KR20010040747A - 디엔에이를 고정화해서 증폭하기 위한 기질, 그 기질에디엔에이를 고정화한 디엔에이고정화칩 및 디엔에이를증폭하는 방법 - Google Patents

디엔에이를 고정화해서 증폭하기 위한 기질, 그 기질에디엔에이를 고정화한 디엔에이고정화칩 및 디엔에이를증폭하는 방법 Download PDF

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다나베 히로까즈
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Abstract

본 발명은 DNA 등을 고정해서 DNA 등을 라이브러리로서 이용하기 위한 기질의 제공, 또한, PCR증폭반응에 의해 DNA 등을 복제하기 위해 사용하기에 최적인 기질 및 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이것을 위해 본 발명에서는, 전도성이 우수한 DNA고정화용 고체상 기질을 이용해서 PCR증폭법을 행한다. 이 기질의 표면은 말단에 극성기를 갖는 화학적으로 변형된 것이다. 또, 이들 기질에 DNA를 고정화한 DNA고정화칩을 이용하면 PCR법에 있어서 DNA를 단시간에 증폭할 수 있는 특징을 갖는다.

Description

디엔에이를 고정화해서 증폭하기 위한 기질, 그 기질에 디엔에이를 고정화한 디엔에이고정화 칩 및 디엔에이를 증폭하는 방법{SUBSTRATES FOR IMMOBILIZING AND AMPLIFYING DNA, DNA-IMMOBILIZED CHIPS HAVING DNA IMMOBILIZED ON THE SUBSTRATES, AND METHOD FOR AMPLIFYING DNA}
종래, DNA의 증폭반응 등에 있어서는, 목적으로 하는 DNA를 특정량 얻기 위해,
1)두 개의 사슬 DNA의 수소결합을 풀기 위해 시료의 온도를 95℃로 상승시키고,
2)계속해서 DNA를 복제하기 위한 프라이머와 재결합시키기 위해 시료의 온도를 45℃로 하강시키고,
3)또한 내열성 폴리머라아제에 의해 프라이머를 신장시켜 DNA를 복제시키기 위해 시료의 온도를 74℃로 상승시키는 1)∼3)의 히트사이클(heat cylce)을 몇 번이나 반복할 필요가 있었다.
이러한, 소위 PCR법을 이용한 DNA의 증폭반응에서는, 시료를 반응용액과 함께 튜브형상 플라스틱반응용기 등에 넣고, 이 용기를 알루미늄블록에 수용하여 상기 히트사이클을 행했다.
그러나, 상기 증폭반응은 DNA를 반응용액과 함께 가열, 냉각하기 때문에, 목적으로 하는 양의 DNA를 얻기 위해서는 긴 시간을 필요로 했다. 또, 반응용액의 온도제어의 정밀도가 낮기 때문에, 목적으로 하는 것이외의 DNA도 복제되는 문제점도 있었다.
본 발명은 이러한 문제점을 감안하여, DNA 등을 용이하게 고정화할 수 있고, DNA증폭반응에 의해 DNA를 복제하기 위한 최적의 고체상의 기질, 그 기질에 DNA 등을 고정화한 칩, 및 DNA를 증폭하는 방법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
본 발명은 분자생물학분야나 생화학관련분야에서 이용되는 DNA 등을 고정화하기 위한 기질에 관한 것으로, 보다 바람직하게는, 열전도성이 우수한 기질에 관한 것이고, 더욱 바람직하게는 말단에 수산기, 카르복실기, 에폭시기, 아미노기 등을 갖는 화학적으로 변형된 기질 및 그 기질에 DNA 등을 고정화한 칩에 관한 것이다.
본 발명의 기질은, DNA를 고정화해서 증폭하기 위한 열전도성이 우수한 것을 특징으로 한다. 이들 기질은 다이아몬드인 것이 바람직하고, 화학적으로 변형된 것이 바람직하다.
이들 기질은 말단에 극성기, 수산기, 카르복실기, 에폭시기, 또는 아미노기를 갖는 화학적으로 변형된 것인 것이 바람직하다.
그리고, 상기 카르복실기가 에스테르결합이나 펩티드결합을 통해 기질표면에 결합하고 있는 것, 또는 실란커플링제에 의해 기질표면에 도입된 것이 바람직하고, 또 상기 에폭시기, 또는 아미노기가 실란커플링제에 의해 기질표면에 도입되는 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA고정화 칩은 이들 기질에 DNA를 고정화한 것인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 DNA를 증폭하는 방법은 이들 기질 또는 칩을 이용해서 DNA를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 기질은 DNA를 고정화해서 증폭하기 위해 이용되는 고체상의 기질로서, 열전도성이 우수한 것이 바람직하다. 예를 들면, 다이아몬드는 모든 물질중에서도 가장 뛰어난 열전도율을 갖고 있어 급속하게 가열냉각시킬 수 있으므로, 본 발명의 기질로 이용하면, DNA증폭반응과 같이 가열냉각을 반복하는 히트사이클시간을 매우 단축시킬 수 있다.
또, 본 발명의 기질은 표면이 수산기, 카르복실기, 에폭시기, 아미노기 등으로 화학적으로 변형되어 있으므로, DNA 등의 고정화를 용이하게 행할 수 있고, DNA증폭반응에 의해 DNA를 복제하기 위한 칩 등에 가장 적합하다.
