ｌ、た。

用いた免疫グロブリンに軽鎖プローブは、５’　−ＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧ ＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ＾−３′ビオチンＸＮ）ＩＳＩ ステル（Ｃｌｏｎｔｅｃ社製、Ｎ−ビオチニルを一カプロン酸Ｎ−コハク酸イミ ジルエステル）は供給元の勧めに従って使用した。

９Ｑａｌの水中に溶解した０、１１ｍｏｌのＮＨ２修飾オリゴ（ｄＤ　２５に、 標識用緩衝液（１Ｍ重炭酸／炭酸ナトリウム、ｐＨ９，ｉｌ）　ＩｒＪｐｌを加 えて混合した。

最後にビオチンＸＮＨＳエステルのジメチルホルムアミド溶液（１００■／ｍ１ ）２５μｌを加え、室温で一晩インキユベートシた。

過剰の標識試薬と緩衝液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０のスピンカラムで取り除 いた。

５′ビオチン−オリゴ（ｄＴ）　２５は、クレノーポリメラーゼ、α−［”ＰＩ 　−ｄＴＴＰ、及び鋳型としてのオリゴ（ｄＡ）２゜の反応による補充により末 端標識された。過剰な標識は５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラムで取り除 いた。

オリゴ（ｄＴ）ダイナビーズ（Ｔビーズ）の調製６ｘＳＳＰＥ　２．５ｍｌ中に 溶解したビオチン化オリゴ（ｄＴ）　２９２００ｘｔ　（２４ｎｍｏｌ）を、５ ０ｍｇの予め洗浄したダイナビーズＭ２８０ストレプトアビジンと混合し、ロー ラーミキサー上で１５分間室温でインキュベートした。

ｅＸＳＳＰＥ中で２回洗浄した後、　４℃の１ｉＸＴＥ、０．１％ＳＤＳ中でビ ーズを保存した。

オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションアッセイ 異なるバッチのＴビーズのハイブリダイゼーション能を測定する標準アッセイ法 において、エッペンドルフチューブに入れたＯ、Ｉｍｇのビーズを６ｘＳＳＰＥ 、　０．１％ＳＤＳテ１回洗浄した。各段階でビーズを集めるためにマグネット ・ラック（ＭＰＣ−Ｅ、　Ｊｎｓ１社製、オス口）を使用した。

洗浄用緩衝液を除去した後、痕跡量（１〜２ｘｌＯ’　ｃｐｍ）のα−［”ＰＩ 　−ｄＡＴＰで標識されたオリゴ（ｄＡ）２５を５０ｐｍｏｌ含むハイブリダイ ゼーション溶液（６ＸＳＳＰＥ、　０．１％５ＤＳ）を加えた。

穏やかに撹拌した後、ハイブリダイゼーションさせるためチューブを室温で２分 間放置した。

ハイブリダイズしたビーズを２ｘＳＳＰＥ、　０．１％ＳＤＳで室温で２回洗浄 し、オリゴ（ｄＴ）　２５にハイブリダイズしたオリゴ（ｄＡ）　２５の量をシ ンチレーションカウンターで測定した。

ポリＡ　ｍＲＮＡ　）レーサーの標識 ３′末端ポリＡ２５テイルをもッ１２００ｂｐのｍＲＮＡ　（Ｐｔｏｍｃｇａ社 製）ｌｊｇを、５×クレノウ緩衝液、１ユニツトのＲＮａｓｉｎ（Ｐ＋ｏｍｅｇ ｉ社製）及びｌ０ｍＭ　ＤＴＴ中に溶解した２、　５ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＤ　 ２５と混合する。室温で２分経過した後、ｌＯμＣｉのα〜［３’Ｐ］　−ｄＡ ＴＰ、　１ユニツトのクレノーポリメラーゼ（＾ｍｅ＋ｓｈａｍ社製）及び水を 加えて５Ｑｒｔｌとして、１５℃で６０分間インキヨベートした。過剰のα−［ ３２Ｐ］　−ｄＡＴＰを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラムで除去した。

