JP2004141160A - メチル化検出用オリゴヌクレオチド固定化基板 - Google Patents

Abstract

　　【課題】　ＤＮＡ中のメチル化シトシンを簡便、かつ、正確に検出する方法及びそれに必要なオリゴヌクレオチド固定化基板を提供する。
　　【解決手段】　ＣｐＧジヌクレオチドを含む標的配列を含む試料ＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドのＣのメチル化の有無を、基材上に固定化され、前記標的配列のすべてのＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドと、メチル化されていないシトシンを脱アミノ化してウラシルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物との間でハイブリダイゼーションを行い、前記ハイブリダイゼーションの結果によって、判定する。
　　【選択図】　図１

Description

　本発明は、ＤＮＡ上のシトシンのメチル化の検出用オリゴヌクレオチド固定化基板及び方法に関するものである。

　DNAのメチル化は、DNAの複製や発現の調節において重要な役割を果たしている。真核細胞のDNAのメチル化は、Ｇ（グアニン）の５’側に位置するＣ（シトシン）（以下、「CpGジヌクレオチド」という）の５’位で生じることが多い。特に多くの遺伝子のプロモーター領域には多くのCpGジヌクレオチドが見られ、CpGアイランドと呼ばれている（非特許文献１）。一般に、常染色体のこれらCpGアイランドの大部分はメチル化されているが、プロモーター領域に密集して存在するCpGアイランドはメチル化されていない(非特許文献２）。また、白血病や骨髄腫において、ガン抑制遺伝子であるP16やP15のプロモーター領域のCpGアイランドがメチル化され、その結果これらの遺伝子が不活化されるか発現量の変化によってガン化することが知られている（非特許文献３、４）。

　また、Ｇ以外のヌクレオチドの５’側に位置するＣも、メチル化を受けることが報告されている（非特許文献５）。
　さらに、メチル化はエピジェネティックな変化を司るDNAの修飾方法であり、ゲノムインプリンティングでは、発現抑制のために対立する遺伝子のどちらかがメチル化されることで発現が抑制され、どちらかの親由来の遺伝子が発現する機構がある。したがってメチル化状態が変化すると胎生致死や遺伝病などの発症などを引き起こすこともある（非特許文献６、７、８）
　以上のようなことから、シトシンのメチル化は、遺伝子の発現制御で大きな役割を担っていると考えられている。したがって、メチル化の有無の検出は、疾病の治療および予後を推し量る上で重要な情報である。

　従来、例えば細胞の癌化を引き起こすと考えられているMGMT、hMLH1、MRD1等の遺伝子のプロモーター領域では、メチル化の有無は、CpGアイランドの中でもCpGジヌクレオチド毎に異なっていると考えられてきた（図１Ａ）。したがって、キャプチャーオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションによりメチル化を検出しようとする場合、メチル化のパターンに応じた数のキャプチャーオリゴヌクレオチドが用いられてきた。そのため、キャプチャーオリゴヌクレオチドの設計及び合成は煩雑となり、検出に高価な装置も必要であった。

　ところで、５−メチルシトシンを検出する方法として、染色体ＤＮＡを、５−メチルシトシンとシトシンが異なった反応をする化学試薬で処理し、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションとポリメラーゼ反応を行い、メチル化状態により伸長が左右されることによって、５−メチルシトシンを検出する方法が開示されている（特許文献１）。この方法においても、５−メチルシトシンの検出は、個々に行われる。

国際公開第01/62064号パンフレット（WO 01/62064 A2） Bird, A., Cell, 70, 5-8, 1992 Ng, H-H. et al., Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 158-163, 1999 Shu-Xia Gao et al., Leukemia Res., 24, 39-46, 2000 M. Gonzalez et al., Leukemia, 14, 183-187, 2000 Gruenbaum, H., et al 1981. Nature 292:860-62 Li, E., et al., Cell, 69, 915-926, 1992 Okano, M., et al., Cell, 99, 247-257, 1999 Xu, G-L., Nature, 402, 187-191, 1999

