CN101306841B - 超顺磁性粒子及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种超顺磁性粒子及其制造方法，该方法包含下列步骤：将二价铁化合物粉末、尿素和水混合搅拌，在80℃至110℃的常压下进行回流反应1至24小时，生成氧化铁粒子；清洗前述氧化铁粒子后再加入水、氨水和有机醇溶剂混合搅拌，进行超声波震荡；在前述混合得到的混合物中加入硅酸四乙酯，在50℃至70℃的温度下反应0.5小时至12小时；及将前述70℃的温度下反应产物温度降至25℃至30℃后，另外加入硅酸四乙酯，反应1小时至12小时，形成有二氧化硅包覆的氧化铁粒子，其具有超顺磁性；本发明还提供一种通过前述方法所制得的超顺磁性粒子。

Description

超顺磁性粒子及其制造方法

技术领域

本发明提供一种超顺磁性粒子的制造方法，以及利用该方法所制造的超顺磁性粒子。所述超顺磁性粒子可应用于化学或生化物质的纯化与反应，并可应用于大规模反应与自动化磁珠操作平台。

背景技术

具有超顺磁性的磁性粒子(superparamagnetic particles)，在外加磁场的条件下，会受到磁场的诱导而产生磁性，聚集到磁场的N极或S极；将磁场移离后，其磁性瞬间消失，回复到不具有磁性的状态，重新分散。由于氧化铁粒子具有生物兼容性、且无细胞毒性，所以是所有磁性粒子中最被广为使用的材料。

在具有超顺磁性的磁性粒子的早期应用与研究中，其粒径等级是以微米为主，且其应用是以体外应用为主，在分离纯化领域的应用尤其如此，仅有少数的体内应用，究其原因，在于微米粒子的大小相对于细微组织仍是较大的，故无法有效地进入细微组织区域。近年来，由于纳米粒子的开发，粒径大幅缩小，而得以进入早期微米粒子无法进入的区域，因此开始大量开发与研究，其应用范围已经可达微血管区域等，并广泛地应用在生物医学领域上，例如磁共振造影、温热治疗等；同时，具有超顺磁性的纳米粒子也具有可控制化载体的特性，故带动了整个生医产业自动化的新里程。

一般常用于合成具有超顺磁性的氧化铁粒子的方式，是简单的共沉淀法(co-precipitation)。共沉淀法是在同时具有二价铁离子与三价铁离子的溶液中加入碱液，将酸碱值调整到9至14之间，如此即可得到四氧化三铁的沉淀物。但此传统方式需将三价与二价铁离子的摩尔比例控制在Fe³⁺：Fe²⁺＝2：1，且需在无氧环境下进行，否则将影响氧化铁粒子的结晶型态，而且氧化铁粒子会在制备过程中持续氧化，进而影响到氧化铁粒子的饱和磁化量(saturationmagnetization)大小。目前的解决方式是在氮气下进行反应、或改在有机相中反应，以便减缓氧化；但二价铁离子易氧化成三价铁离子，需新鲜配置，且不易精准控制反应中的摩尔比例，这都会增加大量合成的困难度。此外，四氧化三铁粒子中的铁离子并非全数处于最高的氧化态，所以这些铁离子会在空气中慢慢氧化成不具顺磁性或磁性较弱的三氧化二铁。一般来说，会在四氧化三铁粒子表面包覆高分子聚合物或二氧化硅的无机氧化物，但这类粒子常会出现无法长时间耐高温与耐酸性差的缺点，使其应用受到限制。

针对先前技术的缺点，本发明利用尿素特殊的高温热分解特性，在单纯只需二价铁离子存在的情况下，产生具有高饱和磁化量的超顺磁性氧化铁粒子，并在表面包覆二氧化硅来形成核-壳结构，使磁性氧化铁粒子的抗酸性增强，并可接受高温高压灭菌处理。前述有二氧化硅包覆的氧化铁粒子可经进一步酸处理，来作为吸附核酸的载体；亦可进一步经带有官能基的硅烷修饰，而与蛋白质或其它化合物进行化学键结，增加超顺磁性氧化铁粒子的应用层面。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种超顺磁性粒子的制造方法，相较于传统的磁性粒子，本发明只需使用单一的二价铁离子来源，配合尿素特殊的高温热分解特性，即可在常压高温的开放系统下合成具有高饱和磁化量及超顺磁性的氧化铁粒子，容易大量生产。

