CN106544339B - 一种用于提取动物组织dna的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种用于提取动物组织DNA的试剂盒，该试剂盒包括有提取液，提取液中含有磁性微球、异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸，其中异硫氰酸酯的浓度为3.5‑5M,盐酸胍的浓度为1.5‑3M,碘化钠的浓度为1.2‑2.5M,EDTA的浓度为15‑30mM,十二烷基氨基酸的浓度为60‑100mM；磁性微球的质量浓度为10‑15％。根据本发明的用于提取动物组织DNA的试剂盒，能够对动物组织进行快速解离并高效分离提纯DNA，能够广泛应用到动物疫病检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于提取动物组织DNA的试剂盒。
背景技术
动物疾病对畜牧业以及人类安全都有着重要的影响，采用分子生物学方法对动物组织进行病原菌诊断能够获得最准确的结果。关键步骤是要从动物组织样品中提取细菌或病毒的DNA。能获取不同种类的细菌DNA或不同种类病毒的DNA，以及基因组的完整性、纯度和浓度，是从动物组织中提取DNA用于动物病原菌诊断的首要目标。
现有的DNA提取过程中常常有污染，并且步骤繁琐，提取过程时间较长。如高氯酸钠法、SDS法和尿素法等提取方法，但这些方法需要样本量较大，并且苯酚类等有机物容易在DNA溶液中残留，特别是在后续的PCR扩增过程中会干扰扩增过程，影响扩增结果，使得该方法的应用受到一定的限制。
磁性微球在外加磁力的作用下，可快速分离纯化核酸DNA，因安全并易于实现自动化而迅速发展。磁性微球核酸提取方法是指以超顺磁性的磁性微球在高盐、低PH溶液中吸附核酸，而在低盐溶液中将核酸从磁性微球表面脱离的原理进行核酸提取的方法。
现有的磁性微球通常是由四氧化三铁或三氧化二铁等磁芯与二氧化硅等材料复合而成的具有一定磁性的球形微粒。中国发明专利(CN1217352)公开了一种二氧化硅包覆四氧化三铁的磁性微球的制备方法，其采用酸化法在四氧化三铁表面沉积二氧化硅。而加入的酸性物质(HCl)会在一定程度上与磁芯四氧化三铁发生反应，从而会对磁性微球的磁性产生不确定性影响，导致产品质量不稳定。
发明内容
本发明的目的是针对上述背景技术中存在的某些和某个问题，提供一种用于提取动物组织DNA的试剂盒。
根据本发明的用于提取动物组织DNA的试剂盒，试剂盒中包括有提取液，提取液通过以下步骤制得：
(一)磁性微球的制备
(1)将聚碳硅烷固体溶解到有机苯类溶剂中，形成乳液；将纳米级磁性粉体加入到含有表面活性剂的有机醇类溶剂中，搅拌均匀形成悬浮液；将悬浮液加入到乳液中，搅拌均匀，得到混合液；其中聚碳硅烷与磁性粉体的质量比为2-5:1；
(2)将混合液通过微孔膜滴入到含有交联剂的温水溶液中，水温保持在60-80℃；使得混合液中聚碳硅烷交联固化在磁性粉体表面；利用减压蒸馏手段将水分和有机溶剂去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉体的固体微球；
(3)将固体微球在500-1000℃下、氮气或惰性气体保护下进行保温1-2小时，聚碳硅烷裂解后形成表面多孔的固体微球；
(4)将热处理后的固体微球通过磁分离手段进行筛选，筛选出合格的成品磁性微球；
(二)磁性微球的活化
将步骤(一)中制得的成品磁性微球、催化剂和氨基试剂以1:1-20：5-30的质量比混合，保持pH值为10-13，温度为50-80℃下，搅拌反应5-10小时，冷却，经磁性分离、洗涤，得到表面带有亲和基团的磁性微球；其中催化剂选自氢氧化钠或氢氧化钾，氨基试剂选自氨基苯甲脒或氨基苯基硼酸。
(三)提取液的配制
将步骤(二)中活化后的磁性微球与异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸配置成提取液，其中异硫氰酸酯的浓度为3.5-5M,盐酸胍的浓度为1.5-3M，碘化钠的浓度为1.2-2.5M，EDTA的浓度为15-30mM,十二烷基氨基酸的浓度为60-100mM，磁性微球的质量浓度为10-15％。