ポリ（Ａ）ｍＲＮＡのオリゴ（ｄＤ　２５結合ダイナビーズＭ２８０ストレプト アビジンへのハイブリダイゼーション用緩衝液 ポリ（Ａ）結合用緩衝液： Ｑ、　５Ｍ　ＬｉＣＪ、　１０ｍＭ　Ｔｗｉｔ−ＣＩ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ。

０．１％５ＤＳ０ 洗浄用緩衝液： ０、１５Ｍ　ＬｉＣＩ、　ＩＧｍＭ　Ｔ「ｔ−ＣＩ　（ｐｆｔ　７．５）、Ｉｍ Ｍ　ＥＤＴＡ。

０．１９６ＳＤＳ 溶出用緩衝液： ２１１ｆｉＭＥＩｌ！Ｔ八、０．１％５ＤＳ６精製ωＩＩＮＡを用いるその後の 段階に応じて最後の洗浄段階並びに溶出用緩衝液からＳＤＳを省いてもよい。

磁性粒子上でのインビトロ変異導入法にょろりチンＡ遺伝子からの３ｂｐの除去 リチンＡをコードする植物毒素遺伝子を含んだクローン化されたＢ！ＩＩＩＨＩ 断片（５ｕｎｄｔｎ他Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、第１４巻４号９８− ９９頁）をｐＢＲ３２２のＢ　Ｉ　ｍ　Ｉｆ　１部位へ結合させ、以下の配列を 含むｐＡＬＲ５００プラスミドを作製した。

５ｒＮＩの高塩濃度緩衝液（１００ｍＭ　Ｎ＠Ｃｊ、　ＳＬｍＭ　Ｔ＋Ｉ富−Ｃ Ｊ（ｐＨ７，５）、ｌ０ｍＭ　ＪＣｌｚ、　ＩｍＭ　ＤＴＴ）に溶解したこのプ ラスミド２ｐｍｏｌを、制限酵素ＥｃｏＲ１及び５８１１で切断し、２つの断片 を作る。

酵素をフェノール抽出で変性し、次いでエタノール沈殿を行なった（Ｍｇｎｌａ ｌｌｓ参照）。

６ユニツトのフレノウ酵素及び唯一のヌクレオチドとして２＋＋＋ｎｏｌのビオ チン２１−ｄυＴＰ　（ｅｌｏｎｌｅｃ社製）を加え、室温で１時間インキュベ ートした。

この操作によって５ｒｌ１部位だけがビオチン化される。

残ったビオチンｄ（ＩＴＩ’を５ｔｐｈ１ｄｅｘ　Ｇ−Ｓｏスピンカラムで除去 する。

スプレブトアビジンでコートした磁性ビーズ（ダイナビーズ２８０）Ｉｍｇを加 え、ローラーミキサー上に室温で１５〜３０分間放置し、ＴＥ緩衝液（ＩＯｍＭ 　Ｔｗｉｔ５−１１ＩＩ　ＥＤＴＡ（ｐ１１７．５１）で１回洗浄し、ＤＮＡ鎮 を分けるためにＯｔ　２８　Ｎａ０）１ｉ　００　ｇ＋で２分間処理した。ビー ズはＴＥ緩衝液で１回洗浄する。次いで緩衝液を除去した。

本発明者らはビーズに結合した一本鎖ＯＮ＾を最終的に得た。第２図参照： これはりチンＡの非コード鎖を含むインビトロ変異導入用の一本鎖の鋳型である 。

一本目の鎖の合成に用いたプライマー：１）　５’　ＣＡＣＧＡＴ　ＧＣＧ　丁 ＣＣＧＧＣ’ＧＴＡ　Ｇ＾　３′２）変異用プライマー ５’ＣＣＡＡＴ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＴＣＧＧＣ（鋳型はＣＧＴをここ に含む）　ＴＡＣＧＣＴ　ＧＧ＾＾＾ＴＡ＾Ｔ　ＡＧＣ’ＣＡ　Ｔ＾３′２番目 の鎖の合成に用いたプライマー；３）　５’　ＣＡＣＴＡＴ　ＣＧＡ　ＣＴＡ　 ＣＧＣＧＡＴ　Ｃ＾３′プライマーの位置を以下に示す。

