JP2006271324A

JP2006271324A - 核酸検出法

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Publication number: JP2006271324A
Application number: JP2005099179A
Authority: JP
Inventors: Maiko Tanabe; 麻衣子田邉; Chihiro Uematsu; 千宗植松
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: US8895246B2; JP4658660B2; US20060223085A1

Abstract

【課題】迅速かつ高感度に検出可能な新規恒温増幅法を提供すること。
【解決手段】鋳型配列に依存せずに増幅配列を設計することを特長とする遺伝子増幅法及び遺伝子検出法。
【効果】本発明によれば、短時間かつ高感度に増幅、検出することが可能な増幅産物を設計することが可能であるため、従来法よりも容易に遺伝子量の判定し得る。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子解析において有用な核酸(DNAもしくはRNA)の検出方法に関する。より詳しくは、ウイルス、原核細胞生物、真核細胞生物等の特定遺伝子の検出方法に関する。

生命現象の研究において、DNAやRNAの増幅は様々な目的に用いられている。例えば、ある遺伝子の発現解析及び発現量を定量する方法として、コンペティティブPCR法(非特許文献1参照)やリアルタイムPCR法(非特許文献2参照)などが知られている。これらはいずれも一般的な核酸増幅法であるPCR(Polymerase chain reaction)法(非特許文献3参照)を応用して、増幅された遺伝子から発現量を判定する方法である。

上記解析に用いる核酸増幅法は、二本鎖鋳型DNAの一本鎖への変性、一本鎖鋳型DNAへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖の伸長の3つ、もしくは変性、伸長の2つの工程からなっていて、高温度から低温度へのサイクルを繰り返す工程が不可欠となる。

この工程を行うために、PCR法は正確な温度制御を行うことが可能なサーマルサイクラーを使用して行う必要がある。また、装置及び反応液を設定温度にするために要する時間はサイクル数に応じて増大していくため、解析に時間がかかってしまう。

そこで、上記問題点を解決するために恒温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法 (非特許文献4参照)、SDA(strand displacement amplification)法(非特許文献5参照)、3SR(self-sustained sequence replication)法 (非特許文献6参照)、TMA(transcription-mediated amplification)法 (特許文献1参照)、Qβ replicase amplification法 (特許文献2参照)、などが主な方法として知られている。これらの恒温核酸増幅法は一定温度で保温された反応混合物中で、プライマーの伸長や、一本鎖伸長産物へのプライマーのアニーリングが行われる。

これらの恒温核酸増幅法のうち最終的にRNAが増幅されるTMA法、Qβ replicase amplification法、3SR法やNASBA法は、試料中の標的核酸配列をRNAポリメラーゼや逆転写酵素を介して増幅する方法であるが、反応中に変性を促す高温工程がないために、鋳型が高次構造をとりプライマーの鋳型へのアニーリングがうまくいかない場合がある。そのためにPCR法では増幅可能なプライマー配列を用いても、必ずしも増幅産物を得ることはできない。検出配列も同様の理由により増幅産物を検出することが難しい。このため、設計したい領域にプライマー及びプローブ配列を設計しても、増幅や検出の効率がよいものが得られない場合があり、恒温増幅法に用いることの出来るプライマー及びプローブの設計は煩雑であった。このように従来の恒温増幅法は、効率よく増幅産物を得て、高感度に検出できるプライマー及びプローブ設計は困難であるなど種々問題をかかえており、これらが解決できる核酸の恒温核酸増幅方法が求められている。

日本国特許第3241717号日本国特許第2710159号 A. Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9717-9721(1989 S. H. Aliyu, et al., Journal of Antimicrobial, 54, 968 (2004) R. K. Saiki, et al., Science, 239, 487-491 (1988) J. Compton, et.al., Nature, 350, 91-92 (1991) G. T. Walker, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 392-396 (1992) J. C. Guatelli, et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1874-1878 (1990)

本発明の主な目的は、従来の恒温増幅法の問題点を解決し、簡単な操作により迅速かつ高感度に遺伝子の発現、もしくはその定量を可能にする方法を提供することにある。

発明者らは標的遺伝子に鋳型非特異的な配列を導入し、前記配列の恒温増幅と検出を利用した、迅速且つ高感度な核酸検出法を発明した。

すなわち本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記標的核酸上の配列F1に相補的な第1の塩基配列、RNAポリメラーゼのプロモータ配列に相補的な第2の塩基配列、及び任意の第3の塩基配列を3’側からこの順で含む第1のプライマーを用いて、前記標的核酸を鋳型とした逆転写反応を行う第1の工程と、鋳型である前記標的核酸を酵素消化する第2の工程と、前記標的核酸上の配列F1よりも5’側に存在する配列F2と同一の第4の塩基配列を含む第2のプライマーを用いて、前記逆転写産物を鋳型とした伸長反応を行う第3の工程と、前記伸長産物のRNAポリメラーゼによる転写反応を行う第4の工程を含み、前記転写産物中の標的核酸に非特異的な配列を検出することを特徴とする核酸検出方法を提供する。

