JP4019167B2 - 核酸とダイヤモンドの結合方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸とダイヤモンドの結合方法及びこの方法に使用するダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体並びにこのダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体に核酸を結合したダイヤモンド・核酸結合体に関する。
さらに詳しくは、例えばDNAチップとして、あるいはDNA・RNAセンサ、DNA・RNA・タンパク質・酵素の分離カラムなどとして、その他多くの分野で優れた有用性が期待できるダイヤモンドを固定基材とする核酸固定方法及びこの方法に使用するダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体並びにこのダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体に核酸を結合したダイヤモンド・核酸結合体に関する。
【0002】
【従来の技術】
DNAを固定する技術には、スライドガラスを固定基材としてDNAを固定する技術があり、DNAチップとして良く知られている。
DNAチップは、例えばDNAセンサとして利用する。例えば、検出目標となるDNA配列に対して相補的な関係にある塩基配列のDNAをガラス表面に結合させると、検出目標となるDNA配列の核酸が存在していた場合、ガラス表面の核酸と結合し合って選択的に取り出されてくる。これによって、検出目標となるDNA核酸の存否を確認することができ、また、物理化学的な特性試験も可能になり、医薬品の効果試験などもこのようにして行っている。
固定基材とDNAとを結合する技術は、最近始まったばかりである。その技術開発は多くの分野から様々に期待され、より優れた技術の早急な実現が望まれている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
従来、核酸の塩基配列検定(同定)の方法には、ポリL−リシンで被覆したスライドガラスに、あるいはナイロン膜等に、多数の異なった塩基配列をもつDNAを微小スポット状に付着、配列させたDNAチップ(DNAマイクロアレーとも呼ばれる)が用いられている。前者では、基材とは別な化合物(中間化合物)を介してDNAを固定しており、ガラスとの結合は間接的で、基材と中間層、中間層とDNAの結合はいずれもファンデルワールス力、あるいは弱い静電的な結合によっている。また、ナイロン膜でも、現在用いられている他の基材との直接的な固定の場合にも、基材とDNAの結合は、強固な化学結合によるものではなく、ファンデルワールス力あるいは弱い静電力によっている。結合力が弱いために、検定のための種々の操作に対してしばしばDNAが基材から剥離したり、他のスポットに混入するなどの不便さがあり、検査対象となるDNAの正確な特性を把握できない場合があるという不都合もあった。また、基材の生体適合性が低いためにDNAの変質を誘起する場合もあるという不便さもあった。
以上のような、幾つかの解決すべき課題に鑑み、本発明は、核酸との化学的な結合性が強固で化学的安定性に優れ、有機溶媒、酸またはアルカリ液中で化学的安定性に優れ、核酸の結合密度が高く、かつ、生体親和性、生体適合性に優れた核酸チップを実現できる、核酸とダイヤモンドの結合方法を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明の核酸とダイヤモンドの結合方法は、ダイヤモンドの表面を、マイクロ波水素プラズマに晒してこのダイヤモンド表面を平滑化すると共に水素化し、酸で酸化し、アルカリで加水分解することでカルボキシル基を形成し、このカルボキシル基の水酸基をハロゲン化剤でハロゲン化し、ハロゲン化したカルボキシル基とモノヌクレオシドとを、触媒を含んだ有機溶媒中のエステル反応で結合させて、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体を形成する工程(1)と、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体と核酸とを、酵素を含んだ緩衝液中でライゲーション酵素反応により相補結合させる工程(2)と、によりダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体と上記核酸とを結合し、ダイヤモンド・核酸結合体を得ることを特徴とする。
この構成によれば、ダイヤモンドが結晶であることから、表面の炭素原子のダングリングボンドを核酸との結合に使用することができ、核酸との結合点が密に、そして均一にできる。また、ダイヤモンドのダングリングボンドとの化学結合は結合エネルギーが大きいので、ダングリングボンドと核酸との結合をヌクレオシドを介して強固にできる。また、ダイヤモンドの炭素原子は化学的に不活性であるので、生体適合性が高く、核酸の変質を誘起することがない。
【0005】
上記モノヌクレオシドは、好ましくは、チミジン、アデノシン、グアノシン、シトシン又はウリジンのいずれかである。この構成により、目的とする核酸の種類に応じたモノヌクレオシドをダイヤモンド表面に結合させることによって、目的の核酸を塩基の相補結合により結合させることができる。