本发明还利用改进的二氧化硅包覆技术，将前述粒子在有机醇溶剂、水和碱液的混合溶液中进行超声波震荡，利用高温与低温两阶段的包覆，在氧化铁粒子表面形成一层均匀的二氧化硅，此核-壳结构可耐高温高压，且其抗酸性佳，在酸性溶液中不会有过渡金属离子释出。在本发明的方法中，只需简单改变反应参数，即可制备出不同粒径的粒子，而包覆在氧化铁粒子外的均匀二氧化硅层可进行多种表面修饰，以便于进行各种应用。

本发明的目的还在于提供一种超顺磁性粒子，其核心氧化铁粒子的主要成分是具有超顺磁性的四氧化三铁，且氧化铁粒子的表面有均匀的二氧化硅包覆层，可抗强酸，并可进行高温高压灭菌处理。

本发明的目的还在于提供一种表面经过酸处理而使硅烷醇基(Si-OH)增加的超顺磁性粒子，其于高盐环境下具有吸附核酸的能力。

本发明的目的还在于提供一种表面经过具有官能基的硅烷(silane)修饰而使其表面具有胺基、羧基、醛基等官能基的超顺磁性粒子，再利用活化剂或连结剂，使之与蛋白质或化合物键结，而成为具有专一性的吸附载体，可应用于例如抗体的纯化。

为达上述目的，本发明提供一种超顺磁性粒子的制造方法，其包含下列步骤：

(a)将二价铁化合物粉末、尿素和水混合搅拌，在80℃至110℃的常压下进行回流反应1至24小时，生成氧化铁粒子；

(b)清洗前述氧化铁粒子后再加入水、氨水和有机醇溶剂混合搅拌，进行超声波震荡；

(c)在前述步骤(b)混合得到的混合物中加入硅酸四乙酯，在50℃至70℃的温度下反应0.5小时至12小时；及

(d)将步骤(c)得到的产物的温度降至25℃至30℃后，另外再加入硅酸四乙酯，反应1小时至12小时，形成有二氧化硅包覆的氧化铁粒子，该氧化铁粒子具有超顺磁性。

在本发明的优选实施方式中，前述制造方法进一步包括通过下列步骤以制得活化的超顺磁粒子：

(e)将前述步骤(d)得到的有二氧化硅包覆的氧化铁粒子与pH值小于6的酸性缓冲液混合搅拌。

在本发明的优选实施方式中，所述酸性缓冲液优选为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、MES缓冲液(2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid))或Bis-Tris缓冲液(双(2-羟基乙基)亚胺基-参(羟基甲基)甲烷(bis(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)methane))。

在本发明的优选实施方式中，前述制造方法进一步包括下列步骤，以制得表面具有官能基的超顺磁粒子：

(f)前述步骤(d)得到有二氧化硅包覆的氧化铁粒子移入极性有机溶剂中；

(g)加入具有官能基的硅烷化物混合搅拌，使前述有二氧化硅包覆的氧化铁粒子表面具有官能基。

在本发明的优选实施方式中，所述的极性有机溶剂为丙酮、DMSO(二甲亚砜(dimethyl sulfoxide))、DMF(N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide))、NMP(N-甲基-2-吡咯啶酮(N-methyl-2-pyrrolidone))或异丙醇。

