JP4734943B2

JP4734943B2 - 光学測定用基材

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Publication number: JP4734943B2
Application number: JP2005024912A
Authority: JP
Inventors: 史夫中村; 遵塚本; 均信正; 淳二真多
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2004-02-02
Filing date: 2005-02-01
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2025-02-01
Also published as: JP2005249776A

Description

本発明は、カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレン、フラーレンの誘導体、もしくはこれらの混合物を含有することを特徴とする光学測定用基材に関する。代表的には蛍光標識された物質が表面に存在するかどうかを検出するための光学測定用基材に関する。

化学反応や生体間相互作用などの分子間相互作用の定性・定量には、紫外可視吸収分光法、赤外分光法や蛍光分光法などの分光学的手法が、また、質量変化を検出する水晶発振子法や表面の膜厚変化を検出する表面プラズモン共鳴法などが主に用いられている。特に、遺伝子、蛋白質、糖鎖などの生体間相互作用の検出については、蛍光分光法はその感度や簡易性などで最も一般的に用いられている方法である。生体間相互作用の主なものとしては、核酸のハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用したものがある。この相互作用の有無から各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。また、蛋白質については、ウエスタンブロッティングに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。また、抗原−抗体相互作用ではＥＬＩＳＡ法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）という、抗体と抗原及び酵素標識された抗原との結合により、標識酵素の活性を測定することで抗原を定性・定量分析する方法が主に用いられている。この手法においても標識体として蛍光物質が用いられ、この標識体からの蛍光を検出することで定性・定量が行われている。他には蛍光分子から他の分子へ励起エネルギーが移動する現象を利用した分析法、例えば、蛍光エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）や、分子ビーコン法などが挙げられるが、いずれも、検体に蛍光標識を施し、微弱な蛍光を高感度に検出することが必要不可欠になっている。

ところで、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性化合物」）の相互作用を分光学的手法で検出する際、基材からの自家蛍光が大きいと、これがノイズとなり、結果的にＳ／Ｎ比が下がり検出精度を低減させる。

この基材からの自家蛍光を抑えるため、カーボンブラックなどの黒色を有する化合物を基材に混入させて、基材を黒色にして、自家蛍光をも黒色を呈する化合物に吸収させて、自家蛍光を低減させる手法が提案されている（例えば特許文献１参照）。しかし、このように基材を黒色にすることにより基材からの蛍光は低減するが、検出のための光源として光量の強い単色レーザー光をレンズで絞り込んで基材上に照射した場合、光吸収による熱のため、表面が焼けたり溶けたりして、基材表面の粗さが増し、結果として散乱光によりノイズが増大したり、最悪の場合、基材が破壊されるといった問題点があった。
特開２００３−１３０８７４号公報（特許請求の範囲および実施例）

本発明が解決しようとする課題は、上記のような基材からの自家蛍光を抑えてＳ／Ｎ比の悪化を防ぎ、かつ、集光された強いレーザー光を基材上に照射した場合でも、光吸収による熱によって基材が損傷することがない光学測定用基材を提供するものである。

（１）物質の存在有無を光で検出する方法に用いる基材であって、該基材がビニル系樹脂にカーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレン、およびフラーレンの誘導体からなる群より１種類以上選択される物質を分散した樹脂コンポジットであることを特徴とする光学測定用基材。

（２）共役系重合体で被覆されたカーボンナノチューブおよび／または共役系重合体で被覆されたカーボンナノチューブの誘導体が基材中に分散した（１）に記載の光学測定用基材。

（３）カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレンおよびフラーレンの誘導体の混合物の組成分率が０．０１重量％以上、１重量％以下である（１）または（２）に記載の光学測定用基材。

（４）下記一般式（１）の構造単位を有する樹脂を含むことを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の光学測定用基材。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ^３またはＣＨ_２を表す。）。

（５）選択結合性化合物が基材上に固定化されている（１）〜（４）のいずれか１項に記載の光学測定用基材。

（６）選択結合性化合物が核酸である（５）に記載の光学測定用基材。

本発明により、カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレン、フラーレンの誘導体、もしくはこれらの混合物を含有する光学測定用基材からの自家蛍光を低減させ、バックグラウンドノイズを低減させることが可能となり、検出精度の高い光学測定用基材を提供できる。