또, 본 발명의 칩은 표면이 오염된 경우에, 가수분해시켜 화학적 변형을 재생시킬 수 있다.
본 발명에 이용하는 기질, 예를 들면, 고체상의 기질은 열전도율이 0.1W/cm·K이상인 것이 바람직하다.
더 바람직하게는 열전도율이 0.5W/cm·K이상인 것이 바람직하다.
더욱 더 바람직하게는 열전도율이 1W/cm·K이상인 것이 바람직하다.
기질의 열전도율이 0.1W/cm·K이상이면, DNA를 본 발명의 기질에 고정화시켜, PCR(폴리머라아제 체인 리액션)반응을 행할 경우 등에 있어서, 가열, 냉각의 추수성(追隨性)이 우수하기 때문이다.
열전도성이 좋은 것의 예로서는, 다이아몬드, 은, 동, 알루미늄, 텅스텐, 몰리브덴 등의 금속 등을 들 수 있다. 또, 알루미나, 질화알루미늄, 탄화티타늄, 탄화규소, 실리콘 등의 세라믹을 들 수 있다.
또, 상기 금속과 세라믹과의 혼합체도 적용할 수 있다. 또, 폴리카보네이트나 불소수지 등의 플라스틱 등도 적용할 수 있다. 또, 화학적으로 안정된 것이면, 상기 금속, 세라믹, 플라스틱에 한정되지 않는다. 예를 들면, 다이아몬드나 다이아몬드류 등도 적용할 수 있다. 또, 플라스틱과 상기 금속, 세라믹, 다이아몬드 등과의 혼합체이어도 좋다.
다이아몬드기질의 소재로서는, 합성다이아몬드, 고압합성다이아몬드, 또는 천연 다이아몬드 등을 이용할 수 있다. 또, 이들은 단결정체 또는 다결정체 중 어느 구조를 가지고 있어도 지장없다. 생산성의 관점에서, 마이크로파 플라즈마 CVD법 등의 기상합성법을 이용해서 제조된 다이아몬드를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 기질의 형성방법은 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 마이크로파 플라즈마CVD법, ECRCVD법, 고주파플라즈마CVD법, IPC법, 직류스퍼터링법, ECR스퍼터링법, 이온플레이팅법, 아크이온플레이팅법, EB증착법, 저항가열증착법 등을 들 수 있다. 또, 금속분말이나 세라믹분말 등에 수지를 바인더로서 혼합해서 결합형성한 것을 들 수 있다. 또, 금속분말이나 세라믹분말 등의 원료를 프레스성형기를 이용해서 압분한 것을 고온에서 소결한 것도 들 수 있다.
본 발명의 기질표면은, 의도적으로 조면화되어 있는 것도 바람직하다. 이러한 조면화된 표면은 기질의 표면적을 넓히고, 다량의 DNA 등을 고정화시키는 것이 적합하기 때문이다. 기질의 형상은, 평판상, 실형상, 구형상, 다각형상, 분말상 등 특별히 따지지 않는다. 또한 이들 기질과 다른 물질과의 복합체(예를 들면 2층체)이어도 좋다.
본 발명의 기질은 기질표면이 화학적으로 변형된 것이고, 화학수식의 말단에 극성기, 수산기 또는 카르복실기를 갖는 것이 바람직하다. 즉, 상기 기질의 표면에 특정의 기를 부가(화학수식)시킨다. 이 화학수식에 의해, DNA가 기질의 표면에 고정화되기 쉬워진다. 기질표면에 부가(화학수식)되고, 말단에 극성기를 갖는 특정의 기로서는, 수산기, 카르복실기, 황산기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 에폭시기 등의 기를 들 수 있다. 또, 이 밖에, 유기카르본산도 포함된다. 상기 기 중, 카르복실기는 다이아몬드 등의 기질에 직접 부가시켜도 좋지만, 기질과의 사이에 다른 탄화수소기를 통해, 말단에 카르복실기를 갖는 것으로 해도 좋다.
이 경우의 탄화수소기는 탄소수1∼10의 것이, DNA의 고정화에 있어서 바람직하다. 탄화수소기가 될 수 있는 산은 개미산, 초산, 프로피온산 등의 모노카르본산이나, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레인산, 푸마르산, 프탈산 등의 디카르본산이나, 트리멜리트산 등의 다가카르본산 등을 들 수 있다.
PCR법 등을 이용해서, DNA의 증폭반응에 본 발명의 기질을 적용할 경우, 내가수분해성이 필요로 될 경우와, 가수분해시켜 화학수식을 재생시킬 필요가 있는 경우의 2가지의 적용케이스가 있다.
내가수분해성이 필요로 되는 경우에는, 내알칼리성을 부여하기 위해, 상기 탄화수소기의 말단에 카르복실기가 결합한 기를 펩티드결합을 통해 기질표면에 결합시키는 것이 바람직하다.
한편, 생성한 화학수식을 가수분해시켜 제거하여 재생시킬 필요가 있는 경우에는, 알칼리용액으로 가수분해가능하게 하기 위해, 상기 탄화수소기의 말단에 카르복실기가 결합한 기를 에스테르결합을 통해 기질표면에 결합시키는 것이 바람직하다.
