JPH04501057A

JPH04501057A - 核酸増幅方法

Info

Publication number: JPH04501057A
Application number: JP50909789A
Authority: JP
Inventors: メレク，ローレンス・テイー; デイビー，シエリル
Original assignee: アクゾ・エヌ・ヴエー
Priority date: 1989-08-19
Filing date: 1989-08-19
Publication date: 1992-02-27
Also published as: FI911877A0; DK68591D0; DK68591A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

止七剖肛ｎ７分−」一本発明は、特定の核酸配列を増幅する方法に係わる。兄ユの一’ＦｉＪ−５試料中に存在する特定の核酸配列を　相補的な核酸配列を用いる試料のプローブ探査によつで検出するＪとは公知の診翫技術である。核酸は、相補的核酸との結合においてきわめて特異的であり、従って特定の核酸が試料中に存在するかどうかを決定するうえで１用である。検出するべき特定核酸の配列を確認し、次いでこの配列と８撓的である核酸配列を有するプローブを形成する。本出願において、“特定の核酸配列”という語句は増幅しようとする一重鎖または二３１値核酸を意味［２、“試料゛とは核酸を含有する混合物のことであり、 “十分に相補的”どは、プライマーと鋳型との２Ｆｌの核酸が特異的に相互作用し得、そｉ：ｌ。によって所与のイオン強度及び温度条件下「プライマー・依存性で、かつ鋳型に支配された効率的なりＮＡ合成が可能となることを意味′する、核酸プローブがきわめて特異的であるため、場合にＪつでは核酸配列によ−）１：構成されるタンパク質より核酸配列自体？プローブ探査するＪｊが好まし２い。特定的な例として、肝炎１３型°フイルスの感染粒子ａ、）存し２決定する場合は、ＤＮ＾ゲ２１ムを人＜１１−感染性の抗原粒子力（非常に高いジベルで存在するためタンパク質検出のみに基づく診断法（ｊ、信頼できない。別の例では、前癌性：／、・に、良性の頚管Ｎに口、１．）だされ６ｍ々な゛リプタｆブの

【ドパじロー・マウイルスハｌ！ｔｊ　Ｗブロー・グハイブリダイゼーシ９：′ ／を用いる４：とによ−）てのｈｒ（別゛ぐきる８また、ΔＸ　Ｄ　Ｓ　Ｉ′７）　ｆ筬１：　物Ｔ　！；ｘ、ΔｘＤｓ特ｉ的な核酸配列の存在に基づくアッセイが診断法と１．Ｃダ・れていＺ）ことを確認している。既存の核酸プローブ技術の適用に伴う最大の難点、ｒｑｇち既存のグＤ−・”プ技術６）用途が限ｔ＞；ｆする理由はコピ・−数の問題に有、乙６例えば細胞のつｆノも・スでは、特定遺伝子のコピーはＶ遭ｌ、・だ−く）仔ｌｌＥイも、、：フ）一つのコピ　が洪伝子産物、即ち１鉗Ａ；たｌｊタユ・・バ、′７真の多数Ｃつ、ｌビ・−を！、たらし得る。１′二のため、検出ずｂべき核酸の持７配列ｈ（型子ものり゛／バク質；７ビー・をらたらｌ−１得ε、のてン、診断技術は１−ば１゜ばタンパク誠のプローブ炉二）？含むも、ρ−）ν：な−・ノていイ１、天然に多数、即ち給胞１４？ｊ当１．−Ｉす！００，０００コピー・・に速性゛るほと存在するりボソームＲＮへがＧｅｎＰｒｏｂｅ（こよ−）て、レジｊ才・′ン（Ｌｅｇｉｏｎｅｉ　ｌａ）及びマイコアラスマなど成る橿Ｃ）邪菌病原体の存在を核酸プローブと用いて分析するこ゛とを容易ζＪ“するのに用いられでいる７しかし、ごの方策は５．ウィルスのような非細胞性・の柄力ぽ休には用い得ない、コピー数は、核酸プ１コープ法と、末梢血液リンパ球１万個のうちの１個未満において［、かプＬ１ウィルスが組み込まり、ないかもｌ、ｊ′ヨ、ないＡＩＤＳウィルスの検出用に開発す′ζ、際特に問題ｌ：なる。、皿も、試料中に７１在するので（大ないかと＆Ｊ％　；！：Ｉ　１％る特定の核酸配列を増幅で′きｈば一７ビ・−数の問題は［司政でき、ブローン゛アッセイはより適用しやすくなる。細胞と数個し２か含有佑で５従って特定遺伝子の′：Ｉビ・−を数制御７か含Ｊ了ｉ、−い３攬常の生物学的二丁（料ｔ゛゛゛は、：コビーｐ工の問題を・克服４″Ｚ、・＼く増幅ブ■３セス多・用い・グＣり力ばなら・ンい１゜増幅の一２Ｈ法は試着を゛成長さ一已るー、゛と３、即ら試料中Ｌ：、　Ｉ存づｂｌｉ′牝学的１〜質か自己を復製し得るように条１１・を朶漏１゜てや２］こと１゛ある６復製の結果７核酸配列のｉが検出可能１．−□べ刀（、、、、，４，で増加する。例えば食、品工業で（式、加］：ｉ食品を倉中帽［クルーｌ一本う（Ｓａ！ｍＬ、１ｎｅｌ　ｉａ）に１考しで検寮オる７′、：めにＪｊ：、１品試料て行数１ヨ澗インキュベ・−１−シこ核酸（７）黍を増加させなｉｔ′ＦＬばならない。臨床試料゛Ｓも、病原体を４１１当時間にわたって成長させることによりその数を増加させなければならない。Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに１９８７年７月２８日付で付与された米国特許第４，６８３，１９５号、及びＣｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに１９８７年７月２８日付で付与された米国特許第４，６８３，２０２号はいずれも、試料に含まれたターゲット核酸配列を増幅する方法の提供を目的としている。米国特許第４，８８３，１９５号は、ターゲット核酸配列を含むと疑われる試料をオリゴヌクレオチドプライマーで、鋳型としてｔｓ能するプライマー延長生成物が合成されるように処理し、それによってターゲット核酸配列の増幅を実現する方法に係わる。プライマー延長生成物は、好ましい一例において熱変性を用いて鋳型から分離する。同様に、米国特許第４，６８３，２０２号は、互いに分離した２本の相補的鎖（ｅｏｍｐｌｅ＋５ｅｎｔａｒｙ　５ｔｒａｎｄｓ）を有するターゲット核酸配列を増幅する方法に係わる。この方法は、鎖をプライマーで処理して延長生成物を合成すること、プライマー延長生成物を鋳型から分離すること、及びプライマー延長生成物自体を鋳型として用いることを含む。上記２つの米国特許のいずれでも、増幅プロセスにおいてユーザーは手動で、または機械的に関与し、多段操作を行なわなければならない、これらの特許に含まれる操作ステップはユーザーに、試料を加熱し、冷却し、適当酵素の添加を行ない、がっ操作ステップを反復することを要求する。温度変化は酵素にその活性を失わせる。従って、ユーザーは増幅プロ七スの閏、適当酵素のアリコートを加えた増幅混合物を繰り返し補充しなければならない。そのうえ、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号では増幅プロセスの各サイクルを第一の鋳型から第二の鋳型を合成することによって実施し、第二の鋳型は第一の鋳型の合成に用いる。この手続きは反復され、即ち増幅プロセスの各サイクルは一つの基質がら−っの生成物を合成することを基礎とする。先行技術に幾つかの増幅プロセスが開示されてはいるが、増幅プロセスを改良する必要性が存在する。増幅プロセスは、ユーザーによる関与及び操作を必要としなければしないほど好ましいであろう。更に、増幅を、増幅プロセスに必須である酵素の活性に悪影響が及ばないように比較的一定の周囲温度で実施すれば有利であろう、鋳型を、増幅プロセスの各サイクルで一つの基質から複数の生成物を得るのに用いることができればより好都合であろう。１朋１」し」本発明は、従来の増幅方法に比べてユーザーの介入及びユーザーによる操作が少なくてすむ有利な増幅方法に係わる。この増幅は比較的一定した室温で生起する。更に、この方法では各サイクル毎に１つの物質から複数の産物コピーが形成される０本発明の増幅方法は、特定の核酸の量を増加させるのに使用し得るため、コピー数の間圧がない。従って、プローブアッセイをより容易に使用し得る０本発明の増幅方法はまた、通常のクローニング技術の代わりとして、特定核酸配列の純度を増加させるのに使用することもできる。本発明の実施態様の１つでは、−重鎮ＲＮ＾、−重ｇＤＮＡ及び二重ＭＤＮＡの合成を含む特定核酸配列増幅方法を使用する。−重ｇＲＮ＾は第１プライマー用の第１鋳型である。−重鎮ＤＮＡは第２プライマー用の第２鋳型である。二重鎖ＤＮＡは第１鋳型の複数のコピーを合成するための第３鋳型である。第１又は第２プライマーの成る配列は特定核酸配列の成る配列に対して十分に相補的であり、第１又は第２プライマーの成る配列は特定核酸配列の成る配列に対して十分に相同である。第１プライマーの３′末端は相補的鎖上の第２プライマーの３°末端に向けられる（ｏｒｉｅｎｔｅｄ　ｔｏｗａｒｄｓＬ本発明の別の実施Ｒ様では、下記の操作を含む特定核酸配列増幅方法を使用する：（ａ）第１プライマーを第１鋳型にハイブリダイズする。この第１プライマーは第１鋳型のＲＮ＾配列に対して十分に相補的なりＮＡ配列を有する。（ｂ）前記第１プライマーに共有結合しており且つ前記第１Ｍ型のＲＮ＾配列に対して相補的である第１ＤＮＡ配列を合成する。この第１ＤＮＡ配列及び前記第１プライマーは第２鋳型を含む。（Ｃ）第２プライマーのハイブリダイゼーションを行えるように、前記第２鋳型から前記第１鋳型を分離する。（ｄ）前記第２プライマーを前記第２！ｉｉ型にハイブリダイズする。この第２プライマーは前記第２鋳型のＤＮＡ配列に対して十分に相補的なりＮＡ配列を有する。この第２プライマーはまた、プロモーターの配列とｆｔＮ＾ポリメラーゼ用転写開始部位の配列とをも有する。（ｅ）Ｎ２第２１ライマーに共有結合し且つ前記第２鋳型のＤＮＡ配列に対して相補的である第２ＤＮＡ配列の合成と、前記第２鋳型に共有結合し且つ前記第２１ライマーのＤＮＡ配列に対［５て相補的て゛ある第３ＤＮ八配列の合成どを行う、これらの第２及び第３ＤＮＡ配列、第２プライマー並びに第２鋳型は第３鋳型を含む。（ｆ）前記第３鋳型から前記第１１１型のＲＮＡ配列の複数のコピーを合成づ′ る。第１　Ｘ　！！第２プライマーの成る配列は視ｇ核酸配列の鰻、る配列に対しで十分に相補的゛Ｓあり、第１又１虚第２ノ°ライマーの成る配列は特定核酸配列の戊Ｚ）配列に対１−′Ｃ十分（３相同”Ｃある。第１プライマー−の３゛末８逓は相補的＆上の第２アシ、イア−の３°末端に向けらＪしる。本発明の更に別の実施５檄で：太、ＤＮＡの第２プライマーが、第２鋳望のＤＮＡ配列１７対して十分に相補的な配列を３′末端に有する。第２１ライマーは５ °末端に、８グロモー・ターの配列とＲｔ１＾ポリメラーゼ用転写開始部位の配列と２含む。本発明の更に別の実施態様では、第１ｙライマー、第２プライマー、リボヌクレアーゼ＋１．ＲＮΔ支配ＤＮΔポリメラーゼ（ＲＮＡ−ｄｉＩ−ｅｅｔｅｄ　ＤＮＡｐｏｉｙｍｅｒａｓｅ）　、　ＤＮＡ支配ＩＩＮＡボリメラ・−ゼ（ＤＮＡ −ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ＤＮＡ　ｐｏｔｙｉｉｅｒｉｓｅ）、　ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオシド１ヘリホスンコート及びデオキシリボヌクｌ／オシド）− リホスフΣ−ト・を試料と組合わせる操作を含む特定核酸配列増幅方法を使用釘る。第１ＤＮＡプライマーは第】ＲＮＡ儲型（１：対し、て十分に相補的な配列を有する。第２Ｉ）ＮＡプライマーは第２　Ｄ　ＮＡ鋳鋳型一対して十分（、、：相補的な配列ど、プロ般−ターの配列と、転写開始部位の配列、−をイ４Ｌ、４−え１〜らの配列はＲＮＡポリメラーゼにより基質とし、て認毘さｈろ。第１〕ｆライ？゛・−Ｘは筆２゛２゛う・１゛マーの成る配列は特定核酸配列の成る配列に対して・十分にＭｊ補的Ｃあり、第１プライマーＸ　Ｉ：ｊ、第２グ）イマ　の成る配列（」特定核酸の成る配列に夕４して十分に相同である６第１プライマーの３“、未電：は相補的鎖上の第２プライマーの３゛末端を向←づ− られる、本発明の更に別の実施態様では、第１グライマー、第２）′シイマー・、トリ筋芽細層形成、（ｌｌｌｙｏｂｌａｓｆ−ｏｓｉｓ）ウィルスポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ、ｅｏｌｉ）リボヌクレアーゼＨ、バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオシド■・リボスフェート及びデオキシリボヌクレオシドトリボスフＪ−・トを試料に加える操作を含む特定核酸増幅方法を使用１−る。第】Ｄト１＾プライマーは第１ＲＮＡ鋳型に対して十分に相補的な配列を有する。第２ＤＮＡプライマーは第２ＤＮＡ鋳型に対して寸分に相補的な配列と、プロモーターの配列と転写開始部位の配列とを含み、これらの配列はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより基質としてＪｉされる。