　本発明は、ＤＮＡ中のメチル化シトシンを簡便に検出する方法及びそれに必要なオリゴヌクレオチド固定化基板を提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の領域中のCpGアイランドにおけるシトシンのメチル化は、個々のCpGジヌクレオチド毎に異なっているものではなく、ほとんどのCpGジヌクレオチドでメチル化されているか、されていないかに二分されていることを見い出した（図１Ｂ、Ｃ）。さらに、そして、すべてのCpGジヌクレオチドにおいてメチル化された配列を検出し得るオリゴヌクレオチドと、全くメチル化されていない配列を検出し得るオリゴヌクレオチドを用いることにより、メチル化の有無を検出できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。

（１）試料ＤＮＡ中のＣのメチル化の有無を検出するために用いられ、複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドが基材上に固定化された、オリゴヌクレオチド固定化基板であって、
　前記試料ＤＮＡは、メチル化され得るＣと、その３’側に存在するＧとからなるジヌクレオチド（以下、「ＣｐＧジヌクレオチド」という）を複数箇所に含む標的配列を含み、
　前記複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドは、前記標的配列のすべてのＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、
　メチル化されていないシトシンを脱アミノ化してウラシルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物とキャプチャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、前記メチル化の有無を検出する、オリゴヌクレオチド固定化基板。
（２）前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが基材上にドット状で固定化され、各々のドットの占有面積が０．１ｃｍ²以下である（１）に記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
（３）前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが１００ｍｅｒ以下のオリゴヌクレオチドである（１）又は（２）に記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
（４）前記試料ＤＮＡは複数の標的配列を含み、各々の標的配列に対応するキャプチャーオリゴヌクレオチドが固定化された（１）〜（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
（５）ＣｐＧジヌクレオチドを含む標的配列を含む試料ＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドのＣのメチル化の有無を検出する方法であって、
　基材上に固定化され、前記標的配列のすべてのＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のすべて
のＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドと、メチル化されていないシトシンを脱アミノ化してウラシルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物との間でハイブリダイゼーションを行い、
　前記ハイブリダイゼーションの結果によって前記メチル化の有無を判定することを特徴とする方法。
（６）試料ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理することによって、前記メチル化されていないシトシンを脱アミノ化する、（５）に記載の方法。

　本発明によれば、多数のオリゴヌクレオチドを必要とせずに、ＤＮＡ中のメチル化シトシンを簡便、かつ、正確に検出することができる。

　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のオリゴヌクレオチド固定化基板は、試料ＤＮＡ中のＣのメチル化の有無を検出するために用いられるものである。試料ＤＮＡはメチル化され得るＣと、その３’側のＧからなるジヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチド）を複数箇所に含む標的配列を含む。標的配列は、試料ＤＮＡにつき一個存在してもよく、複数存在してもよい。

　前記オリゴヌクレオチド固定化基板は、基材と、同基材上に固定化された複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドからなる。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、前記標的配列のすべてのＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、「Ｃ特異的オリゴヌクレオチド」ともいう）と、前記標的配列のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、「Ｔ特異的オリゴヌクレオチド」ともいう）を少なくとも含む。

　上記のようなキャプチャーオリゴヌクレオチドと、メチル化されていないＣを脱アミノ化してウラシルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物との間でハイブリダイゼーションを行うと、標的配列中のＣｐＧジヌクレオチドのＣがメチル化されている場合は、このＣはウラシルに変換されず、ＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のＣはウラシルに変換されるため、標的配列にＣ特異的オリゴヌクレオチドはハイブリダイズするが、Ｔ特異的オリゴヌクレオチドはハイブリダイズしない。一方、標的配列中のＣｐＧジヌクレオチドのＣがメチル化されていない場合は、このＣを含め、すべのＣがウラシルに変換されるため、標的配列にＣ特異的オリゴヌクレオチドはハイブリダイズしないが、Ｔ特異的オリゴヌクレオチドはハイブリダイズする。したがって、上記ハイブリダイゼーションの結果から、ＣｐＧジヌクレオチドのＣのメチル化の有無を検出することができる。

　尚、本発明においては、CpGアイランド中の個々のCpGジヌクレオチドにおけるメチル化を検出せずに、隣接する複数のCpGジヌクレオチドのメチル化をまとめて検出する。