步骤(一)的(1)中，有机苯类溶剂选自甲苯、二甲苯和二乙烯基苯中的一种或几种组合。聚碳硅烷与有机苯类溶剂的质量比优选控制在1-1.5:1，在该配比范围内，形成的乳液能够保持适中的粘度，以便于后续的混合。有机醇类溶剂选自乙醇或乙二醇；表面活性剂选自二辛基琥珀酸磺酸钠、十烷基硫酸钠、溴化十烷基三甲基铵或溴化十烷基铵。上述表面活性剂能够与有机醇互溶，从而能够将纳米磁性粉体充分分散并悬浮。其中磁性粉体为铁、钴、镍或它们的合金，也可以为Fe3O4。磁性粉体的粒径优选为1nm-30nm，在该粒径范围内的磁性粉体具有超顺磁性，即当外加磁场撤去后，磁性粉体无剩磁，从而不会发生聚集。磁性粉体与有机醇类溶剂的质量比优选为1-3:1，表面活性剂与有机醇类溶剂的质量比优选为0.05-0.2:1。在这些配比条件下，磁性粉体不仅能够很好地分散，并且具有相对高的浓度，从而为最终产品的磁强度提供的保证。
步骤(一)的(2)中，交联剂选自N,N-亚甲基双丙烯酰胺或氨丙啶，这两种交联剂能够与水互溶，交联剂与水的质量比优选为0.05-0.2:1。在该步骤中，微孔膜的孔径优选为1-50μm，更优选为10-30μm。通过微孔膜的液滴进入温水溶液后，形成尺寸均一的水包油球形结构，并且球形结构表面的聚碳硅烷在交联剂和温度促进作用下，迅速发生交联固化，从而均匀包覆住磁性粉体。
步骤(一)的(3)中，对固体微球进行热处理，包覆在磁性粉体表面的聚碳硅烷发生裂解，一些小分子碳氢化合物挥发出去，从而形成多孔包覆层。其中升温速率尤为关键，若采用普通的热处理升温速率(5-30℃/min)，聚碳硅烷的裂解速度过快，就会发生发泡和结构崩塌。本发明的发明人在采用0.1-2℃/min的超低升温速率时，意外发现聚碳硅烷的裂解得以缓慢进行，从而形成主要为0.01μm以下孔径的超微孔，这对磁性微球应用过程中吸附核酸具有非常重要的作用。通过热处理，聚碳硅烷裂解后形成主要成分为碳化硅的多孔包覆层，不仅具有较大的比表面积，同时具有较高的结构强度，并且与磁性粉体结合紧密。
步骤(一)的(4)中，采用磁分离手段，对得到的磁性微球进行筛选，去除没有磁性或磁性不够要求的不合格磁性微球，最终得到符合磁性要求的合格磁性微球成品。
通过步骤(二)的活化处理，使磁性微球表面结合有羧基和羟基的活性基团，使其对核酸具有特异性吸附能力。
步骤(三)中，提取液中的异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠等成分能够对动物组织进行有效解离，解离出核酸DNA/RNA、核蛋白以及盐分。所述动物组织包括心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏，也可以为全血、血浆、血清或动物分泌物。
根据本发明的用于提取动物组织DNA的试剂盒，能够对动物组织进行快速解离并高效分离提纯DNA，能够广泛应用到动物疫病(如禽流感、口蹄疫、猪瘟、蓝耳病等)检测领域。
具体实施方式
下面通过具体实施例来描述本发明的用于提取动物组织DNA的试剂盒的制备过程。本领域技术人员应当理解，下面描述的实施例仅是对本发明的示例性说明，而非用于对其作出任何限制。
实施例1
称取聚碳硅烷固体1000g，研磨成粉末后，加入到盛有1000g甲苯的旋转蒸发瓶中，在水浴40℃下旋转溶解形成乳液。在烧杯中先加入300g的乙醇，再加入20g的二辛基琥珀酸磺酸钠，搅拌均匀后，将500g的纳米铁粉(粒径为30nm以下)加入到烧杯中，搅拌10分钟，形成悬浮液。将制备的悬浮液缓慢加入到制备的乳液中，搅拌均匀，得到混合液。在收集容器中加入1000g去离子水，并加入100g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺，加热到80℃。在收集容器上方设置微孔膜，微孔膜的孔径为10μm。将混合液通过微孔膜滴入到收集容器中。利用减压蒸馏手段将收集容器中的水分和有机溶剂去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉体的固体微球。将固体微球放到热处理炉中，通入氩气保护，以0.5℃/min的升温速率升到800℃，保温1小时后，自然降温，得到表面多孔的固体微球。利用磁铁吸出具有磁性的磁性微球，得到568g合格的成品磁性微球。