第１プライマー又は第２プライマーの戊る配列は特定核酸配列の成る配列に対して十分に相補的であり、第１プライマー又は第２プライマーの成る配列は特定核酸配列の成る配列に対して十分に相同である。第１プライマーの３°末端は相補的鎖上の第２プライマーの３゛末端に向けられる。図面の簡単な説明本発明を説明する添付図面のうち、第１図は核酸増幅方法の全体を図式的に示す説明図である。第２図は増幅方法の検査に使用される合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ配列の説明図であって、Ａはｇａｇテスト配列、ＢはＨａｇ２テスト配列牙示している。第３図は種々のプライマー・濃度を用いて行）ノ、：増幅反応のＰＡＧＥＡ析のオートラジオグラムであるゆ第４図は種々の鋳型１度を用いて行−〕た増幅反応のＰＡＧＥＡ析のす・〜トラジオダラムで゛ある。第５図は増幅反応時のドツトプロ・ノ１−ハイブリダイゼ・−ジョンのオートラジオグラムである。第６図は制限フラグメントを鋳型として使用した増幅反応のＰＡＧＥＡ析のオートラジオグラムである、第７図は間接的核酸増幅方法の全体２図式的に示す説明図である。ＬＬ上」と（二５１））コｊじ１１１本発明は特定核酸配列の増幅方法に伜わる。このｉ１１幅はＤＮＡ及びＲＮＡの交互合成を含む、この合成の全体を第１図に図式的に示し７た。、：の方法では、−ｊｉ　ｋＭ　ＲＮＡを一１ｉ饋ＤＮΔに転換し、この−・重鎮ＤＮＡを元の一重須ＲＮ＾の複数のコピ９−を合成するための機能鋳型に転換する。この増幅方法では第１プライマー及び第２プライマーを・使用する。第１プライマー・又は第２ブラ・イマーの成る配列は特定核酸配列の成る配列に対して十分に相補的 °ぐあり、第１又は第２１ライマーの成る配列は特定核酸配列の成る配列に対１．て十分に相同である。場合によっては、ｆＩ！４えば特定核酸配列が二ｆｉ　ｇ　ＩＩＮＡの場合には、第１プライマー及び第２ブーｊイ゛フー・〜の両刀が特定核酸配列の成る配列に対１．て十分に相補的であり且つ十分に相同゛ごある。ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドブライマー（第１ブンイ７・−）をＲＮＡ　（第１鋳望）ｅハイブリグイズＬ、且つＲＮΔ支配Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼを用いて第１プライマー（第３ＤＮＡ配列ンから相補的ＤＮＡ鎖を合成することにより一重ｇＤＮＡに転換する。得られた一重鎖ＤＮＡ（第２鋳型）は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して特異的なりボヌクレアーゼ（例えばリボヌクレアーゼＢ）を用いて、例えば第１鋳型の加水分解により第１鋳型から分離する。第２ｆｉ型は、第２ｆｉＩ型の３°末端に対して十分に相補的な配列を３°末端に含み且つプロモーターの配列と転写開始部位の配列とを５′末端の近傍に含む合成オリゴヌクレオチド（第２１ライマー）をハイブリダイズし、ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼを使用しながら、第２プライマーの３゛末端に共有結合した第２ＤＮＡ配列の合成を第２ｆＩＩ型を鋳型として行い且つ第２鋳型の３°末端に共有結合した第３ＤＮＡ配列の合成を第２１ライマーを鋳型として行うことにより、ＲＮ＾合成が可能な形態に転換する。その結果得られた第２鋳型の機能誘導体は第３鋳型を構成し、第２プライマーによって決定されるプロモーター及び転写開始部位に対して特異的なＲＮＡポリメラーゼを用いて第１鋳型である複数のＲＮＡコピーを合成するのに使用される。新たに合成された各第１鋳型は、このサイクルを繰り返すことによって、更に第２鋳型及び第３鋳型のコピーに転換することができる。また、このサイクルの反復にはユーザーの介入又はユーザーによる操作は必要ない。この増幅方法は、適当な鋳型核酸を適当な反応条件で適当な酵素、プライマー及び補因子に加えることがら始まる。前記鋳型核酸は均−且つ連続的な増幅が可能な形態を有し、第１図に示したサイクルで中間体として機能し得る。この増幅方法では、前駆体（プライマー、リボヌクレオシドトリホスフェート及びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート）の正味の消耗及び産物（ＲＮＡ及びＤＮＡ）の正味の蓄積が起こる。ＲＮ＾合成及びＤＮＡ合成は、核酸が検出できるほど十分に合成されるまで非同期的に進行する。この増幅方法は、例えば標識付き前駆体からの標識付き産物の合成によってモニターし得る。この増幅は、第１図に示したプロセスに加えて、又はこのプロセスの代わりに、別のプロセスを含み得ると考えられる。また、許される範囲の低速度で生起する成る種の産生妨害（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）酵素反応も可能である。これらの非生産的副反応の１つは、添加鋳型核酸の不在下におけるＲＮＡ及び／又はＤＮＡの合成である。このようなＲＮＡ及び／又はＤＮＡ産物は、特定核酸配列の２つのプライミング部位の間にだけ見られる特定配列が存在するか否かを調べることによって、所望の産物から区別することができる。第１プライマーは第１鋳型の３°末端に対して十分に相補的な配列を３°末端に含むオリゴデオキシリボヌクレオチドである。第１プライマーの３゛末端の配列は、所与のイオン強度及び温度条件で第１ＤＮＡ配列の特異的且つ効果的合成を可能にする特定の長さ及び塩基組成を有する。第１プライマーは、第１サイクルでは、第１鋳型の３°末端より内側の領域に対して十分に相補的であり得る。後続サイクルでは、第１プライマーの５°末端が第１鋳型の３゛末端に対して相補的になる。第１１ライマーは一部分又は全体が天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体からなり得る。第１プライマーの５゛末端は、第１サイクルで第１鋳型に対して相補的でない配列を含み得る。これらの非相補的配列は固定し得る核酸に対して、又は有用な非核酸成分例えば検出を容易にするリポータ−と結合し得る核酸に対して相補的であり得る。第２プライマーは第２鋳型の３゛末端に対して十分に相補的な配列を３°末端に含むオリゴデオキシリボヌクレオチドである。第２プライマーは、イオン強度及び温度に関する所与の条件で、第２及び第３ＤＮＡ配列の特異的且つ効果的合成を可能にする特定の長さ及び塩基組成を有する。第２プライマーは更に、機能プロモーターの配列と転写開始部位の配列とを含む、この配列は、第３ＤＮＡを合成するための鋳型として使用する場合には、ＲＮＡポリメラーゼの特異的且つ効果的結合と所望の部位での転写開始とを可能にする十分な情報を含む、プロモーター配列は機能プロモーターのアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ）［から誘導し得る。転写開始部位は天然ＲＮＡ転写体の５°末末端列から誘導し得る。好ましい実施態様では、第２プライマーの５°末末端列が＾＾ＴＴＣＴ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＣＧＣＡＧである。この配列は７７　ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターの配列及び転写開始部位の配列を含む。あるいは、別のファージＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位及びプロモーターを使用してもよい、また、プロモーター機能に関係のない配列は、第２プライマーの５゛末端に含まれるか又は転写開始部位と第２鋳型にハイブリダイズする３゛末端の配列との間に含まれ得る。第２プライマーは一部分又は全体が天然デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体からなり得る。本発明で使用する酵素は総て特定の基準にかなったものでなければならない、各酵素又は酵素調製物は有害なデオキシリボヌクレアーゼ（”ＤＮａｓｅ”）活性、例えば特定のＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼの一重鎖らしくは二重ｉ特異的エキソヌクレアーゼに１．、ば１．（：詰穐・している５゛も［２くは３°エキソヌクレア〜・ゼ活性を′有していてはならないい各酵素又は酵素調製物は５有賽なリボヌクレアーゼ（”ＲＮａｓｔ＝−）活性を有していてはならない。但し例夕）として、ＲＮＡ及びＤＮＡハイブリッドに対して特異的なりボヌクトアーゼ活性（例えばリボヌクレアーゼＨ）の添加は好ましい、まｊ：、各酵素は他の酵素プロセス及び非酵素７０七ス、例えばＲＮＡもしは（ＤＮＡ１型へのオリゴメクレオ千ドプライマーのハイブリダイゼーションで使用される一般的反応条件で妥当な活性を示すようなものでなければならない。本発明で使用するＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターと称する特定ＤＮＡ配列に結合て′さ且つそのプロモーターの近傍の所定の開始部位でｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＲＮＡ合成を特異的に開始させることができる任意の酵素であり得る。前記プロモーター及び開始部位は第２プライマーの一部分となす。このＲＮＡポリメラーゼは更に、鋳型の１１！能コピー１つにつき複数のＲＮＡコピーを妥当な時間内で合成できるものがよい。好ましい実施態様ではバクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを使用する。池のバクテリオフフージＲＮΔポリメラーゼ、例えばファー・ジＴ３、ファージφ１１、サルモネラノアージ３ｐ６又はジュードモナスファ・−ンｇｎ−１を（＋Ｊり］、゛こもＪ。１・）。別の実施態様て゛は、別の反核生物又は真核生物のＤＮＡ１配ＲＮΔボリメシーゼを使用し得るや別のＲＮΔボリノζラーゼき使用Ｖる時は、第２プライマーのブＯ亡−夕一及び開始配列の必要な改変を特定ＲＮＡポリメラーゼ゛の鋳型特性に従って行わなりればならない、本発明で使用するＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴデオキシリボヌクしオチドプラ・イマー及びＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成することができる任意の酵素であ・ンてよい、この酵素は、ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮａｓｅ　Ｈに対する活性を含み得る。好ましい実施態様では、トリ筋芽ａｉｌ！胞形成ウィルスポリメラーゼ（＾ＭＶ逆転写酵素）２使用する。　ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼは別のレトロウィルス例えばＭｉｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルスに由来するものであってもよい、あるいは、他の真核生物のＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。本発明で使用するＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー及びＤＮＡ１型からＤＮＡを合成できる任官の酵素であってよい、この酵素は多くの種層のＤＮＡポリメラーゼに結合している５゛又は３′エキソヌクレアーゼ活性な含んでいてはならない、好ましい実施態様ではＡＭＶ逆転写酵素を使用する。但し、もともと５°又は３゛エキソヌクレアーゼ活性のない他のＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい、この種のＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼとしては、成る種の真核生物ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼγもしくはβ、哺乳動物の組織例えば子ウシ胸服から単離し得るＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。