　図１に、メチル化の状態のモデルを示す。（Ａ）は個々のＣｐＧ毎にメチル化の有無が異なる状態を示す。（Ｂ）は、隣接する複数のＣｐＧアイランドがメチル化されているか、あるいはメチル化されていない状態を示す。（Ｃ）は、すべてのＣｐＧがメチル化されていない状態を示す。このモデルにおいては、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、（Ｂ）のメチル化され得るＣｐＧアイランドのうち、隣接する複数のＣｐＧに対応するように設計される。その結果、Ｃ特異的オリゴヌクレオチドとＴ特異的オリゴヌクレオチドでは、２塩基以上の違いがある。したがって、一塩基の置換のみを検出する場合に比べて、高
感度かつ正確な検出が可能となる。

　本発明によりメチル化を検出する対象である試料ＤＮＡは、好ましくはヒトＤＮＡである。また、標的配列は、メチル化され得る領域であれば特に制限されないが、発癌に関与する遺伝子、例えばMGMT、hMLH1、MRD1、MINT31、CACNA1G、DCC、P16、MINT1、MINT2、COX2、p16、p14、p15、APC、RASSF1A、THBS1、COX2、MLH1、MGMT、GSTP1、DAPK、SOCS3、RUNX3、E-CADHERIN、CACNA1G、CHFR遺伝子が挙げられる。特に、このような遺伝子のプロモーター領域が好ましい。

　試料ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでも二本鎖ＤＮＡでもよい。一本鎖ＤＮＡの場合には、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、標的配列のＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のＣをＴに置換した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。一方、二本鎖ＤＮＡの場合は、標的配列を含む鎖と、それに対して相補的な配列を有する鎖を含んでおり、ＣｐＧジヌクレオチドは各々の鎖で対称的であるから、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡの場合と同じオリゴヌクレオチドであってもよく、それらに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。

　キャプチャーオリゴヌクレオチドは、複数塩基の相違をハイブリダイゼーションにより検出できるものであれば、配列及び長さは特に制限されないが、通常、１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜２５ｍｅｒ、特に好ましくは１３〜２５ｍｅｒの長さが好ましい。

　キャプチャーオリゴヌクレオチドとして用いるオリゴヌクレオチドは、通常の固相合成法によって、化学合成することができる。上記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、基板上に固定化される。一つの基板には、少なくとも一つの標的配列に対応するキャプチャーオリゴヌクレオチド対（Ｔ特異的オリゴヌクレオチド及びＣ特異的オリゴヌクレオチド）が固定化されるが、複数の標的配列に対応した複数のキャプチャーオリゴヌクレオチド対が固定化されてもよい。

　各々のオリゴヌクレオチドは、好ましくは５’末端部分又は３’末端部分で、基材に固定化される。本発明で用いる基材は、物理的吸着又は化学結合によってオリゴヌクレオチドを固定化することができ、通常のハイブリダイゼーションの条件に耐えうるものであれば特に制限されない。具体的には、オリゴヌクレオチドの固定及びハイブリダイゼーション等に用いる溶剤に不溶であり、かつ常温若しくはその付近の温度範囲内（例えば０℃〜１００℃）で固体又はゲル状であるものが挙げられる。尚、基材が溶剤に不溶性であるとは、基材に後述のようにしてカルボジイミド基等のオリゴヌクレオチドに結合性を有する基材が胆持され、ついでオリゴヌクレオチドが固定化され、その後、例えば、ＤＮＡチップ等として使用される際の各過程で用いられる水性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であることをいう。

　このような基材の材質として、具体的には、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙げられる。
　上記プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等が挙げられる。

　また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が挙げられる。
　また、金属として具体的には、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグ
ネット及びアパタイト等が挙げられる。

　また、天然高分子としては、ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及びそれら誘導体が挙げられる。
　また、セラミックとして具体的には、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。

　上記基材の形状としては、例えば、フィルム、平板、粒子、成形品（ビーズ、ストリップ、マルチウェルプレートのウェルまたはストリップ、チューブ、メッシュ、連続発砲フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、スライド及び細胞培養容器等）、ラテックス等を挙げることができる。また、それらの大きさについては、特に制限は無い。