第2の実施態様において、前記第1のプライマーは、その5’末端にRNAポリメラーゼのプロモータ配列と同一の第5の塩基配列をさらに含み、前記第4の工程で得られる、前記第4の塩基配列に相補的な配列と前記第1の塩基配列と前記第2の塩基配列と前記第3の塩基配列を含む転写産物を鋳型として、前記第2のプライマーを用いて逆転写反応を行う第5の工程と、鋳型である前記伸長産物を酵素消化する第6の工程と、前記第1のプライマーを用いて、前記逆転写産物を鋳型とした伸長反応を行う第7の工程と、前記伸長産物のRNAポリメラーゼによる転写反応を行う第8の工程をさらに含む。

また第3の実施態様において、前記第1のプライマーは、その5’末端に任意の第6の塩基配列をさらに含み、前記第3の工程の伸長産物に対し、RNAポリメラーゼによる転写反応とともに、前記第6の塩基配列と同一の配列を含む第3のプライマーからの鎖置換DNAポリメラーゼを用いた伸長反応を行う第4の工程と、前記第3のプライマーからの伸長産物を鋳型として、前記第2のプライマーを用いて2本鎖核酸を合成する第5の工程と、前記2本鎖核酸に対し、RNAポリメラーゼによる転写反応とともに、前記第3のプライマーと鎖置換型DNAポリメラーゼを用いた核酸合成反応を行う第6の工程をさらに含む。

本発明の方法において、前記転写産物中の標的核酸に非特異的な配列は、前記第3の塩基配列に相補的な配列を含むものである。特に、第3の態様では、前記転写産物中の標的核酸に非特異的な配列は、前記第3の塩基配列と前記第5の塩基配列に各々相補的な配列を含む。

したがって、本発明では、前記転写産物中の前記第3の塩基配列に相補的な配列を検出することにより、標的遺伝子の検出を行うことができる。例えば、前記第3の塩基配列を含み、かつその末端に各々発光体と消光体とが結合されたプローブを、前記転写産物にハイブリダイズさせ、発光体から生じる光を検出することにより、標的遺伝子の検出を行うことができる。

より迅速な検出のためには、前記転写産物が20塩基以上61塩基以下になるようにプライマー設計がなされることが望ましい。

本発明の核酸検出方法は、PCRに必要な温度サイクルを必要としないため、簡便な装置により迅速かつ高感度な核酸検出を行うことができる。

本発明によれば、増幅産物の配列を短く設計できるため、RNA増幅にかかる時間が短縮され、通常の恒温核酸増幅法より短時間で大量の増幅することが可能となる。また増幅産物は鋳型配列に依存せずに検出効率のよい配列を設計することができるため、プローブ設計の煩雑さがなく、かつ高感度に検出することが可能となる。

本発明では、恒温増幅用プライマーとしてRNAポリメラーゼのプロモータ配列に相補的な配列を用い、その5'側にタグ配列をつけることにより、当該プライマーを用いて標的核酸を逆転写し、二本鎖DNAに変換した際に初めてプロモータ配列が生成され、タグ配列に相補的な配列が転写産物として得られる。つまり、本発明の方法では、標的核酸の配列とは無関係なタグ配列を当該標的核酸の代わりに増幅し、増幅産物中の前記タグ配列を検出することにより、迅速かつ高感度に遺伝子を検出することが可能となる。

本発明の第1の発明フローを図1に示す。本発明は核酸配列を増幅、検出するための方法であって、標的遺伝子1の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列2と、RNAポリメラーゼのプロモータ配列に相補的な塩基配列3と、任意の塩基配列4とを含むP1プライマー5を用いて、前記標的遺伝子1を鋳型として逆転写する第1の工程と、第1の工程で得られた産物の鋳型、つまり標的遺伝子1を消化する第2の工程と、第2の工程により一本鎖となった逆転写産物6を鋳型として、標的遺伝子の塩基配列に対して特異的な塩基配列7を含むP2プライマー8を逆転写酵素で伸長させる第3の工程と、第3の工程で得られた伸長産物9を含む二本鎖DNAを鋳型として、RNAポリメラーゼのプロモータ配列10を認識するRNAポリメラーゼを用いて転写反応を行う第4の工程と、前記塩基配列4に相補的な配列12を含む転写産物13を検出する第5の工程とを有することを特徴とする遺伝子増幅方法に関する。