不適当なりＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を改質し、次いで改質ポリメラーゼを適当な宿主細胞中に発現させるか、又はＤＮＡポリメラーゼタンパク質を化学的に修飾することにより、望ましくないエキソヌクレアー・ゼ活性を除去することによって有用なものにし得る。改質ＤＮＡポリメラーゼは、大ｉ菌１１１Ｎ＾ポリメラーゼＩのフレノウフラグメント又はバクテリオファージＴ７　ＤＮＡポリメラーゼから形成し得る。このような別のＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ＤＮ＾支配ＤＮＡボリメラ・−ゼによって与えられる活性を補足するために添加するものと理解されたい、なぜなら、好まし、い実施！！ｔＩａ！では、ＲＮＡ支配［）ＮＡポリメラーゼ活性及び［’ｌＮ＾支配ＤＮＡポリメラーゼ活性が同一酵素によって与えられるからである。本発明で使用し得るＲＮａｓｅ　Ｈは相補的ＤＮＡにアニーリングされるＲＮＡを加水分解できる任意の酵素であってよい、この酵素は、−重鎮もしくは二重鎖ＲＮ＾又は総てのＤＮＡの加水分解を生起させるようなものであってはならない、好ましい実施Ｒ様では大腸菌ＲＮａｓｅＨを使用する。別のＲＮａｓｅ　Ｈ酵素、例えば子ウシ＊腺ＲＮａｓｅＨを使用してもよい、ＲＮａｓｅＨは＾ＭＶ逆転写酵素に固有の活性であるため、好ましい実施態様ではＡＭＶ逆転写酵素のＲＮａｓｅＨによって大腸菌３ＮａｓｅＨを補足する。あるいは、第２鋳型を第１鋳型から分離できる他の任意の酵素を使用してもよい。前記酵素及びプライマーは、ＤＮＡ合成及びＲＮＡ合成の両方に必要なバッファ及び補因子を入れた反応容器内で一緒に混合する。イオン条件及び反応温度は、当業者に公知のように、プライマーとＤＮＡＩ型及びＲＮＡ鋳型との特異的ハイブリグイゼーシ３７に適１．ｆ：ものでなければならない、前：己反応混合物は増幅プロセスを妨害するような物質、特に酵素の活性を著しく低下させ得る物質、プライマーと鋳型のハイブリダイゼーシシンを妨害する物質、又は核酸中間体及び産物を非産生的に劣化させる物質を含んでいてはならない。ここで、使用可能な検出方法を説明する。この説明は、本発明の増幅方法を適用する上で有用と思われるからである。但し、本発明の増幅方法で合成される核酸の検出に使用し得る方法はここで説明するものには限定されず、他の方法も使用し得ると理解されたい。これらの方法の１つでは、標識付き前駆体を前記反応混合物に添加する。増幅は、標識付き産物の量又は質の分析によって測定する。これらの産物は当業者に公知の方法で標識付き前駆体から分離できる。標識付き前駆体は、ＲＮＡ合成を検出するためのりボヌクレオシドトリホスフエート又はＤＮＡ合成を検出するためのデオキシヌクレオシドトリホスフェートもしくはオリゴヌクレオチドプライマーであってよい、ａｍの種類は、放射性同位体又は有用な化学基、例えば抗体に結合し得るビオチン、発色団、蛍光発生体（ｆ　１ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）又はハプテンであり得、あるいはタンパク質もしくは酵素であってもよい、標識付き産物は溶解度、電荷又は大きさに基づいて標識付き前駆体から分離し得る。また、標識付きＤＮＡ又はＲＮＡは、相補的配列を含み且つ固定できる核酸にハイブリダイズし得る。別の方法では、本発明の増幅方法の産物を固定支持体に結合し、相補的配列を含む核酸プローブにハイブリダイズし、且つ溶液状態を維持するハイブリダイズしなかった核酸プローブから分離するようにし得る。産物即ちＤＮＡ又はＲＮＡは、例えば疎水性相互作用、静電相互作用又は共有結合性相互作用のような任意の安定な相互作用によって固定支持体に直接結合し得る。これらの産物はまた、例えばアビジンもしくはストレプトアビジンのような固定したタンパク質に結合できるように、増幅プロセスの間にこれらの産物に組込むことができる特定の化学基、例えばビオチンを含み得る。これらの産物は更に、相補的配列を含み且つ固定できる核酸にハイブリダイズし得る。核酸プローブは、ハイブリダイゼーション条件下で結合し且つハイブリダイズしなかった核酸プローブの除去に使用される条件下で結合が維持されるように、増幅プロセスの産物に対して十分に安定な相互作用を起こす相補的配列を含む、好ましい実施態様では、この相補的配列が第１１ライマーの配列と第２１ライマーの配列との間の特定核酸配列部分に由来する。ことができる二重ｊｉＤＮ＾もしくはＲＮＡ、又はデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドがらなり得るオリゴヌクレオチドであり得る。この核酸プローブはまた、適当な条件で産物ＤＮＡ又はＲＮＡに共有結合し得る化学基を含み得る。この核酸プローブは放射性同位体又は有用な化学基、例えば抗体に結合し得るビオチン、発色団、蛍光発生体又はハプテンで標識し得る。この核酸１０−ブはまた、タンパク質又は酵素、例えばホスファターゼ又はペルオキシダーゼに接合し得る。この核酸プローブは更に、プローブのｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製を可能にする配列を含み得る。この増幅方法の産物は分子クローニング技術で増殖した核酸に通常使用される方法によって分析し得る。あるいは、特定ＤＮＡ配列の合成を制限エンドヌクレアーゼによる合成りＮへの消化によって検出し、次いで電気泳動で分離し、且つ当業者に公知の方法で検出することもできる。別の方法として、増幅したＲＮＡの配列をＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼ、第１プライマー及びジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いるＤＮＡ合成によって決定してもよい（Ｓｔｏｆｌｅｔら、１９８８）　、更に別の方法では、増幅した男３ａ型の配列を、増幅プロセスで使用したＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼ及び３°−デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを用いるＲＮＡ合成によって決定し得る（＾ｘｅｌｒｏｄ及びにｒａｗｅｒ、１９８５）、更に別の方法では、増幅したＲＮＡがｉｎ　ｖｉｔｒｏ９訳し得るポリペプチドをコードし得る。このｉｎ　ｖｉｔｒｏｌｌ訳のポリペプチド産物は抗体を用いて分析し得る。特定核酸配列を含む疑いがあるか又は該配列を含んでいることがわかっている試料は、均−且つ連続的な増幅が可能であり且つ第１図に示したサイクルの任意の中間体であり得る鋳型核酸形態で前記反応混合物に加える。この鋳型核酸は特に、第２プライマーの３゛末端に存在する配列と十分に相同の配列を５゛末端に含むと共に第１プライマーに対して十分に相補的な配列も含む一重ｇＲＮ＾であり得る。この形態の鋳型核酸は本発明の増幅プロセスで第１鋳型として機能する。前記鋳型核酸は、あるいは、第２プライマーの少なくとも３゛末端に対して十分に相補的な配列を３°末端に含むと共に第１プライマーの３°末端に存在する配列に対して十分に相同である配列を含む一重ＭＤＮＡであり得る。この形態の鋳型核酸は本発明の増幅プロセスで第２鋳型として機能する。前記鋳型核酸はまた、一方の鎖が第２プライマーの配列全体を５′末端に含むと共に第１プライマーに対して十分に相補的な配列も含む二重鎖ＤＮＡであり得る。この二！ｇＤＮＡは本発明の増幅プロセスで第３鋳型として機能する。鋳型核酸の製造は増幅プロセスの一部分をなすものではないが、鋳型核酸の形成に使用し得る方法の説明は該増幅方法を実施する上で有用であろう、但し、鋳型核酸の製造に使用し得る方法は以下に説明するものには限定されず、別の方法も使用できると理解されたい。１つの方法では、第１鋳型としてｔａ能し得る鋳型核酸が、当業者に公知の部位特異的加水分解（Ｓｂｉｂａｂａｒａら、１９８７）でより大きいＲＮＡ分子から形成し得る天然ＲＮ＾又はＲＮＡフラグメントであり得る。別の方法では、第２ｆｉＩ型として機能し得る鋳型核酸を、第２プライマーの３ ′末端に対して十分に相補的な配列に接する部位をもつ制限エンドヌクレアーゼでの消化によって二重ＭＤＮＡから形成し得る。得られた二重ｊ［ＤＮＡフラグメントは次いで、化学的変性又は熱変性により一重鎖にし得る。別の方法では、第２鋳型として機能し得る鋳型核酸を、ＤＮＡ合成をブロックできるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした一重ｇＤＮＡ又はＲＮＡから形成し得る。ブロック作用をもつ前記オリゴヌクレオチドは、適当な条件で鋳型に共有結合し得る化学基を含み得る。第１プライマーを用いてブロックされた鋳型からＤＮＡを合成すると、第２ｇＩ盟と同じ３′末端を有する合成りＮＡが形成され得る０元の鋳型がＲＮＡの場合には、得られたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを鋳型核酸として直接使用し得る０元の鋳型がＤＮＡの場合には、得られた第２鋳型のコピーを化学的変性又は熱変性によって元の鋳型から分離し得る。別の方法では、第３鋳型として機能し得る鋳型核酸を、第２プライマーを用いるＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ合成により、−重ｇＤＮＡ又はＲＮＡから形成し得る。得られた合成りＮＡは次いで、化学的変性又は熱変性により元の鋳型から分離し得る。また、ＲＮＡ鋳型を化学的に又は酵素を用いて加水分解することもできる。その結果得られる一重１ｉＤＮ＾は５′末端に共有結合した第２１ライマーの配列を有し、且つ第１プライマーに対して十分に相補的な配列を含む、この−重ｇＤＮＡは、第１プライマーをこの一重１ｉＤＮ＾にハイブリダイズして、該第１１ライマーに共有結合しており且つ該−重ＨＤＮＡに対して相補的であるＤＮ＾ＮＡを合成することにより、転写機能をもつ二重ｇＤＮＡに変換し得る。更に別の方法では、化学的、熱的又は＃素的方法を用いて二重１ＤＮＡ、二重ＵＲＮ＾又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドがら一重１ｉＤＮ＾又はＲＮＡを形成し得る。得られた一重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは次いで、山述のいずれかの方法を渭いて、第１鋳型、第２鋳型又は第３鋳型として機能し得る鋳型核酸を形成するのに使用し得る。また、第１プライマーと核酸の一方の鎖とを用いる方法、並びに第２プライマーと核酸の他方の鎖とを用いる方法を一緒に使用して鋳型核酸を形成することもできる。社ｊしＬ２功」組材料＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ＋ｓ社の３８ＯＡ　ＤＮＮＡ成器を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド合成に使用したカラム、ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ＋５ｉｄｉｔｅｓ）及び試薬はＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓを通して＾ｐｐｌｉ −ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、から入手した。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーに雇次かけて精製した。放射性同位体［ｃｒ−３２ｐ］ＵＴＰ（８００Ｃｉ／ｓｅ＋ｏｆ）は＾ｍｅｒｓｂａｍから入手した。　ＤＮへの消化及び連結反応に必要な酵素はＮｅｗ　Ｅ＋＋４１ｉｏｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手し、製造業者の指示に従って使用した。　ＤＮＡポリメラーゼ１のラージフラグメント（フレノウ）を含む調製物もＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。　ＰｒｏｍｅＨａ　ＢｉｏＬｅｃのＲＮａｓｉｎ及び丁７　ＲＮＡポリメラーゼはＢｉｏ／Ｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ。を通して入手した。逆転写酵素及びＲＮａｓｅ　）ＩはＰｈａｒｍａｃｉａから入手した。プロテイナーゼにはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ（４ｎａｄａのものと使用した。形質転換は総て大腸菌株ＨＢＩＯＩ（＾ＴＣＣ３３６９４）を用いて行った。