【0006】
好ましくは、酸は、硝酸及び硫酸の混合液であり、アルカリは、苛性ソーダである。
この構成により、ダイヤモンド表面の炭素原子にカルボキシル基を形成することができる。
【0007】
ハロゲン化剤は、好ましくは、塩化チオニル、三塩化リン又は五塩化リンのいずれか、またはこれらの組み合わせでなる。
この構成により、カルボキシル基がハロゲン化され、モノヌクレオシドとエステル化結合することができる。
【0008】
上記エステル反応において、好ましくは、触媒が4−ジメチルアミノピリジンであり、有機溶媒が無水ピリジンである。好ましくは、ダイヤモンドを混酸液に浸漬した後、ダイヤモンドを加熱し、マイクロ波水素プラズマに晒す処理を行う。
この構成により、ダイヤモンド表面の炭素原子にモノヌクレオシドが結合した、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体を形成できる。
【0009】
上記酵素を含んだ緩衝液は、好ましくは、核酸の末端がアデノシンであり、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体のモノヌクレオシドがチミジンである場合に、酵素がT4DNALigaseであり、緩衝液がポリアミンと2価金属塩とポリエチレングリコールとの混合液である。
この構成により、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体のモノヌクレオシドと核酸の末端の塩基とが相補結合し、ダイヤモンド固定基材に目的の核酸を固定できる。
【0010】
上記構成において、ダイヤモンド・核酸結合体に、好ましくは、核酸蛍光染色剤を加える。
この構成により、目的の核酸が存在していれば蛍光を発し、存在していなければ蛍光を発しないことから、目的の核酸の存否を検出することができる。
【0014】
本発明は、発明者の下記の知見に基づいて成された。
ダイヤモンドは特異な性質を有する。本発明は、ダイヤモンドの特異な性質を遺伝子工学分野に効果的に応用したものである。
【0015】
i)表面安定性
ダイヤモンドは、炭素原子同士の強固な共有結合体で構成されている。表面の炭素原子は、水素、酸素、フッ素等と強固な結合、すなわち安定な化学吸着状態を形成することができる。化学吸着した水素は、室温以上でも200℃程度までなら空気にさらされても安定である。ダイヤモンドの表面状態は変化しない。ダイヤモンドのこうした性質は、他の多くの半導体や金属と対照的である。多くの半導体や金属は、表面が容易に酸化されてそこに酸化物相を形成する。このほか、上記の元素を化学吸着したダイヤモンドの表面は、エタノール等の有機溶媒に対しても不活性で安定である。
【0016】
ii) 生体適合性
ダイヤモンドの同素体である黒鉛材料(炭素材料)等は、生体親和性、生体適合性に優れていることが既によく知られている。ダイヤモンドの生体適合性は黒鉛ほどは詳しく知られていないが、適切な表面制御によってダイヤモンドにも同様な性質を付加することができる。
【0017】
iii)導電性
ダイヤモンドは、上記の優れた性質を損なわせることなく導電性を付与することができる。導電性ダイヤモンドを得るには、ホウ素(p型)、リン(n型)、イオウ(n型)等の不純物をドーピングしても良い。或いはまた、表面だけを導電性にするには、表面に水素を吸着させることによって実現できる。炭素のナノチューブを使用すれば、超極微細な配線が可能になる。
【0018】
本発明は、有機化学反応技術と遺伝子工学技術を利用して、化学結合によってDNAとダイヤモンド表面とを結合させる。その結果、核酸がダイヤモンドと化学結合した強固な結合が得られる。核酸とダイヤモンドとの結合が強固で化学的に安定であり、また、上記i)で説明したように、ダイヤモンド表面が安定であるので、化学的、あるいは物理的な加工を加えても、核酸とダイヤモンドとの結合が切れたり、好ましくない副反応が生じたりせず、信頼性のあるデータを取得することができる。
【0019】
また、DNAセンサによるDNAの試験においては、固定基材表面に結合した核酸分子を他の核酸、アミノ酸又はタンパク質・酵素等の生体分子と接触させる。上記ii)で説明したように、ダイヤモンドは生体適合性が優れているので、好ましくない副反応が生じたりして核酸が変質せず、信頼性のあるデータを取得することができる。
【0020】
また、核酸とダイヤモンドが化学的に安定な結合状態にあり、また、上記iii)で説明したようにダイヤモンドは表面安定性及び生体適合性を犠牲にすることなく導電性を付加できるので、核酸で生じた状態変化をダイヤモンド側で電気信号として検出することができる。例えば、ダイヤモンド表面に核酸が結合したとき、或いは、ダイヤモンド表面に結合した核酸が生体接触したとき等の核酸の状態変化に伴って、核酸とダイヤモンド表面との間で、電荷移動(電子又はホール)あるいは双極子相互作用の変化が生じ、ダイヤモンド側で電気信号として検出可能である。
【0021】
したがって、本発明のダイヤモンド固定基材による核酸検出方法及びダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体並びにダイヤモンド・核酸結合体を用いれば、目的の核酸を高密度にかつ安定に検出することができ、また、化学的な結合が強固で化学的安定性に優れ、有機溶媒、酸または弱アルカリ液中などでも使用可能なダイヤモンド・核酸結合体を提供することができる。