　上記基材にオリゴヌクレオチドを固定化するにあたって、基材にオリゴヌクレオチドを直接固定化してもよく、担体を基材に担持させて、担体を介してオリゴヌクレオチドを基材に固定化してもよい。基材としては、基材自体がオリゴヌクレオチドに結合性を有していてもよく、オリゴヌクレオチドに結合性を有するリガンドを介してオリゴヌクレオチドを固定化できるものであってもよい。ここで、「担持」とは、基材にオリゴヌクレオチドを固定化する際や、オリゴヌクレオチド固定化基材をＤＮＡチップ等として使用する際等に用いられる水溶性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤中で、基材からオリゴヌクレオチドが実質的に脱離しないことを意味する。

　本発明に用いられる担体は、上記基材上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、基材上の全面において担持されても、また、その一部において胆持されてもよい。

　担体としては、有機低分子、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙げられる。
　上記有機低分子として具体的には、カルボジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、アミノ基含有化合物等が挙げられる。

　また、プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等が挙げられる。

　また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が挙げられる。
　また、金属として具体的には、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット及びアパタイト等が挙げられる。

　また、天然高分子としては、ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン及びそれらの誘導体が挙げられる。
　また、セラミックとして具体的には、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。

　このような担体は、上記基材に対して高い接着性を有するものであり、この接着性を利用して基材に担持されるものである。尚、前記担体が基材上に物理的な接着性を利用して担持される際の代表的な形態は皮膜である。前記基材上に前記担体を皮膜で担持させる方
法としては、スプレー、浸漬、ブラッシング、スタンプ、蒸着、フィルムコータを用いたコーティング等の公知の方法を用いることができる。

　例えば、ガラス基材の表面全体にカルボジイミド基を有する樹脂を担持させるには、まず、３−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ置換オルガノアルコキシシランを適当な溶媒に溶解して得られた溶液に、７０〜８０℃程度の温度条件下でガラス基材を概ね２〜３時間程度浸漬したあと、これを取り出して溶液を水洗し、さらに、１００〜１２０℃程度で約４〜５時間加熱乾燥する。乾燥後、適当な溶媒中に浸し、カルボジイミド樹脂を加え３０〜１７０℃程度の温度条件下で１２時間程度攪拌し洗浄すれば良い。また、上記３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基と窒素イペリット基のオリゴヌクレオチド結合基以外の官能基を適当な溶媒を用いて反応させ、ガラス基材の表面に窒素イペリット基を導入することもできる。

　また、ガラス基材にアミノ基以外の官能基を存在する場合や、基材がガラス以外の材料からなる場合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に種々の官能基を導入することは、従来より一般的に行われていることであり、その方法も公知であるので、このような公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を行うことができる。

　さらに、上記で挙げた基材のプラスチック基材の中には、基材表面に既に上記のような官能基を有するものも有り、この場合には基材表面に官能基を導入することなしに、これをそのまま基材の製造に用いることも可能である。また、このようなプラスチック基材であってもさらに官能基を導入して上記基材の製造に用いることも可能である。

　キャプチャーオリゴヌクレオチドは、上記のような基材上に、５’末端部分又は３’末端部分で固定化される。オリゴヌクレオチドの固定化の方法は、基材、基材表面の官能基、リガンドの種類等に応じて、適宜設定すればよい。

　キャプチャーオリゴヌクレオチドは、基材に固定化する末端側に、３塩基又はそれ以上の長さのホモポリマーを結合させてもよい。特に、表面にカルボジイミド基を有する基材を用いる場合、ホモポリマーを有するオリゴヌクレオチドは、基材により強固に固定化される。

　上記のようなオリゴヌクレオチドの末端にホモポリマーを結合する方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、市販されている核酸合成器を用いて、オリゴヌクレオチドの末端に核酸塩基が少なくとも３塩基以上重合するように、一体として合成する方法が挙げられる。また、ホモポリマーを、オリゴヌクレオチドと化学的または酵素的な手法を用いて結合する方法等が挙げられる。ホモポリマーを構成する核酸塩基は、核酸がＤＮＡである場合はアデニン、グアニン、シトシン又はチミンであり、ＲＮＡである場合はアデニン、グアニン、シトシン又はウラシルである。

　ホモポリマーの長さとしては、３塩基以上１００塩基以下が好ましく、５塩基以上５０塩基以下がより好ましく、１０塩基以上４０塩基以下が特に好ましい。この塩基数が２塩基以下であると、十分な量の核酸を基材上に固定できず、また、塩基数が１０１塩基以上であると核酸製造工程で著しく収率が低下する。

