TWI318297B - - Google Patents

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1318297 五、發明說明（1) 【發明所屬技術領域】 本發明與核酸與鑽石之結合方法，使用於該結合方法之 鑽石-單核苷結合體，及結合核酸於該鑽石~單核誓結合體 之鑽石-核酸結合體有關。 13 σ 更詳言之’例如在當做DNA晶片、或DNA-RNA感測器 (sensor)、或MA-RNA-蛋白質-酵素之分離管柱、及其他 許多領城可望具優異有用性之以鑽石為基本固定材料之核 酸固定方法’及使用於此固定方法之鑽石-單核苔結合 體，及結合核酸於該鑽石-單核苷結合體之鑽石—核酸"結合 體有關。 【習用技術】 固定DNA技術有以載玻片（slide glass)為固定基材固定 核酸之技術，且以DNA晶片廣泛知悉。 DNA晶片可利用為DNA感測器。例如於玻璃表面結合與欲 檢測目標DNA序列成互補關係之鹼基序列DNA，如具檢測目 標DNA序列之核酸存在時，與玻璃表面之核酸結合而被選 擇性檢出。因此可確認具檢測目標DNA之核酸存在與否， 同時可能應用於物理化學特性試驗，醫藥品之效果試驗亦 應用此法。 結合固定基材與DNA之技術最近才開始。許多領域均期 待該技術之開發，並期望早日實現更優異之技術。 【發明欲解決之課題】 習知核酸鹼基序列檢定（鑑定）方法使用DNA晶片（又稱 DNA微陣列、microarray)，該晶片由多數具不同驗基序歹ij

C:\2D-CODE\91-03\90132000.ptd 第4頁 1318297 五、發明說明（2) DNA以微小點狀附著、排列於以聚l _離胺酸塗覆之載玻 片上或尼龍膜上形成。於載玻片，該固定基材介其他化合 物（中間化合物）固定DNA，與玻璃之結合為間接性，固定 基材與中間層、中間層與DNA之結合均以范德瓦斯力（van der Walls’ f0rce)結合，亦即以弱靜電性結合。又於尼 龍膜或於現所使用直接固定之其他基材，其固定基材盥 :=合亦非以堅固之化學結合而亦以范德瓦斯力或以 電性結合。由於結合力弱’對各種檢定操作常引起 DNA由固定基材剝離或混入於其他微小點等不便，因此 SC;檢查對象議之正確特性。另外因固定基材之 生體適合性低，故有誘致DNA變質之缺點。 鑑於上述幾點須要解決之課題’本發明以提供能盥 核酸之化學結合性堅固而化學安定性優異，在有機 二、 酸j驗溶液中之化學安定性優異，核酸之結合密产片 ii;;和=生體適合J 生優異之核酸晶片之核酸；鑽石 、··》口方法，及鑽石-單核苷結合 與鑽石-單核苷結人體之鑽 ^ -日日，及，、、口 口核酸 千似甘、，口 口奴之鑽石-核酸結合體為目的。 又以提供使用鑽石-單核苷結合 檢測方法為目的❶ 一杉S文存在與否之 又以提供使用鑽石—核酸結合 態變化之核酸感測器為目的。 電乱^唬檢測核酸狀 【解決課題之手段】 酸：：：二=徵本發明之核酸與錄石之結合方法以核

1318297 五、發明說明（3) 依據此構想，因鑽石為結晶，可使用其表面碳原子之 空鍵（dangling bond)為與核酸之結合，故與核醆之結合“ 點密佈且均勻。又因與鑽石懸空鍵之化學結合之結合能' 大’故可介核誓酸使懸空鍵與核酸之結合堅固。又鑽== 原子為化學惰性’其生體適合性高，不會誘致核酸變質， 又於本發明，鑽石表面結合特定單核苷之鑽石—單核貝苷 結合體與末端具有特定鹼基之核酸互補結合為特徵。 上述特定單核苷為胸腺核苷、腺嘌呤核苷、烏糞嘌呤杪 苷、胞嘧啶、及尿嘧啶核穿等中之任一種。 ^ 依據此構想，可結合因應目標核酸種類之單核苷於鑽石 表面’使目標核酸以鹼基之互補結合而結合。 又鑽石-單核苷結合體以形成羧基於鑽石表面碳原子 後’鹵化此羧基再結合特定單核誓與_化之羧基而制 特徵。 衣成為 羧基最好先以酸氧化鑽石表面後再以加鹼水解 較適合之酸為硝酸與硫酸之混合液，較適合〔战° 化納。 口 &為氣氣 依據此構想，可形成羧基於鑽石表面 鹵化之羧基以齒化羧基之羥基而形 $碳原子。 較適合之鹵化劑為氣化亞硫酿、： 特敛。 之任一種或此等之組合。 ：化嘴、五氣化鱗中 依據此構想’羧基被鹵化而與單枝— 又鹵化之羧基與特定單核苷之結^甘以s旨鍵結合。 與特定單核苷之催化劑之有機溶劑中以在含i化之緩 特 -曰反應而形成為基

