WO1999040173A1 - Substrats d'immobilisation et d'amplification de l'adn, cristaux de blocage d'adn avec de l'adn bloque sur les substrats, et procede d'amplification de l'adn - Google Patents

Substrats d'immobilisation et d'amplification de l'adn, cristaux de blocage d'adn avec de l'adn bloque sur les substrats, et procede d'amplification de l'adn Download PDF

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Michifumi Tanga
Kojiro Takahashi
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Toyo Kohan Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a substrate for immobilizing and expanding DNA, a DNA-immobilized chip having DNA immobilized on the substrate, and a method for amplifying DNA.
  • the present invention relates to a substrate for immobilizing DNA or the like used in the field of molecular biology or biochemistry, more particularly to a substrate having excellent thermal conductivity, and more specifically, to a hydroxyl group at a terminal,
  • the present invention relates to a chemically modified substrate having a carboxyl group, an epoxy group, an amino group, and the like, and a chip having DNA and the like immobilized on the substrate.
  • the sample was put into a tubular plastic reaction vessel together with the reaction solution, and this vessel was housed in an aluminum block to perform the heat cycle. .
  • the present invention provides a solid substrate that can easily immobilize DNA and the like and replicates DNA by a DNA amplification reaction, a chip in which DNA and the like are immobilized on the substrate, and
  • the technical problem is to provide a method for amplifying DNA.
  • the substrate of the present invention is characterized by having excellent thermal conductivity for immobilizing and amplifying DNA.
  • These substrates are desirably diamond and are preferably chemically modified.
  • These substrates are desirably chemically modified having a polar group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an epoxy group, or an amino group at the terminal.
  • the carboxyl group is bonded to the substrate surface through an ester bond or a peptide bond, or is introduced to the substrate surface by a silane coupling agent, and the epoxy group or the amino group is It is desirable that the silane coupling agent is introduced onto the surface of the substrate.
  • the DNA-immobilized chip of the present invention is characterized in that DNA is immobilized on these substrates.
  • the method for amplifying DNA of the present invention is characterized by amplifying DNA using these substrates or chips.
  • the substrate of the present invention is a solid substrate used for immobilizing and amplifying DNA, and desirably has excellent thermal conductivity.
  • diamond has an outstanding thermal conductivity among materials and can be rapidly heated and cooled. If the substrate of the present invention is used, the heating and cooling is repeated as in a DNA amplification reaction. The cycle time can be significantly reduced.
  • the surface of the substrate of the present invention is chemically modified with a hydroxyl group, a carboxyl group, an epoxy group, an amino group, or the like, a DNA or the like can be easily immobilized, and a chip for replicating DNA by a DNA amplification reaction. Ideal for such.
  • the surface of the chip of the present invention when the surface of the chip of the present invention is contaminated, it can be hydrolyzed to regenerate the chemically modified surface.
  • the substrate used in the present invention is preferably, for example, a solid substrate having a thermal conductivity of 0.1 LW / cm * K or more.
  • the thermal conductivity is preferably 0.5 WZcm ⁇ K or more. Furthermore, it is more desirable that the thermal conductivity is 1 W / cm ⁇ K or more. If the thermal conductivity of the i0 substrate is 0.1 WZ cm ⁇ K or more, heating and cooling are performed, for example, when the DNA is immobilized on the substrate of the present invention and a PCR (polymerase chain reaction) reaction is performed. This is because the ability to follow is excellent.
  • Examples of materials having good thermal conductivity include metals such as diamond, silver, copper, aluminum, tungsten, and molybdenum. Also, alumina, aluminum nitride
  • Ceramics such as minium, titanium carbide, silicon carbide, silicon, and the like.
  • a mixture of the above-mentioned metal and ceramics can be applied.
  • plastics such as polycarbonate and fluororesin can be applied.
  • the materials are not limited to the above-mentioned metals, ceramics and plastics as long as they are chemically stable.
  • diamond and diamond-like can be applied.
  • a mixture of plastic and the above-mentioned metals, ceramics, diamonds and the like may be used.
  • the material of the diamond substrate synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, or the like can be used. Further, it may have any structure of a single crystal or a polycrystal. From the viewpoint of productivity, diamonds manufactured using gas-phase synthesis methods such as microwave plasma CVD method
  • the method for forming the substrate of the present invention can be appropriately selected.
  • microwave plasma CV D method ECRCVD method, high frequency plasma CVD method, IPC method, DC sputtering method, ECR sputtering method, ion plating method, arc ion plating method, EB evaporation method, resistance heating evaporation method and the like.
  • a resin formed by mixing a resin as a binder with a metal powder, a ceramic powder, or the like is formed.
  • the substrate surface of the present invention is intentionally roughened. This is because such a roughened surface increases the surface area of the substrate and is convenient for immobilizing a large amount of DNA and the like.
  • the shape of the substrate is not limited to a specific shape such as a flat plate, a thread, a sphere, a polygon, and a powder. Further, it may be a complex (for example, a two-layer body) of these substrates and other substances.
  • the substrate of the present invention is preferably one in which the surface of the substrate is chemically modified and has a polar group, a hydroxyl group or a carboxyl group at the terminal of the chemical modification. That is, a specific group is added (chemically modified) to the surface of the substrate. This chemical modification facilitates the immobilization of DNA on the surface of the substrate.
  • Specific groups that have been added (chemically modified) to the substrate surface and have a polar group at the end include groups such as hydroxyl, carboxyl, sulfate, cyano, nitro, thiol, amino, and epoxy groups. can give.
  • organic carboxylic acids are also included. Among the above groups, the carboxyl group may be directly added to a substrate such as diamond, but other hydrocarbons may be added to the substrate.
  • It may have a carboxyl group at the terminal via the ⁇ 0 group.
  • the hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms is preferable for immobilizing DNA.
  • Acids that can be hydrocarbon groups include monocarboxylic acids such as formic acid, acetic acid, and propionic acid; dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, and phthalic acid; and trimellitic acid. And polyvalent carboxylic acids.
  • a group in which a carboxyl group is bonded to the terminal of the above-mentioned hydrocarbon group is added to the base via a peptide bond in order to impart alkali resistance.
  • it is attached to the S surface.
  • Hydroxyl groups are bonded to the substrate surface at the terminal of the hydrocarbon group by oxidizing the substrate surface with oxygen plasma and then steaming, or by irradiating ultraviolet light in chlorine gas to chlorinate the substrate surface and then alkaline solution. And a method of oxidizing the substrate surface with oxygen plasma, then chlorinating and then hydrolyzing in an alkaline solution to form a hydroxy group.
  • a silane coupling agent, a titanium coupling agent, an aluminum coupling agent, etc. can be treated on top of it to enhance the chemical modification with the carboxyl group. become.
  • a method in which a group in which a carboxyl group is bonded to the terminal of a hydrocarbon group is bonded to the substrate surface via a peptide bond includes: irradiating ultraviolet light in chlorine gas to chlorinate the substrate surface; After amination by irradiation with ultraviolet rays, a method of reacting with carboxylic acid chloride in a non-aqueous solvent and then neutralizing in a weak alkaline solution can be mentioned.