プラスミドｐＬＩｃ１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、１９８３）はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ、ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ＤＮＡの単離及び配列決定大腸菌形質転換細胞は５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹ丁培地（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）で増殖した。プラスミドＤＮＡはラビッドボイリング法（Ｉ（ｏｌｍｅｓ及びＱｕｉｇｌｅｙ、　１９８１）で精製した。総ての構造に使用したＤＮＡフラグメント及びベクターは、低融点アガロース中での；気泳動によって分離し、フェノール抽出及びエタノール沈澱（Ｍｉｏｉａｔｉｓら、１９８２）によって溶融アガロースから精製した。１ラスミドＤＮＡの配列決定は、ジデオキシ法（Ｓｉｎｇｅｒら、１９７７）の変法（）ｌａＨｏｒｉら、１９８５）によって行った０反応操作は−２０ユニバーサルブライ？− （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行った。ＴＣ＾沈澱増幅反応のアリコート（５ｕｌ）を２０１１１の１（ＩｍＭＥＤＴＡ中でクエンチングし、全時点試料が採取されるまで氷上に留置した。冷却した試料をガラスフィルターディスクに適用し、即座に水冷５％トリクロロ酢酸（“ＴＣ＾”）及び１％ビロリン酸ナトリウム中に落として時々撹拌しながら１０分間放置した。水冷５％ＴＣ＾による５分間の洗浄を２回行い、次いで９５％エタノールによる洗浄を２回行い、Ｎ、結乾固させた。液体シンナレーションカウンターで放射能を測定した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動試料（１〜６−１）を４〜５１１１のホルムアミド染料（９０％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭ　丁ｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ８，０＞、ＩＩＩＭＥＤＴ＾、キシレンシアツール及びブロモフェノールブルー）と混合し、長さＩＺｃｍの７％変性ポリアクリルアミドゲルに適用した。ゲルにはブロモフェノールブルー染料が底に到達するまで３５０ボルトの電圧を印加した。場合によってはオートラジオグラフィーの前にゲルを固定し乾燥させた。この固定は、１０％メタノール及び７％酢酸で１５分間洗浄することによって行った。この方法で分離したＲＮ八へ物のプロフィルを室温でオートラジオグラフィーにより視覚化した。（以下余白）天１ヱＬＬｇｔｔｇテストンステム用のオリゴヌクレオチドの設計及び合成ＥｃｏＲ１部位、Ｔ７フアージプロモーター、Ｔ７　ＲＮ＾ポリメラーゼによる転写開始に必要な配列及び１９　ｂｐハイブリダイゼーション領域（ハイブリダイゼーション領域１）を含むように合成りＮＡ配列（図２＾）を設計した。これらの要素のクローニングに関与する４７ｂオリゴヌクレオチドＭ　（Ｔ７Ｈ１，にＡに）は、プライマーとしてら役立つ。ハイブリダイゼーション領域２は、ハイブリダイゼーション領域１から５３ｂｐｇｉれており、その長さは２０ｂｐである。この領域（Ｉ１２．［；ＡＧ）に対し作成されたプライマーは、一方向（ｓｅｎｓｅ）ｉｉの２０ｂオリゴヌクレオチドの重復物であり、クローニングには使用されない、ハイブリダイゼーション領域をつなぎ及びこれを含む配列は、ＩＩＴＬＶ−ＴＩＩゲノムのｗａｇ部分の９２ｂｐセグメントである。この特定の遺伝子セグメントは、プライマーが効率良くハイブリダイズすると予想されたこと、及び２つのハイブリダイゼーション領域の閏の距離が比較的短かかったので選択した。さらに、Ｘｂａ１部位をクローニングを容易にするために配列の末端に設置した。ｇａｇテスト配列は、組換え体のスクリーニングを促進し得るｓｐｈ　Ｉ及びＰｓｔＩも含む。全部で４つのオリゴヌクレオチドを、このフラグメントのクローニングに使用した。　ｇａｇテスト及びｇａｇ２テスト配列の両方の１成で使用したＮｌ　、ＧＡＧは、逆方向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖を完結し且つクローニングプロセスでのみ使用される。同様に、Ｔ７４．ＰＲＯはＴ７プロモーターの一方向鎖成分である。しかしながらＮｏ、（：ＡＣは、両方のテストフラグメントの構成で使用され、増殖サイクルの２段階で中間体（第２の鋳型）としても使用された。全クローン化ｇｉｇテストフラグメントも、増殖サイクルの中間体（第３の鋳型）を代表し得る。好適なベクターに一部クローン化されると、　ｇａｇテストＤＮ＾はＴ７　ＲＮ＾ポリメラーゼにより転写され得、段階の３つに包含される増殖中間体として有用なＲＮ＾フラグメン１−　（第１の鋳型）を生産する。さらに、Ｔ７Ｈ１，ＧＡＧ及びＦＩ２．ＣＡｆ：も、コノテストンステムでプライマーとして役立つ。ｇａｇ２テスト合成りＮＡフラグメント（ＩＩＷ２Ｂ）は、Ｔ７プロモーターを含まないが、配列の歿余はｇａｔｇテスト配列と同一であり、従ってＮ１．ＣＡＣ及びＮ２．［：ＡＣ；の両方は、その構成に包含された。逆方内研を完結するのに必要なオリゴヌクレオチドｌ、：、　１１１．１；ＡＬ：と呼称される７一度クローン化されると、ｇａｇ２テストフラグメ〉トは、篤型核酸ン一してＤＮＡ制訳フラグノ（ントを使用して増殖を・試験するため（′、、ｌ彷型どして使用され得る。え２−贋ユ、。ｇａｇテストアラスミドの構築オリゴヌクしオチドＴ７４．ＰＲＯ及びＮ１．ＧＡＩｌ：（各２ｕｇ）Ｑ　７０鯵ＭＴｒｉｓＨＣ１（ｐＨ’７．６）、１４ｇＣＩ２１０Ｊ、ＤＴＴ　ｈ＋Ｍ、ＡＴＰ　０．５１１．Ｍ及びＴ４ボリヌクレオチドキ十−１擾イ５単位を古む２０　ｐ　ｎ　Ｏ反応器て′房々に３７℃で３０分間リシ酸化した。リン酸化Ｔ７４．ＰＲＯとＮｌ。にＡに　（各１０￥１１７）を、未リン酸化Ｔ７）１ｕ、ＧＡＩ：及び８２．巳ｃの各１１ＪＩｌｌ、並びに３ｐ（の１００＋ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｆｆ（ｐＨ７，８）−５００ｍＭ　ＮａＣρと混合し、、ｇａｇテストアセンブリ用に最終容積を２９１１１７にした。ＨａＨ２デスト混合物は、リン酸化ＮＸ、ｔｌ：ＡＣ１０１Ｉ＆、未リン酸化１１１．ＧＡＧ及びＮ　２　、　［：　Ａ　［；を各１ｕｙ並び！、：　、　１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｆｆ（ｐＨ７，８）−５００ｍＭＮａＣ１１，８ｕｊ！ｅ含み、最終容積を１８１ＪＮとした。オリゴヌクレオチド混合物を、別々に９０℃で１０分間数置Ｉ７てハイブリダ・イズし、次いで１０〜１６時閲かけて室温まで徐冷した。５０ｄ　丁ｒｉｓＨＩＪ！　（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ、２０ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｍＭ　ＡＴＰ及び５０ｕｙ／ｚＩＢＳ八を含む反応混合物６０ν！を、ハイブリダイズし、たオリゴヌク１／オチドを一緒に連結するのに使用し、た。Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼ４００単位を３ａＨテスト反応物にご＼加し、これを１５ ″Ｃ゛で２時間培養した。また、ｇｎＢ２テスト反応物は１４へ１ｕ時間Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼ２００１位と培！シタ。分離して精製Ｉ−た合成りＮ＾七グメ〉川−を、ボッリンカ・−＜ｐｏｌｙｌ　１ｉｋｅｒ）領域内の制ｐ酵素部位て・消化することによって直鎖化１．７だプラスミドｐｔｌｃ１９と混合Ｉまた０丁４　［］Ｎ＾リガーゼを使用してｇａｇテスト配列を、ｔｌｃｉ９のＥｅａＲＩ−Ｘｂａ＋１フラグメンｌ＝　（、；二連結１７、ＨａＢ２テスト配列をＳｉ＊ａＩ−Ｘｂａｌフラグメント１、、こ連結した８、−れらの反応を大腸菌の形質転換に使用１−だ接に得られプｓ形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを制限分析（ｌ：″よりスクリー・ニジグし、Ω終プラス、ミド＜ｐＧＡＧ、ＴＥＳＴ及びｐ（−八Ｇ２．ＴＥＳＴ）が配列分析により正しいものであることが確認された。Ｋ菰−匠−とＲＮΔ増殖に於けるプライマー濃度の効果μｇテストスリゴヌクレオチドから転写されたＲＮＡを増殖するのに使用された反応混合物（２５μｆ）は、５０ＩＩＭＴｒｉｓＨＣｊ’（ｐＨ８，４５）、６ｍＭＭｇＣｊｚ　、　４０−ＭＫＣｌ、　１０ＩａＨジチオスレイトール　０．５ｍ１４　ＮＴＰ（ＡＴＰ、　ＣＴＰ、　ＧＴＰ、　ＵＴＰ）、１１１Ｍ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ）、ＲＮａｓｉｎ　２０単位、　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ１０単位、逆転写酵素１０単位、ＲＮａｓｅ　Ｈ０，４単位、及び［α−５２ｐ］ＵＴＰ　１０ｕＣｉを含んティた−　反応物ノウチ２　ツｌｉ、Ｎ２．にＡ（：　０．５ｕｇ＜０．０１５ｐｍｏｌｅｓ＞を含んでいたが、他の２つの反応物は全く鋳型を含んでいなかった。プライマー７７１１１．（：ＡＣ及び＋！２．１１；Ａｌ：を各々、Ｎ２．ＣＡＧを含むかまたは全く鋳型を含まない反応物に、終濃度３．４μＨまたは０．３４μＨで添加した０反応物を４２℃で２時間培養した。ＲＮＡの全合成量を３０分毎にＴＣ＾に不溶物への放射活性典曇の取り込みを測定することによりモニターした。プライマー濃度の鋳型依存性ＲＮＡ合成に於ける効果を、表１に示す１合成したＲＮＡを等１含む各反応のアリコートを、ＰＡ（：Ｅ及びオートラシ゛オグラフイー分析法（図３、レーン１〜４、反応と同一番号と付与−）によって分析した。艮ＬＡＯ，，３４”−７反応器では最も同位体罰り込み量が多かったが、鋳型な含まない対照、即ち反応２でもそのｌは高く（反応１の７３ｚ）、酷似した；気泳動プロフィールを示した。従ってプライマー濃度が高いと、増殖で予想されたものと同一サイズのＲＮ Δ転写体が、鋳型が全く無くても製造されることが知見された。プライマー濃度会十分の−に減らしたサンプルを使用した結果は、これど１的に異なった。ｖ：、、応３で製造されたＲＮＡ量は反応４７ｇ！遺されたものの２．６倍であったが、殆ど総ての転写が反応３で予想されｆ：：サイズの単一バンドに検出されたのに対し、反応４では６０〜７０ｂよりも大きいフラグメントは検出されなかった。従ってプライマー濃度は、正確で且一つ効率的なＲＮＡ増殖に非常に重要な役割を担っている。増殖システムによって生み出されると予想されたフラグメントサイズを表すのに使用された対照のＲＮ八へ写物（図３のレーン０）を、テストプラスミド由来の転写によって調製した。　ｐｃＡｃ、ＴＥｓＴを、χｂｉｌで消化して直鎖化し、プロテアーゼにで処理しくＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２）、７ｘノ・＝ル抽出し次いでエタノール沈澱した９次いて′、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを供給者の推奨法に従って使用して、［α−５２ｐ］ＵＴＰ　１０ｕＣｉｔ含む反応混合物２５ｕｆ中で得られたフラグメントｏ、ｓｕｇを転写した。Ｋ１１上ＲＮＡ増殖に於ける鋳型濃度の効果標準の反応混合物５０１ＪＮを使用して、０，３ｈＭ　Ｔ７１（１，にＡに、０．３ｈＭ　Ｎ２．ＧＡＧ、　５〇−阿　丁ｒｉｓＢｃｆ（ｐＨ８，４５）、　ａｄ　ＨｇＣｌ２、４０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＮ　Ｄ丁Ｔ、０．５ｍＭ　ＮＴＰ、　１ｍＭ　ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｉｎ　４０単位、丁７　ＲＮ＾ポリメラーゼ２０単位、逆転写酵素２０単位、ＲＮａｓｅ　［１０、ｓ即位、及び［α−３２ρ］Ｕ丁ｐ　ｉｏ〜２０μＣｒを含んだｇ＆ｇテストオリゴヌクレオチドから転写したＲＮＡを増殖させた０反応物は、ｌｒ＋４〜１ｒｇの量の鋳型（Ｎ２．ＧＡＣ）を含んでいた。