탄화수소기의 말단에 수산기를 기질표면에 결합시키는 방법으로서는, 기질표면을 산소플라즈마로 산화하고, 계속해서 수증기처리하는 방법, 또 염소가스속에서 자외선조사해서 기질표면을 염소화한 후 알칼리용액속에서 가수분해해서 히드록실화하는 방법, 또한 기질표면을 산소플라즈마로 산화하고, 계속해서 염소화한 후 알칼리용액속에서 가수분해해서 히드록실화하는 방법을 들 수 있다.
또, 기질표면에 수산기가 결합되어 있는 경우에는, 실란커플링제, 티타늄커플링제, 알루미늄커플링제 등을 그 위에 처리하면, 카르복실기 등과의 화학수식이 보다 강고한 것으로 된다.
또, 탄화수소기의 말단에 카르복실기가 결합한 기를 펩티드결합을 통해 기질표면에 결합시키는 방법으로서는, 염소가스속에서 자외선조사해서 기질표면을 염소화하고, 계속해서 암모니아가스속에서 자외선조사해서 아미노화한 후, 비수용매속에서 카르본산 염소와 반응시키고, 계속해서 약알칼리용액속에서 중화시키는 방법을 들 수 있다.
또, 탄화수소기의 말단에 카르복실기가 결합한 기를 에스테르결합을 통해 기질표면에 결합시키는 방법으로서는, 염소가스속에서 자외선조사해서 기질표면을 염소화하고, 계속해서 비수용매속에서 카르본산소다와 반응시키고, 계속해서 약산용액속에서 중화시키는 방법, 또는, 기질표면을 산소플라즈마로 산화하고, 계속해서 염소화한 후 알칼리용액속에서 가수분해해서 히드록실화한 후, 비수용매속에서 카르본산염소와 반응시키고, 계속해서 약알칼리용액속에서 중화시키는 방법을 들 수 있다. 이하, 실시예로 본 발명을 상세하게 설명한다.
(실시예1)
마이크로파 플라즈마CVD법을 이용해서, 직경이 64mm 두께가 0.3mm의 다이아몬드를 기상합성한 후, 전체가 균일한 0.25mm의 두께가 되도록 표면을 연마했다. 이렇게 해서 연마한 표면의 10mm×10mm의 면적에 있어서, FTIR법(푸리에변환 적외선 분광분석법)에 의해 탄소-수소의 신축의 진동에서 유래하는 2879cm-1의 흡수강도를 측정한 결과, 거의 일정한 값이 얻어졌다. 이 다이아몬드에서 레이저에 의해 10mm각의 시료를 잘라내어, 이하의 실시예1∼실시예6의 시료로서 이용했다. 실시예1에 있어서는, 마이크로파에 의해 여기한 산소플라즈마로 다이아몬드표면을 산화한 후, 분리가능 플라스크속에 배치하고, 플라스크속의 분위기를 수증기로 치환한 후, 수증기를 유입시키면서 400℃로 가열하여 30분간 유지한 후 냉각했다.
계속해서 시료를 꺼내 건조하고, 말단에 수산기를 갖는 다이아몬드를 얻었다. 또, SIMS법(2차이온질량분석법)에 의해, 표면연마하고, 산소플라즈마처리, 및 수증기처리후의 수소, 수산기의 피크강도를 측정한 결과, 수소의 피크강도를 1로 한 경우의 수산기의 피크강도비는 하기의 표 1에 나타낸 값으로 되었다.
표 1
공정 수산기의 피크강도비
표면연마후 0.14
산소플라즈마처리후 0.70
수증기처리후 1.14
표 1에 나타내듯이, 수산기의 피크강도비는 산소플라즈마처리와, 그것에 계속되는 수증기처리에 의해 증가하고 있고, 다이아몬드표면이 수산기에 의해 화학수식되어 있는 것이 확인되었다.
(실시예2)
실시예1에서 얻어진 기상합성다이아몬드를 표면연마하고, 레이저에 의해 10mm×10mm의 시료를 잘라냈다. 이 시료를 분리가능 플라스크속에 배치하고, 플라스크속의 분위기를 아르곤가스로 치환한 후, 염소가스를 1 SCCM의 유량으로 유입시키면서 Hg-Xe램프를 이용하여, 주파장이 3600Å의 자외선을 60분간 조사해서 다이아몬드표면을 염소화했다. 분위기를 아르곤가스로 치환한 후 시료를 꺼내고, 10중량%의 수산화나트륨수용액 속에서 15분간 끓이고, 다시 수세한 후 건조하여, 말단에 수산기를 갖는 다이아몬드를 얻었다. 또, SIMS법에 의해, 표면연마, 염소화, 및 수산화나트륨처리 후의 수소, 수산기 및 염소기의 피크강도를 측정한 결과, 수소의 피크강도를 1로 한 경우의 수산기, 염소기의 피크강도비는 하기의 표 2에 나타낸 값으로 되었다.