C:\2D-00DE\91-03\90132000.ptd 第 頁 1318297 ------ 五、發明說明（4) 徵。 催化劑與有機溶劑，較镝人+拙 啶，較適人之古:軟適合之催化劑為4 忙it M·二之有機溶劑為無水吡啶。 ” $ 之鑽 义虞b構想，可形成單人 石—單核誓結合體。 口於鑽石表面碳原子 補、=石:At體與末端具有特定驗基之桉/ 與核酸之酵素連接反應為特徵。_石~早核誓、结合體 。。上述含酵素之緩衝液，如核酸 -單核苷結合體之單4 而為腺嘌呤核苷、^ 接酶：緩衝液為聚胺與2價金屬鹽與：乙二：為乙DNA連 依據此構想，錄$ g , 、 醇之忍合液。 之驗基互】：人鑽ΓΛ/結合體之單核誓與核酸末端 ^發月為加核酸螢光染色 _ ^ ^…射兔外線於其生成物使發生螢光，以螢光 檢測核酸為特徵。 依據此構想，目標核酸存在時發生螢光，不存在時不發 生螢光，故可檢測目標核酸存在與否。 再者，本發明之鑽石_單核苷結合體以具有結合於鑽石 表面碳原子之單核苷為特徵。 6亥鑽石-翠核普結合體具有與鑽石表面碳原子以酯鍵結 合之單核苷。 上該鑽石為多結晶或單結晶，粒徑丨〇nm以上之顆粒、塊 狀（bulk)、或薄膜之任一種。

II m 第7頁 C:\2D-CODE\91-03\90132000.ptd 五 發明說明 (5) 上§玄鱗石以非 上該接雜質鑽或摻雜質鑽石為特徵。 上該半導體以；：體、導電體、或半導I… 使用此種錯石單:二硼人或，之咖 石表面。 '。〇體可堅固固定目標核酸於鑽 又本發明之鑽石-士人 鑽石表面碳原子結合之單二體以核酸互Μ^ 核苷為特徵。 X 4之鑽石-單核苷結合體之單 使用此種鑽石-核酸結合 並生體適合性良好地被固定’因核^可可提堅^且^密被固定 有機溶劑、及盆他冷妒八；拉4 了 乂供而要與酸、驗、 特^ 觸，能夠進行_物理化學 符性试驗之DNA晶片。 4 干 又本發明之核酸感測器具有導電體鑽石、半導體鑽石、 5' Pn接合鑽石，以電氣信號檢測核酸之狀態變化為特徵。 使用此種核酸感測器，能夠以電氣信號即時檢測核酸之 ’態纟支化，可以尚精密度與高速度進行核酸狀態變化之产 測。 〜 欢 本發明依據發明者之下述知識及見解而完成。 鑽石具有特異性質。本發明乃有效應用鑽石之特異性質 於基因工程領域。 i)表面安定性 鑽石以由碳原子間之堅固共價鍵結合體構成。其表面碳 原子可與氫原子、氧原子、氟原子等形成堅固結合，即形 成安定之化學吸附狀態（chemisorption)。化學吸附之氫

C:\2D-GODE\91-O3\90132000.ptd 第8頁 1318297 五、發明說明（6) 原子，在室溫以上至約2〇〇 〇c曝露 面狀態不會轡介。m 亦女疋。鑽石表 扈占日日辟 4化鑽石之此種性質與其他多數半導體或全 屬成明顯對照。多數 少双千令體或金 機溶劑為惰附述原子之鑽石表面對乙醇等有 i i )生體適合性 ，石，同素異形體石墨材料(碳材 和性、生體適合性。镨石之庄姊、奋人ω ^ *设於生胆親 知悉，作可由、尚a鑽 生肚適合性雖未如石墨之詳細

Hi)導ΐ: 表面控制付加相同性質於鑽石。 鑽石可賦予導電性而損害 性鑽石可松吨挪,, 乩優良性質。欲獲得導電 或如欲僅使表面有導電性，則可吸附氫(原二 現。使用碳原子之奈米管路（nan〇七汕時 °貝 極微細配線。 夺貝】可月形成超 本發明利用有機化學反應技術與 學結合之堅固結合。核酸與鑽石之結人堅Ί醆與鑽石化 定，同時如上述i)說明由於鑽石表 …及化學性安 的、或物理的加工’亦不發生核酸 石疋’故加以化學 良副反應，而可取得具信賴性之數據。、，、。合切斷或不 又於使用DNA感測器之DNA試驗，蛀人 核酸分子與其他核酸、胺基酸、或^ ^ ^固定基材表面之 子接觸。如上述ii)說明由於鑽石 二酵素等生體分 生體適合性優良，故