２Ｇ９１の２ｘ　ｓｓｃ中の各々２０ｐｍｏｌのプライマー１）及びリン酸化変 異プライマー２）を１■の鋳型ビーズに加え、７０℃に加熱し、室温まで冷やし た。

ハイブリダイゼーション溶液に以下のものを加える：１０［１ｍＭ　Ｔｒｙｓ− Ｃ１（ｐＨ８，８）、２０ｐ１の５×ポリメラ一ゼ混合液、１０ｎＭ　ＤＴＴ、 　２．５１＝　ットのＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、２ユ ニツトのＴ４リガーゼ、ｄＡＴＰ、　ｄＧＴ［’。

ｄＴＴ［’、　ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ、５ｍＭ　人ＴＰ、水で１００ｘＪにする 。

混合 ５℃で５分間、続いて室温で５分間、３７℃で２時間インキュベートする。

Ｔ４ポリメラーゼのユニット数は酵素の品質に応じて加減する。

ビーズは１度水で洗浄し、０．２Ｍ　ＮａＯＨで２分間処理した。次いで、ビー ズに結合した鋳型と新しく合成された１番目の変異鎖を磁気的に分離した。

上清をフレノウ緩衝液で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラムに かけた。

プライマー３）を２０ｐｍｏｌ加え、７０℃に加熱した後ゆっくりと室温まで冷 やした。６ユニツトのフレノウ酵素及び２　ｎ＋ａｏｌの４種類のｄＮＴＰを加 え、６０分間室温でインキュベートした。

この新しく合成された二本鎖変異断片のＢ＊ｍＨ１部分をｐＵｃ８にクローニン グし、ポジティブなりローンを選んで配列決定した。

毀ユ 磁性粒子上でのインビトロ変異導入性 材料及び方法 細菌の株及びプラスミド Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＲＲＩΔＭＩ５を細菌宿主として使用した。プラスミドベクタ ーはｐＲＩ７２８である。プラスミドを含む細菌はアンピシリン（２Ｑ　０１１ ｘＪ　ｍｌ）　、Ｘ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むｔＢＡＢプレート上で生育さ せた。

酵素及びオリゴヌクレオチド 制限酵素、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、フレノウは Ｐｈａｔｍｘｃｔｘ社（スウェーデン）から購入した。Ｔ４ポリメラーゼはＮｅ ｖＥｎｇｌｘｎｄＢｉｏｌａｂｓ社から入手し、ビオチン川６−ｄＵＴＰはＢｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒＭ＋ｎｎｈｅｉｍ社（西独）から入手した。ＤＮＡ操作や精製 は常法に従って行った。オリゴヌクレオチドプライマーは自動ＤＮＡ合成装置（ Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ、Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ社製）上でのホスフォルア ミダイト法で合成した。

友殊 第１図に概略を示した固相インビトロ変異導入のプロ）・コルに従ってプラスミ ドベクターｐＲＩＴ２＋１の１ｉｃ２’遺伝子中にユニークなＮｃｏ１部位を誘 導した。これはｐＲＩＴ２８のＨｉｎｄｌ１１部位及びＢｓｌＥｌｌ部位近傍の 領域に相補的な２つの一般的な変異プライマー（ＧＭＰＩ及びＧＭＰ２）　、及 び１ａｃ２′遺伝子内の２番目のメチオニンのコドンの位置にＮｃｏｌの制限酵 素部位が生じた１つのミスマツチを除いてはＥｃｏＲＩの上流の流域と相補的な 変異用プライマー（Ｍｃｏｌプライマー）を用いて行った。

ベクター鋳型を得るため、１０ＭｇのｐＲＩ７２８を全量５０ｐｌのｆｌｉｎｄ ｌｌｌで切断した。その突出末端を、クレノウボリメラーゼ（５ユニツト）、１ ．５ｕ（のビオチン−１６−ｄＵＴＰ　（１ｍＭ）　、各ｄＮＴＰ　（０、５ｍ Ｍ）　３　ａｌ、及びｌ００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−４１ＣＪ　（ｐＨ７，５）、Ｉ　 ００　ｍＭ　ＭｇＣｊ　２、ＩＭＮａＣｌから成る緩衝液７．５ｕＩを使って埋 めた。反応溶液の体積は水で７Ｓｊ目ニ調節した。