一つの反応物は鋳型を全く含んでいなかった６反応物を、４２℃ で３時間培養し、この間３０分毎に丁ＣΔに不溶の放射活性組み込み量を測定することによってモニターした８表２に示したように、ＲＮＡ全合成量は、試験した総ての鋳型濃度について、全く鋳型を含まない対照よりも多かった。しかし、ＲＮＡ全合成量は一般に、鋳型濃度が減少するにつれて減少するが、この合成に於ける減少は定量的ではなかった。従って、開始鋳型１個当たりのＲＮＡの増殖度は、一般に鋳型濃度が減少するにつれて増加する。８ｘｌＯ”倍の増殖が、Ｎ２．Ｃ：ＡＣ鋳型Ｉｆ、からＲＮＡｏ、ｓｕｇが合成されたことによって達成されり、　１０２−ｂＮ２．ＧＡｃオ！Ｊ　コヌクレオ＋　Ｆ　ノｌｒｇ！ｉ、はぼ２×１０４個の分子を表す。民Ｚ〜　日　′のＮＺ、ＣＡＣ）　のＲＮＡ　１区区　級皿　含叉は８訊　１１鐙ひ１　１ｎＨ３，５３，５ｘｌＯコ２　１１００ｐ　４．４　４．４Ｘ１０’３　１０ｐｇ４．１　４．１ｘｌＯ” ４　１ｐｇ　３．０　３．０ｙ１０’ ５　１００ｆ、　２．７　２．７Ｘ１０テ８　１０ｆｇ１．９　１．９×１０” ７　１ｆｇ　０．７８　７．８×１０”８　−　０．０４６　− 反応３時間後に合成されたＲＮＡを、各鋳型濃度毎にＰＡにＥで分析した（図４．レーン１〜８、反応と同一番号を付与）。約１００　ｂのＲＮＡを表す大きなバンドが、鋳型をＨｇを含む反応及び全く鋳型を含まない反応を除いて総ての反応で検出された。鋳型１ｆｇを含む反応は、３時間ではこの１００５の生成物が多くないが、鋳型を全く含まない反応よりも全体のＲＮ＾合成量は多く、且つ定性的に異なっていた。え１匠ｉＲＮＡ生成物のハイブリダイゼーション分析Ｎ２．Ｉｌ：ＡＧｉｌｉ型をＩＩ）ｇ〜０．１ｆｇの量で含む増重反応を、放射性標識したＵＴＰを省略した以外には、実施例４の教示に従って実施した０反応物を４２℃で３時間培養した。３０分毎に各反応物からアリコートを取り出し、ナイロンＭ（＾ｍｅｒｓｈａｍ）に付けた。これらの反応物のアリコートに含まれていた核酸を、紫外光に＆露することによって固定した。ＷＡを５０℃で１時間、１００ｃ＋ｙ”当たり溶液５ｒｓｌに等しい容Ｉの最終濃度５０ｖ／ｖ＄（７）ホルムアミド、５ｘＳＳＣ及び５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液（Ｍａｎｉａｔｉｓら、、１９８２；５ｏｕｔｈｅｒｎら、、１９７５）からなるプレハイブリダイゼーションハ＠液中でプレハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション溶液の１０’ｃｐｍ／ＩＩｌの比活性で放射性標識したプローブでハイブリダイズした。５０Ｓホルムアミド、５ＸＳＳＣ及び５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液＜Ｍａｎｉａｔｉｓら、、１９８２゜５ｏｕｔｈｅｒｎら、　、　１９７５）中で２５０℃１６時間ハイブリダイゼーション分案施した。放射性標識したプローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び［α−３２１］＾ＴＰを使用して５′末端で標ニした、合成オリゴヌクレオチド５’Ｇ＾丁ＣＴにＧＧＡＴＡＧＡＧＴＡＣＡＴＣＣ八３°であった。膜を、２ｘＳＳへ１０．１ｖ／ｄ　ＳＤＳ次いで０．２ＸＳＳＣ２０，１ｖ／ｓ４５ＤＳ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、、１９７５　；　Ｍａｎｉｉｔｉｓら、、１９８２　。５ｚｏｓｔａｋら、、１９７９）からなる一連の洗浄液で２．３分間づつ、５０ ℃で洗浄した。図５は１種々の培養時開にサンプリングした、種々の量“のＮ２．ＧＡに鋳型を含む増殖反応で実施したハイブリダイゼーション分析結果を示す。図５の各欄は、種々の時間（１，３０分、２．６０分、３．９０分；４゜１２０分、５．１５０分；ｓ、　１８０分）を表し、各列は添加しりＮＺ、ＧＡに鋳型の種々ノ量（１，ｌｐｇ：２．１１００ｆ：３．１０４ｇ；４．　Ｉｆｇ；５．０．１ｆｇ、６．鋳型無し）を表す、標皿化したプローブに対してハイブリダイズした核酸の増殖は、１〜３列に示される（Ｉｐｇ〜１０ｆｇ）が、特定の核酸に対するハイブリダイゼーション（列４〜５（ｌｆｇ、０．１ｆｇ））は列６（鋳型無し）よりも高くなかった。時間が経つにつれてハイブリダイゼーションシグナルも増加することから、列６で標識されたプローブの外見上の非特異的結合は、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成に関係するものであろう。１！ｌ二　〇型と１−でのＤＮＡ制限フラグメントの使用。７　ラスミＦ　ｐ（：ＡＣ３，ＴＥＳＴをＭｓｐ　Ｉ　及ヒフ　０　ティカーセ ′にテ消化し１、フェノール抽出及びエタノール沈殿により精製ｌ７．５分間煮沸により変性させた。　ＮＺ、ＧＡＣオリゴゾクレオチトの代わりにＭｓｐｌで消化ｉ、、、　ｙ’；　ｐ　（：八Ｇ２　、　ＴＥＳＴを鋳型とじ１使用１７た以外は実施例１１の教示にしたか−）で増幅反応を笑施し、分析した。各反応に加ｊ、たプラスミドの量は５５０８〜５．．５ｐｇ、及び鋳型な１．としメ、：。実際のサンダル中に存在し、でいる付加的なりＮＡにシミーｚ　ｉ−−１−する六二めに、同様に＋め消化、精製及び変性させておいたウシ胸腺ＤＮＡ１ｎｇを反ｆ：物に１つおきに加えた３４２℃て゛３時間インキュベー・ジョン後、ＴＣΔ沈殿及びＰＡＧＥ分析によりＲＮ＾合成率を決定した。表３に示すように、合計ＲＮ＾合成早は試馴した全鋳型濃度とも鋳型を含まない対照より高かった。グラスミドＤＮＡ全体の１，８％である実際の鋳型からのＲＮ＾合成率に基づいて増幅率を計算した、特定の初期レベルの組型濃度から得られる合計ＲＮ＾合成率（増ｔｉＩ率）は合成オリゴヌクレオチド鋳型の増幅率（表２）に比較して制限フラグメント（表３）のほうが−貫して低かった。これは使用条件下での制限フラグメント鋳型の相補的値との競合によるものど思わバーる。ｐ　Ｃ二Ｍｓｐ　Ｉ　ｒ、ｒｌｊｆ化しｆ；　ｐＧＡＧ２　、　ＴＥＳＴカＡ）　Ｉ）　ＲＮＡｊｆＪ　ｇｌに一又Ｊ、　ｉ’ＪＪ大　１犬馬−廣１本庫　笠１皇０３　１ｉ５．ｏｎｓｌ：１ｒ＋Ｂｙ］　３，６５　３．７ｘ　１０’＜４．ＩＪ５）　＜４．ｌＸ１０’）３　５．５ｎＨｌ：ｉｏｏｐｇ］　３．５４　３．５ｘ　１０’４　（３，，１６）　（３，２ｘ　１０’）ｓ　５ｉ５０．Ｏｐｇ［１０ｐｇ′Ｊ　２．２９　２．３Ｘ　３．０’６　（２，’７９）　（２，ｌ’ｌｘ　’ｉｏ’＞５５．０ｐｇ［１ｐｇ：ｌ　２．１３２　２．６ｘ　１０’８　＜０．（ｉ７）　＜０．７ｘ　１０”　ンｇ　５．５ｐｕ目００ｆｇｌ　ｉ、、３７　１．４ｘ　ｉＯ’ ｊＯ（２゜２．６）　（２，３ｘ　１０’）＊大括弧内の数字はＮＺ、ＧＡＧの当凰を示す６■括弧内の数字はＭａｐ　ｉで消化したウシ３１！ＤＮＡ１ｕ９の存在下でのＲＮＮＡ成率を示す。３時間の反応時間後に合成されたＲＮＡ、をＰ＾ＣＥ（図６、レーン１〜６．１１及び１２、ｌ／−ン番号は反応物番号に同じ）により分析した。約１００ｂのＲＮＡを表す主要バンドは反Ｅ；物（レーン）１〜６に存在しており、鋳型なしの反応物（レーン１１及び１２）には現れなかっな、レーン０のＲＮＡは実Ｍｉ例３の教示にしたがって調製した標準である。Ｍｓｐｌで消化したウシ胸ＪＩＩＤＮ＾１１１ｇを加えた場合くレーン２．４及び６）も加えない場合くレーン１．３及び５）も合成されるＲＮＡに明白な定性的な相違はなかった。ｍユニ　間接増幅１丘ｌｙ１遣（＆）細菌株及びプラスミドカナダ赤十字社の総裁であるＤｒ、Ｐ、Ｇ１１ｌから寄贈されたＳａｃＩ−Ｂｇｌｌ［サブクローンから、各々Ｈｍ（８１１１０株）からの１４２２塩基対のＸｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲｌ制限フラグメントを含むｐにＥＭ、４−８１ｇプラスミド及びＭ１３−Ｍｐ１８−［ｉａｇプラスミドを構築しな。この制限フラグメントは！（ＴＶＩ　Ｆｌａｇ遺伝子（Ｒれｎｅｒ、　Ｌ、）の大部分を含む、大腸菌株ＨＢＩＯＩはｐ［；ＥＭ４−ｇａｇプラスミドで形質転換し、大腸菌株ＴＣＩはＭ１３−０ｇプラスミドで形質転換した。Ｍａｎｉａｔｉｓ他（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　１．、　Ｆｒ１ｔｓｅｈ、　Ｅ、Ｆ、ｌびＳｉｍｂｒｏｏｋ。Ｊ、）に記載の方法によりプラスミドＤＮＡを調製した。（ｂ）　８８八鋳呈の合成ｇａｇ−ＲＮＡ鋳型を得るために、ｐＧＥＭ、ＨａｇプラスミドをＸｂａ　Ｉで直鎖化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた。精製したＤＮＡをＭｅｌｔｏｏ（Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｄ、＾、他）の方法にしたがってＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して転写した。　ＲＮａｓｅを含まない１）Ｎａｓｅ　Ｉ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）５単位を加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。　ＲＮＡ産物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた。ＲＮＮＡ率をスペクトロフォトメトリーにより決定した６（ｅ）オリゴヌクレオチドの合成及び末端標識プローブの調製＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ｍｓ　Ｎｏｄｅｌ　３８０−＾ＤＮ＾ＤＮＡ置でオリゴヌクレオチドを合成した。　ＤＮＡオリゴ７−をポリアクリルブ゛ミドゲル電気泳動及びＤＥ　５′２カラムクロマトグラフイーにより精製した。　４０ｕｇ／＾２６０単位の換算俤数を使用してスベク１−ロフオドメトリーにより合成収率を決定した。第１のプライマーは２０１体とし、第２のプライマーは４５塩基長（Ｔ７プロモーター・配列を下線で示す）、プローブは５３量体とした。これらの配列を以下に示す５第１のプライマー：５゛　＾ＣＡ　ＴＣ八へにＣＣＡＴ　ＧＣ＾八Δ３゛第２のプライマー：５°ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＡＣに　ＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＡ　ＡＣＧ　ｌｌ：ＡにＴＡＧ　ＴＴＣＣＴ（：　ＣＴＡ　ＴにＴ　ＣＡＣ３’プローブ：５’　ＴＧＴ　ＴＡＡ　ＡＡＧ　ＡにＡ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＡＧＣＡＡに　ＣＴ［；ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＧＣＧＡＴＡ　にＡ（：　ＴＡＣＡＴＣＣＡ　３゜５３塩基オリゴヌクレオチドプローブは増幅産物配列に相補的であり、Ｘ−” Ｐ　ＡＴＰ（＾ｍｅｒｓｈａｍ）の存在下にポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）により標識した。１監亙ＩＲＮＡターゲットは、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，３，８ｍＭ　ＭｇＣＬ、４０＋ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１１１Ｍデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．５ａ＋Ｍリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、＾ＭＶ逆転写酵素（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）４０単位、ＲＮａｓｅＨ（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）０．４単位、録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）０．５単位ｈｌを含有する媒質中で間接増幅反応を誘導した。各プライマーの濃度は０．３５．Ｍ、最終反応体積は２５９１であった。標準反応は４２℃で３時間行い、５ｄの最終濃度までＥＤＴ＾を加えることにより終了した。幅誘導した。二重鎖ＤＮＡを緩衝液、ヌクレオチド及びプライマーと混合し、９５℃に３分間加熱し、その後、氷上に置いた。０．