本発明の第2の発明フローを図2に示す。本発明は、核酸配列を増幅するための方法であって、標的遺伝子1の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列2と、RNAポリメラーゼのプロモータ配列に相補的な塩基配列3と、任意の塩基配列4とを含むプライマーの5'末端に、RNAポリメラーゼのプロモータ配列である塩基配列10をさらに有するP1プライマー5を用いて、前記標的遺伝子1を鋳型として逆転写する第1の工程と、第1の工程で得られた産物の鋳型である標的遺伝子1を消化する第2の工程と、第2の工程により一本鎖となった逆転写産物6を鋳型として、標的遺伝子の塩基配列に対して特異的な塩基配列7を含む、P2プライマー8を逆転写酵素で伸長させる第3の工程と、第3の工程で得られた伸長産物9を含む二本鎖DNAを鋳型として、RNAポリメラーゼを用いて、塩基配列4、10各々に相補的な配列12、14を含む転写産物15と、塩基配列7、10、11各々に相補的な配列を含む転写産物18を得る工程とを有する第4の工程と、第4の工程で得られた転写産物18を鋳型として、P2プライマー8を用いて逆転写する第6の工程と、第6の工程で得られた産物の鋳型である転写産物18を消化する第7の工程と、第7の工程により一本鎖となった逆転写産物19に、P1プライマー5を作用させ、逆転写酵素を用いて相互に伸長させる第8の工程と、第8の工程で得られた二本鎖DNA20を鋳型として、RNAポリメラーゼを用いて転写反応を行う第9の工程と、第9の工程で得られた転写産物18を鋳型としてP2プライマー8を用いて逆転写することにより、第6の工程で生じる逆転写産物19を再合成する第10の工程と、上記第6、7、8、9、10の工程を繰り返すことによって増幅される転写産物15を検出することを特徴とする遺伝子検出方法に関する。

本発明の第3の発明フローを図3に示す。本発明は、核酸配列を増幅するための方法であって、標的遺伝子1の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列2と、RNAポリメラーゼのプロモータ配列に相補的な塩基配列3と、任意の塩基配列4とを含むプライマーの5'末端に、任意の配列である塩基配列21をさらに有するP1プライマー5を用いて、前記標的遺伝子1を鋳型として逆転写する第1の工程と、第1の工程で得られた産物の鋳型である標的遺伝子1を消化する第2の工程と、第2の工程により一本鎖となった逆転写産物22を鋳型として、標的遺伝子の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列7を含むP2プライマー8を逆転写酵素で伸長させる第3の工程と、第3の工程で得られた伸長産物23を含む二本鎖DNAを鋳型として、RNAポリメラーゼを用いて、塩基配列4、21各々に相補的な配列12、24を含む転写産物25を得るとともに、第3の工程で得られた伸長産物23を含む二本鎖DNAを鋳型として、任意の配列21を有するプライマー27と鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて塩基配列7、10、11、26各々に相補的な配列を含む伸長産物28を得る第6の工程と、第6の工程で得られた伸長産物28を鋳型として、P2プライマー8を伸長させる第7の工程と、第7の工程で得られた二本鎖DNA29を鋳型として、RNAポリメラーゼを用いて塩基配列4、21各々に相補的な配列12、24を含む転写産物25を得る第8の工程と、第7の工程で得られた二本鎖DNA29を鋳型として、任意の配列21を有するプライマー27と鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて、塩基配列7、10、11、26各々に相補的な配列を含む伸長産物28を得る第9の工程と、第9の工程で得られた伸長産物28を鋳型として、P2プライマー8を伸長させて二本鎖DNAを再合成する第10の工程と、第7、8、9、10の工程を繰り返すことにより、増幅される転写産物25を検出することを特徴とする遺伝子検出方法に関する。

本発明の第2の発明フローでは、標的遺伝子の5’末端に導入された標的遺伝子とは無関係な配列（塩基配列4、10各々に相補的な配列12、14）を含む転写産物15が増幅されるので、これを検出することができる。

また、本発明の第1、第2、第3の発明フローでは、第5の工程において、P1プライマーに含まれる塩基配列4に相補的な配列を有しかつその末端に各々発光体と消光体とが結合されたプローブを、転写産物13（第1の発明フロー）、転写産物15（第2の発明フロー）、あるいは転写産物25と伸長産物28（第3の発明フロー）にハイブリダイズさせて、前記発光体から生じる光を検出するか、あるいは電気泳動により検出することができる。