在本发明的优选实施方式中，所述的官能基选自由胺基、氢硫基(巯基)、氢氧基(羟基)、甲基、辛基、十八基和苯基所组成的组群。

在本发明的优选实施方式中，所述硅烷化物包含γ-胺基丙基三乙氧基硅烷(γ-aminopropyl triethoxysilane)、(3-氢硫基丙基)三甲氧基硅烷((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane)、环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(glycidoxypropyl trimethoxysilane)、甲基三乙氧基硅烷(methyl triethoxysilane)、正辛基三乙氧基硅烷(n-octyl triethoxysilane)、十八基三甲氧基硅烷(octadecyltrimethoxysilane)或苯基三乙氧基硅烷(phenyl triethoxysilane)。

本发明还提供了一种超顺磁性粒子，其由前述方法制得，其中所述的超顺磁性粒子的主要成分为四氧化三铁，二氧化硅的含量为该超顺磁性粒子重量的0.05％至40％，且其粒径范围为100nm至10μm。

在本发明的优选实施方式中，前述超顺磁性粒子的饱合磁化量一般大于35emu/g。

本发明还提供一种活化的超顺磁性粒子，其由前述相关方法制得，该活化的超顺磁性粒子在高盐环境下对核酸分子具有强吸附力。其中高盐环境优选是指0.5M至8M的NaCl、NaI、GuHCl或GuSCN。

本发明还提供一种表面具有官能基的超顺磁性粒子，由前述相关方法制得。

在本发明的优选实施方式中，如果前述超顺磁性粒子表面所具有的官能基是胺基，则其可进一步利用羟基活化剂来进行修饰，使其可与具有羧基官能基的蛋白质或化合物键结。

在本发明的优选实施方式中，前述羟基活化剂优选为EDAC、CMC(1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳化二亚胺(1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide))、DCC(二环己基碳化二亚胺(dicyclohexyl carbodiimde))或DIC(二异丙基碳化二亚胺(diisopropyl carbodiimide))。

在本发明的优选实施方式中，前述经羟基活化剂修饰后的超顺磁性粒子进一步与蛋白质键结后，可用以纯化抗体。

在本发明的优选实施方式中，所述蛋白质是指蛋白质A(Protein A)、蛋白质G(Protein G)、抗体、酶或链霉亲合素(Streptavidin)。

在本发明的优选实施方式中，前述表面具有官能基的超顺磁性粒子的表面可进一步利用螯合剂修饰，使其可与过渡金属离子螯合，纯化带有组胺酸(也称为组氨酸)的蛋白或磷酸化蛋白。

在本发明的优选实施方式中，所述螯合剂优选为三乙酸基胺(nitrilotriaceticacid)、IDA(亚胺基二乙酸(iminodiacetic acid))或EDTA(乙底酸ethylenediamine-tetraacetic acid)。

综上所述，本发明提供了一种超顺磁性粒子的制造方法，相较于传统的共沉淀法，本发明只需使用单一的铁离子源，即可合成出高饱和磁化量的超顺磁性氧化铁粒子，并利用改良的二氧化硅包覆技术，使所制得的有二氧化硅包覆的氧化铁粒子除了极佳的磁反应性外，更具有绝佳的抗酸性，且可耐高温高压处理。而利用本方法所制得的超顺磁性粒子用途广泛，可应用于如核酸与蛋白质的纯化技术中。

附图说明

图1：本发明的有二氧化硅包覆的超顺磁性粒子(粒径约500nm)的电子显微镜图(400,000X放大图)；

图2A-1、图2A-2、图2B-1、图2B-2、图2C-1、图2C-2：本发明的超顺磁性粒子与市售磁性粒子经高温高压处理前后在显微镜下的400X放大图，其中，图2A-1、2A-2为本发明的超顺磁性粒子经高温高压处理前后在显微镜下的400X放大图，图2B-1、2B-2为Qiagen公司的超顺磁性粒子经高温高压处理前后在显微镜下的400X放大图，图2C-1、2C-2为Invitrogen公司的超顺磁性粒子经高温高压处理前后在显微镜下的400X放大图；

图3：本发明与市售磁性粒子的抗酸性(2M HCl)比较图，菱形的连接曲线为本发明的超顺磁性粒子(TANBead)，正方形的连接曲线为Invitrogen公司的产品，三角形的连接曲线为Qiagen公司的产品；