反応は３７℃で１時間行なった。生成物は５ｅｐｈｘｄｅｘ　Ｇ−７５カラム（ Ｐｈｘｒｍａｃｉａ社製）を用いて精製し、次（こエタノール沈殿を行った。Ｔ Ｅ　（１０ｍＭ　Ｔｈ１ｓ　（ｐＨ７，５）、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した後 、プラスミドをＥｃｏＲＩで切断した。ビオチン化二本鎖ＤＮＡを含む反応溶液 を予めＩＭＮＩＣｊとＴＥで洗浄したダイナビーズＭ２８０−ストレプトアビジ ンと混合した。固定された二本鎖を０．１５Ｍ　ＮａＯＨと３７℃で１０分間イ ンキュベーションすることによって、コード鎖を融解して一本鎖にした。

「挿入」用の鋳型を得るためにＬＤ＋＋ｇのｐＲＩＴ２１１を８ｓｔＥｌｌで切 断し、５′突出末端を上記の通りビオチン化した。塩基で埋め、精製した後、プ ラスミドをＢｇｌｌ＋で切断し、その後前出の鋳型と同様に磁性ビーズ上に固定 した。固定した鋳型をもつダイナビーズを引き続き０．１５Ｍ　ＮａＯＨと水で 洗浄した。

伸長反応 プラスミドのベクタ一部分を作るために使われるオリゴヌクレオチドプライマー はＧＭＰＩ　（５’−ＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴ丁ＴＡＣＡＡＣＧＴＣ ＧＴＧＡ−３’）　と　ＧＭＰ２　（５’　−ＡＧＣＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＡ ＴＧＧＴ丁ＣＡＧＧＣ丁ＧＣＧＣ−３”）である。これらはそれぞれｐＲＩ７２ ８のＢｉｎｄｌｌｌの下流領域及びＢｓ１ＥＩＩの上流領域と相捕的である。部 位特異的変異導入は、ｐＲＩ７２８の１ａｃＺ’遺伝子内の２番目のメチオニン のコドンの位置にＨｅａｌ制限酵素部位を生ずるようなポリヌクレオチドプライ マー（５’　−ＧＴＡＴＴＡＡＡＴＴＣＧＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴ Ｇ−３’　）を用いて行った。このオリゴヌクレオチドをＮｅａｔプライマーは 呼ばれる。

各々のオリゴヌクレオチドプライマー５ｐｍｏｌを、１０ｍＭＴｈ１ｓ−ＨＣｊ 　（ｐＨ７，５）、ｌ０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、　ｌ００ｐｊ／ｍｌ　８３人、１０ ０ｍＭ　Ｎａ　Ｃ１を含む水溶液中でグイナビーズＭ２８０ストレプトアビジン ビーズ上に固定されたそれぞれの鋳型にアニールさせた。その反応液を６５℃で 　２〜３分間インキュベートし、ゆっくりと室温まで冷却した。

伸長反応は、１ａＪのＢＳＡ　（＋、　ＯＱｇ　／　ｍｌ）、６ｕｌのポリメラ ーゼ混合液（ＩＯＱｍＭ　Ｔｈ１ｉ−ＨＣｊ　（ｐＨ８，８）、ｌ０ｍＭ　ＤＴ Ｔ。

５０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２．５ｍＭ　ＡＴＰ）、５ｊＪのチェース（１０ｍＭの各 ｄＮＴＰ）　、及び３．５ユニツトの７４　ＤＮＡポリメラーゼの添加によって 行った。１ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼを挿入鎖を含むビーズへ加えた。体 積を水で３０ｔｈｌに調節した。反応液を室温で２０分間、続いて３７℃で２時 間インキュベートした。伸長反応後、ビーズをＴＥで１回洗浄した。新しく合成 した鎖を２０９１　（７）１１５Ｍ　ＮｔＯＨテ３７℃１０分間インキュベート することによって融解させた。直ぐに、１．５ａｌの酢酸（１，７Ｍ）及び２． ２ｊｊの１０　ＸＴＥ　（１００ｍＭ　Ｔｈ口（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＥＤＴ Ａ）で上清１７）ｐＨをｌ１節Ｌｆ。