本発明は、温度サイクルを用いてもよく、また鋳型となる核酸配列はRNA配列であってもDNA配列であってもよい。また、鋳型となるDNAは一本鎖、二本鎖のいずれであってもよく、二本鎖DNAを鋳型として使用する場合には、二本鎖DNAを一本鎖に変性する前処理工程の後に本発明の方法を行う。

以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
〔実施例1〕
1.実施例1で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
P1プライマー1：
5'-CCCTTCTCACTGTTCTCTCATTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATTCTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT‐3' (配列番号1)
P2プライマー2：
5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3' (配列番号2)
2.実施例1で使用したモレキュラービーコンプローブ。
MBPa：
5'‐CGACGTCCCTTCTCACTGTTCTCTCATACGTCG‐3' (配列番号3)

本発明の第1の発明フローを用いて遺伝子発現解析が可能かを確認するために、増幅産物をモレキュラービーコンプローブでリアルタイムに検出した。

鋳型はC型肝炎ウイルス(HCV, Hepatitis C Virus)II型RNA(濃度：1.8×10²μg/mL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。P1プライマー1は、5'末端より1〜21塩基はMBPaが増幅産物とハイブリダイズする配列、22〜49塩基はT7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列の相補配列、50〜73塩基はHCV II型RNAに特異的な配列からなるリバースプライマーである。また、P2プライマー2はHCV II型RNAに特異的な配列からなるフォワードプライマーである。検出プローブは上記2.記載のMBPaを使用した。MBPaは5'末端にFAM、3'末端にBHQ1が標識されており、5'末端より1〜6塩基と28〜33塩基はステム配列、7〜27塩基は増幅産物とハイブリダイズする配列である。

増幅反応液は、市販の「NUCLISENS^TMBasic Kit」(bioMerieux)を用い、その説明書にしたがって調製した。

図4に本発明によるリアルタイム検出フローを示す。検体RNA、プライマー、試薬等を含む反応液40に酵素42を加え、恒温増幅/検出装置41を用いて増幅し、増幅産物をリアルタイムに検出した。恒温増幅/検出装置41にはコロナ蛍光マイクロプレートリーダー(コロナ電気)を用いた。本発明の第1の発明フローによるリアルタイム検出結果を図5のグラフ45に示す。縦軸はFAMの蛍光強度、横軸は時間を示し、曲線は検体RNAの増幅産物に由来する蛍光強度の時間による推移を示す。リアルタイム検出により得られたFAMの蛍光強度は時間と共に増加しており、これにより本発明の第1の発明のフローを利用した増幅産物の検出が確認された。この結果は、さらに本発明の第3のフローによる遺伝子の発現解析の可能性を支持する。

〔実施例2〕
1.実施例2で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
P1プライマー3：
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACCACTCATCTCTTCTCCCTGTTTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATTCAAGCACCCTATCAGGCAGTA‐3' (配列番号4)
P2プライマー4：
5'-GTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (配列番号5)
2.実施例2で使用したモレキュラービーコンプローブ。
MBPb：
5'‐CGACGTCACTCATCTCTTCTCCCTGTTACGTCG‐3' (配列番号6)

本発明の第2の発明フローにより目的の増幅産物が得られるかを確認するため、反応後の産物を電気泳動により解析した。

鋳型はC型肝炎ウイルス(HCV,Hepatitis C Virus)II型RNA(濃度：1.8×10²μg/mL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。P1プライマー3は、5'末端より1〜23塩基はSP6RNAポリメラーゼのプロモータ配列、24〜44塩基はMBPbが増幅産物とハイブリダイズする配列、45〜72塩基はT7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列の相補配列、73〜93塩基はHCV II型RNAに特異的な配列からなるリバースプライマーである。また、P2プライマー4はHCV II型RNAに特異的な配列からなるフォワードプライマーである。検出プローブは上記2.記載のMBPbを使用した。MBPbは5'末端にFAM、3'末端にBHQ1が標識されており、5'末端より1〜6塩基と28〜33塩基はステム配列、7〜27塩基は増幅産物とハイブリダイズする配列である。

増幅反応液は、市販の「NASBA Amplificationキット」(Kainos)を用い、その説明書にしたがって調製した反応液にSP6 RNAポリメラーゼを混合したものを利用した。