また、共役系重合体で被覆されたカーボンナノチューブおよび／または共役系重合体で被覆されたカーボンナノチューブの誘導体を用いることにより、基材中に分散することが容易になる。

さらに、カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレンおよびフラーレンの誘導体の混合物の組成分率が０．０１重量％以上、１重量％以下にすることにより、自家蛍光を抑制しつつ、検出用の強度の強いレーザー光などを照射した場合でも、熱による基材表面のやけがない光学測定用基材を提供することが可能である。

本発明の光学測定用基材およびその製造方法を具体的に以下に述べる。

本発明者らは、鋭意実験を重ねた結果、カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレン、フラーレンの誘導体、もしくはこれらの混合物を、例えば、樹脂に分散させることにより、樹脂そのものよりも自家蛍光を低減できることを見いだした。広がったπ共役系を持つカーボンナノチューブ（以下ＣＮＴという）とその誘導体、フラーレンとその誘導体はブロードな吸収帯を示す。（このことは、Chemistry Letters. vol. 32, (2003) pp 456およびChemistry of Materials, vol. 14 (2002) pp 4281に詳しい。）従って、これらは似たような光学的性質を示し、基材からの蛍光を減少させる特性を示す。ここで『フラーレン』とは６０個もしくはそれ以上の炭素原子が球状あるいはチューブ状に繋がった中空構造を有する巨大分子（Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、ナノホーンなど）である。フラーレンの場合、比較的高い親油性を示すことがら、非水溶媒に容易に溶解し、ポリマー等への分散が比較的容易である。

本発明に用いるＣＮＴは、単層および／または多層のＣＮＴである。このようなＣＮＴとしては、例えば短軸が１０ｎｍ以下のＣＮＴが挙げられる。すなわち、ＣＮＴとしては、現時点でもっとも一般的に用いられているＣＮＴを用いることができる。その他、その誘導体でも良い。すなわち、種々の化学修飾が付加されたＣＮＴや、ＣＮＴの炭素原子の一部がホウ素（Ｂ）や窒素（Ｎ）に置き換わったＢＣＮナノチューブあってもよい。

化学修飾されたＣＮＴに導入された官能基として、具体的にはカルボキシル基、水酸基、アミド基、エステル基、チオエステル基、ハロゲン基等の少なくとも１種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

上記ＣＮＴはアーク放電法、化学気相成長法（ＣＶＤ法）、レーザー・アブレーション法等によって作製されるが、本発明において使用されるＣＮＴはいずれの方法によって得られたものであってもよい。また、ＣＮＴには１枚の炭素膜（グラフェン・シート）が円筒状に巻かれた単層ＣＮＴと、２枚のグラフェン・シートが同心円状に巻かれた２層ＣＮＴと、複数のグラフェン・シートが同心円状に巻かれた多層ＣＮＴとがあり、本発明においてそれぞれ単体で、もしくは複数を同時に使用できる。

このような、ＣＮＴを例えば樹脂に分散させて、これを光学測定用基材とすることにより、基材からの自家蛍光を低減することが可能である。本発明において、ＣＮＴを樹脂に分散させたものをＣＮＴ含有樹脂コンポジットという。本発明において、ＣＮＴを樹脂に分散させるとは、ＣＮＴが凝集せずに樹脂中に均一に存在している状態を意味する。これまでＣＮＴを樹脂中に分散させた樹脂コンポジットの作製法としていくつかの例が報告されている。例えば、Chemical Physics Letters、Vol.330、2000、pp219ではＰＭＭＡのＤＭＦ溶液にＣＮＴを混入して乾燥フィルムを作製し、この小片を金属板間に挟み１８０℃、３０００ｌｂでホットプレスすることにより、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を樹脂としてＣＮＴを分散する製造方法が記載されている。また、Materials Science and Engneering, Vol.A271、1999、pp.359ではＰＭＭＡを重合する際に、反応液にＣＮＴを混合させて重合させ、ＣＮＴ含有樹脂を作製する方法が記載されており、これらの手法によりＣＮＴの導入することが可能である。