将制得的成品磁性微球与氢氧化钠和氨基苯甲脒以1:3:8的质量比配置成水溶液，保持pH值为10.8，温度为80℃下，搅拌反应5小时，冷却，经磁性分离、洗涤，得到表面带有亲和基团的磁性微球。
将活化后的磁性微球与异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸配置成提取液，其中异硫氰酸酯的浓度为4M,盐酸胍的浓度为1.8M，碘化钠的浓度为1.2M，EDTA的浓度为18mM,十二烷基氨基酸的浓度为60mM，磁性微球的质量浓度为12％。
将制得的提取液封装后形成用于提取动物组织DNA的试剂盒。
实施例2
称取聚碳硅烷固体1000g，研磨成粉末后，加入到盛有800g二乙烯基苯的旋转蒸发瓶中，在水浴60℃下旋转溶解形成乳液。在烧杯中先加入300g的乙二醇，再加入30g的溴化十烷基三甲基铵，搅拌均匀后，将300g的纳米钴粉(粒径为30nm以下)加入到烧杯中，搅拌10分钟，形成悬浮液。将制备的悬浮液缓慢加入到制备的乳液中，搅拌均匀，得到混合液。在收集容器中加入1000g去离子水，并加入100g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺，加热到60℃。在收集容器上方设置微孔膜，微孔膜的孔径为30μm。将混合液通过微孔膜滴入到收集容器中。利用减压蒸馏手段将收集容器中的水分和有机溶剂去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉体的固体微球。将固体微球放到热处理炉中，通入氩气保护，以0.2℃/min的升温速率升到1000℃，保温1小时后，自然降温，得到表面多孔的固体微球。利用磁铁吸出具有磁性的磁性微球，得到324g合格的成品磁性微球。
将制得的成品磁性微球与氢氧化钾和氨基苯基硼酸以1:5:10的质量比配置成水溶液，保持pH值为12.5，温度为60℃下，搅拌反应10小时，冷却，经磁性分离、洗涤，得到表面带有亲和基团的磁性微球。
将活化后的磁性微球与异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸配置成提取液，其中异硫氰酸酯的浓度为5M，盐酸胍的浓度为2.5M，碘化钠的浓度为2.0M，EDTA的浓度为30mM,十二烷基氨基酸的浓度为80mM，磁性微球的质量浓度为15％。
将制得的提取液封装后形成用于提取动物组织DNA的试剂盒。
实施例3
称取聚碳硅烷固体1000g，研磨成粉末后，加入到盛有1000g二甲苯的旋转蒸发瓶中，在水浴50℃下旋转溶解形成乳液。在烧杯中先加入300g的乙醇，再加入45g的十烷基硫酸钠，搅拌均匀后，将300g的纳米Fe3O4粉(粒径为30nm以下)加入到烧杯中，搅拌10分钟，形成悬浮液。将制备的悬浮液缓慢加入到制备的乳液中，搅拌均匀，得到混合液。在收集容器中加入1000g去离子水，并加入100g的氨丙啶，加热到80℃。在收集容器上方设置微孔膜，微孔膜的孔径为50μm。将混合液通过微孔膜滴入到收集容器中。利用减压蒸馏手段将收集容器中的水分和有机溶剂去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉体的固体微球。将固体微球放到热处理炉中，通入氮气保护，以1℃/min的升温速率升到600℃，保温1小时后，自然降温，得到表面多孔的固体微球。利用磁铁吸出具有磁性的磁性微球，得到331g合格的成品磁性微球。
将制得的成品磁性微球、氢氧化钠和氨基苯甲脒以1:2.5:6的质量比配制成水溶液，保持pH值为11.2，温度为80℃下，搅拌反应10小时，冷却，经磁性分离、洗涤，得到表面带有亲和基团的磁性微球。
将活化后的磁性微球与异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸配置成提取液，其中异硫氰酸酯的浓度为5M,盐酸胍的浓度为2.8M，碘化钠的浓度为2.1M，EDTA的浓度为25mM,十二烷基氨基酸的浓度为75mM，磁性微球的质量浓度为12％。
将制得的提取液封装后形成用于提取动物组织DNA的试剂盒。
实施例4