５単位／νｌの最終濃度まで７７−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｌｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａ１社製５ｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標））を加え、１５分間３７℃でインキュベートした。混合物を９５℃に３分間加熱し、次に冷却し、その後、ＤＴＴ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ［Ｉ、　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡ−Ｇｕａｒｄ（登録商標）を加え、４２℃で３時間反応を行った。のバイブ１　イゼーション各反応のサンプル５ｕ１をＭｉｎｉｉｔｉｓ他（Ｍａｎｉｉｔｉｓｊ、。Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、及び５ａａｂｒｏｏｋ、　Ｊ、）に推奨されている方法によりグリオキシル化し、２００ハの６ｘＳＳＣと混合し、スロット−プロット装置（Ｂｉｏ４ａｄ（登録面１１））を使用してナイロン膜（八ｍｅｒｓｈａｍ）に結合した。フィルターを０．１Ｎ　Ｎａ０Ｂで８分間処理することにより核酸を膜に固定した。フィルターを５０％ホルムアミド、３ｘｓｓｃ及びｓｘ　Ｄｅｎｈｉｒｄｔ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　。Ｄ、Ｔ、）中で４２℃で２時間３２ｐ末端標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。ハイブリダイズしたフィルターを１０分間室温でｚｘｓｓｃ及び０，５％ＳＤＳで洗浄した後、１時間５０℃で０．１％５ＳＣ１０，５％ＳＤＳで洗浄した。　Ｋｏｃｌａｋχ＾Ｒ−５フイルムを使用してオートラジオグラフィーを実施した。Ｎ　ｃｒ＞」シ工公−折増幅反応物をＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ　Ｉ　２単位テ３０分間３７℃で処理した後、フェノール−クロロポルム抽出及びエタノール沈殿させた。精製したＲＮＡをコリ末端標識プライマーにハイブリダイズし、ジデオキシヌクレオチド（Ｌｉｎｅ。Ｄ、Ｊ、、　Ｐａｃｅ、　Ｂ、、　０ｌｓｅｎ、　Ｇ、Ｊ、、　５ｔａｈｌ、　Ｄ、＾、、　Ｓｏｇｉｎ、　Ｈ，Ｌ。及びＰａｃｅ、　Ｎ、Ｒ，）の存在下に逆転写酵素を使用して配列決定した。縫ユ間接増幅プロセスを図７に示す、天然ＲＮＡターゲット（ＪＮ＾、　ｎＲＮＡ、　ｔＲＮ＾等）を使用して、間接増幅反応が、５′末端にＴ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む第２のプライマーのアニーリングと共に進行する（１９．２０）　ｅ反応混合物中に存在する逆転写酵素は第２のプライマーの３゛末端から相補的ＤＮＡｆｆを生成する。ＲＮ＾／ＤＮ＾複合体のＲＮＡ１Ｆ　（天然ＲＮＡターゲット）は混合物中に存在するＲＮａｓｅＨにより分解される。第１のプライマーは形成されるｅＤＮＡの一重頒にアニールし、第２の二重鎖合成が生じ、プロモーター配列が二重鎖になる。この機能的プロモーターから、混合物中に存在するＴ７−ＲＮＡポリメラーゼは、元のターゲットに対して逆方向のＲＮＡの多重コピーを生成し、これらのコピーは間接増幅反応の環状相でｃＤＮＤＮＡの新しい鋳型として機能する。この環状相は非環状相と逆の順序のプライマーアニーリングにより特徴付けられ、即ち第１のプライマーがまずアニールして逆転写酵素及びＲＮｉｓｅ）Ｉの反応を開始し、その後、第２のプライマーが二重鎖ＤＮＡ合成を開始し、再び機能的に活性なＴ゛プロモーター形成する。図７は更に、ＤＮＡ中間体が間接増幅プロセスのどこで現れるか、したがってＤＮＡターゲットそれ自体が面接増幅反応を介してどのように指数的増幅を受けるかを示す、二重鎖ターゲットＤＮＡを制＠酵素で切断し、変性させ、規定された末端を有する分子を生成し、その後、第２のプライマーでアニールしてｃＤＮＤＮＡを開始し、こうして間接増幅プロセスの環状部分を誘導することが可能なＲＮＡを生成する機能的に活性なＴ７プロモーターを形成する。非制限二重原ＤＮ＾をターゲットとして使用する場合、図７に示すように、機能的に活性なＴ７プロモーターを生成するためには第１のプライマー及び第２のプライマーの両方が必要である、しかしながら、同一の間接増幅プロセスはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれがターゲットであるかに拘わらず増幅産物を生成する。この間接増幅システムの実用性を立証するためｉ、：、ＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型の両方を試験１７た。　ｐＧ）：Ｍ−＠ａ＠グラスミドを二重、ｉｉ　ＤＮＡ１ｌｉ型のソースとＬ７て使用ｔ、　ｌ′、？、　ＲＮＡ鋳型を得るために、挿入されるＤＨへの末端を切断するＸｂａ　ｌを使用してｐＧＥＭ−ｓａｇプラスミドをＷ鋲止した。直値化したグラスミドをＳＦ３　ＲＮ八へリメラービにより転写し。Ｘ４２２塩基長のＲＮＡ産物を得ノご、　ＤＮＡ又はＲＮ＾クーグツトからの増幅産物が１４０塩基長となイ）ようにプライマー部位を選択した。凛準反応条件（材料及び方法の項参照）下に種々の産の１１ＮＡ鋳型に１）いて増幅動力学を決定した０表４は間接増幅反応がＲＮＡ又はＯＮ＾タープ・シ弓・からの産物を指数的に生成す′ｎ！　分子数　質量　分子数！、Ｏｎｇ　１．２ｘｌＯ’　４．２１Ｊｇ　５．０ｘｌＯ”　４．２ｘｉＯ’ １、Ｏｐ８　１．２ｘｌＯ’　２．７５ｐｇ　３．３ｘｌＯ”　２．７５Ｘ１０ ’１．０ｆ８１．２ｙ１０’　０．８ＩＩｇ　９．６×１０’　２８．ＯへｌＯ ”拡１墜ツＩ゛　眺１１　（呈Ｊ質量　分子数　質量　分子数ｔ、ＱｎＨｉ、２ｘｌｏ’　４．’Ｏμｇ　４．７ｘｌＯ”　４０ｘｌＯ’１、、ｏｐＨ１，２ｘｌＯ’　２．Ｊ＋＠　３．ｉ、ｘｌＯ”　２．６ｘｌＯ’ｉ、Ｏｆｇ　ｉ、２ｘｌｏ’　０．７２Ｂ　８．６ｘｌＯ＋２７．２ｘｌＯ”＋ＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型は１４２２塩基長である９ム増幅産物は１４０塩基長である。１箇接増幅反応の特異性も試験した。４準条件下で異種ＲＮΔ又はＤＮＡ１μ２の存立下又は不在下で間接増幅反応で１ｎ４又はｌａｇのＩ’ｔＮ＾又はＤＮＡをターゲットどした。アガ［１−スゲルミ気泳動後、臭化エチジウム染色により反応産物を試験した。これらのｉ応Ｃはいずれも約１４０塩基長の童−の増幅産物１７か得られず、こｈ−＆玖、２択したプライマー配列が８ｍｇ遺伝子の適正なセグメントに特異的であったことを示す、　ＩＩＬ６０細胞から単殖した異種完全ＲＮＡの存在は間接増幅反応の特異性に何ら影響しなかった。　１４０＠八産物をデンシトメーターで走査した処、鋳型を１０００分のＨ１ｐｇ→Ｌｆ、）に減らしても産物収率は５０％にしか減少ないことが判明した。　ＨＬ６０　ＲＮＡの存在下では収率は約５分のｊに減少した。ウシ胸腺ＤＮ＾１■の存在下で増幅しなｇｉｇ−ＲＮＡを用いて同様の実験を行った処、εａｇ−ＲＮΔ単独に比較して産物の減少は２分の】未満であった。反応産物をハイブリダイゼーションにより分析した処、同様の定量結果が得られた。　ＢＬ６０　ＲＮＡにより産物が５分の１に減っても、Ｕｆｌサンプルはハイブリダイゼーションにより容易に検出可能であった。ＤＮＡ及びＲＮＡターゲットの両方について間接増幅反応の３度を決定した。ＲＮａｓｅを含まない大腸＠ｔＲＮΔ２０目／ｚｌを含有する滅菌水で各ターゲットのストック溶液を逐次希釈した。これらの希釈液のアリコートを３時間４２℃で凛準間接増幅条件下においた。３２Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ナイロン膜に結合した増幅産物を検出した。１０程度の低い初期分子数で出発してＤＮＡ及びＲＮＡのいずれも検出可能であった。凛準間接増幅反応からのＲＮＡ産物のヌクレオチド配列を試験した。　ＤＮＡ又はＲＮＡターゲット１１１ｇを３時間４２℃で間接増幅条件下におき、ジデオキシヌクレオチドの存在下に′２ｐ＠識ＰＺプライマーからの延長により産物を配列決定した。配列決定又応産物？８％アクリルアミドゲル中で分離した。得られた配列を分析した処、適正な長さく１４０塩基）の産物であるのみならず、得られた配列もｇａｌ？遺伝子の適正なセグメンｌ〜と同一であることが判明した。この間接増幅プロセスは１０１倍を越える異種核酸の存在下で少数の核酸分子を３時開に１０・を越える分子数に間接的に増幅する。この間接核酸増幅プロセスの特徴を以下に示す。まず第１に間接増幅反応全体は均質であり、即ち反応をいったん開始したら添加を行わない。第２に、間接増幅反応は単一の温度で行われる。第３に、間接増幅反応の主産物は元のターゲットに相補的なＲＮＡである。この −ｊ！鎖産物はそれ以上操作することなく容易に検出される。第４に、反応産物の大部分はＲＮＡであるが、間接増幅反応の闇にプロセスに不可欠な二重ｇＤＮＡ分子が形成される。反応から直接クローニングを行うために十分なりＮ八が生成される。第５に、間接増幅反応のベクトル相では第２のプライマーを使用してｅＤＮ＾合成を開始し、間接増幅反応の環状相では第１のプライマーを使用してｃＤＮ＾ＤＮＡ開始する（図７参照）。第６に、簡単な間接増幅フォーマットは、転写において機能性のＤＮＡが蓄積するように、ＲＮＡの酵素による合成及び分解を同時に行うことにより達成される。間接増幅プロセスの全体的な増幅を数学的に表すことは困難であるが、恐らく３次の多項式展開を要すると思われる。本明細書中に報告した間接増幅反応は標準の３時開実施したが、この時開を診断目的で（３０分程度に）短縮してもよい０反応時間は存在するターゲット核酸の推定量、使用される検出システム、及びバックグラウンド比に有効な信号を与える検出可能な産物の量に依存する。以上、本発明の好適実施Ｂｍを詳細に説明したが１発明の趣旨及び特許請求の範囲内で種々の変形が可能であることは当業者に理解されよう。（以下余白）下記の文転１；鵬細書＋＝１；引用でれたしのであろ２Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、（１９７５）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８＝５０：ｌ。９、Ｈａｒｂａｒｔｈ、Ｐ、ａｎｄ　Ｖｏｓｂｅｒｇ、Ｈ，Ｐ、（１９８Ｂ）ＤＮＡ　７，２９７−３０６１４、　Ｒａｔｎｅｒ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　刀ユ、２７７−２８４１６−　、、　ｅｔ　ａ　、（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　２２．７０３５−７０５６１９、Ｒｏｓａ、Ｍ、Ｄ、（１９７９）Ｃｅｌｌ　Ｍｌ、８１５−８２５２Ｌ　Ａｂｂｏｔｔ　、Ａ、ｔ　ａ　、（１９８Ｂ）、　Ｊ、工ｎｆ、　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　、１ｊＪｌ　１１５８２２、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｈ，ａｎｄ　工、Ｈｅｍｉｎｇｓｅｎ　（１９７０）ＰＮＡ５６５１６Ｂ日Ｇ、１゜く　ω ＦＩＧ、３゜ＦＩＧ。４゜ＦＩＧ、６゜Ｆｉｇ、７国際調査報告１−Ｎ−鵠１＾−−”−１１ａ、　ＰＣＴ／ＥＰ　８９１００９８１国際調査” 告　ＰＣＴ／ＥＰ　８９１００９８１〜１帽−１ｂｅ　ｐｄ−１−一−ｒＮ−呵電一函−−−鹸−−−０１−静“■−トーーｅｍｍ１−１→岬緒）０−一一−ｍ　ｔ＊ｍ−＝　１ｍ　Ｆ劇−一１’ｍｍ　１Ｍ％ｅｅ　ｒｎｒ　１％ｌ　Ｍ　２８／　０２／　９０）Ｆ＃！絆Ｐ−潮０勧胃霞紳−１神−１ｗｔｈａｗ　ｐ−一 −ｗｋｔｈ−−ｔＨ−階−呻ｉ−一−

Claims

【特許請求の範囲】

１．特定の核酸配列を増幅する方法であって、第１プライマー用の第１鋳型を構成する一重鎖ＲＮＡ、第２プライマー用の第２鋳型を構成する一重鎖ＤＮＡ、並びに第１鋳型の複数のコピーを合成するための第３鋳型を構成する二重鎖ＤＮＡの合成を含み、但し第１又は第２プライマーの或る配列は当該特定核酸配列の或る配列に対して十分に相補的であり、第１又は第２プライマーの或る配列は当該特定核酸配列の或る配列に対して十分に相同であり、第１プライマーの３′末端は相補的鎖上の第２プライマーの３′末端に向けられる、特定核酸配列増幅方法。