　また、ホモポリマーは、ある塩基から構成されるホモポリマーと、他の塩基から構成されるホモポリマーが連結したものであってもよい。
　また、オリゴヌクレオチドの５’末端は、アミノリンカーを介して固定化してもよい。

　オリゴヌクレオチドを固定化するに際し、基材上にオリゴヌクレオチドをドット状に固
定することが好ましい。ドット状に固定するとは、基材の大きさに対して、オリゴヌクレオチド固定部位が複数個所設けられる程度に充分小さいことをいう。前記ドットの形状は、特に制限されないが、通常は円形が好ましい。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、通常、基材上の複数個所に固定化され、いわゆるＤＮＡアレイ又はＤＮＡチップとして調製される。

　具体的には、例えば、オリゴヌクレオチドと基材との接触反応において固定化されるオリゴヌクレオチドの活性が維持されるように、通常、オリゴヌクレオチドは水またはバッファー中に含まれる形で供給される。また、接触の際の温度としては固定化されるオリゴヌクレオチドの活性が失われないように、概ね０〜１００℃とすることが好ましい。

　また、オリゴヌクレオチドと基材の接触後にUV等の電磁波を照射することによって固定することもできる。さらに、オリゴヌクレオチドとカルボジイミド樹脂、窒素イペリット、ポリアミノ酸、ニトロセルロール等の公知の化合物を化学的に結合又は物理的に結合した状態で、これら混合物と基材を接触させ固定させても良く、また、このときUV等の電磁波を照射して固定しても良い。

　本発明においてオリゴヌクレオチドを、通常は、オリゴヌクレオチドを含有する水またはバッファーを、基材にドット状に供給する手段として、ディスペンサを用いる方法、ピンを用いる方法、インクジェットを用いる方法等があるが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、このように溶液を微量に供給する装置は、一般に市販されており、本発明においてもこれらを用いることが可能である。

　キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基材は、試料ＤＮＡが非特異的に結合することを防ぐため、上記のようにしてドット状にキャプチャーオリゴヌクレオチドを基材に固定化した後に、過剰量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、サケ精子ＤＮＡ等を接触させ、未反応部分をブロックしておくことが好ましい。

　本発明は、上記キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板を用い、キャプチャーオリゴヌクレオチドと試料ＤＮＡ、又は又はその増幅産物との間でのハイブリダイゼーションを行う。

　試料ＤＮＡは、ＣｐＧジヌクレオチドを含み、Ｃのメチル化の存在が予想されるものであれば特に制限されず、目的に応じて、種々の生物由来のＤＮＡが使用される。試料ＤＮＡは、微生物細胞、又は動物もしくは植物の種々の組織から調製される。試料ＤＮＡの調製は、通常の細胞からのＤＮＡの調製と同様にして行うことができる。また、試料ＤＮＡとしては、細胞から調製したＤＮＡをそのまま使用することもできるが、ＰＣＲ法等によって標的配列又は標的配列を含む領域を増幅したものを用いてもよい。

　従来のメチレーション特異的PCRでは、１箇所のCpGについて少なくとも３種類のプライマーが必要となるが、本発明においては２種類のプライマーで、複数のCpGを含む領域の増幅を行うことができる。また、メチレーション特異的PCRでは、プライマーの３'末端がCpGのシトシンに対応するように設計されるため、CpGアイランドのようにCpGジヌクレオチドが多数存在する場合は、比較的狭い範囲のCpGのメチル化しか検出することができない。一方、本発明においては、プライマーは、３'末端にCpGのＣが対応しないようにプライマーを設計すればよく、CpGのＣがメチル化されているか否かにかかわらず、PCR増幅が可能である。

　試料ＤＮＡ、又はその増幅産物は、ハイブリダイゼーションに先立ち、メチル化されていないＣを脱アミノ化してウラシルに変換させる。この非メチル化Ｃの選択的脱アミノ化
は、試料ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理することによって行うことができる。具体的には、試料ＤＮＡを含む溶液に重亜硫酸ナトリウム（pH5）を2.5Ｍ〜3.0Ｍとなるように加え、50℃で16時間加熱する（J. G. Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,
9821-9826, 1996）。加熱反応後シリカベースの精製用フィルターに試料DNAを吸着させ重亜硫酸ナトリウムを除去する。除去後シリカベースのフィルターより試料DNAを回収し、エタノール沈殿などで濃縮する。