표 2
공정 피크강도비
수산기 염소기
표면연마후 0.14 -
염소화후 0.20 0.50
수산화나트륨처리후 0.47 0.35
표 2에 나타내듯이, 수산기의 피크강도비는 염소화처리와 그것에 계속되는 수산화나트륨처리에 의해 증가하고 있고, 다이아몬드표면이 수산기에 의해 화학수식되어 있는 것이 확인되었다. 또, 염소기가 감소하고 있는 것으로부터 수산기에 의해 치환된 것이 확인되었다.
(실시예3)
실시예1에서 얻어진 기상합성다이아몬드를 표면연마하고, 레이저에 의해 10mm×10mm의 시료를 잘라내고, 마이크로파에 의해 여기한 산소플라즈마로 표면을 산화한 후, 실시예2와 마찬가지로 해서 다이아몬드표면을 염소화했다. 분위기를 아르곤가스로 치환한 후 시료를 꺼내고, 10중량%의 수산화나트륨수용액 속에서 15분간 끓이고, 다시 수세한 후 건조하여, 말단에 수산기를 갖는 다이아몬드를 얻었다. 또, SIMS에 의해, 표면연마후, 산소플라즈마처리, 염소화, 및 수산화나트륨처리후의 수소, 수산기, 염소기의 피크강도를 측정한 결과, 수소의 피크강도를 1로 한 경우의 수산기, 염소기의 피크강도비는 표 3에 나타낸 값으로 되었다.
표 3
공정 피크강도비
수산기 염소기
표면연마후 0.14 -
산소플라즈마처리후 0.70 -
염소화후 0.21 0.47
수산화나트륨처리후 0.54 0.33
상기 표 3에 나타내듯이, 수산기의 피크강도비는 산소플라즈마처리와 그것에 계속되는 염소화 및 다시 그것에 계속되는 수산화나트륨처리에 의해 증가하고 있고, 다이아몬드표면이 수산기에 의해 화학수식되어 있는 것이 확인되었다. 또, 염소기가 감소하고 있는 것으로부터 수산기에 의해 치환된 것이 확인되었다.
(실시예4)
실시예1에서 얻어진 기상합성다이아몬드를 표면연마하고, 레이저에 의해 10mm×10mm의 시료를 잘라내고, 분리가능 플라스크속에 배치하고, 플라스크속의 분위기를 아르곤가스로 치환한 후, 염소가스를 1SCCM의 유량으로 유입시키면서 Hg-Xe램프를 이용하여, 주파장이 3600Å의 자외선을 60분간 조사해서 다이아몬드표면을 염소화했다. 다시 플라스크속의 분위기를 아르곤가스로 치환한 후, 1중량%의 세바신산소다의 N,N-디메틸포름아미드용액100ml를 첨가하고, 분리가능 플라스크에 콘덴서를 설치하고, 2시간 환류했다. 계속해서 시료를 꺼내어, 1중량%의 초산수용액으로 세정하고, 다시 아세톤으로 세정한 후 건조하고, 세바신산이 에스테르결합을 통해 결합한 말단에 카르복실기를 갖는 다이아몬드를 얻었다. 또, SIMS법에 의해, 표면연마, 염소화, 및 세바신산소다처리후의 수소, 수산기, 염소기의 피크강도를 측정한 결과, 수소의 피크강도를 1로 한 경우의 수산기, 염소기의 피크강도비는 표 4에 나타낸 값으로 되었다.
표 4
공정 피크강도비
수산기 염소기
표면연마후 0.14 -
염소화후 0.20 0.50
세바신산소다처리후 0.40 0.34
표 4에 나타내듯이, 수산기의 피크강도비는 염소화 및 그것에 계속되는 세바신산 소다처리에 의해 증가하고 있는 것, 또 FTIR법을 이용해서 시료표면의 탄소-수소의 신축진동에서 유래하는 흡수강도, 및 탄소-산소의 신축진동에서 유래하는 흡수강도를 측정한 결과, 어느 것이나 흡수강도도 증대했다(다이아몬드블랭크에 대한 흡수강도의 증대율은 약 30%였다.)
이것으로부터, 다이아몬드표면이 세바신산의 탄화수소기의 말단에 카르복실기가 결합한 기에 의해 화학수식되어 있는 것이 확인되었다.
또, 염소기가 감소하고 있는 것으로부터, 수산기에 의해 치환된 것이 확인되었다.
(실시예5)
실시예1에서 얻어진 기상합성다이아몬드를 표면연마하고, 레이저에 의해 10mm×10mm의 시료를 잘라내고, 마이크로파에 의해 여기한 산소플라즈마로 표면을 산화한 후, 실시예2와 동일하게 해서 다이아몬드표면을 염소화했다. 분위기를 아르곤가스로 치환한 후 시료를 잘라내고, 10중량%의 수산화칼륨수용액속에서 15분간 끓여서 다이아몬드표면을 히드록실기로 치환했다. 건조한 후, 상부에 염화칼슘건조관을 구비한 콘덴서를 설치한 분리가능 플라스크속에 시료를 배치하고, 클로로포름50ml와 트리에틸아민1g을 첨가하고, 플라스크속의 분위기를 아르곤가스로 치환했다. 계속해서, 분리가능 플라스크를 얼음으로 냉각하면서, 클로로포름50ml에 염화숙시닐10g을 용해시킨 용액을 서서히 첨가했다. 그후 4시간 환류한 후 시료를 꺼내고, 10중량%의 탄산칼륨수용액으로 세정하고, 다시 아세톤으로 세정한 후 건조하여, 말론산이 에스테르결합을 통해 결합한, 말단에 카르복실기를 갖는 다이아몬드를 얻었다. 또, SIMS법에 의해, 표면연마, 산소플라즈마처리, 염소화, 히드록실화, 및 염화숙시닐처리후의 수소, 수산기의 피크강도를 측정한 결과, 수소의 피크강도를 1로 한 경우의 수산기의 피크강도비는 표 5에 나타낸 값으로 되었다.