また、本発明の核酸センサを用いれば、電気的に核酸の存否、または、核酸の状態変化を検出できる。
【0022】
【発明の実施の形態】
以下、実施の一形態を説明するが、本発明は下記の実施形態に限定されないことは勿論である。
本実施の形態のダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体は、ダイヤモンドを固定基材としている。
モノヌクレオシドと結合するダイヤモンドは、天然ダイヤモンドでもよく、人工ダイヤモンドでもよい。一般に、天然ダイヤモンドとしては、Ia、IIa、IIb形がある。人工ダイヤモンドとしては、Ib、IIa、IIb形がある。本実施の形態では、いずれも好ましく使用できる。
ダイヤモンドは不純物をドーピングすることによって、電気伝導度、表面構造、表面特性等の物理的あるいは化学的な性質を変化させることができる。例えば、ホウ素、リン、イオウなどをドーピングしたダイヤモンドは、p型及びn型導電性を示す。この導電性を利用して核酸の状態変化の結果生じる電荷移動、例えば、核酸とダイヤモンドの結合の結果生じる電荷移動を検出しても良い。p型層とn型層を積層してpnジャンクションを形成し、この接合を利用して、上記電荷移動を検出しても良い。ドーピングされたダイヤモンドは、高い電気抵抗を示す場合もあり、また、その他の優れた物理的化学的性質を示すこともある。特定の表面だけに水素を吸着させたダイヤモンドは、特定の表面だけが導電性を有する。表面の特定のサイトを導電性の高分子で結んだり、炭素のナノチューブで部分的に結んだダイヤモンドは、特定のラインだけが導電性である。
ダイヤモンド・核酸結合体の使用用途に応じて、これらのダイヤモンドを適宜選択することができる。
【0023】
ダイヤモンドの粒径は、基本的には大きな問題にならない。粒径が極めて小さいものから、表面積が例えば十数mm2 程度の比較的大きなものまで幅広く利用できる。粒径や表面積などは用途に応じて適切に選択すればよい。形状も問わない。例えば、板状でもよい。粒径に言及すれば一般的に、例えば2〜5μm、更に好ましくは1〜2μmが最も望ましい場合が多い。粒径が1μm未満であれば有機化学反応時にダイヤモンドの分離作業が行いづらくなり、好ましくない恐れもある。100μmを超えると、単位質量当たりの表面積が狭くなる。反応量の減少につながり、反応の有無をたとえば蛍光で確認するような場合、確認しづらくなる場合もある。
【0024】
また、結晶面の違いも基本的に大きな問題とならない。表面での結合サイト(核酸の結合点)の配列の対称性、サイト間の距離などには結晶面によって差異があり、結合する分子同士の立体的障害を考慮すると、結合可能な核酸分子の最大密度や、結合分子と結晶面との成す角度、分子の回転の自由度などが結晶面に依存する。必要な場合には結晶面の選択を行うことができる。
また、結晶表面のステップ、キンクなどの特異なサイトでの結合は、平坦な結晶表面とは異なった配列構造をとるので、目的によっては、この配列構造を有効に生かすことができる。
【0025】
さらに、ダイヤモンドはその多結晶体も固定基材として有効に利用できる。CVD法によれば種々の形態のダイヤモンド多結晶体、すなわち、粒子状、膜状(板状)、針状(繊維状)、網目状ダイヤモンドを合成することができる。CVD法では多結晶膜を他の基材上に析出させる技術は最も広く応用されており、これを利用し、まず必要とする形状、構造を持った基板を作成し、その表面をダイヤモンドで被覆することにより、目的とする形状、構造を有するダイヤモンド基材を作成することができる。また、形状の制御は合成のみでなく酸素、フッ素、水素などのガスによる熱エッチング、あるいはこれら元素を含むガスによるプラズマエッチング、あるいはイオンスパッタエッチングなどによって行うことができる。エッチングは、微細な表面形態、例えばマイクロファセット、および、ナノオーダーからミクロンオーダーの針状ダイヤモンドの集合体などを形成するのに有効である。多結晶体を構成する粒子の大きさはナノメートルであっても、または、数ミクロン以上であっても基本的に大きな問題とはならない。このように多結晶体は、用途に応じた多様な形状を有するダイヤモンド固定基材の構築に利用することができる。
【0026】
核酸にはDNAとRNAとがある。本実施の形態ではどちらも好ましく使用できる。核酸は分子量の大小も問わない。ダイヤモンド表面には、構造式の異なるDNAとRNAとが組み合わさって混在していてもよいが、通常は、使用用途に適合した同一構造式の複製DNA又はRNAを均一に結合させて用いる。核酸としてDNAを結合させている場合、通常は二本鎖DNAとするとよい場合が多い。二本鎖DNAの場合、相補関係にある一方の核酸分子だけがダイヤモンド表面に結合し、他方の核酸分子は、ダイヤモンド表面に結合している方の核酸分子に相補的に結合することでダイヤモンドと間接的に結合されていてもよい。このようにすれば、二本鎖DNAでも一本鎖DNAにすることは可能である。
【0027】
ダイヤモンドと核酸との結合は、ダイヤモンド側からはダイヤモンド表面の炭素原子と、例えばエステル結合しているヌクレオシドを介して核酸と相補結合している。核酸側は、鎖状体の最端にあるヌクレオシド構造体が、ダイヤモンドの表面の炭素原子と、例えばエステル結合しているヌクレオシドと相補結合している。例えば核酸が、最端にアデノシン構造体を有している場合は、チミジン構造体がダイヤモンドの表面の炭素原子と例えばエステル結合している。