図6に本発明による増幅フローを示す。反応に用いる反応液50は、検体RNA、プライマー、試薬等を含んでいる。65 ℃ 5分のインキュベーションと41 ℃ 5分のインキュベーションを経て、その後酵素53を添加し、41 ℃ 90分間恒温増幅装置51で反応を行ない、得られた反応生成物を検出装置52で検出した。ここでは検出装置52としてSV1210 コスモアイ(日立ハイテクノロジーズ)を用いた。実施例2のSV1210 コスモアイ電気泳動結果を図7の電気泳動イメージ62に示す。その結果、MBPbにより検出される52塩基長のRNA増幅産物60と、増幅過程の鋳型として用いられるRNA増幅産物61が確認できた。この結果より、本発明の第2の方法により目的の増幅産物が得られ、標的遺伝子の検出できることが確認された。

〔実施例3〕
1.実施例3で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
P1プライマー5：
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACCTCTGTTCCCTCATCACTTCTTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATTCAAGCACCCTATCAGGCAGTA‐3' (配列番号7)
P2プライマー4：
5'-GTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (配列番号5)

2.実施例3で使用したモレキュラービーコンプローブ。
MBPc：
5'‐CGACGTCTCTGTTCCCTCATCACTTCTACGTCG‐3' (配列番号8)

本発明の第2の発明フローを用いて得られたデータより遺伝子発現量の解析が可能であるかを確認するために、増幅産物をモレキュラービーコンプローブでリアルタイムに検出した。

鋳型は10倍ずつ希釈したC型肝炎ウイルス(HCV,Hepatitis C Virus)II型RNA(希釈濃度：1.8×10³μg/mL、1.8×10²μg/mL、1.8×10¹μg/mL、1.8×10⁰μg/mL、1.8×10^-1μg/mL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。P1プライマー5は、5'末端より1〜23塩基はSP6 RNAポリメラーゼのプロモータ配列、24〜44塩基はMBPcが増幅産物とハイブリダイズする配列、45〜72塩基はT7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列の相補配列、73〜93塩基はHCV II型RNAに特異的な配列からなるリバースプライマーである。また、P2プライマー4はHCV II型RNAに特異的な配列をもつフォワードプライマーである。検出プローブは上記2.記載のMBPcを使用した。MBPcは5'末端にFAM、3'末端にBHQ1が標識されており、5'末端より1〜6塩基と28〜33塩基はステム配列、7〜27塩基は増幅産物とハイブリダイズする配列である。

増幅反応液は、市販の「NUCLISENS^TMBasic Kit」(bioMerieux)を用い、その説明書にしたがって調製した反応液にSP6RNAポリメラーゼを混合したものを利用した。

図4に本発明によるリアルタイム検出フローを示す。検体RNA、プライマー、試薬等を含む反応液40に酵素42を加え、恒温増幅/検出装置41により増幅し、増幅産物をリアルタイムに検出した。恒温増幅/検出装置41にはコロナ蛍光マイクロプレートリーダー(コロナ電気)を用いた。

本発明の第2の発明フローによるリアルタイム検出結果を図8のグラフ65に示す。縦軸はFAMの蛍光強度、横軸は時間を示し、曲線は検体RNAの増幅産物に由来する蛍光強度の時間による推移を示す。黒丸、白丸、黒三角、白三角、米印は増幅に用いた鋳型の濃度を示し(順に1.8×10³μg/mL、1.8×10²μg/mL、1.8×10¹μg/mL、1.8×10⁰μg/mL、1.8×10^-1μg/mL)、黒四角はネガティブコントロールとして鋳型の代わりに水を用いた反応の検出結果を示す。黒丸、白丸、黒三角、白三角、米印で示す鋳型濃度により得られたFAMの蛍光強度は時間と共に増加しているが、黒四角で示すネガティブコントロールとして鋳型の代わりに水を用いた反応では蛍光強度は一定の蛍光強度を示していた。この結果は、本発明の第2の発明フローにより増幅産物をリアルタイムに検出できることを示している。また、得られた曲線の立ち上がり時間は鋳型濃度に依存して変化していることから、この結果を解析することにより遺伝子発現量を定量できることが確認された。

〔実施例4〕
1.実施例4で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
P1プライマー6：
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACCCCTTCTCTCTCATCACTGTTTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAG‐3' (配列番号9)
P2プライマー7：
5'-TGGTGCAGGCAGCCTGCA-3' (配列番号10)

2.実施例4で使用したモレキュラービーコンプローブ。
MBPd：
5'‐CGACGTCCCTTCTCTCTCATCACTGTTACGTCG‐3' (配列番号11)