ＣＮＴを樹脂に分散させ、ＣＮＴ含有樹脂コンポジットを作製するためには、次のような処理を施すことがより好ましい。

すなわち、ＣＮＴ含有樹脂コンポジットを構成するＣＮＴは単層および／または多層のＣＮＴであり、該ＣＮＴは共役系重合体で被覆することにより樹脂への分散性が向上するのでこのような処理を施すことが好ましい。本発明において、共役系重合体で被覆するとは、ＣＮＴの表面の少なくとも一部を共役系重合体で接触させ、ＣＮＴ表面を共役系重合体で保護した状態のことを意味する。ＣＮＴを覆う共役系重合体は、ＣＮＴとの相互作用の強い重合体である共役系重合体で、且つマトリックス樹脂である側鎖構造を有する樹脂との相互作用の強いものであることが好ましい。ＣＮＴとの相互作用が強いものとして具体的には直鎖状共役系重合体が好ましい。直鎖状共役系重合体としては、ポリチオフェン系重合体、ポリピロール系重合体、ポリアニリン系重合体、ポリアセチレン系重合体、ポリフェニレン系重合体、ポリフェニレンビニレン系重合体等が挙げられる。ポリチオフェン系重合体、ポリピロール系重合体はそれぞれチオフェン環、ピロール環の２、５位でモノマーユニットがつながったもの、また、ポリフェニレン系重合体ではフェニレン基がパラ位で連なっているポリ−ｐ−フェニレン系重合体、ポリフェニレンビニレン系重合体ではフェニレン基とビニレン基がパラ位で連なっているポリ−ｐ−フェニレンビニレン系重合体であることが好ましい。

上記直鎖状共役系重合体の中でも、特に、ポリチオフェン系重合体が好ましい。ここでポリチオフェン系重合体とはポリチオフェン構造の骨格を持つ重合体に側鎖が付いた構造を有するものであり、この側鎖の効果により溶媒に可溶となることから、取り扱いが容易であり成形性や加工性に優れている。具体例としては、ポリ−３−メチルチオフェン、ポリ−３−ブチルチオフェン、ポリ−３−ヘキシルチオフェン、ポリ−３−オクチルチオフェン、ポリ−３−ドデシルチオフェン等のポリ−３−アルキルチオフェン（アルキル基の炭素数は特に制限はないが好ましくは１〜１２）、ポリ−３−メトキシチオフェン、ポリ−３−エトキシチオフェン、ポリ−３−ドデシルオキシチオフェン等のポリ−３−アルコキシチオフェン（アルコキシ基の炭素数はとくに制限はないが好ましくは１〜１２）、ポリ−３−メトキシ−４−メチルチオフェン、ポリ−３−ドデシルオキシ−４−メチルチオフェン等のポリ−３−アルコキシ−４−アルキルチオフェン（アルコキシ基およびアルキル基の炭素数は特に制限はないが好ましくは１〜１２）、ポリ−３−チオヘキシルチオフェンやポリ−３−チオドデシルチオフェンなどのポリ−３−チオアルキルチオフェン（アルキル基の炭素数は特に制限はないが好ましくは１〜１２）が好ましく挙げられ、１種もしくは２種以上を用いることができる。中でも、ポリ−３−アルキルチオフェン、ポリ−３−アルコキシチオフェンが好ましく、前者としては特にポリ−３−ヘキシルチオフェンが好ましい。好ましい分子量は重量平均分子量で８００〜１０００００である。また、上記重合体は必ずしも高分子量である必要はなく、直鎖状共役系からなるオリゴマーであってもよい。

本発明のＣＮＴ含有樹脂コンポジットにおいて、上記ＣＮＴを分散させるマトリックス樹脂は、側鎖構造を有する樹脂であるビニル系樹脂が用いられる。具体的にはポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ酢酸ビニル等が挙げられるが、特に下記一般式（１）で表せられる構造を持つ樹脂が特に好ましい。

本発明において、一般式（１）で表せられる樹脂の平均重合度の好ましい範囲は、１００から１万である。特に好ましくは、２００以上、５０００以下である。なお、数平均重合度はＧＰＣ（ゲルパーメイションクロマトグラフ）を用い定法にて樹脂の分子量を測定することにより、容易に測定できる。