  • a method in which a group having a carboxyl group bonded to the terminal of a hydrocarbon group is bonded to the substrate surface via an ester bond includes: irradiating ultraviolet rays in chlorine gas to chlorinate the substrate surface; Reaction with sodium carboxylate and then neutralization in a weak acid solution, or oxidation of the substrate surface with oxygen plasma followed by chlorination Then, it is hydrolyzed by hydrolysis in an alkaline solution, reacted with carboxylic acid chloride in a non-aqueous solvent, and then neutralized in a weak alkaline solution.
  • the present invention will be described in detail with reference to examples.
  • Example 1 After the diamond surface was oxidized by oxygen plasma excited by microwaves, it was placed in a separable flask, and the atmosphere in the flask was replaced with steam. And kept for 30 minutes before cooling.
  • the sample was taken out and dried to obtain a diamond having a hydroxyl group at a terminal.
  • the peak intensities of hydrogen and hydroxyl after surface polishing, oxygen plasma treatment, and steam treatment were measured by SIMS (secondary ion mass spectrometry).
  • SIMS secondary ion mass spectrometry
  • the surface of the vapor phase synthetic diamond obtained in Example 1 was polished, and a 10 mm square sample was cut out with a laser. This sample was placed in a separable flask, and the atmosphere in the flask was replaced with argon gas. Then, while dosing chlorine gas at a flow rate of 1 SCCM, the dominant wavelength was 360 ° using an Hg—Xe lamp. The diamond surface was chlorinated by irradiating it with 0 angstrom ultraviolet rays for 60 minutes. After replacing the atmosphere with argon gas, the sample was taken out, boiled in a 10% by weight aqueous sodium hydroxide solution for 15 minutes, washed with water, and dried to obtain a diamond having a hydroxyl group at a terminal. The peak intensities of hydrogen, hydroxyl, and chlorine after surface polishing, chlorination, and sodium hydroxide treatment were measured by SIMS. When the peak intensity of hydrogen was set to 1, the hydroxyl and chlorine The peak intensity ratio was as shown in Table 2 below.
  • the peak intensity ratio of the hydroxyl group was increased by the chlorination treatment and the subsequent sodium hydroxide treatment, and it was confirmed that the diamond surface was chemically modified with the hydroxyl group.
  • the chlorine groups were reduced, it was confirmed that they were substituted by hydroxyl groups.
  • Example 2 The surface of the vapor-phase synthetic diamond obtained in Example 1 was polished, a 10 mm square sample was cut out with a laser, and the surface was oxidized with oxygen plasma excited by microwaves. After that, the diamond surface was chlorinated in the same manner as in Example 2. After replacing the atmosphere with argon gas, the sample was taken out, boiled in a 10% by weight aqueous sodium hydroxide solution for 15 minutes, washed with water, and dried to obtain a diamond having a hydroxyl group at a terminal.
  • the peak intensity ratio of hydroxyl groups was increased by oxygen plasma treatment, followed by chlorination, and then by sodium hydroxide treatment, indicating that the diamond surface was chemically modified with hydroxyl groups. confirmed. Also, since the chlorine group was reduced, it was confirmed that the group was substituted by a hydroxyl group.
  • the surface of the vapor-phase synthetic diamond obtained in Example 1 was polished, a 10 mm square sample was cut out with a laser, placed in a separable flask, and the atmosphere in the flask was replaced with argon gas.
  • the surface of the diamond was chlorinated by irradiating with UV light having a main wavelength of 360 ⁇ for 60 minutes using a Hg—Xe lamp while flowing at a flow rate of 1 SCCM.
  • the peak intensity ratio of hydroxyl groups was increased by chlorination and subsequent sodium sebacate treatment, and was derived from the stretching vibration of carbon-hydrogen on the sample surface using the FTIR method.
  • the absorption intensity due to the stretching vibration of carbon-oxygen and the absorption intensity due to the stretching vibration of carbon-oxygen, all of them increased (the rate of increase of the absorption intensity with respect to the diamond blank was about 30%) .
  • the diamond surface was chemically modified with a group in which the carboxyl group was bonded to the terminal of the hydrocarbon group of sebacic acid.
  • the surface of the vapor-phase synthetic diamond obtained in Example 1 was polished, a 10 mm square sample was cut out with a laser, and the surface was oxidized with oxygen plasma excited by microwaves.
  • the diamond surface was chlorinated. After replacing the atmosphere with argon gas, the sample was taken out and placed in an aqueous solution of 10% by weight of hydroxylating water. After boiling for 5 minutes, the diamond surface was replaced with a hydroxyl group. After drying, place the sample in a separable flask equipped with a condenser equipped with a calcium chloride drying tube at the top, add 50 ml of chloroform and 1 g of triethylamine, and add the atmosphere in the flask. Was replaced with argon gas. Then, ice the separable flask
  • Example 1 A 1-Omm square sample was cut out from the vapor-phase synthetic diamond obtained in Example 1 with a laser, the surface was treated with hydrogen plasma excited by microwaves, and the diamond surface was treated with chlorine in the same manner as in Example 2. It has become.
  • the DNA amplification reaction was carried out using a chemically modified diamond tip having a carboxyl group at the terminal obtained as in Examples 1 to 6, and the desired amount of DNA was obtained in about 1 hour. Can be obtained.
  • the terminal base of the oligonucleic acid is immobilized to the terminal hydroxyl group or terminal carboxyl group by hydrogen bonding, and the DNA having a base sequence complementary to the oligonucleic acid is further fixed. It can also be used as a DNA library 15 chip.
  • DNA nucleotides, oligonucleotides, DNA fragments and the like can be immobilized on the diamond surface to form a library.
  • a titanium carbide disk having a diameter of 64 mm, a thickness of 0.1 mm, and a surface roughness of 0.1 mm with a roughness of Ra was vapor-phase synthesized.
  • Example 7 after oxidizing the sample surface with oxygen plasma excited by high frequency, the sample was placed in a separable flask, and the atmosphere in the flask was replaced with steam. After heating and holding for 30 minutes, it was allowed to cool. Next, the sample was taken out and dried to obtain a substrate having a hydroxyl group at a terminal. Furthermore, this substrate The surface was dipped in a silane coupling solution to obtain a substrate having the surface coated with a silane coupling agent. This substrate was brought into direct contact with a Berch element as a heating and cooling means so that the temperature of the substrate could be controlled, and the following PCR method was performed.
  • mRNA For (messenger RNA messenger RN A) oligo - d T IB -.
  • g DNA genomic DNA: chromosomal DNA
  • cDNA complementary DNA
  • the temperature of the substrate was controlled at 37 to 60 ° C., and cDNA synthesis was performed using reverse transcriptase (RT).
  • RT reverse transcriptase
  • the solution in which the synthesized immobilized cDNA and mRNA were hybridized was heated to 90 ° C to dehybridize the mRNA, and the reaction solution was replaced with Tris-EDTA (TE) buffer. Again, the temperature was lowered to 0 to 4 ° C., and the mixture was washed with ethanol to prepare a purified immobilized cDNA chip in a single-stranded DNA state.
  • TE Tris-EDTA
  • an immobilized oligonucleotide having a target restriction enzyme site was immobilized on the surface of the substrate of the present invention in the same manner as in the case of the above-mentioned oligo dT ! B.