3.実施例4で使用した反応液の組成（括弧内は終濃度の値を示す）
Tris-HCl pH 8.5 (40 mM)、MgCl₂(12 mM)、KCl (70 mM)、DTT (0.5 mM)、dNTP (1.0 mM)、ATP (2.0 mM)、CTP (2.0 mM)、UTP (2.0 mM)、GTP (1.5 mM)、ITP in 30％DMSO (0.5 mM)

4.実施例4で使用した酵素の組成
BSA 2.1 μg、RNaseH 0.08 U、T7 RNAポリメラーゼ 32 U、AMV逆転写酵素 6.4 U、SP6 RNAポリメラーゼ 25 U、BstDNAポリメラーゼ 16 U

本発明の第3の発明フローを用いて遺伝子の発現解析が可能かどうかを確認するために、増幅産物をモレキュラービーコンプローブでリアルタイムに検出した。
鋳型はインシュリン遺伝子(濃度：5.0×10²μg/mL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。P1プライマー6は、5'末端より1〜23塩基はSP6 RNAポリメラーゼのプロモータ配列、24〜44塩基はMBPdが増幅産物とハイブリダイズする配列、45〜72塩基はT7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列の相補配列、73〜93塩基はインシュリン遺伝子のA鎖領域に特異的な配列からなるリバースプライマーを示す。また、P2プライマー7はインシュリン遺伝子のA鎖領域に特異的な配列からなるフォワードプライマーである。検出プローブは上記2.に記載のMBPdを使用した。MBPdは5'末端にFAM、3'末端にBHQ1が標識されており、5'末端より1〜6塩基と28〜33塩基はステム配列、7〜27塩基は増幅産物とハイブリダイズする配列である。

図4に本発明によるリアルタイム検出フローを示す。本発明に関わる増幅反応液の組成及び酵素の組成の具体例は上記3.と4.とにそれぞれ示す。検体RNA,プライマー,試薬等を含んでいる反応液40に酵素42を加え、恒温増幅/検出装置41により増幅し、増幅産物をリアルタイムに検出する。恒温増幅/検出装置41にはコロナ蛍光マイクロプレートリーダー(コロナ電気)を用いた。リアルタイム検出結果を図9のグラフ70に示す。縦軸はFAMの蛍光強度、横軸は時間を示し、曲線は検体RNAの増幅産物に由来する蛍光強度の時間による推移を示す。リアルタイム検出により得られたFAMの蛍光強度は時間と共に増加しており、これにより本発明の第3の発明のフローにより増幅産物が検出できることが分かる。この結果、本発明の第3のフローにより遺伝子発現解析を行うことが可能なことが確認された。

〔実施例5〕
1.実施例5で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
P1プライマー8：
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACCACTCATCCCTGTTCTCTTCTTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATTGTTTGCAGCTCTGTGCATA‐3' (配列番号12)
P1プライマー9：
5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGCAGCTCTGTGCATA‐3' (配列番号13)
P2プライマー10：
5'-AAGGGCGTAACCGAAATCGG-3' (配列番号14)
P2プライマー11：
5'-CACTCATCCCTGTTCTCTTCTAAGGGCGTAACCGAAATCGG-3' (配列番号15)

2.実施例5で使用したモレキュラービーコンプローブ。
MBPe：
5'‐CGACGTCACTCATCCCTGTTCTCTTCTACGTCG‐3' (配列番号16)

本発明が従来法よりも短時間で増幅、検出することができるかどうかを確認するために、本発明の第2の発明フローと従来法を用いて、モレキュラービーコンプローブでリアルタイムに検出し、結果を比較した。

鋳型にはヒト・パピローマウィルス(HPV、Human Papillomavirus)の二本鎖DNAを用い、本発明の第2の発明フローには上記1.に記載のP1プライマー8、P2プライマー10を、従来法にはP1プライマー9、P2プライマー11をオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。P1プライマー8は、5'末端より1〜23塩基はSP6 RNAポリメラーゼのプロモータ配列、24〜44塩基はMBPeが増幅産物とハイブリダイズする配列、45〜72塩基はT7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列の相補配列、73〜93塩基はヒト・パピローマウィルスに特異的な配列からなるリバースプライマーである。P1プライマー9は、5'末端より1〜28塩基はT7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列、29〜47塩基はヒト・パピローマウィルスに特異的な配列からなるリバースプライマーを示す。また、P2プライマー10はヒト・パピローマウィルスに特異的な配列からなるフォワードプライマーであり、P2プライマー11は、5'末端より1〜21塩基はMBPeが増幅産物とハイブリダイズする配列、29〜41塩基はヒト・パピローマウィルスに特異的な配列からなるフォワードプライマーを示す。検出プローブは上記2.記載のMBPeを使用した。MBPeは5'末端にFAM、3'末端にBHQ1が標識されており、5'末端より1〜6塩基と28〜33塩基はステム配列、7〜27塩基は増幅産物とハイブリダイズする配列である。