표 5
공정 수산기의 피크강도비
표면연마후 0.14
산소플라즈마처리후 0.70
염소화후 0.21
히드록실화후 0.70
염화숙시닐처리후 0.50
표 5에 나타내듯이, 수산기의 피크강도비는 산소플라즈마처리, 그것에 계속되는 염소화, 다시 그것에 계속되는 히드록실화, 다시 그것에 계속되는 염화숙시닐처리에 의해 증가하고 있는 것, 또 FTIR법을 이용해서 시료표면의 탄소-수소의 신축진동에서 유래하는 흡수강도, 및 탄소-산소의 신축진동에서 유래하는 흡수강도를 측정한 결과, 어느것이나 흡수강도도 증대했다(다이아몬드블랭크에 대한 흡수강도의 증대율은 약 25%였다).
이것으로부터, 다이아몬드표면이 말론산의 탄화수소기의 말단에 카르복실기가 결합한 기에 의해 화학수식되어 있는 것이 확인되었다.
(실시예6)
실시예1에서 얻어진 기상합성다이아몬드를 레이저에 의해 10mm×10mm의 시료를 잘라내고, 마이크로파에 의해 여기한 수소플라즈마로 표면을 처리한 후, 실시예2와 동일하게 해서 다이아몬드표면을 염소화했다.
시료가 배치된 분리가능 플라스크속의 분위기를 아르곤가스로 치환한 후, 암모니아가스를 1SCCM의 유량으로 유입시키면서 Hg-Xe램프를 이용하고, 주파장이 3600Å인 자외선을 60분간 조사해서 다이아몬드표면을 아미노화했다. 분위기를 아르곤가스로 치환한 후, 분리가능 플라스크상부에 염화칼슘건조관을 구비한 콘덴서를 설치하고, 클로로포름50ml를 첨가하고, 다시 분위기를 아르곤가스로 치환했다.
계속해서, 분리가능 플라스크를 얼음으로 냉각하면서, 클로로포름50ml에 염화숙시닐10g을 용해시킨 용액을 서서히 첨가했다. 그후 4시간 환류한 후 시료를 꺼내고, 10중량%의 탄산칼륨수용액으로 세정하고, 다시 아세톤으로 세정한 후 건조하여, 말론산이 펩티드결합을 통해 결합한 말단에 카르복실기를 갖는 다이아몬드를 얻었다. 또, SIMS법에 의해 각종 처리전, 염소화, 아미노화, 및 염화숙시닐처리후의 수소, 수산기, 염소기의 피크강도를 측정한 결과, 수소의 피크강도를 1로 한 경우의 수산기, 염소기의 피크강도비는 표 6에 나타낸 값으로 되었다.
표 6
공정 피크강도비
수산기 염소기
수소플라즈마처리후 0.06 -
염소화후 0.21 0.47
아미노화후 0.18 0.10
염화숙시닐처리후 0.58 0.10
표 6에 나타내듯이, 수산기의 피크강도비는 수소플라즈마처리, 그것에 계속되는 염소화, 다시 그것에 계속되는 히드록실화, 다시 그것에 계속되는 염화숙시닐처리에 의해 증가하고 있는 것, 또 FTIR법을 이용해서 시료표면의 탄소-수소의 신축진동에서 유래하는 흡수강도, 및 탄소-산소의 신축진동에서 유래하는 흡수강도를 측정한 결과, 어느것이나 흡수강도도 증대했다(다이아몬드블랭크에 대한 흡수강도의 증대율은 약 25%였다.)이것으로부터, 다이아몬드표면이 말론산의 탄화수소기의 말단에 카르복실기가 결합한 기에 의해 화학수식되어 있는 것이 확인되었다.
실시예1∼6과 같이 해서 얻어진 말단에 카르복실기를 갖는 화학적으로 변형된 다이아몬드칩을 이용해서 DNA의 증폭반응을 실시한 결과, 약 1시간에 목적으로 하는 양의 DNA를 얻을 수 있었다.
다시 본 발명의 화학적으로 변형된 다이아몬드칩을 이용하여, 말단수산기 또는 말단카르복실기에, 수소결합으로 올리고핵산의 말단염기를 고정화하고, 다시, 이 올리고핵산과 서로 상보적 염기배열을 갖는 DNA를 고정해서, DNA라이브러리칩으로 해서 이용할 수도 있다. 또, DNA대신에, 뉴클레오티드, 올리고누클레오티드, DNA단편 등을 다이아몬드표면에 고정화해서 라이브러리로 할 수도 있다.