  • the reaction solution for chemical immobilization was exchanged at a low temperature of 0 to 4 ° C with a reaction solution containing the hybrid oligonucleotide and the desired restriction enzyme.
  • the temperature was raised to 37 ° C., and the semi-immobilized oligonucleotide was cleaved with the restriction enzyme.
  • reaction solution was replaced with a reaction solution containing gDNA converted to ⁇ 5 and ligation enzyme (Ligase) .
  • the temperature of the substrate was raised again to 37 ° C, and the ligation reaction was performed.
  • a gDNA-immobilized chip in a state was prepared.
  • multiple samples are placed in separate containers to compare gene mutations of the same type of tissue and cells.
  • These cassettes are buried in the reactor body, and if two or more of these cassettes are systematically made, it is possible to efficiently compare multiple samples.
  • cassette-type DNA library As described above, a single cassette or a plurality of cassette cassettes in which a plurality of containers are linked together, and a DNA-immobilized chip placed in each of these containers is referred to as an l "cassette-type DNA library. be able to.
  • a reaction vessel was constructed using a plurality of the above-mentioned cDNA-immobilized chips, and was brought into controlled contact with heating and cooling means. After sufficiently washing the inner surface of the reaction vessel with a TE buffer, a primer for the DNA for amplification was set, and a PCR reaction solution containing four nucleotides and a DNA polymerase was added. Thereafter, the reaction vessel was immediately heated to a heat denaturation temperature (95 ° C) at which double-stranded DNA was separated into single-stranded DNA. And 9 The mixture was kept at 5 ° C for about 1.5 minutes, and then immediately cooled to 45 ° C, which is the annealing temperature at which the single-stranded DNA and the DNA primer were bound.
  • a heat denaturation temperature 95 ° C
  • the above temperature cycle was repeated 30 times to perform PCR.
  • the time required for PCR was about 135 minutes, which is the sum of the retention times, because no time was required to raise or lower the temperature.
  • the vapor-phase synthetic diamond obtained in Example 1 was cut into 1 Omm square samples by laser, and the surface was treated with hydrogen plasma excited by microwave plasma. It has become. After replacing the atmosphere with argon gas, the sample was taken out and weighed 10 wt. The surface of the diamond was hydrolyzed by boiling for 15 minutes in an aqueous solution of / 0 hydroxylating power. On the other hand, 100 cc of a 95% aqueous ethanol 5% aqueous solution was adjusted to 5 with acetic acid, and 2 cc of 3-glycidoxypropyl 5-trimethoxysilane was added with stirring. Hydroxyl diamond was immersed in this solution, taken out, washed lightly with ethanol, and treated at 110 ° C for 5 minutes to introduce an epoxy group into the diamond surface.
  • the 5 'terminal aminated oligonucleic acid (primer) was immobilized on the epoxy group, and mRNA was annealed. After that, cDNA was prepared with reverse transcriptase and simultaneously immobilized on the chip.
  • Example 1 The vapor-phase synthetic diamond obtained in Example 1 was cut into a 10 mm square sample by a laser, surface-treated with hydrogen plasma excited by microwave plasma, and the diamond surface was chlorinated in the same manner as in Example 2. After replacing the atmosphere with argon gas, the sample was taken out and boiled in a 10% by weight aqueous solution of potassium hydroxide for 15 minutes. Then, the diamond surface was hydroxinated. On the other hand, 2 cc of 3-aminobutyl pyrtrimethoxysilane was added to 100 cc of a 95% aqueous ethanol 5% aqueous solution with stirring. Hydroxylated diamond was immersed in the solution, taken out, washed lightly with ethanol, and treated at 110 ° C for 5 minutes to introduce amino groups on the diamond surface.
  • the mRNA was converted into type III, and the cDNA was diamond-coated with reverse transcriptase. Immobilized.
  • an aluminum nitride disk having a diameter of 64 mm, a thickness of 0.1 mm, and a surface roughness Ra of 0.3 mm was synthesized in a gas phase.
  • a 3 x 5 mm square sample was cut out from this disc with a laser and the thermal conductivity was measured. As a result, a value of 1.7 OW / cm ⁇ K was obtained. Place this sample in a separable flask
  • Example 14 Using powder sintering method, a diameter of 64 mm, the surface roughness of the thickness of 0. 3 mm to obtain a tungsten discs 0. 5 mm in average table surface roughness R a u laser from the disc A 3 x 5 mm square sample was cut out and the thermal conductivity was measured. As a result, a value of 1.67 WZ cm • K was obtained. Then, the surface is exposed to oxygen plasma excited by microwaves. After oxidation, the sample surface was chlorinated. After replacing the atmosphere with argon gas, the sample was taken out, boiled in a 10% by weight aqueous sodium hydroxide solution for 15 minutes, washed with water, and dried to obtain a substrate having a hydroxyl group at the terminal. Thereafter, using this substrate, DNA immobilization and amplification using the PCR method were performed in the same manner as in Example 1. 5 (Example 14)
  • An alumina disk was formed by the powder sintering method.
  • a 3 x 5 mm square sample was cut out from the disk by a laser, and the thermal conductivity was measured. As a result, a value of 0.3 WZcm * K was obtained. Then, it is placed in a separable flask, the atmosphere in the flask is replaced with argon gas, and the main wavelength is 3600 angstroms using a Hg—Xe ⁇ lamp while flowing chlorine gas at a flow rate of 1 S CCM. The sample surface was chlorinated by irradiating with ultraviolet light for 60 minutes.
  • the substrate and DNA chip of the present invention can be used by directly contacting a heating and cooling means such as a thermistor as described above, or in an Etpen type tube as in the DNA amplification method in the conventional PCR method. It can also be used by charging it into the reaction solution. In this case, the PCR amplification method cannot be completed in a very short time as described in the above example, but it should be completed more quickly than in the conventional method of introducing DNA into a reaction solution. be able to. (I) industrial applicability;
  • the PCR method is used by using a substrate having excellent thermal conductivity.
  • the completed DNA amplification reaction can be completed in a very short time.
  • the temperature control of the PCR reaction can be performed with high accuracy, so that DNA for purposes other than amplification is hardly duplicated. There is.
  • DNA is directly immobilized on a solid substrate having excellent thermal conductivity. Therefore, by directly heating and cooling the temperature of the substrate, it is possible to follow a heat cycle by a PCR method or the like. And the desired amount of DNA can be obtained in a short time.
  • the surface of the substrate of the present invention is chemically modified with a hydroxyl group, carboxyl group, epoxy group, amino group, etc. c also a ideal for chips for replicating DNA by, the substrate of the present invention is, when the surface is contaminated, by hydrolysis can be regenerated chemical modification, saving an expensive DNA chip .