本発明法に関わる増幅反応組成の具体例としては、例えば市販の「NASBA Amplificationキット」(Kainos)にSP6RNAポリメラーゼを混合したものを利用することができる。

図4に本発明によるリアルタイム検出フローを示す。検体DNA,プライマー,試薬等を含んでいる反応液40に酵素42を加え、恒温増幅/検出装置41により増幅し、増幅産物をリアルタイムに検出する。恒温増幅/検出装置41にはコロナ蛍光マイクロプレートリーダー(コロナ電気)を用いた。本発明の第2の発明フローによるリアルタイム検出結果を図10のグラフ75に示す。縦軸はFAMの蛍光強度、横軸は時間を示し、曲線は検体のRNA増幅産物の時間による推移を示す。黒丸は本発明の第2の発明フロー、黒三角は従来法により得られた増幅曲線をそれぞれ示す。黒丸、黒三角で示すFAMの蛍光強度は時間と共に両方とも増加しているが、立ち上がり時間が本発明法は従来法よりも15分ほど早く、またプラトーに達する時間は20分ほど早いという結果を得た。この結果より本発明の第2の発明フローによる反応は、従来法よりも短時間で増幅検出を行うことができることが確認できた。

本発明によれば、短時間かつ高感度に、標的核酸を増幅、検出することができる。本発明は、基礎研究、ウイルス検査、遺伝子診断等、核酸検出を必要とする分野に幅広く利用することができる。

図1は、本発明の第1の発明フローを示した図である。図2は、本発明の第2の発明フローを示した図である。図3は、本発明の第3の発明フローを示した図である。図4は、本発明によるリアルタイム検出フローを示した図である。図5は、HCVII型RNAを鋳型として用いて、本発明の第1の発明フローよる増幅産物を電気泳動で解析した結果を示した図である。図6は、本発明法による増幅フローを示した図である。図7は、HCVII型RNAを鋳型として用いて、本発明の第2の発明フローによる増幅産物を電気泳動で解析した結果を示した図である。図8は、HCVII型RNAを鋳型として用いて、本発明の第2の発明フローよる増幅産物をリアルタイムに検出した結果を示した図である。図9は、インシュリン遺伝子を鋳型として用いて、本発明の第3の発明フローよる増幅産物をリアルタイムに検出した結果を示した図である。図10は、ヒト・パピローマウィルスを鋳型として用いて、本発明の第2の発明フローと従来法による各々の増幅産物をリアルタイムに検出した結果を示した図である。

符号の説明

1…標的RNA
2…標的遺伝子にハイブリダイズする配列
3…RNAポリメラーゼのプロモータ配列の相補配列
4…標的遺伝子に非特異的な配列
5、27…リバースプライマー
6、22…P1プライマーによる伸長産物
7…標的遺伝子に特異的な配列
8…フォワードプライマー
9、19、23…P2プライマーによる逆転写産物
10…RNAポリメラーゼのプロモータ配列
11…標的遺伝子に非特異的な配列の相補配列
12…標的遺伝子に非特異的な配列の相補配列
13、15、25…増幅産物
14、16…RNAポリメラーゼのプロモータ配列の相補配列
17…標的遺伝子に非特異的な配列の相補配列からなる
18…増幅サイクルに用いられる転写産物
20、29…二本鎖cDNA
21…標的遺伝子に非特異的な配列
24…標的遺伝子に非特異的な配列の相補配列
26…標的遺伝子に非特異的な配列の相補配列
28…増幅サイクルに用いられる転写産物
40…検体,プライマー,試薬反応液等を含む反応液恒温増幅装置
41…恒温増幅/検出装置
42…酵素
45、65、70、75…反応時間に対する蛍光強度の変化を示したグラフ
50…検体,プライマー,試薬反応液等を含む反応液
51…恒温増幅装置
52…検出装置
53…酵素
60、61…増幅バンド
62…電気泳動イメージ