一般式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２はアルキル基、アリール基または水素原子を表し、それぞれ同一であっても異なっていても良い。前記アルキル基は直鎖状であってもまたは枝別れしていても良く、好ましくは１から２０の炭素数を有する。前記アリール基は、好ましくは６から１８、さらに好ましくは６から１２の炭素数を有する。官能基ＸはＯ、ＮＲ^３、またはＣＨ_２の中から任意に選ばれる。Ｒ^３は前記Ｒ^１およびＲ^２と同様に定義される官能基である。

前記各種のような官能基を含む樹脂で、好ましいものとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）またはポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で特に好ましいものは、ポリメチルメタクリレートである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシルまたはポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。また、前記樹脂構成要素を組み合わせた、または前記樹脂の構成要素に他の一種または複数種の樹脂の構成要素を加えた構造の共重合体も用いることができる。前記他の樹脂としては、ポリスチレン、ポリアクリロニトリルまたはポリアミド等がある。

フラーレンの樹脂への分散手法として、Macromolecules, Vol.33, 2000, 2413ではＰＭＭＡを重合する際に、反応液にＣ６０を混合させて重合させ、Ｃ６０含有樹脂を作製する方法が記載されており、この手法によりＣ６０の導入することが可能である。また、フラーレンと樹脂とを溶媒中に溶解あるいは分散した後、溶媒を除去する方法も用いることができる。溶解あるいは分散するには撹拌や混練、超音波照射することが好ましい。

次に本発明における光学測定用基材の製造方法の一例について説明する。本発明の光学測定用基材は、例えば、共役系重合体をＣＮＴに被覆する工程、および前記工程で得られた共役系重合体で被覆されたＣＮＴをビニル系樹脂または該樹脂溶液に混合分散させる工程を経て製造することができる。

共役系重合体をＣＮＴに被覆する工程では、例えば次のような方法を用いることができる。すなわち、（Ａ）溶融した共役系重合体の中にＣＮＴを添加して混合させる方法、（Ｂ）共役系重合体を溶媒中に溶解させこの中にＣＮＴを添加して混合させる方法、（Ｃ）ＣＮＴを溶媒中で予め超音波などで予備分散しておいた所に共役系重合体を添加し混合させる方法、（Ｄ）溶媒中に共役系重合体とＣＮＴを入れ、この混合系に超音波を照射して混合させる方法等である。本発明では何れかの方法を単独で用いるか、あるいは何れかの方法を組み合わせても良い。中でも（Ｄ）の溶媒中に共役系重合体とＣＮＴを入れ、この混合系に超音波を照射して混合させる方法が好ましい。

ＣＮＴは共役系重合体に覆われた状態において、ＣＮＴ同士の間に働くファンデルワールス相互作用が緩和され溶媒中で高度に分散する。

次に、共役系重合体で被覆されたＣＮＴをビニル系樹脂または該樹脂溶液に混合分散させる工程について説明する。共役系重合体で被覆されたＣＮＴを混合分散させるに際し、（１）共役系重合体の中にＣＮＴを添加し分散した共役系重合体とＣＮＴの混合物をそのまま用いる方法と、（２）共役系重合体とＣＮＴの混合物を孔径０．１μｍ程度のフィルターでＣＮＴをろ別することにより余剰の共役系重合体を除去してから用いる方法等がある。後者（２）のろ別する方法を用いた場合においても、共役系重合体はＣＮＴとの相互作用が強いためＣＮＴの表面を被覆している。ＣＮＴの表面に共役系重合体が被覆していることは種々の元素分析、表面分析装置で確認することができる。