(실시예7)
고주파플라즈마CVD법을 이용해서, 직경이 64mm, 두께가 0.1mm이고, 표면거칠기(Ra)가 0.1mm인 탄화티타늄의 원판을 기상합성했다. 이 원판에서 레이저에 의해 3mm×5mm의 시료를 잘라내고, 열전도율을 측정한 결과, 0.44W/cm·K의 값이 얻어졌다.
실시예7에 있어서는, 고주파에 의해 여기한 산소플라즈마로 시료표면을 산화한 후, 분리가능 플라스크속에 배치하고, 플라스크속의 분위기를 수증기로 치환한 후, 수증기를 유입시키면서 400℃로 가열하여 30분간 유지한 후 냉각했다. 계속해서 시료를 꺼내어 건조하여, 말단에 수산기를 갖는 기질을 얻었다. 다시 이 기질표면을 실란커플링용액속에 담가서 기질표면에 실란커플링제를 피복한 기질을 얻었다. 이 기질을 가열냉각수단인 펠티에소자에 직접 접촉시켜 기질의 온도제어를 할 수 있도록 해서, 이하의 PCR법을 행했다.
(DNA의 고정화)
먼저, 기질표면에, mRNA(messenger RNA:메신저RNA)의 경우에는 올리고-dT16-20을 고정화했다. 한편 gDNA(genomec DNA: 염색체DNA)의 경우에는 목적의 제한효소부위를 가진 올리고뉴클레오티드를 화학적인 에스테르결합반응에 의해 고정화했다. 다음에, cDNA(complementary DNA)고정화의 경우에는, 조직·세포로부터 추출한 전체RNA용액을 첨가해서 0∼4℃의 저온에서 mRNA를 고정화올리고--dT16-20에 하이브리다이즈시킨 후에, 기질온도를 37∼60℃로 온도제어해서, 역전사효소(Reverse Transcriptase:RT)에 의해 cDNA합성을 행했다. 이때의 cDNA는 고정화올리고--dT16-20의 5'로 향한 연장반응시켜 고정화한 것을 이용했다.
합성된 고정화cDNA와 mRNA와의 하이브리다이즈상태에 있는 용액을 90℃로 승온시켜 mRAN를 탈하이브리다이즈한 후, 반응용액을 Tris-EDTA(TE)완충액으로 교환하고, 다시 0∼4℃의 저온으로 해서 에탄올세정하고, 단일 사슬 DNA의 상태로 정제된 고정화cDNA칩을 만들었다.
gDNA고정화의 경우에는, 먼저 목적의 제한효소부위를 가진 고정측 올리고뉴클레오티드를 상기 올리고-dT16-20의 경우와 동일하게 해서 본 발명의 기질표면에 고정화했다. 다음에, 그 화학적 고정화를 위한 반응용액을 0∼4℃의 저온에서 하이브리드측 올리고뉴클레오티드와 목적의 제한효소를 포함하는 반응용액으로 교환했다. 그리고, 각각의 올리고뉴클레오티드 사이를 하이브리드결합후, 37℃까지 승온해서 반고정화된 올리고뉴클레오티드의 제한효소절단을 행했다.
제한효소절단후에, 기질온도를 0∼4℃의 저온으로 해서, 목적의 제한효소로 절단한 gDNA와 라이게이션효소(Ligase)를 포함하는 반응용액으로 교환하고, 다시 기질온도를 37℃까지 상승시켜 라이게이션반응을 행하고, 단일 사슬 DNA상태의 gDNA고정화칩을 만들었다.
또, 기질표면상에 상기 만들어진 cDNA고정화칩 또는 상기 만들어진 gDNA고정화칩을,
①다수 검체에서의 동종의 조직·세포의 유전자변이의 비교,
②동일 검체에서의 각 조직·세포의 유전자발현변동의 비교,
③동일 검체에서의 치료·수술 등에 따른 시간경과에 대응하는 유전자발현변동의 비교, 등을 목적으로 해서, 각각을 다른 용기내에 설치할 수도 있다.
예를 들면 ①의 경우는, 동종의 조직·세포의 유전자변이의 비교를 하기 위해, 다수 검체(복수의 DNA고정화칩)을, 다른 용기속에 설치하고, 이들의 복수의 용기를 연결한 1카셋트로 한다. 그리고 이들 카셋트를 반응기본체에 매설한다. 다시 이들 카셋트를 2카셋트이상을 체계적으로 만들면, 효율적으로 다수검체의 비교를 행할 수 있다.
상기, 복수의 용기를 연결한 1카셋트 또는 복수의 카셋트를 집합체로 해서, 이들의 각각의 용기내에 DNA고정화칩을 설치한 것을 카셋트형 DNA라이브러리로 할 수 있다.
이들 카셋트형 DNA라이브러리를 이용해서, 상기 ①∼②의 비교를 체계적으로 행함으로써, 유전자의 변동을 효율적으로 조사할 수도 있다.
그리고, 본 발명의 DNA고정화칩을 TE완충액 및 70∼75%의 에탄올수용액으로 충분히 세정한 후, 100%의 에탄올에 침윤해서 냉동보존하면, 비교데이터 등의 요구에 따라 반영구적으로 이용가능하다.