２．第１プライマーを第１鋳型に選択的にハイブリダイズして、第１プライマーに共有結合しており且つ第１鋳型に対して相補的であるＤＮＡの合成を促進し；プロモーター用の配列とＲＮＡポリメラーゼの転写開始部位用の配列とを含む第２プライマーを第２鋳型に選択的にハイブリダイズして、第２プライマーに共有結合しており且つ第２鋳型に対して相補的であるＤＮＡを合成する請求項１に記載の方法。
３．（ａ）第１鋳型のＲＮＡ配列に対して十分に相補的な配列を有する第１ＤＮＡプライマーを第１鋳型にハイブリダイズし、（ｂ）前記第１プライマーに共有結合しており且つ前記第１鋳型のＲＮＡ配列に対して相補的である第１ＤＮＡ配列を合成し、但しこの第１ＤＮＡ配列及び前記第１プライマーは第２鋳型を含み、（ｃ）第２プライマーのハイブリダイゼーションを行えるように、前記第２鋳型から前記第１鋳型を分離し、（ｄ）前記第２鋳型のＤＮＡ配列に対して十分に相補的なＤＮＡ配列を有し且つプロモーターの配列とＲＮＡポリメラーゼ用転写開始部位の配列とを有する前記ＤＮＡ第２プライマーを前記第２鋳型にハイブリダイズし、（ｅ）前記第２プライマーに共有結合しており且つ前記第２鋳型のＤＮＡ配列に対して相補的である第２ＤＮＡ配列の合成と、前記第２鋳型に共有結合しており且つ前記第２プライマーのＤＮＡ配列に対して相補的である第３ＤＮＡ配列の合成とを行い、但し第２及び第３ＤＮＡ配列、第２プライマー並びに第２鋳型は第３鋳型を含み、（ｆ）前記第３鋳型から前記第１鋳型のＲＮＡ配列のコピーを複数合成する操作を含み、但し第１又は第２プライマーの或る配列は当該特定核酸配列の或る配列に対して十分に相補的であり、第１又は第２プライマーの或る配列は当該特定核酸配列の或る配列に対して十分に相同であり、第１プライマーの３′末端は相補的鎖上の第２プライマーの３′末端に向けられる特定核酸増幅方法。
４．第２プライマーが、第２鋳型のＤＮＡ配列に対して十分に棺桶的な配列を３ ′末端に有すると共に、プロモーターのＤＮＡ配列とＲＮＡポリメラーゼ用転写開始部位の配列とを５′末端に含む請求項３に記載の方法。
５．第２鋳型に共有結合した第３ＤＮＡ配列が第２プライマーの５′末端のＤＮＡ配列に対して相補的である請求項４に記載の方法。
６．第１ＤＮＡ配列をＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼによって合成する請求項３に記載の方法。
７．ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して特異的なリボヌクレアーゼによって第１鋳型を第２鋳型から分離する請求項３に記載の方法。
８．リボヌクレアーゼが大腸菌リボヌクレアーゼＨである請求項７に記載の方法。
９．リボヌクレアーゼが仔ウシ胸腺リボヌクレアーゼＨである請求項７に記載の方法。
１０．ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼによって第２及び第３ＤＮＡ配列を合成する請求項３に記載の方法。
１１．ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼによって第３鋳型から第１鋳型を合成する請求項３に記載の方法。
１２．第１プライマーがプロモーターの配列と転写開始部位の配列とを含む請求項３に記載の方法。
１３．第１プライマーが、支持手段にハイプリダイズする配列を含む請求項３に記載の方法。
１４．第２プライマーが３′末端から５′末端の間に、十分に相補的な配列と、転写開始部位の配列と、プロモーターの配列とを含む請求項３記載の方法。
１５．転写開始部位の配列及びプロモーターの配列がバクデリオファージＲＮＡポリメラーゼを結合する請求項１４に記載の方法。
１６．転写開始部位の配列及びプロモーターの配列がＴ７ＲＮＡポリメラーゼを結合する請求項１４に記載方法。
１７．転写開始部位の配列及びプロモーターの配列が【配列があります】である請求項１４に記載の方法。
１８．ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである請求項１１に記載の方法。
１９．ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである請求項１１に記載の方法。
２０．ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼがファージＴ３ポリメラーゼである請求項１１に記載の方法。
２１．ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼがファージΦＩＩポリメラーゼである請求項１１に記載の方法。
２２．ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼがサルモネラファージｓｐ６ポリメラーゼである請求項１１に記載の方法。
２３．ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼがシュードモナスファージｇｈ−１ポリメラーゼである請求項１１に記載の方法。
２４．ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼがレトロウイルスポリメラーゼである請求項６に記載の方法。
２５．レトロウイルスポリメラーゼがトリ筋芽細胞形成ウイルスポリメラーゼである請求項２４に記載の方法。
２６．レトロウイルスポリメラーゼがＭａｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスポリメラーゼである請求項２４に記載の方法。
２７．ポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性又はエンドヌクレアーゼ活性をもたない請求項６、１０又は１１のいずれか一項に記載の方法。
２８．ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼがトリ筋芽細胞形成ウイルスポリメラーゼである請求項１０に記載の方法。
２９．第１プライマー、第２プライマー、リポヌクレアーゼＨ、ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リポヌクレオシドトリホスフェート及びデオキシリポヌクレオシドトリホスフェートを試料と組合わせる操作を含み、但しＤＮＡ第１プライマーはＲＮＡ第１鋳型に対して十分に相補的な配列を符し；ＤＮＡ第２プライマーはＤＮＡ第２鋳型に対して十分に相補的な配列と、プロモーターの配列と、転写開始部位の配列とを有し、これらの配列はＲＮＡポリメラーゼにより基質として認識され；第１プライマー又は第２プライマーの或る配列は当該特定核酸配列の或る配列に対して十分に相補的であり、第１プライマー又は第２プライマーの或る配列は当該特定核酸配列の或る配列に対して十分に相同であり、第１プライマーの３′末端は相補的鎖上の第２プライマーの３′末端に向けられる特定核酸配列増幅方法。
３０．第１プライマー、第２プライマー、トリ筋芽細胞形成ウイルスポリメラーゼ、大腸菌リボヌクレアーゼＨ、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオシドトリホスフェート及びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを試料と組合わせる操作を含み、但し第１プライマーはＲＮＡ第１鋳型に対して十分に相補的な配列を有し；第２プライマーはＤＮＡ第２鋳型に対して十分に相補的な配列とプロモーターの配列と転写開始部位の配列とを含み、これらの配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより基質として認識され；第１プライマー又は第２プライマーの或る配列は当該特定核酸配列の或る配列に対して十分に相補的であり、第１プライマー又は第２プライマーの或る配列は当該特定核酸配列の成る配列に対して十分に相同であり、第１プライマーの３′末端は相補的鎖上の第２プライマーの３′末端に向けられる特定核酸配列増幅方法。
３１．特定の核酸配列を含む疑いのある第１試料の増幅量と該核酸配列を含まない第２試料の増幅量との比較によってその特定核酸配列の存在を検出する操作も含む請求項１又は３に記載の方法。
３２．特定の核酸配列を含む疑いのある第１試料の増幅量と該核酸配列を含まない第２試料の増幅量との比較によってその特定核酸配列の存在を検出する操作も含む請求項２９又は３０に記載の方法。
３３．特定の核酸配列にハイブリダイズするプローブ又は特定の核酸配列の産物を用いてその特定核酸配列の存在を検出する操作も含む請求項１又は３に記載の方法。
３４．制限エンドヌクレアーゼ及び電気泳動分離を用いて特定核酸配列の存在を検出する操作も含む請求項１又は３に記載の方法。
３５．制限エンドヌクレアーゼ及び電気泳動分離を用いて特定核酸配列の存在を検出する操作も含む請求項３１又は３２に記載の方法。
３６．特定の核酸配列にハイブリダイズするプローブ又は特定の核酸配列の産物を用いてその特定核酸配列の存在を検出する操作も含む請求項３１又は３２に記載の方法。
３７．請求項１に記載の方法で増幅した特定核酸配列。
３８．請求項３に記載の方法で増幅した特定核酸配列。
３９．請求項２９に記載の方法で増幅した特定核酸配列。
４０．請求項３０に記載の方法で増幅した特定核酸配列。
４１．特定の核酸配列を増幅するためのキットであって、（ａ）第１鋳型のＲＮＡ配列に対して十分に相補的なＤＮＡ配列を有する第１プライマーと、（ｂ）第２鋳型のＤＮＡ配列に対して相補的なＤＮＡ配列を有する第２プライマーと、（ｃ）リボヌクレアーゼＨと、（ｄ）ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼと、（ｅ）ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼと、（ｆ）ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼと、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェートと、（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを含み、但し、第１プライマー又は第２プライマーの或る配列は特定核酸配列の成る配列に対して十分に相補的であり、第１プライマー又は第２プライマーの或る配列は特定核酸配列の或る配列に対して十分に相同であり、第１プライマーの３′末端は相補的鎖上の第２プライマーの３′末端に向けられるキット。
４２．特定の核酸配列を増幅するためのキットであって、（ａ）第１鋳型のＲＮＡ配列に対して十分に相補的なＤＮＡ配列を有する第１プライマーと、（ｂ）第２鋳型のＤＮＡ配列に対して相補的なＤＮＡ配列を有する第２プライマーと、（ｃ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼと、（ｄ）大腸菌リボヌクレアーゼＨと、（ｅ）トリ筋芽細胞形成ウイルスポリメラーゼと、（ｆ）リボヌクレオシドトリホスフェートと、（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを含み、但し、第１プライマー又は第２プライマーの或る配列は特定核酸配列の成る配列に対して十分に相補的であり、第１プライマー又は第２プライマーの或る配列は特定核酸配列の或る配列に対して十分に相同であり、第１プライマーの３′末端は相補的鎖上の第２プライマーの３′末端に向けられるキット。