２つの上清を混合し、７０℃で１０分間インキュベートし、ゆっくりと室温まで 冷却した。２つの鎖のアニーリングの後Ｃ，ｘＣＪｚの濃度を０．１Ｍに調整し て、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩΔＭ１５をこのＤＮＡテ形質転換し、ＩＰＴＧ及びＸ −ｇａｌを含むＴＢＡＢプレートに撒いた。

直接的な選択法を利用することができなかったため、調製したプラスミドの制限 酵素マツピングによるクローンのスクリーニングをしたところ、拾った２０個の クローンの中で１９個がポジティブであったが、そのポジティブなりローンの３ 個をＤＮＡの塩基配列決定によって確認した。

第２図に示したプロトコールを用いた。

（ａ）一本鎖ベクター鋳型を得るため、全量５ｈＪのＥｃｏＲＩでＩＯｘｇのｐ ｔｌｃｌｇを切断した。５′突出末端をフレノウポリメラーゼ（５ユニツト）、 ２μＩのビオチン−７−ｄＡＴＰ、及び１１００ＩＩＩのＴｈ１ｓ−ＨＣＪ　（ ｐＨ７，５）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２及　び　ＩＭＮＩＣ＋からなる緩衝液７ ．５μ！で埋めた。容量を水で７５μ目こ合わせた。反応を室温で１時間行い、 反応後５ｅｐｈｘｄｅｘ　Ｇ−５０のスピンカラムを用いて精製した。その精製 したビオチン化直線状ベクターをＨｉｎｄｌｌｌで切断した。ビオチン化した二 本鎖ＤＮＡを含む反応液を予め洗浄したＰｘｎｄｅｘアビジン粒子（Ｂａｘｔｅ ｒＨｅａｌｔｈｃｘ＋ｅ　Ｃｏｒｐ、社製、米国イリノイ州マンプライン）と混 合した。

一本鎖ベクターの鋳型を得るため、固定された二本鎖ＤＮＡを２０９１の０．１ ５Ｍ　ＮａＯＨで３７℃１０分間インキュベートすることによって未結合鎖を融 解して一本鎖とした。直ちに、１．５ｐＪの酢酸（１，７ｋｌ）及び２．２ｐｌ のＩＯｘ　ＴＥ　（１００ｍＭＴｈｉｓ　（ｐＨ７，５）、ｌ０ｍＭ　ＥＤＴ＾ ）で上清のｐｉ（を調節した。

（ｂ）変異導入のための鋳型を得るために、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅ＋社の推奨 するＰＣＲ反応液２５１１中のＩＯｐｍｏｌのプライマーＡ（丁ＧＣ−ＴＴＣ− ＣＧＧ−ＣＴＣ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＴＧＴ−ＧＴＧ３’　）及びビオチン化プラ イマーＢ（ビオチン−ＡＡＡ−ＧＧＧ−ＧＧＡ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＧＣＡ−ＡＧ Ｇ−ＣＧＡ３’　）を用いて、ＰＵＣＲＡから挿入された断片を２０サイクルＰ ＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅後、ＰａｎｄｅＸアビジン粒子を加え、両側にベクタ ー配列を有する増幅した挿入配列を固定した。

（ｃ）インビトロ変異導入用の鋳型を得るため、上記の固定化したＰＣＲ増幅断 片を、室温で１０分間０．１５Ｍ　ＮａＯＨで処理して一本鎖とした。プライマ ーＱ　（５’　ＣＧＧ−ＣＴＣ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＴＧＴ−ＧＴＧ−ＧＡＡ−Ｔ ＴＧ）及び変異プライマーＭ　（５’　ＣＣ−ＡＡＴ−ＧＣＡ−Ｔ＾Ｔ−ＧＴＧ −ＧＴＣ−ＧＧＣ−ＴＡＣ−ＧＣＴ−ＧＧＡ−ＡＡＴ−＾ＧＣ−ＧＣＡ−ＴＡＴ −ＴＴＣ３’、本来の配列はＣＣＡＡＴ−ＧＣＡづ＾Ｔ−ＧＴＧ−ＧＴＣ−ＧＧ Ｃ−ＴＡＣ−ＣＧＴ−ＧＣＴ−ＧＧＡ−＾＾丁−＾ｃｃ−ｃｃ＾）を各ｈ　ＩＯ ｐｍｏｌ加え、　ｉＱｍＭ　Ｔｈ１ｓ−ＨＣＪ（ｐＨ７，５）、ｌｏｍＭ　Ｍｇ Ｃｌ２、ｌｏＯｊｇ／ｍｌ　８３人及び１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む溶液中でＰ ａｎｄｅｘアビジン粒子に固定化した鋳型にアニールさせた。この混合液を６５ ℃で数分間インキュベートシ、ゆっくりと室温まで冷却した。