(DNA고정화칩을 이용한 유전자증폭)
상기 cDNA고정화칩의 복수개를 이용해서 반응용기를 구성하고, 가열·냉각수단으로 조절접촉시켰다. 이 반응용기내면을 TE완충액으로 충분히 세정후, 증폭목적의 DNA에 대한 프라이머를 셋트하고, 4종의 뉴클레오티드 및 DNA폴리머라아제를 포함하는 PCR반응용액을 첨가했다. 그후, 반응용기를 이중 사슬 DNA를 단일 사슬 DNA로 분리시키기 위해 열변성온도(95℃)로 짧은 시간안에 승온시켰다. 그리고, 95℃에서 약 1.5분간 유지하고, 다음에, 단일 사슬 DNA와 DNA프라이머를 결합시키는 어닐링온도인 45℃로 짧은 시간안에 온도하강시켰다. 그리고 45℃로 약 1분간 유지했다. 다음에, 내열성 DNA폴리머라아제에 의해 DNA사슬의 신장반응을 행하게 하는 DNA증폭온도인 74℃로 승온했다. 그리고 그 온도에서 약 2분간 유지했다. 상기 온도사이클을 30번 반복하여 PCR을 행했다. PCR에 필요한 시간은 온도상승 및 하강의 시간을 전혀 필요로 하지 않았으므로, 유지시간의 합인 약 135분이었다.
(실시예8)
실시예1에서 얻어진 기상합성다이아몬드를 레이저에 의해 10mm×10mm의 시료로 잘라 내고, 마이크로파 플라즈마에 의해 여기한 수소플라즈마로 표면을 처리한 후, 실시예2와 마찬가지로 해서 다이아몬드표면을 염소화했다. 분위기를 아르곤가스로 치환한 후 시료를 꺼내고, 10중량%의 수산화칼륨수용액속에서 15분간 끓여서 다이아몬드표면을 히드록실화했다. 한편 100cc의 95%에탄올-5%수용액을 초산으로 pH5로 조정하고, 2cc의 3-그리시드크시프로피루트리메톡시실란(3-gricydxypropyrutrimethoxyl silane)을 교반하면서 첨가했다. 이 용액에 히드록실다이아몬드를 담가 꺼내고, 에탄올로 가볍게 세정한 후, 110℃로 5분간 처리함으로써 다이아몬드표면에 에폭시기를 도입했다.
(실시예9)
에폭시기에 대해서, 5'말단아미노화올리고핵산(프라이머)를 고정화해서, mRNA를 어닐링한 후 역전사효소로 cDNA레플리카를 제작하는 동시에 칩으로 고정화했다.
(실시예10)
실시예1에서 얻어진 기상합성다이아몬드를 레이저에 의해 10mm×10mm의 시료로 잘라내고, 마이크로파 플라즈마에 의해 여기한 수소플라즈마로 표면처리한 후, 실시예2와 동일하게 해서 다이아몬드표면을 염소화했다. 분위기를 아르곤가스로 치환한 후 시료를 잘라내고, 10중량%의 수산화칼륨수용액속에서 15분 끓여서 다이아몬드표면을 히드록실화했다. 한편 100cc의 95%에탄올-5%수용액에 2cc의 3-아미노프로필트리메톡시실란을 교반하면서 첨가했다. 그 용액에 히드록실화다이아몬드를 담가 꺼내고, 에탄올로 가볍게 세정한 후, 110℃에서 5분간 처리함으로써 다이아몬드표면에 아미노기를 도입했다.
(실시예11)
실시예10에서 얻어진 아미노기 도입 다이아몬드표면에 5'말단에 카르복실기를 수식한 올리고핵산을 펩티드결합으로 고정화한 후, mRNA를 주형(鑄型)으로 해서 역전사효소에 의해 cDNA를 다이아몬드에 고정화했다.
(실시예12)
아크이온플레이팅법을 이용해서, 직경이 64mm, 두께가 0.1mm이고 표면거칠기(Ra)가 0.3mm인 질화알루미늄원판을 기상합성했다. 이 원판을 레이저에 의해 3mm×5mm의 시료를 잘라내고, 열전도율을 측정한 결과, 1.70W/cm·K의 값이 얻어졌다. 이 시료를 분리가능 플라스크속에 배치하고, 플라스크속의 분위기를 아르곤가스로 치환한 후, 염소가스를 1SCCM의 유량으로 유입시키면서 Hg-Xe램프를 이용하여, 주파장이 3600Å인 자외선을 60분간 조사해서 시료표면을 염소화했다. 분위기를 아르곤가스로 치환한 후 시료를 잘라내고, 10중량%의 수산화나트륨수용액속에서 15분간 끓이고, 다시 수세한 후 건조하여, 말단에 수산기를 갖는 기질을 얻었다. 그후, 이 기질을 이용해서, 실시예1과 동일하게 해서, DNA의 고정화 및 PCR법을 이용한 증폭을 행했다.