混合分散の方法としては、（i）溶媒中に共役系重合体で覆われたＣＮＴを再分散させ、そこへビニル系樹脂を溶解させる方法、（ii）ビニル系樹脂溶液の中に共役系重合体で覆われたＣＮＴを添加し分散させる方法、（iii）熱などによりビニル系樹脂を溶融させ、液状の樹脂に共役系重合体で覆われたＣＮＴを直接添加し分散させる方法等がある。また混合分散の手段としては、撹拌、超音波処理、振動分散、混練等が挙げられ、濃度や粘度に応じて手段を選択する必要がある。例えば撹拌による分散方法としては、フラスコや蓋付きの容器を回転させたり、スクリュー型やブラシ型の撹拌羽根が高速に回転する装置を用いることができる。超音波処理による分散方法としては、超音波洗浄機の槽の中にビニル系樹脂と共役系重合体で覆われたＣＮＴの入った容器を設置したり、あるいは超音波振動子を該容器の中に入れて処理するなどの方法がある。混練による分散方法としては、セラミックスの微粒子を用いたビーズミル装置やボールミル装置、三本ローラー等を用いることができる。本発明のＣＮＴ含有樹脂コンポジットの製造方法においては、撹拌混合をした後、超音波処理を施すことが好ましいが、これに限定されるものではない。こうして共役系重合体で覆われたＣＮＴをマトリックス樹脂であるビニル系樹脂の中に分散させることで、ＣＮＴとマトリックス樹脂との間に共役系重合体の層を有するＣＮＴ含有樹脂コンポジットを得ることができる。

なお、上記本発明のＣＮＴ含有樹脂コンポジットの製造方法において用いられる溶媒としては、メタノール、エタノール、ブタノール、トルエン、キシレン、ｏ−クロロフェノール、アセトン、酢酸エチル、エチレングリコール、クロロホルム、クロロベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、γ−ブチロラクトン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフロロ−２−プロパノールなどが挙げられるがこれらに限定されるものではなく、必要に応じて溶媒を選ぶことができる。

本発明の基材は、ＣＮＴやＣＮＴ誘導体、フラーレン、フラーレン誘導体を含有させることで自家蛍光を抑制でき、含有量を多くするほど抑制効果を向上することができる。含有量については、レーザー光照射時の熱による基材特性低下が生じないようにしたり、基材の透明性を確保したりするなど、他の因子とのとバランスによって決めることができる。

また、本発明の基材において光学特性を考慮し着色性を配慮しなければならない場合は、ＣＮＴやフラーレンの割合は０．０１〜０．５重量％であることが好ましい。この範囲ではＣＮＴは目視で確認することは難しく、膜・フィルムなどの透過率をあまり下げることがないので、基材の自家蛍光を低減させ、かつ、検出用の光で、基材表面が焼けたり溶けたりすることを防ぐことができる。この範囲をはずれると、例えば、樹脂コンポジットに含有されるＣＮＴの添加量が１重量％を越えると基材の黒色度が増大してしまうため、基材表面での光吸収が増大し、レーザー等の光量の強い光源を用いた場合、光吸収が熱に変換されて、表面が焼けたり、溶けたりして粗くなってしまうことがある。さらに、１重量％を超えると、ＣＮＴの均一な分散が困難となる傾向にある。一方、ＣＮＴの量が０．０１重量％未満であるとＣＮＴ添加による自家蛍光の減少もほとんど観察されない。したがって、本発明におけるカーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレンおよびフラーレンの誘導体の混合物の組成分率は、０．０１重量％以上、１重量％以下が好ましい。ここでいう「カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレンおよびフラーレンの誘導体の混合物」とは、「カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレンおよびフラーレン」から選択された１種以上の物質を含むものをいい、２種類以上の物質を含むことを必ずしも要しない。

このようにして得られたＣＮＴ含有樹脂コンポジットを加工することで、板に代表される本発明の物質の存在有無を光で検出する方法に用いる基材を作製することが可能である。本発明で物質の存在有無を光で検出する方法とは、分子の光吸収もしくは分子からの発光を検出することにより、その分子の有無および分子を定量的・定性的に分析する方法である。このような光学測定用基材の具体的な例としては、光学測定セル、ＤＮＡチップ、蛋白チップ、いわゆるマイクロフルーイディクスと呼ばれる分野に用いられているラボオン・ア・チップ、９６穴、３８４穴等のウェルプレート、培養フラスコ、キュベット、エッペンドルフチューブ、８連チューブ等の代表的には検体自身の蛍光もしくは、検体に付与された蛍光体からの蛍光によって、試薬や、核酸、タンパクなどの存在有無を調べるための基材に加工が可能である。