配列番号1 ‐人工配列の説明：本発明に使用する、C型肝炎ウイルスとハイブリダイズするリバースDNAプライマー
配列番号2 ‐人工配列の説明：本発明に使用する、C型肝炎ウイルスとハイブリダイズするフォワードDNAプライマー
配列番号3 ‐人工配列の説明：増幅断片のリアルタイム検出用DNAプローブ
配列番号4 ‐人工配列の説明：本発明に使用する、C型肝炎ウイルスとハイブリダイズするリバースDNAプライマー
配列番号5 ‐人工配列の説明：本発明に使用する、C型肝炎ウイルスとハイブリダイズするフォワードDNAプライマー
配列番号6 ‐人工配列の説明：増幅断片のリアルタイム検出用DNAプローブ
配列番号7 ‐人工配列の説明：本発明に使用する、C型肝炎ウイルスとハイブリダイズするリバースDNAプライマー
配列番号8 ‐人工配列の説明：増幅断片のリアルタイム検出用DNAプローブ
配列番号9 ‐人工配列の説明：本発明に使用する、インシュリン遺伝子のA鎖領域とハイブリダイズするリバースDNAプライマー
配列番号10 ‐人工配列の説明：従来法に使用する、インシュリン遺伝子のA鎖領域とハイブリダイズするフォワードDNAプライマー
配列番号11 ‐人工配列の説明：増幅断片のリアルタイム検出用DNAプローブ
配列番号12 ‐人工配列の説明：本発明に使用する、パピローマウィルスとハイブリダイズするリバースDNAプライマー
配列番号13 ‐人工配列の説明：従来法に使用する、パピローマウィルスとハイブリダイズするリバースDNAプライマー
配列番号14 ‐人工配列の説明：本発明に使用する、パピローマウィルスとハイブリダイズするフォワードDNAプライマー
配列番号15 ‐人工配列の説明：従来法に使用する、パピローマウィルスとハイブリダイズするフォワードDNAプライマー
配列番号16 ‐人工配列の説明：増幅断片のリアルタイム検出用DNAプローブ

Claims

標的核酸の検出方法であって、
前記標的核酸上の配列F1に相補的な第1の塩基配列、RNAポリメラーゼのプロモータ配列に相補的な第2の塩基配列、及び任意の第3の塩基配列を3’側からこの順で含む第1のプライマーを用いて、前記標的核酸を鋳型とした逆転写反応を行う第1の工程と、
鋳型である前記標的核酸を酵素消化する第2の工程と、
前記標的核酸上の配列F1よりも5’側に存在する配列F2と同一の第4の塩基配列を含む第2のプライマーを用いて、前記逆転写産物を鋳型とした伸長反応を行う第3の工程と、
前記伸長産物のRNAポリメラーゼによる転写反応を行う第4の工程を含み、
前記転写産物中の標的核酸に非特異的な配列を検出することを特徴とする核酸検出方法。
前記方法において、前記第1のプライマーがその5’末端にRNAポリメラーゼのプロモータ配列と同一の第5の塩基配列をさらに含み、
前記第4の工程で得られる、前記第4の塩基配列に相補的な配列と前記第1の塩基配列と前記第2の塩基配列と前記第3の塩基配列を含む転写産物を鋳型として、前記第2のプライマーを用いて逆転写反応を行う第5の工程と、
鋳型である前記伸長産物を酵素消化する第6の工程と、
前記第1のプライマーを用いて、前記逆転写産物を鋳型とした伸長反応を行う第7の工程と、
前記伸長産物のRNAポリメラーゼによる転写反応を行う第8の工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の核酸検出方法。
前記方法において、前記第1のプライマーがその5’末端に任意の第6の塩基配列をさらに含み、
前記第3の工程の伸長産物に対し、RNAポリメラーゼによる転写反応とともに、前記第6の塩基配列と同一の配列を含む第3のプライマーからの鎖置換DNAポリメラーゼを用いた伸長反応を行う第4の工程と、
前記第3のプライマーからの伸長産物を鋳型として、前記第2のプライマーを用いて2本鎖核酸を合成する第5の工程と、
前記2本鎖核酸に対し、RNAポリメラーゼによる転写反応とともに、前記第3のプライマーと鎖置換型DNAポリメラーゼを用いた核酸合成反応を行う第6の工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の核酸検出方法。
前記転写産物中の標的核酸に非特異的な配列が、前記第3の塩基配列に相補的な配列を含むものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸検出方法。
前記転写産物中の標的核酸に非特異的な配列が、前記第3の塩基配列と前記第5の塩基配列に各々相補的な配列を含むものである、請求項3に記載の核酸検出方法。
前記第3の塩基配列を含み、かつその末端に各々発光体と消光体とが結合されたプローブを、前記転写産物にハイブリダイズさせ、前記発光体から生じる光を検出することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸検出方法。
前記第4の工程で得られる転写産物が、20塩基以上61塩基以下であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸検出方法。
温度サイクルを必要としないことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸検出方法。