　ハイブリダイゼーションの具体的方法は特に制限されないが、例えば、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板を、試料ＤＮＡを含む溶液に浸漬するか、基板上のキャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した部分に試料ＤＮＡを含む溶液をスポットすることによって、行うことができる。また、基板上のキャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した部分を囲むように枠で覆い、その中に試料ＤＮＡを含む溶液を流し込んでもよい。

　溶液は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションが可能であれば特に制限されず、各種緩衝液を用いることができる。例えば、pH6.5〜8程度のTris-HClが挙げられる。溶液は、通常、ＤＮＡやオリゴヌクレオチドの分子内で形成される塩基対が解離する程度の温度、例えば９０〜１００℃程度に高められた後、キャプチャーオリゴヌクレオチドと試料核酸中の標的配列がアニールする温度に調整される。具体的には、キャプチャーオリゴヌクレオチドの長さにもよるが、通常５〜８０℃であることが好ましい。

　ハイブリダイゼーションの検出の方法は特に制限されないが、例えば、試料核酸を予め標識物質で標識しておき、ハイブリダイゼーションに続いて基板を洗浄た後に、標識を検出することによって、行うことができる。標識物質としては、特に制限されないが、通常ハイブリダイゼーションの検出に用いられている物質、例えば放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、又は抗原等が挙げられる。例えば、標識物質としてビオチンを用いた場合、ハイブリダイゼーション操作後に、ビオチンに特異的に結合する蛋白質（アビジン又はストレプトアビジン）とこれに化学的に結合された酵素の複合体を結合させ、更に同酵素によって分解されると沈着性の色素を形成する化合物を加えて反応を行うと、ハイブリダイゼーションの有無及び位置を容易に検出することができる。

　以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。しかしながら、本発明はこの遺伝子のみに適用されるものではない。

〔実施例１〕
＜１＞オリゴヌクレオチドの合成
　常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Perkin-elmer Applied biosystems）を用いて、配列番号１〜１３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。尚、配列番号３、４、５に示すオリゴヌクレオチドは、５’末端をビオチン化した。これらのオリゴヌクレオチドを1pmol/μlになるように1×TE緩衝液（10mM Tris塩酸, pH 8／1mM EDTA）に溶解した。

＜２＞キャプチャーオリゴヌクレオチドの基板への固定化
　特開平８−３３４５０９号公報に記載の方法にしたがって作製したポリカルボジイミド樹脂コートスライドガラスの所定の位置に、上記配列番号６〜１３のオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、３箇所づつスポットした。スポットの量は0.5μlづつであり、スポットの大きさは直径約１mmであった。この平板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にUvstratalinker 2400（STRATAGENE社製）を用い、波長280nmを含む紫外線を600mJ/cm²照射した。その後、前記スライドガラスを水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥さ
せた。

　一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（1×TE緩衝液）も同様にスライドガラスにスポットし、固定化の操作を行った。

＜３＞核酸プローブの調製（被検生体試料中のDNAの重亜硫酸修飾及びPCR反応）
　大腸癌と診断された癌患者について、同一患者の患部細胞及び通常細胞からMGMT蛋白質をコードする遺伝子プロモーター領域のCpG領域のPCR増幅をそれぞれ行なった。同領域の塩基配列を配列番号１４に示す。同配列中、「y」は、「c」又は「t」を表す。また、同塩基配列と、各プライマー（配列番号１〜５）及びキャプチャーオリゴヌクレオチド（配列番号６〜１３）の対応する位置を、図２に示す。

　検体１〜１０はいずれも手術の実施以前に化学療法及び放射線療法を受けていない患者に由来するものである。被検体生体試料は手術時に切除し、直ちに−８０℃にて凍結保存した。

　上記生体試料からDNAを通常のフェノール/クロロホルム法で抽出し、得られたDNA１００ｎｇに対し、DNA修飾キット[CpGenome（Intergen社）]を用いて重亜硫酸ナトリウムによる非メチル化シトシンの修飾を行なった。