【0028】
核酸がダイヤモンドに結びついたダイヤモンド・核酸結合体は、例えば以下の方法で製造することができる。
3工程又は4工程で行うとよい。第1の工程は、ダイヤモンドの表面にモノヌクレオシドを結合させる工程である。第2の工程は、核酸本体を複製する工程である。第3の工程は、モノヌクレオシドの結合したダイヤモンドすなわち、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体と、核酸本体とを結合する工程である。ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体と、核酸本体とが結合すると、ダイヤモンドに核酸が結合したダイヤモンド・核酸結合体が得られる。第4の工程は、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体と、核酸本体との結合を確認する工程である。なお、必要量の核酸本体が予め十分確保されている場合には、第2の工程は省略することもできる。
【0029】
第1の工程は、例えば以下のようにして行うとよい。
ダイヤモンドを濃硝酸と濃硫酸との混酸液で加熱して表面を酸化させる。混酸の濃度比は、濃硝酸対濃硫酸の質量比で、1:8〜9がよい。
ダイヤモンドと混酸との混合比率は、ダイヤモンド100質量部に対し、混酸5000〜9000質量部がよい。反応温度は150〜200℃とし、反応時間は数(7〜8程度)時間〜3日間がよい。反応中、反応液は還流させるとよい。
【0030】
表面を混酸にさらしたダイヤモンドは、次いでアルカリで加水分解するとよい。加水分解に先だって、好ましくは純水で十分に洗浄する。加水分解に使用するアルカリは、例えばNaOH水溶液などが好適である。濃度は0.1〜0.2モル/リットルがよい。使用量は、ダイヤモンド100質量部に対し、アルカリ12〜20質量部とし得る。
反応温度は80〜90℃、反応時間は数(7〜8程度)時間〜3日間がよい。
次いで純水で洗浄し、乾燥後、強酸にさらす。例えば、濃度0.1〜0.2モル/リットルの塩酸などがよい。このようにすると、ダイヤモンドの表面に多くのカルボキシル基が形成される。
【0031】
なお、天然ダイヤモンド、市販のダイヤモンドを使用する場合には、硝酸と硫酸との混酸液等に浸漬し、金属不純物等を除去してから使用するのが好ましい。また、マイクロ波水素プラズマに晒してダイヤモンド表面を平滑化すれば、さらに再現性良くカルボキシル基を形成できる。この場合、ダイヤモンド表面の炭素原子は水素化されて、CH、CH2 、CH3 基等が生じ、さらに再現性良くカルボキシル基を形成できる。
【0032】
カルボキシル基が結合したダイヤモンド・カルボン酸は、次いでカルボン酸中の水酸基をハロゲン化する。これによってダイヤモンド・酸ハロゲン化物を得る。ハロゲン化剤としては、例えば塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リンなどを単独で又は組み合わせて用い、例えば塩素化するとよい。
得られたダイヤモンド・酸ハロゲン化物とモノヌクレオシドとを、次いで、有機溶媒中に導入して反応させ、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体を合成する。
【0033】
反応に供するモノヌクレオシドは、チミジン、アデノシン、グアノシン、シトシン、ウリジンいずれでもよい。これらの類似構造体でもよい。アデノシンとの反応容易性(相補性結合)を考慮する場合は反応に供するモノヌクレオシドとしてチミジンを選択するとよい。酸ハロゲン化物とモノヌクレオシドとの結合は、例えばエステル反応がよい。有機溶媒としては、例えば無水ピリジンなどを好ましく挙げることができる。反応触媒としては、4−ジメチルアミノピリジンなどがよい。反応温度は常温、反応時間は(3〜4)時間〜3日間が好ましい。
ダイヤモンド結晶表面の炭素原子がメチル基を構成した場合の例に基づき反応式を示す。メチル基に限らず、CH、CH2 または他のアルキル基であっても良い。〔C〕−CH3 の〔C〕はダイヤモンド結晶を示し、−Cはダイヤモンド結晶の表面炭素原子を示す。
【0034】
【化1】
【0035】
第2の工程は、例えば以下のようにして行うとよい。
好ましくは例えばPCR法を用いる。ダイヤモンドに結合する核酸の、情報を含む遺伝子に対し、当該範囲を転写するプライマーを関与させて増幅する。増幅はサーマルサイクラー装置などを使用して自動的に行なえばよい。
プライマーは、5’末端にリン酸基を付けておいたものを使用するとよい。このようにすると増幅された核酸の5’末端にリン酸基が結合する。PCR増幅したDNAの多くは、3’末端にアデノシンが結合しており、アデノシンが結合しているとこれに相補的なチミジンとのライゲーション(酵素反応)が円滑に進行する。
なお、増幅法はPCR法に限らない。手間、時間、回収率などを総合的に判断し、最適な方法を選択すればよい。
【0036】
第3の工程は、例えば以下のようにして行うとよい。