图4：使用本发明的超顺磁性粒子进行核酸纯化的DNA电泳图；

图5：使用本发明的超顺磁性粒子进行抗体纯化的蛋白质电泳图。

具体实施方式

以下结合附图详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。

本发明利用尿素特殊的高温热分解特性，在单纯只需二价铁离子存在的情况下，产生具有高饱和磁化量的超顺磁性氧化铁粒子。将二价铁化合物粉末、尿素和水混合搅拌，在80℃至110℃的常压环境下进行回流反应1至24小时，其中二价铁离子在水中会慢慢氧化成三价铁离子，同时尿素在热水中会分解成氨水与二氧化碳，其中二氧化碳会从回流管排出，而氨水则会提供氢氧基，使溶液的酸碱值慢慢升高，产生以下的颜色反应：

当酸碱度达到9以上时，二价铁离子与三价铁离子会产生共沉淀反应，开始生成黑色的四氧化三铁粒子晶核；而水中未反应的二价铁离子继续反应，在前述晶核表面形成四氧化三铁沉淀，使粒径逐渐增加。因此，可通过调整尿素与二价铁离子的摩尔比，来控制晶核生成的数量；或调整四氧化三铁生成后的反应时间，将氧化铁粒子的粒径范围控制在100nm至10μm。

本发明制成超顺磁粒子的反应机制如下：

1)4Fe²⁺+O₂+2H₂O→4Fe³⁺+4OH^-

2NH₃+2H₂O→2NH₄OH→2NH⁴⁺+2OH^-

3)Fe²⁺+2Fe³⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O

全反应式如下：

四氧化三铁粒子在空气中会渐渐氧化成不具顺磁性或磁性较弱的三氧化二铁。本发明利用改良的二氧化硅包覆技术在四氧化三铁粒子表面形成包覆层，降低其氧化程度。首先在高温下反应，生成厚实的二氧化硅层，然后在低温下反应，将表面空隙填补完整，并在表面生成具有活性的硅烷醇基。由前述方法所制得的有二氧化硅包覆的氧化铁粒子，其核-壳结构的抗酸性增强，并可接受高温高压灭菌处理。

前述有二氧化硅包覆的氧化铁粒子可经进一步进行酸处理，增加其表面的硅烷醇基，如此可在高盐环境下作为吸附核酸的载体，但却不会吸附蛋白质与其它污染物；亦可进一步经带有官能基的硅烷修饰，使氧化铁粒子表面具有官能基，而与蛋白质或其它化合物进行化学键结，增加超顺磁性氧化铁粒子的应用层面。此类磁性材料渐渐成为自动化分子生物检验分析之前处理步骤中不可或缺的载体。

一般认为，粒径大于50nm的磁性粒子不具超顺磁性，或有磁迟滞现象(remanent magnetism)。但在本发明的制造方法中，首先生成纳米级的氧化铁晶核，再慢慢在晶核表层继续成长，因此，即便氧化铁粒子的粒径已达10μm，仍保有超顺磁性，且其饱和磁化量大于35emu/g。另一方面，可通过增加氧化铁粒子的粒径、或通过二氧化硅的包覆来增加单颗粒子中的氧化铁粒子数目，缩短磁反应时间。本发明的超顺磁性粒子在外加磁场的吸引下，磁反应时间小于2秒。如此强的磁力不仅可以缩短磁反应时间，也可以在1公升(1000ml)、甚至100公升的大反应体积中进行操作。