なお、上記樹脂コンポジットの加工の方法としては、公知の方法を使用することができる。すなわち、押出成形、圧縮成形、射出成形等の製造法が使用できるが、好ましくは、生産性および形状の自由度の観点から射出成形が使用できる。その他の方法としては、溶剤に溶融している樹脂コンポジットをキャスト法などでフィルムにするなどの方法が挙げられる。

ついで、本発明の光学測定用基材の具体的な使用方法の好ましい形態についてのべる。本発明の光学測定用基材は、選択結合性化合物が多数固定化されている、マイクロアレイと呼ばれる基材に用いることが好ましい。ここで、「選択結合性化合物」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性化合物」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性化合物」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性化合物は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。「選択結合性化合物」として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、担体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。

また、本発明のマトリックス樹脂が特に下記一般式（１）で表せられる構造を持つ樹脂の場合は次のような方法にて選択結合性化合物を固定化することが可能である。

一般式（１）で表される構造単位を少なくとも１つ有する樹脂を有する基材に選択結合性化合物を固定化するためには、これに前処理を施して、基材表面にカルボン酸を形成させることが好ましい。基材表面にカルボン酸を生成する手段としては、アルカリ、酸などで処理するほか、温水中での超音波処理、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に基材を晒す方法などが挙げられるが、基材の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点からアルカリ、もしくは酸に基材を漬け込んで表面にカルボン酸を生成させることが好ましい。具体的な例としては、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に基材を漬け込み、好ましくは３０℃から８０℃の温度にして、１時間から１００時間の間保持すればよい。

このようにカルボン酸を基材の表面に生成すれば、基材表面にアミノ基や水酸基を有する選択結合性化合物を共有結合により固定化することが可能となる。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３'−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)や４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性化合物と基材表面のカルボン酸との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性化合物の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボン酸が表面に生成された基材を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、表面のカルボン酸を活性化しておいても良い。

このような縮合剤を用い、基材表面のカルボン酸と選択結合性化合物のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により基材表面と選択結合性化合物が固定化されることになり、基材表面のカルボン酸と選択結合性化合物の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により基材表面と選択結合性化合物とが固定化されることになる。選択結合性化合物を含む試料を基材に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。

前述した方法により、ポリマー表面に選択結合性化合物を固定化することにより、非特異的な検体の吸着を抑え、さらに、共有結合で強固に、かつ、高密度に選択結合性化合物を固定化でき、さらに、ガラスに比べ、固定化された選択結合性化合物の空間的な自由度が高いという推定理由のために、検体とのハイブリダイゼーション効率が高く、しかも、基材からの自家蛍光が少ない基材を得ることができる。

以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
（ＣＮＴ含有樹脂コンポジットの作製）
クロロホルム３０ｍＬに単層ＣＮＴ（以下ＳＷＣＮＴと言う）（ＣＮＩ社製、純度９５％）３ｍｇを加え、共役系重合体としてポリ−３−ヘキシルチオフェン（アルドリッチ社製、分子量：Ｍｗ２００００）３ｍｇを加えて氷冷しながら超音波ホモジナイザー（ＳＯＮＩＣＳ社製ＶＣＸ−５００）を用いて出力２５０Ｗで３０分間超音波攪拌してＳＷＣＮＴを分散した。次いで、分散したＳＷＣＮＴを孔径０．１μｍのＰＴＦＥ製のメンブレンフィルターを用いて濾別し、１０ｍＬのクロロホルムで３回洗浄した。洗浄したＳＷＣＮＴを３０ｍＬのクロロホルムの中に入れ、再び超音波ホモジナイザーで超音波撹拌することによってＳＷＣＮＴ分散液を得た。

得られたＳＷＣＮＴ分散液０．５ｍＬにポリメチルメタクリレート（以下、ＰＭＭＡと言う）（住友化学工業（株）製“スミペックス”、分子量：Ｍｗ５０００００）５０ｍｇをクロロホルム４．５ｍＬに溶解したマトリックス樹脂溶液を加え、超音波洗浄機（井内盛栄堂（株）製ＵＳ−２、出力１２０Ｗ、２．６Ｌ）を用いて３０分間超音波攪拌することによりＳＷＣＮＴ含有ＰＭＭＡペーストを得た。