すなわち、鎖状の核酸本体分子と、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体とを結合反応させる。ダイヤモンドに結合しているモノヌクレオシドと鎖状の核酸本体分子の最端のヌクレオシド構造体とが相補的でない場合がある。その場合には、ダイヤモンドに結合しているモノヌクレオシドに相補的な関係にあるヌクレオシドを鎖状の核酸本体分子の最端に更に結合して伸長しておくとよい。相補的な関係にあるモノヌクレオシドが最端に現われるまで核酸本体分子を短縮してもよい。
【0037】
3’末端にアデノシンが結合している核酸と、チミジンが結合しているダイヤモンド・チミジン結合体とは、たとえばT4DNALigaseなどの存在下で結合させるとよい。結合反応は通常、緩衝液中で行う。緩衝液としては、ポリアミンと2価金属塩とポリエチレングリコールなどとの混合液を用いることが多い。2価金属塩としては、例えばMg2+塩などを用いる。宝酒造社(供給メーカー)からキット製品が販売されている。反応温度は16℃程度がよい。反応時間は90〜120時間である。通常はヒートブロック装置を使用して行えばよい。TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 (商品名)などが知られている。これはTAクローニング法を利用するライゲーション方法である。チミジンとアデノシンは相補的であることから、DNAの末端でベースペアができ、反応は容易に進行する。
反応式の一例を、ダイヤモンド・チミジン結合体と末端がアデノシンである2本鎖DNAとの結合反応の例で示す。COTはチミジンエステルを示している。チミジン構造部とアデノシン構造部は相補的に結合する。
【0038】
【化2】
【0039】
反応時間経過後、核酸が結合していると推定されるダイヤモンドから未反応のDNAを除去する。例えば水洗を行う。洗浄回数は5〜7回くり返すとよい。
【0040】
第4の工程は、例えば以下のようにして行う。
すなわち、核酸蛍光染色剤を加えて紫外線による蛍光検出を行う。DNA蛍光染色剤としては、例えば薬品名EtBr(エチジウムブロマイド)などを挙げることができる。一般にはGelster 液(商品名≪正式商品名 GelSter Nucleic Acid Stain ≫BMA社製)を用いれば便利でよい。
【0041】
蛍光検出は次のようにして行う。例えば、TBE緩衝液(Tris−Borate−EDTAbuffer)を0.5倍に希釈する。そのTBE緩衝希釈液にGelster 液を加え、Gelster 液をTBE緩衝希釈液で5000〜10000倍に希釈する。蛍光検出でTBE緩衝希釈液と比較するため、比較基準としてほぼ同量の純水をTBE緩衝希釈液とは別に用意する。0.5倍に希釈する前の通常濃度のTBE緩衝液は、トリスアミノメタンとホウ酸とEDTAとを純水に溶かして予め調製しておくとよい。通常濃度のTBE緩衝液は、TBE緩衝液全体量を1リットルとすれば、その中に通常、トリスアミノメタンが10.8g、ホウ酸が5.5g、0.5モル/リットル濃度のEDTA液を4ミリリットル程度導入する。
【0042】
次いで、Gelster 液を希釈したTBE緩衝希釈液に、核酸が結合していると推定されるダイヤモンドを導入する。核酸が結合している場合には、通常、約20分程度で結果が現れる。その際、核酸が結合していると推定されるダイヤモンドの一部を、比較基準として用意した純水にも導入する。
紫外線を照射し蛍光の有無を確認する。紫外線の波長は302〜312nmがよい。確認装置としては、トランスイルミネータを使うと良い。例えばフナコシ社製3UVトランスイルミネータ、型式NLMS−20等がある。同等程度の性能があれば機種を問わない。比較基準の純水には蛍光が確認されないで、Gelster 液を希釈したTBE緩衝希釈液には蛍光が確認されれば、核酸がダイヤモンドに結合していることが確認できたことになる。
なお、鎖状の核酸を結合していないダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体についても上記の方法に準じて蛍光試験を行い、比較して確認を行うとよい。
【0043】
このようにして得られる本実施の形態のダイヤモンド・核酸結合体は、化学的に安定であって、多くの有機溶媒、多くの酸性液、多くのアルカリ性液の中で安定に存在する。
例えば、有機溶媒としては、酢酸エチル、フェノール、クロロホルム、ピリジン、ベンゼン、四塩化炭素、ジメチルスルホキシド(DMSC)、ジメチルホルムアミド(DMF)などを挙げることができる。その他にもエタノールなどの多くのアルコール類を挙げることができる。これらの有機溶媒は単独で使用してもよく、物理化学的特性に沿って組み合わせて使用してもよい。
【0044】
酸性液としては、酢酸、安息香酸溶液、ホウ酸水、炭酸水なども挙げることができる。また、濃度0.1モル程度のフッ化水素水、濃度0.1モル程度の塩化水素水なども挙げることができる。これらの酸性液を単独で使用してもよく、物理化学的特性に沿って組み合わせて使用してもよい。
アルカリ性液としては、炭酸水素ナトリウム塩水溶液、第一リン酸ナトリウム塩(NaH2 PO3 )水溶液なども挙げることができる。これらは単独で使用してもよく、物理化学的特性に沿って組み合わせて使用してもよい。
【0045】
このようにして得られる本実施の形態のダイヤモンド・ヌクレオシド結合体は、以下のような分野で広く応用できると考えられる。波及効果の大きいと考えられるものを数例を示す。