具有超顺磁性的粒子在外加磁场移离后，不需加热，磁性便即消失，而能够重新分散在溶液中，继续反应。这项特性能够增加异相反应的均匀性。

二氧化硅的包覆须在氧化铁粒子制备完成后马上进行，以防止四氧化三铁继续氧化。首先将氧化铁粒子分散在水与醇类(如甲醇、乙醇、异丙醇、1-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、第三丁醇(叔丁醇)、异丁醇等)的混合液中，再加入氨水或其它碱性溶液(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化四甲基铵、氢氧化四乙基铵)，将反应环境控制在碱性，进行超声波振荡。在前述混合物中加入硅酸四乙酯，在50℃至70℃的温度下反应0.5小时至12小时；通过控制硅酸四乙酯的添加量，可将二氧化硅包覆层的厚度限制在从1nm到1μm的范围。之后将温度降至25℃至30℃，另外再加入硅酸四乙酯，反应1小时至12小时，其通过较慢的反应速率，将表面空隙填补完整。

本发明的氧化铁粒子-二氧化硅的改良式的核-壳结构，在2M的浓盐酸下可耐酸超过60分钟；且高温高压灭菌不会影响氧化铁的超顺磁性与其表面的二氧化硅结构。

包覆氧化铁粒子的二氧化硅表面具有硅烷醇基，若浸泡在pH值小于6的酸性缓冲溶液中，可使二氧化硅表面活化，硅烷醇基的数量增加，而这类活化的超顺磁性粒子在0.5M至8M的NaCl、NaI、GuHCl或GuSCN的高盐环境下，对核酸分子有很强的吸附力，且超顺磁粒子的结果不会被破坏，至于蛋白质分子与其它污染物，则可通过简单的清洗步骤去除。可对所得的纯化核酸进行聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)来将它放大，其结果如图4所示，纯化核酸中并无蛋白质和其它会抑制PCR反应的物质存在。

将有二氧化硅包覆的氧化铁粒子移至极性有机溶剂(如丙酮)中，再加入具有官能基的硅烷化物(如γ-胺基丙基三乙氧基硅烷)，使氧化铁粒子表面具有官能基(例如胺基)。之后可利用羟基活化剂(如EDAC)做进一步修饰，使超顺磁性粒子与蛋白质(如蛋白质A(Protein A)、蛋白质G(Protein G)、抗体、酶或链霉亲合素(Streptavidin))键结，之后用以纯化抗体；其亦可利用螯合剂(如三乙酸基氨)做进一步修饰，使超顺磁性粒子与二价或三价的过渡金属离子螯合，之后用以纯化带有组胺酸(histidine)的蛋白或磷酸化蛋白。

实施例

实施例1：超顺磁性氧化铁粒子的小量制备

将0.25克二氯化铁粉末与6克尿素结晶颗粒溶解在100毫升去离子水中，在装有冷凝管的玻璃反应器中快速搅拌10分钟，形成黄绿色澄清溶液，移入90℃的油锅进行回流反应12小时，生成黑色氧化铁粒子，静置沉淀后，将接近澄清的上清液倒出，沉淀物用去离子水清洗三次，去除反应剩下来的铵离子与氯离子。进行二氧化硅包覆前，将前述沉淀物保持在水溶液中，避免干燥。

实施例2：超顺磁性氧化铁粒子的大量制备

将60克二氯化铁粉末与90克尿素结晶颗粒溶解在1公升(1000ml)去离子水中，在装有冷凝管的玻璃反应器中快速搅拌3分钟，并将混合物移入温度设定为95℃的油锅进行回流反应12小时，生成黑色氧化铁粒子，静置沉淀后，将接近澄清的上清液吸出，沉淀物用去离子水清洗三次，去除反应剩下来的铵离子与氯离子。进行二氧化硅包覆前，将前述沉淀物保持在水溶液中，避免干燥。

实施例3：二氧化硅的包覆

将30克由实施例1或实施例2制得的氧化铁粒子分散在225毫升去离子水中，再加入22.5毫升28％的氨水，然后加入900毫升异丙醇，将此溶液封闭在玻璃反应器中持续搅拌，并进行超声波震荡10分钟。加入4.5毫升的硅酸四乙酯，并将水温升高至50℃，持续反应2小时；之后将水温降至室温(约25℃)，再加入4.5毫升的硅酸四乙酯，持续反应1小时。反应完成后，静置沉淀，将透明上清液吸出，并用去离子水清洗至无氨水与异丙醇的味道为止。实施例3制成的有二氧化硅包覆的超顺磁粒子的影像图如图1所示。