　次いで、重亜硫酸ナトリウム修飾済みのDNAをテンプレートとして、配列番号１及び配列番号２に示すPCRプライマーを用いてそれぞれPCR増幅を行なった。さらに、得られたPCR産物１μLをテンプレートとして、配列番号３及び配列番号４（癌細胞由来遺伝子をテンプレートとした。）あるいは配列番号４及び配列番号５（通常細胞由来遺伝子をテンプレートとした。）に示すPCRプライマーを用いてそれぞれPCR増幅を行なった。得られたPCR産物の塩基数をアガロース電気泳動・エチジウムブロマイド染色にて分析すると、癌細胞由来及び通常細胞由来の検体１〜１０はすべて約５００ｂｐであった。得られた核酸プローブはビオチンで標識されている。

＜４＞ハイブリダイゼーション
　前記オリゴヌクレオチド固定化スライドガラスの核酸を固定化した部分に、癌細胞由来及び通常細胞由来の検体１の核酸プローブ（約500bp）を含むハイブリダイゼーション溶液Arrayit UniHyb (Telechem International, Inc.）10μlを載せ、スライドガラスに水が浸入しないケース（ハイブリカセット、Telechem International Inc.）に入れて、そのケースごとウォーターバスに沈め、45℃で１時間加熱した。

＜５＞ポストハイブリダイゼーション
　上記ハイブリダイゼーションの後、2×SSCを用いて、室温で１分間ポストハイブリダイゼーション洗浄を１回行い、オリゴヌクレオチド固定化スライドガラスに非特異的に吸着したプローブを除去した。

＜６＞固定化されたオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーションの検出
　スライドガラスのハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に、乳タンパクを含むブロッキング溶液（ブロックエース　雪印乳業製）1.5mlを載せ、室温で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除いた後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート溶液（VECTOR社製）を1.5ml載せ、室温で30分間反応させた。

　つぎに、スライドガラスをTBST（50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20）溶液に浸し、５分間振とうして反応しなかったコンジュゲートを除去した。最後に、スライドガラスのハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に基質溶液（TMB）を1.5ml載せ
て、３０分間放置し、発色反応を行った。

　その結果を表１に示す。配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２に示すオリゴマーは、癌細胞由来DNAと相補的であり、配列番号７、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３に示すオリゴマーは、通常細胞由来DNAと相補的である。

　表１の結果から明らかなように、２塩基以上の違いを含む配列を検出することによって、癌細胞由来DNAと通常細胞由来DNAを明瞭に区別することができた。

〔実施例２〕
＜１＞オリゴヌクレオチドの合成
　常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Perkin-elmer Applied biosystems）を用いて、配列番号１５〜２８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。尚、配列番号１５及び１６に示すオリゴヌクレオチドは、５'末端をビオチン化した。これらのオリゴヌクレオチドを1pmol/μlになるように1×TE緩衝液（10mM Tris塩酸, pH 8／1mM EDTA）に溶解した。

＜２＞キャプチャーオリゴヌクレオチドの基板への固定化
　実施例１と同様にして、ポリカルボジイミド樹脂コートスライドガラスに、配列番号１５〜２８のオリゴヌクレオチドを固定化した。

　一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（1×TE緩衝液）も同様にスライドガラスにスポットし、固定化の操作を行った。

＜３＞核酸プローブの調製（被検生体試料中のDNAの重亜硫酸修飾及びPCR反応）
　大腸癌と診断された癌患者について、同一患者の患部細胞及び通常細胞からhMLH1蛋白質をコードする遺伝子プロモーター領域のCpG領域のPCR増幅をそれぞれ行なった。同領域の塩基配列を配列番号２９に示す。同配列中、「y」は、「c」又は「t」を表す。また、同塩基配列と、各プライマー（配列番号１５及び１６）及びキャプチャーオリゴヌクレオチド（配列番号１７〜２８）の対応する位置を、図３に示す。
　検体１１及び１２はいずれも手術の実施以前に化学療法及び放射線療法を受けていない患者に由来するものである。被検体生体試料は手術時に切除し、直ちに−８０℃にて凍結保存した。
　上記生体試料からDNAを通常のフェノール/クロロホルム法で抽出し、得られたDNA１００ｎｇに対し、DNA修飾キット[CpGenome（Intergen社）]を用いて重亜硫酸ナトリウムによる非メチル化シトシンの修飾を行なった。