【0046】
(1)DNAチップ技術への応用
DNAチップとして利用できる。現在、DNAチップとしては、スライドガラスを用いたDNAチップが存在する。スライドガラスを用いたDNAチップに比較して本実施の形態は、さらに安定的に信頼性の高い、集積度の高いチップとすることができる。
本実施の形態では、DNAの構成単位であるヌクレオシドが化学結合で強固にダイヤモンド基板に固定され、固定強度が安定している。基板であるダイヤモンド自身も化学的に安定である。その結果、本実施の形態のダイヤモンド・核酸結合体は、耐久性が高く、長い期間、当初の化学構造を安定的に維持することができる。分析データの信頼性も高い。種々の有機溶媒を使用することも可能である。ダイヤモンドの表面の格子点毎に結合サイトがあるから、DNAを平面的に高密度で配置することができる。ダイヤモンド自身が生体適合性をもつ材料であることから、生体分子の破壊や変質を誘起する可能性も少ない。
【0047】
(2) バイオセンサへの応用
一本鎖DNAへのハイブリダイゼーションによる遺伝子識別、あるいはDNAへの薬物作用の識別などの認識センサとして用いることができる。
例えば、DNAが作用する反応を電気的信号として取り出し、得られた電気的信号を素子内の論理回路で適宜に演算処理して同定し、特定の機能を実現させる。導電性ダイヤモンドを基板に用いることでこのような知的素子が可能となり、幅広い応用分野が期待できる。
DNAセンサは、他の分子と接触して生じた変化を何らかの信号で感度よく取り出す必要がある。DNAで何らかの新たな状態変化が起きれば、DNAとダイヤモンドの間で、電気的エネルギーの移動、電荷移動、あるいは双極子相互作用の変化が生じる。導電性のダイヤモンドを使用すれば、これらの電気的変化を取り出すことができ、検出データの画像化も可能となる。
【0048】
(3)DNA・RNAの分離への応用
特定の塩基配列をもった一本鎖DNA・RNAを固定したダイヤモンドを、液体クロマトグラフのカラムとして使うことによって、固定されたDNA・RNAと同じ塩基配列をもったものと、異なるものを分離することができる。また、このカラムを利用することで、電気泳動による分離も可能である。
【0049】
(4)生体分子構造解析への応用
i)各種タンパク質−DNA相互作用研究への利用が考えられる。
現在、タンパク質とDNAとの間の相互作用は、主に、タンパク質−DNA複合体を結晶や溶液の形で生成し、NMRやその他の機器分析的法によって調べている。
溶液中で核酸分子は、通常、遊泳可能なフリーな状態にあるため、生体内部では起こらない作用を効果的に抑制することは現在のところ困難である。DNAをダイヤモンドに固定し、DNAと例えばタンパク質とを溶液中で作用させれば、エラーの少ない精度の高いデータが得られると考えられる。例えばタンパク質分子上のどのサイトが作用し易く、またその相互作用がどのようなものであるのか詳細な調査が可能になる。
【0050】
ii)難結晶性生体タンパク質の構造解析技術への応用が考えられる。
一般的に、NMRによる解析の困難な分子量の大きなタンパク質は、結晶化させ、X線構造解析によって構造を決定する。そのため、有用性が認められ、構造解析が急がれていながらタンパク質の結晶化が困難なため、解析が行なわれていないタンパク質の数も増えつつある。このようなタンパク質分子の構造決定には、有機化学的手法(特有の有機反応や振動分光スペクトルの利用)とAFMのようなアトムプローブとの組み合わせ技術が利用される。アトムプローブで複雑な分子を解析するためには、タンパク質分子全体あるいはその一部がプローブ操作を受けても形状変位しないように形を固定する必要がある。
【0051】
構造が不明なタンパク質分子を直接固定することは通常、極めて困難である。そこで、タンパク質を直接基板に固定するのではなく、ダイヤモンドに固定化したDNAとの相互作用を利用して、あるいは結合させてタンパク質を当該DNAに結合・固定化するという可能性が考えられる。本発明は、そうした場合の基盤技術となる。
【0052】
アトムプローブによって分子構造を決定することは、原理的には可能であっても、今後相当に時間のかかる作業となることが予測される。そこでより効率的で実際的な手法として、アトムプローブの前段階に複数種のDNAを利用し、タンパク質の立体構造の差異によって大まかな分類を行う「ふるい分け」操作を加えるという考えが浮かんでくる。例えば、いくつかの異なった立体構造選択性をもつDNAを固定した基板を用意し、これによって未知タンパク質の局所的構造の特徴を利用したふるい分け操作を行う。こうすると、未知分子を構成する立体構造を迅速に把握することができる。DNAを一ケ所または複数箇所で基板に固定する技術として、本発明はその基盤技術となる。
【0053】
【実施例】
以下、実施例を説明するが、本発明はこれに限定されない。
〔実施例1〕
<原料ダイヤモンドの調整>
市販のダイヤモンド粉末(粒径1〜2μm に分級したもの)を、金属など混入の可能性のある不純物を除去するために硫酸・硝酸混液で処理した。これを純水で洗浄、乾燥したのち、マイクロ波プラズマCVD装置によって、圧力40Torrの水素プラズマで約800℃、1時間加熱処理してダイヤモンド表面の平滑化と水素化を行なった。
【0054】
<チミジンの結合>