次いで得られたペースト１ｍＬを周縁部に厚み１００μmの粘着テープを貼った５０ｍｍ角のガラス基板に滴下し、ブレードコーター（英ＲＫＰｒｉｎｔ−ＣｏａｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を３０ｍｍ／ｓｅｃの速さで移動させることにより均一な塗膜面を形成したのち、基板ごと５０℃のオーブンに５分間入れ、最後に真空乾燥機で２時間溶媒を除去することで厚み２０μｍの塗膜を作製し、基板から剥がしてＳＷＣＮＴ０．１重量％含有ＰＭＭＡ膜を得た。

（ＣＮＴ含有樹脂コンポジットの自家蛍光測定）
上記の方法で調整されたコンポジット重合体溶液をガラス基板に塗布して均一な膜厚のコンポジット薄膜を形成する。次に、蛍光分光光度計を用いて上記コンポジット薄膜をある一定の波長で励起して発光する蛍光スペクトルを測定することにより、定量的かつ定性的に評価できる。該ＳＷＣＮＴ０．１重量％含有ＰＭＭＡ膜とＳＷＣＮＴを含まないこと以外は上記方法と同様にして得られたＰＭＭＡ膜の蛍光発光スペクトルを蛍光分光光度計（日立（株）製Ｆ−２５００形分光蛍光光度計）を用いて測定した。基板は入射光に対して４５°の角度で設置し、励起波長は４６０nm、検出部のホトマル電圧を７００ボルトとした。この結果を図１示す。ＰＭＭＡ膜の場合では広範囲にブロードな発光が観察された。一方、ＣＮＴを０．１重量％含有したＰＭＭＡ膜では、この発光が減少することが確認された。

実施例２、比較例１、比較例２
（核酸ハイブリダイゼーション後のＰＭＭＡ基板の蛍光測定）
（核酸固定化担体の作製）
上記該ＳＷＣＮＴ０．１重量％含有ＰＭＭＡ膜および透明なポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板（（株）クラレ製；コモグラス押し出し板、厚さ１mm、平均分子量１５万）を調整した。また、比較例１として透明なＰＭＭＡ板（クラレ製；前述と同じ）、比較例２として１重量％のカーボンブラック（三菱化学製；製品番号＃３０５０Ｂ）を含有した（ＰＭＭＡ）板（クラレ製；前述と同じ）を用意した。これら３種類の基板を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に６５℃で１２時間浸漬した。次いで、純水、０．１ＮＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、基板表面のＰＭＭＡの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。

（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１（６０塩基、５’末端アミノ化）、のＤＮＡを合成した。
5'-ACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCATCTGGA-3’
この配列番号１のＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。

これらのＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をおよそ２００ｎｌ取り出して、これを基板に点着した。次いで、基板を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図２に示す。

（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号５のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調整方法を以下に示す。

検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つＤＮＡ（９６８ｂ.ｐ.）を用いた。調整方法を以下に示す。
以下の配列の核酸を合成した。
5'-GGGCGAAGAAGTTGTCCATA-3' （配列番号２：２０塩基）
5'-GCAGAGCGAGGTATGTAGGC-3' （配列番号３：２０塩基）
これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐKＦ３プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号４：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。

ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ４０μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製；製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２の溶液を２μｌ、配列番号３の溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号４）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。

次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡ（配列番号５：９６８塩基）を得た。さらにこれをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。

この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇの純水にとかし、２００ｍｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。

（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化した基板に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、先に用意したプローブ核酸が固定化されている担体にハイブリダイゼーション用の溶液を１０μｌ滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。また、カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。これを、プラスチック容器の中に入れ、６５℃、湿度１００％の条件で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。

（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ）に上記処理後の基材をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧を６００Ｖに設定した状態で測定を行った。その結果を表１に示す。この結果より、ＰＭＭＡ基板と比較しＣＮＴを含有させることによりＳ／Ｎ比が向上した。

実施例３
（核酸ハイブリダイゼーション後のＰＭＭＡ膜の蛍光シグナル）
（フラーレン含有樹脂コンポジットの作製）
フラーレン（Ｃ６０、東京化成工業（株）製、純度９９．９％以上）１ｍｇをトルエン１ｍＬ中に加え、超音波洗浄機を用いて３０分間超音波照射することでフラーレン溶液を得た。得られたフラーレン溶液にＰＭＭＡ（住友化学工業（株）製“スミペックス”、分子量：Ｍｗ５０００００）１００ｍｇを加え、さらに３０分間超音波照射してフラーレン含有ＰＭＭＡペーストを得た。