实施例4：表面活化处理

将实施例3的有二氧化硅包覆的氧化铁粒子静置去除上清液后，从中取30克加入300毫升10mM的磷酸盐缓冲液(pH5.5)，清洗两次，之后在相同的缓冲液中持续搅拌5小时，再以去离子水清洗，重新分散在酸碱值8的缓冲液中，即可制得具有活化的二氧化硅表面的超顺磁性粒子。

实施例5：表面官能基的修饰

将实施例3的有二氧化硅包覆的氧化铁粒子静置去除上清液后，从中取30克加入250毫升无水丙酮，清洗两次，之后将前述粒子分散在500毫升丙酮中，持续搅拌10分钟，再加入3.5毫升γ-胺基丙基三乙氧基硅烷，在室温下反应4小时。反应完成后，静置沉淀，将透明上清液吸出，并用去离子水清洗至无丙酮的味道为止，即可制得表面具有胺基官能基的超顺磁性粒子。

实施例6：核酸的纯化

取分散在100微升中的1×10⁵个TSGH-8301细胞加入400微升的细胞裂解液(120g GuSCN，100ml0.1M Tris-HCl pH6.4，22ml0.2M EDTA pH8.0，2.4ml TritonX-100)，反应10分钟。之后加入50微升150mg/ml由实施例4制备而得的具有活化的二氧化硅表面的超顺磁性粒子，并加入100微升的连结液(异丙醇)，均匀混合10分钟，使磁性粒子与细胞裂解后产生的核酸产生连结。将混合物置于磁座上，将上清液吸出，加入800微升的清洗液(120g GuSCN，100ml0.1MTris-HCl pH6.4)，清洗两次；再加入800微升70％乙醇，清洗两次。之后将氧化铁粒子静置10分钟，使清洗液中的酒精挥发；再加入100微升的冲洗液(10mM Tris pH8)，均匀混合10分钟，接着将反应物置于磁座上，将上清液吸出，置入干净的容器中，此即纯化后的核酸，结果如图4所示，其中M为1kb的核酸标准液；E1至E3为1×10⁵个细胞的三次重复实验；C1至C3为不同数目的细胞的比较，其中C1为1×10⁵个细胞，C2为2×10⁵个细胞，C3为5×10⁵个细胞。由图4的结果可知，利用本发明的活化后的超顺磁粒子来纯化的核酸并无蛋白质和其它会抑制PCR反应的物质存在。

实施例7：抗体的纯化

取10微升的血清，加入900微升的连结液(10mM磷酸盐，150mM NaCl，pH7.5)，再加入20微升50mg/ml键结有蛋白质A的超顺磁性粒子(利用实施例5的表面修饰胺基的超顺磁粒子进一步利用羟基活化剂修饰后，再与蛋白质A键结)，均匀混合30分钟。将混合物置于磁座上，将上清液吸出，加入500微升的清洗液(10mM磷酸盐，150mM NaCl，pH7.5)，清洗两次；再加入100微升的冲洗液(0.5M甘胺酸，0.15M NaCl，pH2.5)，均匀混合10分钟，接着将反应物置于磁座上，将上清液吸出，置入干净的容器中，再加入5微升的中和液(1M Tris，pH9.0)，移动磁性粒子，重复进行一次冲洗步骤，即得纯化后的抗体，结果如图5所示，其中M为蛋白质标准液，S为稀释20倍的血清，F为未被磁性粒子吸附的蛋白质，W1为第一次清洗液的产物，W2为第二次清洗液的产物，E1为第一次冲洗液的产物，其产量大约占总量的60至70％，E2为第二次冲洗液的产物，其产量大约占总量的30至40％。由图5的结果显示，利用本发明制备的超顺磁粒子，经表面官能基修饰后可作为抗体纯化之用。