濃硝酸1リットルと濃硫酸9リットルとを混合し、混酸を調製した。得られた混酸10リットルに上記で得られたダイヤモンド1gを加え、150℃の定温槽で混酸を還流させながら混酸とダイヤモンドとを1日間反応させた。
反応終了後、混酸と反応させたダイヤモンドを純水で洗浄した。次いで、濃度0.1M/リットルの水酸化ナトリウム水溶液0.03リットルを用意し、水で洗浄したダイヤモンド全量を浸漬し、90℃の恒温槽で数日間静置した。次いで純水で十分洗浄後、濃度0.1M/リットル塩酸中、90℃で数日間静置した。これによって、ダイヤモンド表面に多数のカルボキシル基を結合させた。
次いで、このようにカルボキシル基を結合させたダイヤモンドに塩化チオニルを反応させ、ダイヤモンド・酸ハロゲン化物を得た。反応量は、ダイヤモンド1g対塩化チオニルを0.04モルとした。反応温度としては常温以上、50℃以下を保持した。オイルバスを使用し、マグネティクスターラで撹拌した。
得られたダイヤモンド・酸ハロゲン化物とチミジンとを、次いで、有機溶媒である無水ピリジン中に導入して反応させた。ダイヤモンド・酸ハロゲン化物1g、チミジン0.05g、有機溶媒は0.03リットルとした。反応触媒としては4−ジメチルアミノピリジンを使用した。反応温度は18〜25℃の常温とし、反応時間は3時間〜3日とした。
【0055】
<DNAの増幅>
pUC系クローニングベクターの一つであるpUC18DNAにM13PrimerM4とM13primerRVとの2つのプライマーを関与させ、PCR法増幅器であるサーマルサイクラーを使用し、アンシピリン耐性遺伝子の一部123塩基対を増幅した。その際、プライマーの5’末端にリン酸基を付けておいたものを使用し、増幅されたDNAの5’末端にリン酸基をつけた。
【0056】
<ライゲーション>
ダイヤモンド・チミジン結合体は、全量1gを作製し、この内の0.001gを核酸と相補結合させ、残りは、比較試料として保存した。
PCR法増幅器で増幅した核酸と、ダイヤモンド・チミジン結合体とを、次のようにして相補結合させた。
リガーゼとしてT4DNALigaseを用い、宝酒造社製キット<商品名 DNALigation kit Ver 2>を使用してTBE緩衝液中で反応させた。反応装置としてはヒートブロックを用い、反応温度は16℃、反応時間は2時間とした。反応時間経過後、核酸が結合したと推定されるダイヤモンドを数回水洗した。
【0057】
<合成物の確認>
次いで、DNA蛍光染色剤を使用し、紫外線による蛍光検出試験を行った。DNA蛍光染色剤としてGelster を用いた。Gelster を通常の0.5倍濃度のTBE緩衝液で10000倍に希釈し、更に同量の純水を加えた。
次いで、Gelster をTBE緩衝液で希釈した希釈液に、核酸が結合していると推定されるダイヤモンドを加えた。
数十分経過後、波長302nmの紫外線を照射し、トランスイルミネータ(フナコシ製 3UVトランスイルミネータ)でダイヤモンド上に蛍光の存在を確認した。
比較試料として保存していたダイヤモンド・チミジン結合体について、上記に準じて蛍光検出試験を行ったが、蛍光の存在は確認できなかった。
【0058】
〔実施例2〕
実施例1と同種の市販のダイヤモンド粉末(粒径1〜2μm に分級したもの)を、同様に不純物を除去するために硫酸・硝酸混液で処理した。これを純水で洗浄、乾燥したのち、マイクロ波プラズマCVD装置によって、メタンガス(CH4 )0.5vol%、ジボランガス(B2 H6 )50vol ppm 、水素ガス残量(約95vol%)の混合ガスを原料とし、試料温度850℃で2時間成長を行なった。これによって、もとのダイヤモンドは、平均約0.5μmの厚さのホウ素ドープしたp型ダイヤモンドのエピタキシャル層で被われ、粒径2〜3μmの半導体ダイヤモンドが得られた。これを出発原料として、実施例1と同様なチミジン結合、DNAの増幅、ライゲーションの処理過程を経て、最終的に蛍光検出試験によってDNAが結合していることが確認された。
【0059】
〔実施例3〕
実施例1で得られたダイヤモンド・核酸結合体を、0.002リットルのフッ化水素水に浸漬し、当該液を200rpmで2時間撹拌した。フッ化水素水の濃度は0.1モル/リットルに調整しておいた。
撹拌後、ダイヤモンド・核酸結合体を拡散反射型フーリエ変換赤外分光器(通称DRIFT)でスペクトル検査を行った。核酸に化学的、物理的変化は見られなかった。
【0060】
〔実施例4〕
フッ化水素水に代え、5重量%の炭酸水素ナトリウム水溶液を使用した外は実施例2と同様に実施例1で得られたダイヤモンド・核酸結合体を処理した。核酸に化学的、物理的変化は見られなかった。
【0061】
〔実施例5〕
フッ化水素水に代え、ピリジン液を使用した外は実施例2と同様に実施例1で得られたダイヤモンド・核酸結合体を処理した。核酸に化学的、物理的変化は見られなかった。
【0062】
〔実施例6〕
実施例1で得られたダイヤモンド・核酸結合体を、0.02リットルのナトリウムメチラート液に浸漬し、当該液を200rpmで2時間撹拌した。DRIFTで調べたところ、ダイヤモンドから核酸が完全に消失していることが分かった。質量を測定したところ、ナトリウムメチラート液に浸漬する前と後との差からダイヤモンド表面1cm2 当たり10ngのDNAが結合していたことが分かった。
【0063】
〔比較例1〕