　次いで、重亜硫酸ナトリウム修飾済みのDNAをテンプレートとして、配列番号１５及び配列番号１６に示すPCRプライマーを用いてそれぞれPCR増幅を行なった。得られたPCR産物の塩基数をアガロース電気泳動・エチジウムブロマイド染色にて分析すると、癌細胞由来及び通常細胞由来の検体１１及び１２はすべて約７８０ｂｐであった。得られた核酸プローブはビオチンで標識されている。

＜４＞ハイブリダイゼーション
　前記オリゴヌクレオチド固定化スライドガラスの核酸を固定化した部分に、癌細胞由来及び通常細胞由来の検体１１の核酸プローブ（約780bp）を含むハイブリダイゼーション溶液Arrayit UniHyb (Telechem International, Inc.)20μlを載せ、スライドガラスに水が浸入しないケース（ハイブリカセット、Telechem International Inc.）に入れて、そのケースごとウォーターバスに沈め、55℃で2時間加熱した。

＜５＞ポストハイブリダイゼーション、固定化されたオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーションの検出
　実施例１と同様にして、ポストハイブリダイゼーション、固定化されたオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーションの検出を行った。

　その結果を表２に示す。配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７に示すオリゴマーは、癌細胞由来DNAと相補的であり、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８に示すオリゴマーは、通常細胞由来DNAと相補的である。

　表２の結果から明らかなように、２塩基以上の違いを含む配列を検出することによって、癌細胞由来DNAと通常細胞由来DNAを明瞭に区別することができた。

ＣｐＧのメチル化のモデルを示す図。●はＣｐＧのＣがメチル化されている状態を、○はメチル化されていない状態を表す。　（Ａ）は個々のＣｐＧ毎にメチル化の有無が異なる状態を、（Ｂ）は隣接する複数のＣｐＧアイランドがメチル化されているか、あるいはメチル化されていない状態を、（Ｃ）は、すべてのＣｐＧがメチル化されていない状態を示す。 MGMT蛋白質をコードする遺伝子プロモーター領域の配列と、ＰＣＲ用プライマー及びキャプチャーオリゴヌクレオチドの対応する位置を示す図。 hMLH1蛋白質をコードする遺伝子プロモーター領域の配列と、ＰＣＲ用プライマー及びキャプチャーオリゴヌクレオチドの対応する位置を示す図。

Claims (6)

1. 試料ＤＮＡ中のＣのメチル化の有無を検出するために用いられ、複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドが基材上に固定化された、オリゴヌクレオチド固定化基板であって、
   　前記試料ＤＮＡは、メチル化され得るＣと、その３’側に存在するＧとからなるジヌクレオチド（以下、「ＣｐＧジヌクレオチド」という）を複数箇所に含む標的配列を含み、
   　前記複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドは、前記標的配列のすべてのＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、
   　メチル化されていないシトシンを脱アミノ化してウラシルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物とキャプチャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、前記メチル化の有無を検出する、オリゴヌクレオチド固定化基板。
2. 前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが基材上にドット状で固定化され、各々のドットの占有面積が０．１ｃｍ²以下である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
3. 前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが１００ｍｅｒ以下のオリゴヌクレオチドである請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
4. 前記試料ＤＮＡは複数の標的配列を含み、各々の標的配列に対応するキャプチャーオリゴヌクレオチドが固定化された請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド固定化基板。
5. ＣｐＧジヌクレオチドを含む標的配列を含む試料ＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドのＣのメチル化の有無を検出する方法であって、
   　基材上に固定化され、前記標的配列のすべてのＣｐＧジヌクレオチドのＣ以外のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記標的配列のすべてのＣをＴに置換した塩基配列に相補的又は同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む複数のキャプチャーオリゴヌクレオチドと、メチル化されていないシトシンを脱アミノ化してウラシルに変換させた試料ＤＮＡ又はその増幅産物との間でハイブリダイゼーションを行い、
   　前記ハイブリダイゼーションの結果によって前記メチル化の有無を判定することを特徴とする方法。
6. 試料ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理することによって、前記メチル化されていないシトシンを脱アミノ化する、請求項５に記載の方法。
   

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