血清中各种免疫球蛋白(IgG[约70％]、IgM[约6％]、IgA[约10至20％]、IgE[约0.001％]和IgD[约0.2％])的分子量分布在150kDa至900kDa，在进行电泳确认前，须将各样本加热沸腾，使蛋白能在电泳胶片中移动。加热沸腾后的免疫球蛋白会分成重链(heavy chain)和轻链(light chain)两部分，其中各免疫球蛋白的重链大小在50kDa至75kDa范围内，而数量最多的IgG的轻链大小为25kDa，这两个大小的蛋白会在E1与E2上形成两条明显的主带，此外，其它数量较少的免疫球蛋白(IgM、IgA、IgE和IgD)的轻链，会在25kDa上下形成较弱的带。而电泳片上大于75kDa的带，主要是热分解片段重新结合而成的半产物或完整的免疫球蛋白。

实施例8：本发明与市售磁性粒子的比较

1)耐酸性的测定

在1ml的紫外光等级的塑料比色管中，分别加入12.5mg本发明与两种市售磁性粒子，再分别加入500μl的2M HCl，混合均匀后，将磁性粒子磁吸至底部，量测上清液于290nm的吸光值(A290)。在0至10分钟时，每2分钟量测一次；在10至60分钟时，每5分钟量测一次。由于Fe³⁺离子吸收峰在290nm，因此，若前述上清液的A290值在60分钟内有上升，则表示该磁性粒子的二氧化硅层被酸破坏，使氧化铁裸露并开始氧化，形成Fe³⁺。故在前述测定中，A290值未上升判定为“佳”，而A290值上升则判定为“不佳”，如表1和图3所示。

2)耐高温高压处理的测定

在2ml聚丙烯的样品管中，分别加入1.25mg本发明与两种市售磁性粒子，再分别加入1ml去离子水，混合均匀后，半锁紧上盖，放入灭菌锅中，进行高温高压灭菌，温度设定120℃，持续40分钟，之后在显微镜下进行观察磁性粒子表面二氧化硅层脱落的情形，其结果如下表1和图2A-1、2A-2～图2C-1、2C—2所示。在下表1中，“佳”代表表面二氧化硅层未有脱落的情形，“可”代表表面二氧化硅层有些微脱落的情形，而“差”代表表面二氧化硅层有严重脱落的情形；而在图2A-1～图2C—2中，2A-1和2A-2分别为本发明的超顺磁性粒子在高温高压处理前后的外型，表面二氧化硅层未有脱落的情形；2B-1和2B-2分别为Qiagen(公司名称)的磁性粒子在高温高压处理前后的外型，表面二氧化硅层有些微脱落的情形：2C-1和2C-2分别为Invitrogen(公司名称)的磁性粒子在高温高压处理前后的外型，表面二氧化硅层有严重脱落的情形。

此外，磁性粒子是否耐高温高压处理，亦可配合下文所述，而由处理后的磁反应时间变化来观察；若磁反应时间变慢，表示高温高压处理会造成磁性粒子氧化或使其磁性结构改变，表示该磁性粒子不耐高温高压处理，如表1所示。

3)磁吸时间的测定

磁吸时间的测定是在25至30℃下进行，将磁珠置于1ml或40ml的去离子水中。若去离子水的体积为1ml，则利用小磁铁进行测试；若其体积为40ml，则利用大磁铁进行测试。在磁座上安装大/小磁铁，再把装有磁性粒子和反应液体的容器放到磁座上，进行磁吸时间测试，测试结果如下表1所示。与市售产品比较，在反应体积大小不同的测试中可明显看出，若反应体积愈大，则磁性愈强的磁性粒子，其反应操作的时间越短。

表1.本发明与市售磁性粒子的特性比较

 

	本发明的产品	Qiagen的产品	Invitrogen的产品
				颜色	黑色	黑色	黄褐色
粒径(μm)	2-10	2-10	~1
				储藏液的pH值	5-6	6-7	5
耐酸性	佳	佳	不佳
				耐高温高压	佳	可	差
磁吸时间(操作体积1ml)	小于2秒	小于4秒	小于1分钟
				磁吸时间(操作体积40ml)	小于20秒	小于40秒	5-10分钟
高温高压处理后的磁吸时间(操作体积1ml)	小于2秒	小于6秒	小于1分钟