次いで得られたペースト１ｍＬを周縁部に粘着テープを貼った５０ｍｍ角のガラス基板に滴下し、ブレードコーターを３０ｍｍ／ｓｅｃの速さで移動させることにより均一な塗膜面を形成したのち、基板ごと５０℃のオーブンに５分間入れ、最後に真空乾燥機で２時間溶媒を除去することで厚み２０μｍの塗膜を作製し、基板から剥がしてフラーレン１重量％含有ＰＭＭＡ膜を得た。

（フラーレン含有樹脂コンポジットの自家蛍光測定）
上記の方法で調整されたコンポジット重合体溶液をガラス基板に塗布して均一な膜厚のコンポジット薄膜を形成する。次に、該コンポジット薄膜の蛍光発光スペクトルを蛍光分光光度計（日立（株）製Ｆ−２５００形分光蛍光光度計）を用いて測定した。入射光を基板に対して４５°の角度で照射し、励起波長は５３２nm、検出部のホトマル電圧は７００ボルトとした。この結果を図３、図４に示す。図３は蛍光スペクトル全体を示したもので、図４はピークの裾を拡大したものである。５３２nmにおける蛍光強度はＰＭＭＡ膜では１５００で、フラーレンを１重量％含有したＰＭＭＡ膜では６７６と、ＰＭＭＡ膜の約２分の１の強度であった。一方、５４４nmでの蛍光強度はＰＭＭＡ膜が０．２０６であるのに対し、フラーレンを１重量％含有したＰＭＭＡ膜では、わずか０．００３と、蛍光強度がおよそ７０分の１にまで減少した。このように励起波長より少し長波長側での蛍光が大幅に抑制されることが確認された。

（核酸ハイブリダイゼーション後のＰＭＭＡ基板の蛍光測定）
実施例２と同様の方法でフラーレン含有樹脂コンポジット表面を加水分解して核酸固定化担体の作製し、プローブＤＮＡを固定化した。さらに実施例２と同様の検体ＤＮＡを用いハイブリダイゼーションを行い、同様の検出器、測定条件でハイブリダイゼーション後のＰＭＭＡ膜の蛍光シグナルを測定した。その結果を表１に示す。

ＰＭＭＡ膜およびＣＮＴ０．１重量％ＰＭＭＡ膜からの蛍光スペクトル（励起波長４６０ｎｍ）のグラフを示す図面である。ＰＭＭＡ表面への選択結合性化合物（ＤＮＡ）の固定化反応スキームを示す図面である。ＰＭＭＡ膜およびフラーレン１重量％ＰＭＭＡ膜の蛍光スペクトル（励起波長５３２ｎｍ、縦軸スケール：１６００）の全体を示す図面である。ＰＭＭＡ膜およびフラーレン１重量％ＰＭＭＡ膜の蛍光スペクトル（励起波長５３２ｎｍ、縦軸スケール：５）のピークの裾を拡大した図面である。

１ＰＭＭＡ膜
２選択結合性化合物（ＤＮＡ）

Claims

物質の存在有無を光で検出する方法に用いる基材であって、該基材がビニル系樹脂にカーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレン、およびフラーレンの誘導体からなる群より１種類以上選択される物質を分散した樹脂コンポジットであることを特徴とする光学測定用基材。
共役系重合体で被覆されたカーボンナノチューブおよび／または共役系重合体で被覆されたカーボンナノチューブの誘導体が基材中に分散した請求項１に記載の光学測定用基材。
カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブの誘導体、フラーレンおよびフラーレンの誘導体の混合物の組成分率が０．０１重量％以上、１重量％以下である請求項１または２に記載の光学測定用基材。
下記一般式（１）の構造単位を有する樹脂を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の光学測定用基材。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ^３またはＣＨ_２を表す。）
選択結合性化合物が基材上に固定化されている請求項１〜４のいずれか１項に記載の光学測定用基材。
選択結合性化合物が核酸である請求項５に記載の光学測定用基材。