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Description

明 細 書
DNAを固定化して增幅するための基体、 その基体に DNAを固定化した DNA 固定化チップ及び D N Aを増幅する方法 技術分野
本発明は、 分子生物学分野や生化学関連分野において用いられる DNA等を固 定化するための基体に関し、 より詳しくは、 熱伝導性に優れた基体に関し、 さら に詳しくは、 末端に水酸基、 カルボキシル基、 エポキシ基、 アミノ基等を有する 化学修飾された基体及びその基体に D N A等を固定化したチップに関する。 背景技術
従来、 DNAの増幅反応等においては、 目的とする DNAを特定量得るために、 1 ) 二本鎖 DN Aの水素結合をほどくために試料の温度を 95°Cに上昇させる、 2) 次いで DNAを複製するためのプライマーと再結合させるために試料の温度 を 45°Cに下降させる、
3) さらに耐熱性ポリメラーゼによりプライマーを伸長させて DN Aを複製させ るために試料の温度を 74°Cに上昇させる、
といった 1) 〜3) のヒートサイクルを幾度も繰り返す必要があった。
このような、 いわゆる PC R法を用いた DN Aの増幅反応では、 試料を反応溶 液とともにチューブ状プラスチック反応容器などに入れ、 この容器をアルミプロ ックに収容し前記ヒートサイクルを行っていた。
しかし、 前記増幅反応は DN Aを反応溶液とともに加熱 ·冷却を行うために、 目的とする量の DNAを得るには多大な時間を要していた。 また、 反応溶液の温 度制御の精度が低いために、 目的とする以外の DNAも複製されるという問題点 もめった。 本発明は、 このような問題点に鑑み、 D N A等を容易に固定化できて、 D N A 増幅反応により D N Aを複製するために最適な固体状基体、 その基体に D N A等 を固定化したチップ、 及び D N Aを増幅する方法を提供することを技術的課題と する。
5"
発明の開示
本発明の基体は、 D N Aを固定化して増幅するための熱伝導性に優れているこ とを特徴とする。 これらの基体はダイヤモンドであることが望ましく、 化学修飾 されたものであることが望ましい。
( 0 これらの基体は、 末端に極性基、 水酸基、 カルボキシル基、 エポキシ基、 また はアミノ基を有する化学修飾されたものであることが望ましい。
そして、 前記カルボキシル基が、 エステル結合やペプチド結合を介して基体表 面に結合しているもの、 或いはシランカツプリング剤により基体表面に導入され たものであり、 また前記エポキシ基、 またはァミノ基がシランカップリング剤に より基体表面に導入されたものであることが望ましい。
本発明の D N A固定化チップは、 これらの基体に D N Aを固定化したものであ ることを特徴とする。
本発明の D N Aを増幅する方法は、 これらの基体又はチップを用いて D N Aを 増幅することを特徴とする。
ZD 発明を実施するための最良の形態
本発明の基体は、 D N Aを固定化して増幅するために用いる固体状の基体であ つて、 熱伝導性に優れたものであることが望ましい。 例えば、 ダイヤモンドは物 質の中でも抜群の熱伝導率を有しており急速に加熱冷却させることが可能である ため、 本発明の基体を用いれば、 D N A増幅反応のように、 加熱冷却を繰り返す ヒートサイクル時間をきわめて短縮できる。 また、 本発明の基体は、 表面を水酸基、 カルボキシル基、 エポキシ基、 ァミノ 基等で化学修飾してあるので、 DNA等の固定化を容易に行え、 DNA増幅反応 により DNAを複製するためのチップなどに最適である。
また、 本発明のチップは、 表面が汚染された場合に、 加水分解させて化学修飾 Γ を再生させることができる。
本発明に用いる基体は、 例えば、 固体状の基体は熱伝導率が 0. lW/c m * K以上であることが望ましい。
さらに、 好ましくは熱伝導率が 0. 5WZc m · K以上であることが望ましい。 さらに、 より好ましくは熱伝導率が 1W/ cm · K以上であることが望ましい。 i0 基体の熱伝導率が 0. 1 WZ c m · K以上であると、 DNAを本発明の基体に固 定化させて、 PCR (ポリメラーゼ ·チヱイン ' リアクション） 反応を行う場合 等において、 加熱 ·冷却の追随性が優れているからである。
熱伝導性がよいものの例としては、 ダイヤモンド、 銀、 銅、 アルミニウム、 タ ングステン、 モリブデン等の金属などがあげられる。 また、 アルミナ、 窒化アル
^ ミニゥム、 炭化チタン、 炭化珪素、 シリコン、 等のセラミックスがあげられる。
また、 上記の金属とセラミ ックスとの混合体も適用出来る。 また、 ボリカーボネ ートゃフッ素樹脂等のプラスチックなども適用できる。 また、 化学的に安定なも のであれば、 上記した金属、 セラミ ックス、 プラスチックスに限定されない。 例 えば、 ダイヤモンドやダイヤモンドライクなども適用できる。 また、 プラスチッ タスと上記金属、 セラミ ックス、 ダイヤモンド等との混合体でもよい。
ダイヤモンド基体の素材としては、 合成ダイヤモンド、 高圧合成ダイヤモンド、 あるいは天然のダイヤモンドなどを用いることができる。 またそれらの単結晶体 あるいは多結晶体のいずれの構造を有していても差し支えない。 生産性の観点か ら、 マイクロ波プラズマ C V D法などの気相合成法を用いて製造されたダイャモ
^ ンドを用いることが好ましい。
本発明の基体の形成方法は適宜選択できる。 例えば、 マイクロ波プラズマ CV D法、 E C R C V D法、 高周波プラズマ C V D法、 I P C法、 直流スパッタリン グ法、 E C Rスパッタリング法、 イオンプレーティング法、 アークイオンプレー ティング法、 E B蒸着法、 抵抗加熱蒸着法などがあげられる。 また、 金属粉末や セラミックス粉末等に、 樹脂をバインダ一として混合して結合形成したものがあ げられる。 また、 金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機を用いて 圧粉したものを高温で焼結したものもあげられる。
本発明の基体表面は、 意図的に粗面化されていることも望ましい。 このような 粗面化表面は基体の表面積が増えて、 多量の D N A等を固定化させることに好都 合だからである。 基体の形状は、 平板状、 糸状、 球状、 多角形状、 粉末状など特 i o に問わない。 さらにこれらの基体と他の物質との複合体 （例えば 2層体） であつ てもよい。
本発明の基体は、 基体表面を化学修飾されたものであり、 化学修飾の末端に極 性基、 水酸基又はカルボキシル基を有するものであることが好ましい。 すなわち、 上記の基体の表面に特定の基を付加 （化学修飾） させる。 この化学修飾によって、 D N Aが基体の表面に固定化されやすくなる。 基体表面に付加 （化学修飾） され、 末端に極性基を有する特定の基としては、 水酸基、 カルボキシル基、 硫酸基、 シ ァノ基、 ニトロ基、 チオル基、 アミノ基、 エポキシ基などの基があげられる。 ま た、 この他、 有機カルボン酸も含まれる。 前記の基のうち、 カルボキシル基は、 ダイヤモンドなどの基体に直接付加させてもよいが、 基体との間に他の炭化水素