注：

1)小磁铁的重量：9.7g(1ml的磁吸时间测试用)

2)大磁铁的重量：94.2g(40ml的磁吸时间测试用)

Claims (18)

1.一种超顺磁性粒子的制造方法，其包括下列步骤：

(a)将二价铁化合物粉末、尿素和水混合搅拌，在80℃至110℃的常压下进行回流反应1至24小时，生成氧化铁粒子；

(b)清洗前述氧化铁粒子后再加入水、氨水和有机醇溶剂混合搅拌，进行超声波震荡；

(c)在前述步骤(b)混合得到的混合物中加入硅酸四乙酯，在50℃至70℃的温度下反应0.5小时至12小时；及

(d)将步骤(c)的产物温度降至25℃至30℃后，另外加入硅酸四乙酯，反应1小时至12小时，形成有二氧化硅包覆的氧化铁粒子，其具有超顺磁性。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括下列步骤：

(e)将前述步骤(d)的有二氧化硅包覆的氧化铁粒子与pH值小于6的酸性缓冲液混合搅拌。

3.如权利要求2所述的方法，其中前述酸性缓冲液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸缓冲液或双(2-羟基乙基)亚胺基-三(羟基甲基)甲烷缓冲液。

4.如权利要求1所述的方法，其还包括下列步骤：

(f)将前述步骤(d)的有二氧化硅包覆的氧化铁粒子移入极性有机溶剂中；

(g)加入具有官能基的硅烷化物混合搅拌，使前述有二氧化硅包覆的氧化铁粒子表面具有官能基。

5.如权利要求4所述的方法，其中前述极性有机溶剂为丙酮、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯啶酮或异丙醇。

6.如权利要求4所述的方法，其中前述官能基选自由胺基、氢硫基、氢氧基、甲基、辛基、十八基和苯基所组成的组群。

7.如权利要求4所述的方法，其中前述硅烷化物包含γ-胺基丙基三乙氧基硅烷、(3-氢硫基丙基)三甲氧基硅烷、环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷、十八基三甲氧基硅烷、或苯基三乙氧基硅烷。

8.一种超顺磁性粒子，其由权利要求1至7任一所述的方法所制得，其中前述超顺磁性粒子的主要成分为四氧化三铁，二氧化硅的重量含量为0.05％至40％，其粒径范围为100nm至10μm。

9.如权利要求8所述的超顺磁性粒子，其饱和磁化量大于35emu/g。

10.一种活化的超顺磁性粒子，其由如权利要求2所述的方法制得，其在高盐环境下对核酸分子具有强吸附力。

11.一种表面具有官能基的超顺磁性粒子，其由如权利要求4所述的方法制得。

12.如权利要求11所述的超顺磁性粒子，当前述超顺磁性粒子表面所具有的官能基是胺基，其利用羟基活化剂进行修饰，使其与具有羧基官能基的化合物键结。

13.如权利要求12所述的超顺磁性粒子，其中前述化合物为蛋白质。

14.如权利要求12所述的超顺磁性粒子，其中前述羟基活化剂为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳化二亚胺、二环己基碳化二亚胺或二异丙基碳化二亚胺。

15.如权利要求13所述的超顺磁性粒子，其中前述经羟基活化剂修饰后的超顺磁性粒子与蛋白质键结后，用以纯化抗体。

16.如权利要求15所述的超顺磁性粒子，其中前述蛋白质是蛋白质A、蛋白质G、抗体、酶或链霉亲合素。

17.如权利要求11所述的超顺磁性粒子，其表面进一步利用螯合剂修饰，使其与过渡金属离子螯合，纯化带有组氨酸的蛋白或磷酸化蛋白。

18.如权利要求17所述的超顺磁性粒子，其中前述螯合剂为三乙酸基氨、亚胺基二乙酸或乙底酸。

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