（ｄｌ伸長反応はＩ　ｐｉ　ＢＳＡ　（Ｉ　Ｏｈｇ／　ｍＩ　）、６１１ポリメ ラ一ゼ混合液（１００ｍＭ　ＴｒｙＳ−ＨＣｌ　（ｐｆｌ　＆、　ｌｌ）、Ｉ（ ｌｄ　ＤＴＴ、　５０ｍＭＪＣ１２，５ｍＭＡＴＰ）、６ｍｌチェース（ｌ０ｍ Ｍの各ｄＮＴＰ）及び３．５ユニツトの７４　ＤＮＡポリメラーゼの添加によっ て行った。１ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼを挿入鎖を含むビーズへ加えた。

水で全量を３０．目こ合わせた。混合液を室温で２０分間、次いで３７℃で２時 間ローラーミキサー上でインキュベートした。

（ｅ）伸長反応後、ビーズをＴＥで１回洗浄した。新しく合成された鎖を２０１ １１の０．１５Ｍ　ＮａＯＨで３７℃１０分間インキユベートシて融解した。直 ちに１．５μＩの酢酸（］、　７７Ｍと２，２ｐｌの２ｘＴＥで上清のｐＨを調 節した。一本鎖ベクター及び両側にベクター配列をもつ新たに変異の導入された 挿入配列の２つの上溝を混合し、７０℃で１０分間インキュベートし、次いでゆ っくりと室温まで冷却した。２つの鎖をアニーリングした後、ＣａＣ／２ａ度を ０．１１ニ調節し、ＤＮＡでＥ、ｃｏｌｉ　Ｄｔ（５ａを形質転換して、ＩＰＴ ＧとＸ−Ｇａ１を含むＴＢＡＢプレートに徹いた。

２行文献 １．　Ｇ１１ｂｎＩ、］、Ｐ、ｌ’、（１９６８）　Ｒｉｏｅｈｅｍｉａｊ＋１ 第７巻２８０９−２８１３頁 ２、　Ｒｉｃｋｖｏｏｄ、Ｄ、（１９７２）　８ｉｏｃｈｉｍ、ＢｉｏｐｂＨ， Ａｃｔｓ第２６９巻４７−５０頁 ３、Ｂａｎｅｍａｎｎ、　’ｄ、、　Ｗｅｓｌｈａ！＋、Ｐ、及びＨｅ＋＋ｍａ ｎｎ、　Ｒ，Ｇ（１９８２）　Ｎｏｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、第１θ巻？＋６ ３−７１８０頁４、ｌａｎｇｄａｌｅ、］、人、及びＭｘｌｃｏｌｍ、　Ａ、Ｄ 、Ｂ、（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｅ、Ｔｏ！ｎｓ、第１２巻　６９３− ６９４頁５、Ｃｂｕ、Ｂ、Ｃ，Ｆ、、ＷｘｂＩ、　Ｇ、Ｍ、、及びＯｒｇｅｌ、 Ｌ、　Ｅ、（１９８３）Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｃ　Ｒｅｓ、第１１巻６５１３−６ ５２９頁６、Ｇｂｏ＋ｈ、Ｓ、Ｓ、及びＭＯ５ＳＯ，Ｇ、Ｆ、（１９８７）　Ｎ ｕｃｌ、　人ｃｉ＋Ｉ＋Ｒ１＄、第１５巻５３５３−５３７２頁？、Ｍａｎｉ＊ Ｎ＋、　Ｔ、、　Ｆ＋１ｆｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、、及びＳａｍｂｒｏｏｋ、ｌ。