^0 基を介し、 末端にカルボキシル基を有することとしてもよい。
この場合の炭化水素基は炭素数 1〜 1 0のものが、 D N Aの固定化にあたって 好ましい。 炭化水素基となり うるような酸は、 蟻酸、 酢酸、 プロピオン酸などの モノカルボン酸や、 シユウ酸、 マロン酸、 コハク酸、 マレイン酸、 フマル酸、 フ タル酸などのジカルボン酸や、 トリメリッ ト酸などの多価カルボン酸などがあげ
2^ られる。
P C R法などを用いて、 D N Aの增幅反応に本発明の基体を適用する場合、 耐 加水分解性が必要とされる場合と、 加水分解させて化学修飾を再生させる必要が ある場合との 2通りの適用ケースがある。
耐加水分解性が必要とされる場合は、 耐アルカリ性を付与するために、 上記の 炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基を、 ぺプチド結合を介して基体
S 表面に結合させることが好ましい。
一方、 生成した化学修飾を加水分解させて除去し再生させる必要がある場合は、 アル力リ溶液で加水分解可能とするために、 上記の炭化水素基の末端にカルボキ シル基が結合した基を、 エステル結合を介して基体表面に結合させることが好ま しい。
炭化水素基の末端に水酸基を基体表面に結合させる方法としては、 基体表面を 酸素プラズマで酸化し、 次いで水蒸気処理する方法、 または塩素ガス中で紫外線 照射して基体表面を塩素化した後アルカリ溶液中で加水分解してヒ ドロキシル化 する方法、 さらに基体表面を酸素プラズマで酸化し、 次いで塩素化した後アル力 リ溶液中で加水分解してヒ ドロキシル化する方法を挙げることができる。
なお、 基体表面に水酸基が結合されている場合は、 シランカップリング剤、 チ タンカップリング剤、 アルミカップリング剤などをその上に処理すると、 カルボ キシル基などとの化学修飾がより強固なものになる。
また、 炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基をぺプチド結合を介し て基体表面に結合させる方法としては、 塩素ガス中で紫外線照射して基体表面を ^ 塩素化し、 次いでアンモニアガス中で紫外線照射してァミノ化した後、 非水溶媒 中でカルボン酸クロライ ドと反応させ、 次いで弱アルカリ溶液中で中和させる方 法を挙げることができる。
また、 炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基をエステル結合を介し て基体表面に結合させる方法としては、 塩素ガス中で紫外線照射して基体表面を ^ 塩素化し、 次いで非水溶媒中でカルボン酸ソーダと反応させ、 次いで弱酸溶液中 で中和させる方法、 または、 基体表面を酸素プラズマで酸化し、 次いで塩素化し た後アル力リ溶液中で加水分解してヒ ドロキシル化した後、 非水溶媒中でカルボ ン酸クロライ ドと反応させ、 次いで弱アルカリ溶液中で中和させる方法を挙げる ことができる。 以下、 実施例にて本発明を詳細に説明する。
(実施例 1 )
マイクロ波プラズマ CVD法を用いて、 直径が 64mm、 厚さが 0. 3mmの ダイヤモンドを気相合成した後、 全体が均一な 0. 25 mmの厚さとなるよう表 面を研磨した。 このようにして研磨した表面の 1 OmmX 1 Ommの面積におい て、 FT I R法 （フーリエ変換赤外分光分析法） により炭素一水素の伸縮の振動 に由来する 2879 c πΤ'の吸収強度を測定したところ、 ほぼ一定の値が得られ i ? た。 このダイヤモンドからレーザーにより 1 Omm角の試料を切り出し、 以下の 実施例 1〜6の試料として用いた。 実施例 1においては、 マイクロ波により励起 した酸素プラズマでダイヤモンド表面を酸化した後、 セパラブルフラスコ中に配 置し、 フラスコ中の雰囲気を水蒸気で置換した後、 水蒸気を流入させながら 40 0 °Cに加熱し 30分間保持した後放冷した。
次いで試料を取り出し乾燥し、 末端に水酸基を有するダイヤモンドを得た。 ま た、 S I MS法 （二次イオン質量分析法） により、 表面研磨後、 酸素プラズマ処 理後、 および水蒸気処理後の水素、 水酸基のピーク強度を測定したところ、 水素 のピーク強度を 1 とした場合の水酸基のピーク強度比は、 下記の表 1に示す値と なった。
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Figure imgf000008_0001
巧 表 1に示すように、 水酸基のピーク強度比は、 酸素プラズマ処理、 それに続く 水蒸気処理により増加しており、 ダイヤモンド表面が水酸基により化学修飾され ていることが確認された。
(実施例 2 )
実施例 1で得られた気相合成ダイヤモンドを表面研磨し、 レーザーにより 1 0 mm角の試料を切り出した。 この試料をセパラブルフラスコ中に配置し、 フラス コ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、 塩素ガスを 1 S C C Mの流量で流入 させながら H g— X eランプを用い、 主波長が 3 6 0 0オングストロームの紫外 線を 6 0分間照射してダイヤモンド表面を塩素化した。 雰囲気をアルゴンガスで 置換した後試料を取り出し、 1 0重量％の水酸化ナトリゥム水溶液中で 1 5分間 煮沸し、 さらに水洗した後乾燥し、 末端に水酸基を有するダイヤモンドを得た。 また、 S I M Sにより、 表面研磨後、 塩素化後、 および水酸化ナトリウム処理後 の水素、 水酸基および塩素基のピーク強度を測定したところ、 水素のピーク強度 を 1 とした場合の、 水酸基、 塩素基のピーク強度比は下記の表 2に示す値となつ た。
Figure imgf000009_0001
表 2に示すように、 水酸基のピーク強度比は、 塩素化処理、 それに続く水酸化 ナトリゥム処理により増加しており、 ダイヤモンド表面が水酸基により化学修飾 されていることが確認された。 また、 塩素基が減少していることから水酸基によ り置換されたことが確認された。
(実施例 3 )
実施例 1で得られた気相合成ダイヤモンドを表面研磨し、 レーザーにより 1 0 m m角の試料を切り出し、 マイクロ波により励起した酸素プラズマで表面を酸化 した後、 実施例 2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。 雰囲気をァルゴ ンガスで置換した後試料を取り出し、 1 0重量％の水酸化ナトリゥム水溶液中で 1 5分間煮沸し、 さらに水洗した後乾燥し、 末端に水酸基を有するダイヤモンド を得た。 また、 S I M Sにより、 表面研磨後、 酸素プラズマ処理後、 塩素化後、 および水酸化ナトリゥム処理後の水素、 水酸基、 塩素基のピーク強度を測定した ところ、 水素のピーク強度を 1とした場合の、 水酸基、 塩素基のピーク強度比は、 表 3に示す値となった。
Figure imgf000010_0001
上記表 3に示すように、 水酸基のピーク強度比は、 酸素プラズマ処理、 それに 続く塩素化、 さらにそれに続く水酸化ナトリウム処理により増加しており、 ダイ ャモンド表面が水酸基により化学修飾されていることが確認された。 また、 塩素 基が減少していることから水酸基により置換されたことが確認された。