４３．試薬の逐次添加又は温度リサイクルを行わずに核酸配列を増幅させる方法であって、（Ａ）少なくとも一方が機能プロモーターの配列である配列を含むプライマーである第１オリゴヌクレオチドプライマー及び第２オリゴヌクレオチドプライマーと、ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼと、一重鎖もしくは二重鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡを攻撃せずにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＤＮＡを解放させるリボヌクレアーゼと、リボヌクレオシドトリホスフェートとデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを含む単ーの反応媒質を調製し、（Ｂ）前記反応媒質に下記の分子、即ち（ｉ）ＲＮＡ分子、（ｉｉ）（ａ）前記第１オリゴヌクレオチドプライマーの３′末端の領域にハイブリダイズする３′末端配列か、（ｂ）機能プロモーターの配列である５′末端配列か、又は（ｃ）前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの３′末端の領域にハイプリダイズする３′末端配列を含む一重鎖ＤＮＡ分子、（ｉｉｉ）（ｉ）Ｂ（ｉｉ）に記載の少なくとも１つの一重鎖ＤＮＡか、又は（ｉｉ）増幅可能領域並びに該領域に隣接し且つ該領域の転写を制御するように配向された機能ブロモ−ターを含む二重鎖ＤＮＡ分子のうち１つ以上を加え、（Ｃ）比較的一定した温度で、下記の第１事象グループ及び第２事象グループのうち少なくとも一方を含む事象サイクルが前記反応媒質中で開始されるような条件を確立し、但し第１事象グループは、（ｉ）前記第１オリゴヌクレオチドプライマーがＲＮＡ分子の３′末端の領域にハイブリダイズし、前記ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼの作用で、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーに共有結合し且前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対して相補的である第１ＤＮＡセグメントを含むＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成され、（ｉｉ）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに作用して前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部を消化し、前記第１ＤＮＡセグメントを前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから解放し、前記第１ＤＮＡセグメントが前記第２オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズしてデュプレックスを形成し、このデュプレックスが前記ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼの作用を受けて、（ａ）前記第２オリゴヌクレオチドプライマーに共有待合しており且つ前記第１ＤＮＡセグメントの少なくとも一部分に対して相補的である第２ＤＮＡセグメントと、（ｂ）前記第１ＤＮＡセグメントに共有結合しており且つ前記第２プライマーの少なくとも一部分に対して相補的である第３ＤＮＡセグメントとを産生し、且つ（ｉｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼが（Ｃ）（ｉ）のＲＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子を複数産生する事象を含み、第２事象グループは、（ｉ′）前記第２オリゴヌクレオチドプライマーがＲＮＡ分子の３′末端の領域にハイブリダイズし、前記ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼの作用で、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーに共有結合しており且つ前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対して相補的である第２ＤＮＡセグメントを含むＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成され、（ｉｉ′）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに作用して前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部を消化し、前記第２ＤＮＡセグメントを前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから解放し、前記第２ＤＮＡセグメントが前記第１オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズしてデュプレックスを形成し、このデユプレックスが前記ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼの作用を受けて、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーに共有結合しており且つ前記第２ＤＮＡセグメントの少なくとも一部分に対して相補的である第１ＤＮＡセグメントを産生し、且つ（ｉｉｉ′）前記ＲＮＡポリメラーゼが（Ｃ）（ｉ′）のＲＮＡ分子に対して相補的な分子に対応するＲＮＡ分子を複数産生する事象を含み、次いで、（Ｄ）前記条件を、（Ｃ）（ｉｉｉ）又は（Ｃ）（ｉｉｉ′）の前記ＲＮＡ分子、前記第１ＤＮＡセグメント、前記第２ＤＮＡセグメント及び前記二重鎖ＤＮＡのうち少なくとも１つが所定濃度で検出できるようになるまで維持するステップを含む方法。
４４．ステップ（Ｂ）が（Ｃ）（ｉ）のＲＮＡ分子に対してアンチセンスのＲＮＡ分子を加える操作を含む請求項４３に記載の方法。
４５．ステップ（Ｂ）が（Ｃ）（ｉ′）ＲＮＡ分子に対してアンチセンスのＲＮＡ分子を加える操作を含む請求項４３に記載の方法。
４６．ステップ（Ｂ）が前記反応媒質にＲＮＡ分子を加える操作を含む請求項４３に記載の方法。
４７．ステップ（Ｂ）が前記反応媒質に一重鎖ＤＮＡ分子を加える操作を含む請求項４３に記載の方法。
４８．ステップ（Ｂ）が前記反応媒質に二重鎖ＤＮＡ分子を加える操作を含む請求項４３に記載の方法。
４９．ステップ（Ｃ）が前記第１事象グループを含む請求項４３に記載の方法。
５０．ステップ（Ｃ）が前記第２事象グループを含む請求項４３に記載の方法。
５１．ステップ（Ｄ）が（Ｃ）（ｉｉｉ）のＲＮＡ分子の濃度をモニターする操作を含む請求項４３に記載の方法。
５２．ステップ（Ｄ）が（Ｃ）（ｉｉｉ′）のＲＮＡ分子の濃度をモニターする操作を含む請求項４３に記載の方法。
５３．ステップ（Ｄ）が第１ＤＮＡセグメントの濃度をモニターする操作を含む請求項４３に記載の方法。
５４．ステップ（Ｄ）が第２ＤＮＡセグメントの濃度をモニターする操作を含む請求項４３に記載の方法。
５５．ステップ（Ｄ）が二重鎖ＤＮＡの濃度をモニターする操作を含む請求項４３に記載の方法。
５６．ステップ（Ｄ）が前記条件を３０分〜４時間維持する操作を含む請求項４３に記載の方法。
５７．転写が開始されるように、ＲＮＡポリメラーゼが転写開始部位の配列と機能プロモーターの配列とを認識する請求項４３に記載の方法。
５８．ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼα又はＳである請求項４３に記載の方法。
５９．ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼが仔ウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼである請求項４３に記載の方法。
６０．ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性をもたないＤＮＡポリメラーゼである請求項４３に記載の方法。
６１．請求項４３に記載の方法で増幅した核酸配列を含むＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子。
６２．増幅した核酸配列をクローニングベクターに連結し、次いでこの核酸配列をクローニングするか又はこの核酸配列でコードされた産物を発現システム中に発現させる操作も含む請求項４３に記載の方法。
６３．核酸分子を増幅させるためのキットであって、（ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマーの溶液が入っている容器と、（ｂ）第２オリゴヌクレオチドプライマーの溶液が入っている容器と、（ｃ）一重鎖又は二重鎖のＲＮＡ又はＤＭを攻撃せずにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼの溶液が入っている容器と、（ｄ）ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼの溶液が入っている容器と、（ｅ）ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼの溶液が入っている容器と、（ｆ）ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼの溶液が入っている容器と、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェートの溶液が入って、いる容器と、（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの溶液が入っている容器とのアセンブリを含むキット。
６４．比較的一定の温度で核酸配列を増幅させる方法であって、（Ａ）第１オリゴヌクレオチドプライマーと、機能ブロモーターの一重鎖配列である配列を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと、ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ支配ＲＮＡポリメラーゼと、リボヌクレオシドトリホスフェート及びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを攻撃せずにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＤＮＡを解放するリボヌクレアーゼとを含む単一の反応媒質を調製し、（Ｂ）前記反応媒質に下記の分子、即ち（ｉ）ＲＮＡ分子か、（ｉｉ）ａ）前記第１オリゴヌクレオチドプライマーの３′末端の領域にハイブリダイズする３′末端配列、ｂ）機能プロモーターの一重鎖配列である５′末端配列、もしくはｃ）前記第２オリゴヌクレオチドアライマーの３′末端の領域にハイブリダイズする３′末端灰列を含む一重鎖ＤＮＡ分子か、又は（ｉｉに）増幅可能領域並びに、該領域に隣接し且つ該領域の転写を制御するように配向された機能プロモーターを含む二重鎖ＤＮＡ分子を加え、（Ｃ）前記反応媒質中で複数の事象が開始されるような条件を確立し、これらの事象が少なくとも、（ｉ）前記第１オリゴヌクレオチドプライマーがＲＮＡ分子の３′末端の領域にハイブリダイズし、前記ＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼの作用で、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーに共有結合しており且つ前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対して相補的である第１ＤＨＡセグメントを含むＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成されるステップ、（ｉｉ）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに作用して前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部を消化し、前記第１ＤＮＡセグメントを前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから解放し、前記第１ＤＮＡセグメントがその３′末端で前記第２オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズしてデユプレックスを形成し、このデュプレックスが前記ＤＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼの作用を受けて、（ａ）前記第２オリゴヌクレオチドプライマーに共有結合しており且つ前記第１ＤＮＡセグメントの少なくとも一部分に対して相補的である第２ＤＮＡセグメントと、（ｂ）前記第１ＤＮＡセグメントに共有結合しており且つ前記第２プライマーの少なくとも一部分に対して相補的である第３ＤＮＡセグメントとを産生するステップ、並びに（ｉｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼが（Ｃ）（ｉ）のＲＮＡ分子に対して相同のＲＮＡ分子を複数産生するステップを含む方法。