(실시예13)
분말소결법을 이용해서, 직경이 64mm, 두께가 0.3mm이고, 표면거칠기가 평균표면거칠(Ra)로 0.5mm인 텅스텐원판을 얻었다. 이 원판에서 레이저에 의해 3mm×5mm인 시료를 잘라내고, 열전도율을 측정한 결과, 1.67W/cm·K의 값이 얻어졌다. 그리고, 마이크로파에 의해 여기한 산소플라즈마로 표면을 산화한 후, 시료표면을 염소화했다. 분위기를 아르곤가스로 치환한 후 시료를 꺼내고, 10중량%의 수산화나트륨수용액속에서 15분간 끓이고, 다시 수세한 후 건조하여, 말단에 수산기를 갖는 기질을 얻었다. 그후, 이 기질을 이용해서 실시예1과 마찬가지로 해서, DNA의 고정화 및 PCR법을 이용한 증폭을 행했다.
(실시예14)
분말소결법에 의해 알루미나원판을 형성하고, 이 원판을 레이저에 의해 3mm×5mm의 시료를 잘라내고, 열전도율을 측정한 결과, 0.3W/cm·K의 값이 얻어졌다. 그리고, 분리가능 플라스크속에 배치하고, 플라스크속의 분위기를 아르곤가스로 치환한 후, 염소가스를 1SCCM의 유량으로 유입시키면서 Hg-Xe램프를 이용하고, 주파장이 3600Å인 자외선을 60분간 조사해서 시료표면을 염소화했다. 다시 플라스크속의 분위기를 아르곤가스로 치환한 후, 1중량%의 세바신산소다의 N,N-디메틸포름아미드용액 100ml를 첨가하고, 분리가능 플라스크에 콘덴서를 설치하고, 2시간 환류했다. 계속해서 시료를 꺼내고, 1중량%의 초산수용액으로 세정하고, 다시 아세톤으로 세정한 후 건조하여, 세바신산이 에스테르결합을 통해 결합한, 말단에 카르복실기를 갖는 기질을 얻었다. 그후, 이 기질을 이용해서 실시예1과 동일하게 해서, DNA의 고정화 및 PCR법을 이용한 증폭을 행했다.
또, 본 발명의 기질이나 DNA칩은 상기와 같이 서미스터 등의 가열·냉각수단에 직접 접촉시켜 이용하는 것외에, 종래의 PCR법에서의 DNA증폭법과 같이 엡펜형(Eppen) 튜브안의 반응액속에 투입해서 이용할 수도 있다. 이 경우에는, 전술한 실시예에 기재한 바와 같이 매우 단시간에 PCR증폭법을 완료시킬 수 없지만, 종래 행해지고 있던 반응액속에 DNA를 투입하는 방법보다 신속하게 완료시킬 수 있다.
본 발명에 있어서는, 열전도율이 우수한 기질을 이용함으로써, PCR법을 이용한 DNA증폭반응을 매우 단시간에 마칠 수 있다.
또, 기질에 직접 가열·냉각수단을 접촉시켜 기질을 가열·냉각함으로써, 상기 PCR반응의 온도제어도 정밀도좋게 행할 수 있으므로, 증폭 목적이외의 DNA는 거의 복제되지 않는다라는 이점이 있다.
또, 본 발명의 기질은 열전도성이 우수한 고체상 기질에 DNA를 직접 고정화하고 있으므로, 기질의 온도를 직접 가열·냉각시킴으로써, PCR법 등에 의한 히트사이클의 추수성을 향상시킬 수 있고, 목적으로 하는 양의 DNA를 단시간에 얻을 수 있다.
또, 본 발명의 기질은 표면을 수산기, 카르복실기, 에폭시기, 아미노기 등으로 화학수식되어 있으므로, DNA 등의 고정화의 안정화를 꾀하고, PCR법 등을 이용해서 DNA증폭반응에 의해 DNA를 복제하기 위한 칩 등에 적합하다.
또, 본 발명의 기질은 표면이 오염된 경우에, 가수분해시켜 화학수식을 재생시킬 수 있어, 고가의 DNA칩을 절약할 수 있다.

Claims (12)

  1. DNA를 고정화해서 증폭하기 위한 열전도성이 우수한 DNA고정용 고체상 기질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기질이 다이아몬드인 것을 특징으로 하는 기질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기질이 화학적으로 변형된 것을 특징으로 하는 기질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 말단에 극성기를 갖는 것을 특징으로 하는 기질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 극성기가 수산기, 카르복실기, 에폭시기, 아미노기인 것을 특징으로 하는 기질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 카르복실기가 에스테르결합을 통해 기질표면에 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 기질.
  7. 제5항에 있어서, 상기 카르복실기가 펩티드결합을 통해 기질표면에 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 기질.
  8. 제5항에 있어서, 상기 카르복실기가 실란커플링제, 티타늄커플링제 또는 알루미늄커플링제에 의해 기질표면에 도입되는 것을 특징으로 하는 기질.
  9. 제5항에 있어서, 상기 에폭시기가 실란커플링제, 티타늄커플링제 또는 알루미늄커플링제에 의해 기질표면에 도입되는 것을 특징으로 하는 기질.
  10. 제5항에 있어서, 상기 아미노기가 실란커플링제, 티타늄커플링제 또는 알루미늄커플링제에 의해 기질표면에 도입되는 것을 특징으로 하는 기질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 기질에 DNA를 고정화한 DNA고정화 칩.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 기질 또는 제11항에 기재된 칩을 이용해서 DNA를 증폭하는 방법.
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