(実施例 4 )
実施例 1で得られた気相合成ダイヤモンドを表面研磨し、 レーザーにより 1 0 m m角の試料を切り出し、 セパラブルフラスコ中に配置し、 フラスコ中の雰囲気 をアルゴンガスで置換した後、 塩素ガスを 1 S C C Mの流量で流入させながら H g— X eランプを用い、 主波長が 3 6 0 0オングストロームの紫外線を 6 0分間 照射してダイヤモンド表面を塩素化した。 再びフラスコ中の雰囲気をアルゴンガ スで置換した後、 1重量0 /oのセバシン酸ソーダの N， N—ジメチルホルムアミ ド 溶液 1 0 0 m l を添加し、 セパラブルフラスコにコンデンサを設置し、 2時間還 流した。 次いで試料を取り出し、 1重量％の酢酸水溶液で洗浄し、 さらにァセト ンで洗浄した後乾燥し、 セバシン酸がエステル結合を介して結合した、 末端に力 ルボキシル基を有するダイヤモンドを得た。 また、 S I M Sにより、 表面研磨後、 塩素化後、 およびセバシン酸ソーダ処理後の水素、 水酸基、 塩素基のピーク強度
5 を測定したところ、 水素のピーク強度を 1とした場合の、 水酸基、 塩素基のピー ク強度比は、 表 4に示す値となった。
[ P
Figure imgf000011_0001
表 4に示すように、 水酸基のピーク強度比は、 塩素化、 さらにそれに続くセバ シン酸ソーダ処理により増加していること、 また F T I R法を用いてで試料表面 の炭素一水素の伸縮振動に由来する吸収強度、 および炭素一酸素の伸縮振動に由 来する吸収強度を測定したところ、 いずれの吸収強度も増大していた （ダイヤモ ンドブランクに対する吸収強度の増大率は約 3 0 %であった） 。
このことから、 ダイヤモンド表面がセバシン酸の炭化水素基の末端にカルボキシ ル基が結合した基により化学修飾されていることが確認された。
o また、 塩素基が減少していることから水酸基により置換されたことが確認され た。
(実施例 5 )
実施例 1で得られた気相合成ダイヤモンドを表面研磨し、 レーザ一により 1 0 mm角の試料を切り出し、 マイクロ波により励起した酸素プラズマで表面を酸化 - した後、 実施例 2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。 雰囲気をァルゴ ンガスで置換した後試料を取り出し、 1 0重量％の水酸化力リゥム水溶液中で 1 5分間煮沸してダイヤモンド表面をヒ ドロキシル基で置換した。 乾燥した後、 上 部に塩化カルシウム乾燥管を備えたコンデンサを設置したセパラブルフラスコ中 に試料を配置し、 クロ口ホルム 5 0 m 1 と トリエチルァミン 1 gを添加し、 フラ スコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した。 次いで、 セパラブルフラスコを氷冷
5" しながら、 クロ口ホルム 5 O m 1に塩化スクシ二ル 1 O gを溶解させた溶液を徐 々に添加した。 その後 4時間還流した後試料を取り出し、 1 0重量％の炭酸カリ ゥム水溶液で洗浄し、 さらにアセ トンで洗浄した後乾燥し、 マロン酸がエステル 結合を介して結合した、 末端にカルボキシル基を有するダイヤモンドを得た。 ま た、 S I M Sにより、 表面研磨後、 酸素プラズマ処理後、 塩素化後、 ヒ ドロキシ ル化後、 および塩化スクシニル処理後の水素、 水酸基のピーク強度を測定したと ころ、 水素のピーク強度を 1 とした場合の水酸基のピーク強度比は、 表 5に示す 直となった。
l b
Figure imgf000012_0001
0 表 5に示すように、 水酸基のピーク強度比は、 酸素プラズマ処理、 それに続く 塩素化、 さらにそれに続くヒ ドロキル化、 さらにそれに続く塩化スクシニル処理 により増加していること、 また F T I R法を用いて試料表面の炭素一水素の伸縮 振動に由来する吸収強度、 および炭素 酸素の伸縮振動に由来する吸収強度を測 定したところ、 いずれの吸収強度も増大していた （ダイヤモンドブランクに対す f る吸収強度の増大率は約 2 5 %であった） 。
このことから、 ダイャモンド表面がマ口ン酸の炭化水素基の末端にカルボキシ ル基が結合した基により化学修飾されていることが確認された。
(実施例 6)
実施例 1で得られた気相合成ダイヤモンドを、 レーザーにより 1 Omm角の試 料を切り出し、 マイクロ波により励起した水素プラズマで表面を処理した後、 実 施例 2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。
試料が配置されたセパラブルフラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、 アンモニアガスを 1 S C CMの流量で流入させながら H g— X eランプを用い、 主波長が 3600オングストロームの紫外線を 60分間照射してダイヤモンド表 面をァミノ化した。 雰囲気をアルゴンガスで置換した後、 セパラブルフラスコ上 部に塩化カルシウム乾燥管をそなえたコンデンサを設置し、 クロロホルム 50m 1を添加し、 再び雰囲気をアルゴンガスで置換した。
次いで、 セパラブルフラスコを氷冷しながら、 クロ口ホルム 5 Om 1に塩化ス クシニル 1 0 gを溶解させた溶液を徐々に添加した。 その後 4時間還流した後試 料を取り出し、 1 0重量％の炭酸カリウム水溶液で洗浄し、 さらにアセ トンで洗 浄した後乾燥し、 マロン酸がペプチド結合を介して結合した、 末端にカルボキシ ル基を有するダイヤモンドを得た。 また、 S I MSにより、 各種処理前、 塩素化 後、 アミノ化後、 および塩化スクシ二ル処理後の水素、 水酸基、 塩素基のピーク 強度を測定したところ、 水素のピーク強度を 1 とした場合の水酸基、 塩素基のピ ーク強度比は、 表 6に示す値となった。
ピーク強度比
ェ 程 水酸基
水素 ラス"マ処理後 0.06
塩 素 化 後 0. 2 1 0.47
ア ミ ノ ィ匕 後 0. 1 8 0. 1 0
塩化スクシ；:ル処理後 0. 58 0. 1 0 表 6に示すように、 水酸基のピーク強度比は、 水素プラズマ処理、 それに続く 塩素化、 さらにそれに続く ヒ ドロキル化、 さらにそれに続く塩化スクシニル処理 により増加していること、 また FT I R法を用いて試料表面の炭素一水素の伸縮 振動に由来する吸収強度、 および炭素一酸素の伸縮振動に由来する吸収強度を測 5 定したところ、 いずれの吸収強度も増大していた （ダイヤモンドブランクに対す る吸収強度の増大率は約 25%であった） 。 このことから、 ダイヤモンド表面が マロン酸の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基により化学修飾され ていることが確認された。
実施例 1〜6のようにして得られた末端にカルボキシル基を有する化学修飾さ !0 れだダイヤモンドチップを用いて DNAの増幅反応を実施したところ、 約 1時間 で目的とする量の DN Aを得ることができた。