称取聚碳硅烷固体1000g，研磨成粉末后，加入到盛有1000g二甲苯的旋转蒸发瓶中，在水浴50℃下旋转溶解形成乳液。在烧杯中先加入300g的乙二醇，再加入40g的溴化十烷基铵，搅拌均匀后，将500g的纳米镍粉(粒径为30nm以下)加入到烧杯中，搅拌10分钟，形成悬浮液。将制备的悬浮液缓慢加入到制备的乳液中，搅拌均匀，得到混合液。在收集容器中加入1000g去离子水，并加入100g的氨丙啶，加热到80℃。在收集容器上方设置微孔膜，微孔膜的孔径为40μm。将混合液通过微孔膜滴入到收集容器中。利用减压蒸馏手段将收集容器中的水分和有机溶剂去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉体的固体微球。将固体微球放到热处理炉中，通入氩气保护，以0.1℃/min的升温速率升到600℃，保温2小时后，自然降温，得到表面多孔的固体微球。利用磁铁吸出具有磁性的磁性微球，得到538g合格的成品磁性微球。
将制得的成品磁性微球、氢氧化钾和氨基苯基硼酸以1:2:5的质量比配置成水溶液，保持pH值为11.5，温度为60℃下，搅拌反应8小时，冷却，经磁性分离、洗涤，得到表面带有亲和基团的磁性微球。
将活化后的磁性微球与异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸配置成提取液，其中异硫氰酸酯的浓度为4.2M，盐酸胍的浓度为2.5M，碘化钠的浓度为1.5M，EDTA的浓度为15mM,十二烷基氨基酸的浓度为100mM，磁性微球的质量浓度为10％。
将制得的提取液封装后形成用于提取动物组织DNA的试剂盒。
Claims (8)
1.一种用于提取动物组织DNA的试剂盒，该试剂盒包括有提取液，提取液中含有磁性微球、异硫氰酸酯、盐酸胍、碘化钠、EDTA、十二烷基氨基酸，其中异硫氰酸酯的浓度为3.5-5M,盐酸胍的浓度为1.5-3M,碘化钠的浓度为1.2-2.5M,EDTA的浓度为15-30mM,十二烷基氨基酸的浓度为60-100mM；磁性微球的质量浓度为10-15％；
其中磁性微球通过以下方法制得：
(1)将聚碳硅烷固体溶解到有机苯类溶剂中，形成乳液；将纳米级磁性粉体加入到含有表面活性剂的有机醇类溶剂中，搅拌均匀形成悬浮液；将悬浮液加入到乳液中，搅拌均匀，得到混合液；其中聚碳硅烷与磁性粉体的质量比为2-5:1；
(2)将混合液通过微孔膜滴入到含有交联剂的温水溶液中，水温保持在60-80℃；使得混合液中聚碳硅烷交联固化在磁性粉体表面；利用减压蒸馏手段将水分和有机溶剂去除，得到聚碳硅烷包覆磁性粉体的固体微球；
(3)将固体微球在500-1000℃下、氮气或惰性气体保护下进行保温1-2小时，聚碳硅烷裂解后形成表面多孔的固体微球；
(4)将热处理后的固体微球通过磁分离手段进行筛选，筛选出合格的成品磁性微球；
(5)将制得的成品磁性微球与催化剂、氨基试剂以1:1-20：5-30的质量比混合，保持pH值为10-13，温度为50-80℃下，搅拌反应5-10小时，冷却，经磁性分离、洗涤，得到表面带有亲和基团的磁性微球；其中催化剂选自氢氧化钠或氢氧化钾，氨基试剂选自氨基苯甲脒或氨基苯基硼酸；
其中步骤(1)中，其中纳米级磁性粉体的粒径为1nm-30nm。
2.根据权利要求1所述的用于提取动物组织DNA的试剂盒，其中步骤(1)中，有机苯类溶剂选自甲苯、二甲苯和二乙烯基苯中的一种或几种组合。
3.根据权利要求1所述的用于提取动物组织DNA的试剂盒，其中步骤(1)中，其中有机醇类溶剂选自乙醇或乙二醇。
4.根据权利要求1所述的用于提取动物组织DNA的试剂盒，其中步骤(1)中，其中表面活性剂选自二辛基琥珀酸磺酸钠、十烷基硫酸钠、溴化十烷基三甲基铵或溴化十烷基铵。
5.根据权利要求1所述的用于提取动物组织DNA的试剂盒，其中步骤(2)中，其中交联剂选自N,N-亚甲基双丙烯酰胺或氨丙啶。
6.根据权利要求1所述的用于提取动物组织DNA的试剂盒，其中步骤(1)中，其中磁性粉体为铁、钴、镍或它们的合金。
7.根据权利要求1所述的用于提取动物组织DNA的试剂盒，其中步骤(1)中，其中磁性粉体为Fe3O4。
8.根据权利要求1所述的用于提取动物组织DNA的试剂盒，其中步骤(2)中，其中微孔膜的孔径为1-50μm。
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