ｆ１９１１２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌｉ＋　Ｃ１ｏｎｉ＋Ｂ；　入　Ｌａｂｏ＋ａｌ ｏＢ　ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ＋ｂｏ＋　Ｌｔｂｏ＋ａｌｏＢ発行８、Ｃｂｕ、 　Ｂ、Ｃ，Ｆ、及び０Ｂｅｌ、　Ｌ、　Ｅ、（１９８５）　ＤＮＡ　第４巻３２ ７−３３１頁 ９、　Ｃｌｅ＋ｉｃｉ、Ｌ、、Ｃａｍｐａｇｎａｒｉ、Ｆ、、ｄｅ　Ｒｏｏｊｉ 、Ｊ、Ｆ、Ｍ、。

及びｒａｎ　Ｂｏｏｔｎ、Ｊ、Ｈ，（１９７９）　Ｎｏｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ。

第６巻２４７−２５８頁 １０、　Ｎｏ７ｅ＋、Ｂ、　Ｅ、及び５ｔａｃｋ、　Ｇ、Ｒ，（１９Ｎ）　Ｃｅ １ｌ第５巻３０１−３１０頁 Ｉｌ、Ｃｈｕ、Ｂ、Ｃ，Ｆ、　及びＯｒｇｔｌ、Ｌ、　Ｅ、［９８５）　Ｐｔｏ ｃ、　Ｎ２口。

＾ｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　第８２巻　９６３−９６７頁国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　１箇所もしくはそれ以上の塩基改変部位を含む一本鎖ＤＮＡを作製するため の核酸のインビトロ変異導入法にして、 （ａ）変異を導入すべき核酸を保有する不溶性担体の調製段階、 （ｂ）所望の１箇所もしくはそれ以上の塩基改変部位を有してはいるが上記１番 目の核酸上の適当な部位とハイブリダイズするに十分な相同性を有するＤＮＡオ リゴヌクレオチドオブライマーを添加し、該プライマーを上記核酸に結合させる 段階、 （ｃ）必要に応じて上記核酸の合成の開始される末端に対応するプライマーとさ らにハイブリダイゼーションさせ、所望の改変部位を有するＤＮＡ鎖を合成する ためにポリメラーゼ又は逆転写酵素及びヌクレオチドを添加し、該ＤＮＡ鎖をプ ライマーと結合させるためのりガーゼを添加する段階、 （ｄ）合成されたＤＮＡ鎖から上記１番目の核酸を除去する段階、及び （ｅ）液体を除去する段階。 を含んでなる方法。 ２　請求項１記載の方法において、変異を導入すべき核酸を、不溶性担体に結合 させた核酸プローブヘのハイブリダイゼーションによって該担体に結合させるこ とを特徴とする方法。 ３　請求項１又は請求項２記載の方法において、前記核酸プローブを該不溶性担 体に共有結合していることを特徴とする方法。 ４　請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法において、前記不溶性担体 が磁性粒子からなることを特徴とする方法。 ５　請求項４記載の方法において、前記磁性粒子が単分散型及び／又は超常磁性 であることを特徴とする方法。 ６　請求項４又は請求項５記載の方法において、前記磁性粒子を段階（ｄ）と段 階（ｅ）の間で磁気的に集合させることを特徴とする方法。 ７　請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法において、段階（ａ）と段 階（ｂ）の間で変異を導入すべき核酸をポリメラーゼチェーンリアクション法に よって増幅することを特徴とする方法。 ８　請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法において、洗浄段階、並び にハイブリダイゼーション及び酵素活性を最適化するための緩衝液の交換を含む ことを特徴とするする方法。 ９　核酸のインビトロ変異導入用キットにして、（ａ）変異を導入すべき核酸を 担持するための改良不溶性担体、 （ｂ）ポリメラーゼ又は逆転写酵素、及び下記（ｃ）〜（ｅ）の一もしくはそれ 以上を含んでなるキット。 （ｃ）ｃＤＮＡ合成開始用のプライマー、（ｂ）デオキシヌクレオチド、及び （ｅ）適当な緩衝液 １０　請求項９記載のキットにおいて、さらに（ｉ）２種類のＰＣＲプライマー にして、その１種類は前記担体に結合可能な親和性結合分子を保有するもの、及 び （ｉｉ）鎖分離用のアルカリ溶液、 を含んでなるキット。