さらに本発明の化学修飾されたダイヤモンドチップを用い、 末端水酸基または 末端カルボキシル基に、 水素結合でオリゴ核酸の末端塩基を固定化し、 さらに、 このオリゴ核酸と相補的塩基配列を有する DNAを固定して、 DNAライブラリ 15 チップとして用いることもできる。 また、 DNAのかわりに、 ヌクレオチド、 ォ リゴヌクレオチド、 DNAフラグメント等を、 ダイヤモンド表面に固定化して、 ライブラリーとすることもできる。
(実施例 7)
高周波プラズマ CVD法を用いて、 直径が 64mm、 厚さが 0. 1 mmの表面 0 粗さが R aで 0. 1 mmの炭化チタンの円板を気相合成した。 この円板からレー ザ一により 3 X 5mm角の試料を切り出し、 熱伝導率を測定した結果、 0. 44 W/c m · Kの値が得られた。
実施例 7においては、 高周波により励起した酸素プラズマで試料表面を酸化し た後、 セパラブルフラスコ中に配置し、 フラスコ中の雰囲気を水蒸気で置換した ^ 後、 水蒸気を流入させながら 400°Cに加熱し 30分間保持した後放冷した。 次 いで試料を取り出し乾燥し、 末端に水酸基を有する基体を得た。 さらにこの基体 表面をシラン力ップリング溶液中にディップして基体表面にシラン力ップリング 剤を被覆した基体を得た。 この基体を加熱冷却手段であるベルチュ素子に直接接 触させて基体の温度制御ができるようにして、 以下の P C R法を行った。
(DNAの固定化）
5 まず、 基体表面に、 mRNA (messenger RNA:メッセンジャー RN A) の場合は オリゴ— d TI B— 。 を固定化した。 一方 g DNA (genomic DNA:染色体 DNA) の場合は目的の制限酵素部位を持ったオリゴヌクレオチドを、 化学的なエステル 結合反応によって固定化した。 次に、 c DNA (complementary DNA) 固定化の場 合は、 組織 ·細胞から抽出した全 RN A溶液を加えて 0〜4°Cの低温で mRNA iC を固定化ォリゴー d T — にハイブリダィズさせた後に、 基体温度を 3 7〜6 0°Cに温度制御して、 逆転写酵素 （Reverse Transcriptase： RT) によって c DN A合成を行った。 このときの c DNAは、 固定化ォリゴー d T , > の 5 ' へ向 けての延長反応させ固定化したものを用いた。
合成された固定化 c DN Aと mRNAとのハイブリダィズ状態にある溶液を 9 0°Cに昇温させて mRNAを脱ハイブリダィズした後、 反応溶液を T r i s— E DTA(TE)緩衝液に交換し、 再度 0〜4°Cの低温にしてエタノール洗浄し、 一 本鎖 D N Aの状態の精製された固定化 c D N Aチップを作製した。
g DNA固定化の場合は、 まず、 目的の制限酵素部位を持った固定側オリゴヌ クレオチドを上記のオリゴー d T! B ， の場合と同様に本発明の基体表面に固定 ^ 化した。 次に、 その化学的な固定化のための反応溶液を 0〜4°Cの低温でハイブ リ側オリゴヌクレオチドと目的の制限酵素を含む反応溶液に交換した。 そして、 ォリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーシヨン後、 3 7 °Cにまで昇温して半固 定化されたオリゴヌクレオチドの制限酵素切断を行った。
制限酵素切断後に、 基体温度を 0〜4°Cの低温にして、 目的の制限酵素で断片
^5 化した g DN Aとライゲーシヨン酵素 （Ligase) を含む反応溶液に交換し、 再び 基体温度を 3 7°Cにまで上昇させてライゲーシヨン反応を行い、 一本鎖 DNAの 状態の g D N A固定化チップを作製した。
なお、 基体表面上に上記作製された c DN A固定化チップ或いは上記作製され た g DN A固定化チップを、
①多検体での同種の組織 ·細胞の遺伝子変異の比較、
5 ②同一検体での各組織 ·細胞の遺伝子発現変動の比較、
③同一検体での治療 ·手術等に伴う余後経過に対応する遺伝子発現変動の比較、 等を目的として、 それぞれを別の容器内に設置することもできる。
たとえば①の場合は、 同種の組織 ·細胞の遺伝子変異の比較をするために、 多 検体 （複数の DN A固定化チップ） を、 別の容器中に設置し、 これらの複数の容 (C 器を連結した 1カセットとする。 そしてこれらのカセットを反応器本体に埋設す る。 さらにこれらのカセットを 2カセット以上を系統的に作れば、 効率的に多検 体の比較を行うことができる。
上記、 複数の容器を連結した 1カセッ トあるいは複数のカセッカセットを集合 体にして、 これらのそれぞれの容器内に DN A固定化チップを設置したものを、 l" カセッ ト型 DNAライブラリーとすることができる。
これらのカセット型 DNAライブラリ一を用いて、 前記①〜②の比較を系統的に 行うことによって、 遺伝子の変動を効率的に調査することもできる。
そして、 本発明の DNA固定化チップを、 TE緩衝液及び 70〜 75%のエタ ノール水溶液で十分に洗浄後、 1 00 %ェタノールに浸潤して冷凍保存すれば、 z 比較データ等の要求に応じて半永久的に利用可能である。
( D N A固定化チップを用いての遺伝子增幅）
上記の c DNA固定化チップの複数枚を用いて反応容器を構成し、 加熱，冷却 手段に調節接触させた。 この反応容器内面を TE緩衝液で十分に洗浄後、 増幅目 的の DNAに対するプライマ一をセットし、 4種のヌクレオチド及び DN Aポリ メラーゼを含む P C R反応溶液を加えた。 その後、 反応容器を、 二本鎖の DNA を一本鎖 DNAに分離させる熱変性温度 （95°C) に瞬時に昇温した。 そして 9 5°Cで約 1. 5分間保持した、 次に、 一本鎖 DNAと DNAプライマとを結合さ せるアニーリング温度である 45 °Cに瞬時に降温した。 そして 45°じに約 1分間 保持した。 次に、 耐熱性 DN Aポリメラーゼにより DN A鎖の伸長反応を行わせ る DN A増幅温度である 74 °Cに昇温した。 そしてその温度で約 2分間保持した。 5 上記温度サイクルを 30回繰り返し PC Rを行った。 PCRに要した時間は昇温、 降温の時間を全く必要としなかったので、 保持時間の和である約 1 35分であつ た。
(実施例 8)
実施例 1で得られた気相合成ダイヤモンドをレーザにより 1 Omm角の試料に \ϋ 切り出し、 マイクロ波プラズマにより励起した水素プラズマで表面を処理した後、 実施例 2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。 雰囲気をアルゴンガスで 置換した後試料を取り出し、 1 0重量。 /0の水酸化力リゥム水溶液中で 1 5分間煮 沸してダイヤモンド表面をヒ ドロキシル化した。 一方 1 00 c cの 95%ェタノ 一ルー 5 %水溶液を酢酸で Ρ Η 5に調整し、 2 c cの 3—グリシドキシプロピル 5 トリメ トキシシランを撹拌しつつ添加した。 この溶液にヒ ドロキシルダイヤモン ドを浸して取り出し、 エタノールで軽く洗浄した後、 1 1 0°Cで 5分間処理する ことによりダイヤモンド表面にエポキシ基を導入した。
(実施例 9 )
エポキシ基に対して、 5 '末端アミノ化オリゴ核酸 （プライマー） を固定化し· て、 mRN Aをァニールした後逆転写酵素で c DN Aレプリカ作製すると同時に チップに固定化した。
(実施例 1 0)