表面積1cm2 のポリL−リシンを被覆したスリガラスに、実施例1で用いたDNAと同一化学構造のDNAを付着させてスライドガラス・核酸結合体を調製し、実施例2,実施例3,実施例4と同様の実験を行った。
それぞれDRIFTでスペクトル検査を行った。何れの場合にもDNAスライドガラスによる結合信号が見られず、スライドガラス上からはDNAがすべて欠落していることを確認した。
【0064】
〔比較例2〕
実施例1のダイヤモンド・核酸結合体と核酸部分で化学構造が同一のスライドガラス・DNA結合体化合物を調製し、0.02リットルのフッ化水素水(濃度0.1モル/リットル)に浸漬し、当該液を200rpmで2時間撹拌した。
DRIFTで調べたところ、スライドガラスから核酸が完全に消失していることが分かった。
質量を測定し、浸漬前の質量と比較したところ、スライドガラス・核酸結合体には、表面積1cm2 当たりで0.1ngのDNAが結合していたことが分かった。
比較例2のスライドガラス・核酸結合体は、実施例1で得られたダイヤモンド・核酸結合体に比較し、その100分の1の割合でDNAが結合していたことが分かった。
【0065】
【発明の効果】
上記説明から理解されるように、本発明の核酸とダイヤモンドの結合方法を用いれば、核酸との化学的な結合性が強固で化学的安定性に優れ、有機溶媒、酸またはアルカリ液中で化学的安定性に優れ、核酸の結合密度が高く、かつ、生体親和性、生体適合性に優れた核酸チップを実現できる。
また、本発明のダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体を用いれば、核酸との化学的な結合性が強固で化学的安定性に優れ、有機溶媒、酸またはアルカリ液中で化学的安定性に優れ、核酸の結合密度が高く、かつ、生体親和性、生体適合性に優れた核酸チップとして使用できる。
また、本発明のダイヤモンド・核酸結合体を用いれば、核酸との化学的な結合性が強固で化学的安定性に優れ、有機溶媒、酸またはアルカリ液中で化学的安定性に優れ、核酸の結合密度が高く、かつ、生体親和性、生体適合性に優れたDNA試験体として使用できる。
そして、本発明のダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体を用いた核酸の存否の検出方法を用いれば、核酸の存否を検出できる。
さらに、本発明のダイヤモンド・核酸結合体を用いた、核酸の状態変化を電気信号として検出する核酸センサを用いれば、核酸の状態変化を電気信号として検出できる。
Claims (8)
- ダイヤモンドの表面を、マイクロ波水素プラズマに晒して該ダイヤモンド表面を平滑化すると共に水素化し、酸で酸化し、アルカリで加水分解することでカルボキシル基を形成し、該カルボキシル基の水酸基をハロゲン化剤でハロゲン化し、上記ハロゲン化したカルボキシル基とモノヌクレオシドとを、触媒を含んだ有機溶媒中のエステル反応で結合させて、ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体を形成する工程(1)と、
上記ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体と核酸とを、酵素を含んだ緩衝液中でライゲーション酵素反応により相補結合させる工程(2)と、
により上記ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体と上記核酸とを結合し、ダイヤモンド・核酸結合体を得ることを特徴とする、核酸とダイヤモンドの結合方法。 - 前記モノヌクレオシドは、チミジン、アデノシン、グアノシン、シトシン、又はウリジンのいずれかであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸とダイヤモンドの結合方法。
- 前記酸は、硝酸及び硫酸の混合液であり、前記アルカリは、苛性ソーダであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸とダイヤモンドの結合方法。
- 前記ハロゲン化剤は、塩化チオニル、三塩化リン、又は五塩化リンのいずれか、またはこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸とダイヤモンドの結合方法。
- 前記エステル反応において、前記触媒が4−ジメチルアミノピリジンであり、前記有機溶媒が無水ピリジンであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸とダイヤモンドの結合方法。
- 前記酵素を含んだ緩衝液は、前記核酸の末端がアデノシンであり、前記ダイヤモンド・モノヌクレオシド結合体のモノヌクレオシドがチミジンである場合に、酵素がT4DNALigaseであり、緩衝液がポリアミンと2価金属塩とポリエチレングリコールとの混合液であることを特徴とする、請求項1に記載の核酸とダイヤモンドの結合方法。
- 前記ダイヤモンド・核酸結合体に核酸蛍光染色剤を加えることを特徴とする、請求項1に記載の核酸とダイヤモンドの結合方法。
- 前記ダイヤモンドを混酸液に浸漬した後、該ダイヤモンドを加熱し、前記マイクロ波水素プラズマに晒す処理を行うことを特徴とする、請求項1に記載の核酸とダイヤモンドの結合方法。
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