実施例 1で得られた気相合成ダイヤモンドをレーザにより 1 0mm角の試料 に切り出し、 マイクロ波プラズマにより励起した水素プラズマで表面処理した後、 実施例 2と同様にしてダイヤモンド表面を塩素化した。 雰囲気をアルゴンガスで 置換した後試料を取り出し、 1 0重量％の水酸化カリゥム水溶液中で 1 5分煮沸 してダイヤモンド表面をヒ ドロキシノレ化した。 一方 1 00 c cの 95%エタノー ノレ一 5 %水溶液に 2 c cの 3—アミノブ口ピルトリメ トキシシランを撹拌しつつ 添加した。 その溶液にヒ ドロキシル化ダイヤモンドを浸して取り出し、 エタノー ルで軽く洗浄した後、 1 1 0°Cで 5分間処理することによりダイヤモンド表面に アミノ基を導入した。
(実施例 1 1 )
実施例 1 0で得られたアミノ基導入ダイヤモンド表面に 5 '末端にカルボキ シル基を修飾したオリゴ核酸をペプチド結合で固定化した後、 mRNAを铸型と して逆転写酵素により c DNAをダイヤモンドに固定化した。
iP (実施例 1 2 )
アークイオンプレーティング法を用いて、 直径が 64mm、 厚さが 0. 1 mm の表面粗さが R aで 0. 3 mmの窒化アルミニウム円板を気相合成した。 この円 板をレーザーにより 3 X 5 mm角の試料を切り出し、 熱伝導率を測定した結果、 1. 7 OW/c m · Kの値が得られた。 この試料をセパラブルフラスコ中に配置
I？ し、 フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、 塩素ガスを 1 S CCMの 流量で流入させながら H g— X eランプを用い、 主波長が 3600オングスト口 ームの紫外線を 60分間照射して試料表面を塩素化した。 雰囲気をアルゴンガス で置換した後試料を取り出し、 1 0重量％の水酸化ナトリウム水溶液中で 1 5分 間煮沸し、 さらに水洗した後乾燥し、 末端に水酸基を有する基体を得た。 その後、
IV この基体を用いて、 実施例 1 と同様にして、 DNAの固定化及び PCR法を利用 した増幅を行った。
(実施例 1 3)
粉末焼結法を用いて、 直径が 64mm、 厚さが 0. 3 mmの表面粗さが平均表 面粗さ R aで 0. 5 mmのタングステン円板を得た u この円板からレーザーによ り 3 X 5mm角の試料を切り出し、 熱伝導率を測定した結果、 1. 6 7 WZ c m • Kの値が得られた。 そして、 マイクロ波により励起した酸素プラズマで表面を 酸化した後、 試料表面を塩素化した。 雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を 取り出し、 1 0重量％の水酸化ナトリゥム水溶液中で 1 5分間煮沸し、 さらに水 洗した後乾燥し、 末端に水酸基を有する基体を得た。 その後、 この基体を用いて、 実施例 1 と同様にして、 DN Aの固定化及び P CR法を利用した増幅を行った。 5 (実施例 1 4 )
粉末焼結法によりアルミナ円板を形成し、 この円板をレーザーにより 3 X 5m m角の試料を切り出し、 熱伝導率を測定した結果、 0. 3WZc m * Kの値が得 られた。 そして、 セパラブルフラスコ中に配置し、 フラスコ中の雰囲気をァルゴ ンガスで置換した後、 塩素ガスを 1 S CCMの流量で流入させながら H g— X e ιο ランプを用い、 主波長が 3600オングス トロームの紫外線を 60分間照射して 試料表面を塩素化した。 再びフラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、 1重量0 /0のセバシン酸ソーダの N， N—ジメチルホルムアミ ド溶液 1 00m lを 添加し、 セパラブルフラスコにコンデンサを設置し、 2時間還流した。 次いで試 料を取り出し、 1重量％の酢酸水溶液で洗浄し、 さらにアセ トンで洗浄した後乾
I 燥し、 セバシン酸がエステル結合を介して結合した、 末端にカルボキシル基を有 する基体を得た。 その後、 この基体を用いて、 実施例 1 と同様にして、 DNAの 固定化及び P C R法を利用した増幅を行った。
なお、 本発明の基体や DN Aチップは、 上記のようにサーミスタ等の加熱 .冷 却手段に直接接触させて用いる他に、 従来の P C R法での DNA増幅法のように エツペン型チューブ内の反応液中に投入して用いることもできる。 この場合には、 前述の実施例に記載したようにきわめて短時間で P C R増幅法を終了させること はできないが、 従来行われていた反応液中に DN Aを投入する方法よりも迅速に 終了させることができる。 一 産業上の利用可能性
本発明においては、 熱伝導率に優れた基体を用いたことにより、 PCR法を用 いた D N A増幅反応をきわめて短時間に終えることができる。
また、 基体に直接加熱 ·冷却手段を接触させて基体を加熱，冷却することによ つて、 前記 PC R反応の温度制御も精度よく行えるために、 増幅目的以外の DN Aはほとんど複製されないという利点がある。
また、 本発明の基体は、 熱伝導性に優れた固体状基体に DN Aを直接固定化し ているので、 基体の温度を直接加熱 '冷却させることによって、 PCR法等によ るヒートサイクルの追随性を向上させることができ、 目的とする量の DNAを短 時間で得ることができる。
また、 本発明の基体は、 表面を水酸基、 カルボキシル基、 エポキシ基、 ァミノ 基等で化学修飾してあるので、 DN A等の固定化の安定化を図れ、 PCR法など を用いて DNA増幅反応により DNAを複製するためのチップなどに最適である c また、 本発明の基体は、 表面が汚染された場合に、 加水分解させて化学修飾を 再生させることができ、 高価な D N Aチップを節約できる。

Claims

5 求 の
1. DNAを固定化して増幅するための熱伝導性に優れた DNA固定用固体状 基体。
2. 前記基体がダイヤモンドである請求項 1の基体。
3. 前記基体が化学修飾されたものである請求項 1又は 2の基体。
4. 末端に極性基を有する化学修飾された請求項 1 3のいずれかに記載の基 体。
5. 前記極性基が水酸基、 カルボキシル基、 エポキシ基、 アミノ基である請求0 項 4記載の基体。
6. 前記カルボキシル基が、 エステル結合を介して基体表面に結合している請 求項 5記載の基体。
7. 前 基力; プチド結合を介して基体表面に結合している請 求項 5記載の基体 c
8. 前 基力 シランカップリング剤、 チタンカップリング剤又 はアルミカツプリング剤により基体表面に導入される請求項 5記載の基体：
9. 前記エポキシ基が、 シランカップリング剤、 チタンカップリング剤又はァ ルミカツプリング剤により基体表面に導入される請求項 5記載の基体。
1 0. 前記アミノ基が、 シランカップリング剤、 チタンカップリング剤又はアル ミカツプリング剤により基体表面に導入される請求項 5記載の基体。
1 1. 請求項 1 1 0のいずれかに記載の基体に DNAを固定化した DNA固定 化チップ。
1 2. 請求項 1 1 0記載の基体又は請求項 1 1記載のチップを用いて DN Aを 増幅する方法。
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