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五、發明說明（7) 不發生不良副反應或核酸變質，可取 又核酸與鑽石為化學性安定之結 ^ c 、‘之數據^ ，石不必犧牲表面安定性與生以性以，） 因此核酸發生之狀態變化可在鑽石上以 ：導電 測。例如隨核酸結合於鑽石表面時，或結合於鑽』J檢 核酸與生體接觸時之核酸之狀態變化，與鑽^面之 之變化，=广或電洞(11〇1〇)或雙極離子相互作用 文化 了在鑽石上以電氣信號檢測。 因„此使用本發明之以鑽石固定基材檢測核酸方法，及鑽 石-單核答結合體或鑽石_核酸結合體，可以高密度且安定 檢測目標核酸’可提供化學結合堅固、化學安定性優異， 在有機溶劑、酸或弱鹼溶液中亦可能使用之鑽石-核酸結 合體。 又使用本發明之核酸感測器可以電氣性檢測核酸存在與 否及檢測核酸之狀態變化。 【發明之實施形態】 以下說明實施發明之一種形態，但本發明不受下述實施 形態之限定。 本實施形態之鑽石-單核苷結合體以鑽石為固定基材。 與單核苷結合之鑽石可為天然鑽石或人造鑽石。通常天 然鑽石有I a、11 a、11 b型。人造鑽石則有丨b、丨丨a、丨！ b 型。於本實施形態均可適合使用。 鑽石以摻雜不純物而可改變其電導度、表面構造、表面 特性等物理或化學性質。例如摻雜硼、磷、硫等之鑽石表

C:\2D-CDDE\91-03\90132000.ptd 第10頁 1318297 發明說明（8) 五 現P型及η型導電性。利用此導 果產生之電荷移動，例如可檢測核酸：：核酸狀態變化結 之電荷移動。層合Ρ型層及η型層形/、鑽石結合結果產生 利用此接合亦可檢測上述之電蒋tPn接合（junction)， 表現高電阻或其他優良物理化學性：。被摻雜之鑽石可能 氫原子之鑽石僅限特定表面具導 。只在特定表面吸附 結表面之特定位點之鑽石、或以 丄以導電性高分子連 結之鑽石’只有特定管路為導電：原子之奈米管路部分連 因應錯石-核酸結合體 鑽石之粒徑基本上^ Λ 適當選擇此等鑽石。 幾mm2左右之比較大 。碭。由粒徑極小者至表面積十 應用途而適當選擇可°、:乏利用。粒徑與表面積可因 關於粒徑，；ϊϊ2〜ν亦不成問題。如片狀亦可。 多。粒徑未達1 ,以m，但以1〜2以m為更好之情形較 作業而恐ΐί宜 -a- 超過時單位質晉夕 隨反應量減少，如u m/卞早诅負1之表面積變小。 認。 如以螢先確認有無反應時，可能較難確 又結晶面之罢@ , (核酸結合點)之排亡不成問題。在表面之結合位點 ί合分子間之空間位阻（stere。hindrance) 二m之核酸分子之最大密度、結合分子與結晶* 要护二及分子之迴轉自由度等均與結晶面相關。 必要％可選擇結晶面。 又在結晶表面之卩比极 梯、曲折等特異位點之結合，其排列 C:\2D-CODE\91.03\90132000.ptd 第11頁 1318297

構造與平坦之結晶表面不同’故可依目的有效利用此排列 構造。 再者’鑽石之多結晶體亦可有效利用為固定基材。依 CVEKChemical Vapor Deposition、化學氣相沉積）法可合 成各種形態之鑽石多結晶體，即粒狀、膜狀（片狀）、針狀 (纖維狀）、網狀等。於CVD法最廣泛應用析出多結晶膜於 其他基材上之技術，故可利用此技術，首先製成具需要形 狀、構造之基片’再以鑽石覆蓋其表面，即可製成具目標 形狀、構造之鑽石固定基材。又形狀之控制不僅以合成， 亦可以氧、氟、氫等氣體之熱蝕刻、或含此等原子之氣體 之·#離子蚀刻、或離子滅射（i 〇 n s p u 11 e r)姓刻等進行。姓 刻對於形成微細表面形態如微刻面（m i c r 〇 f a c e t)，奈米位 階（nano-order)至微米位階（micron-order)針狀鑽石之集 合體為有效。構成多結晶體之粒子之大小為奈米或數微米 以上基本上均不成問題。此種多結晶體可利用於構築因應 用途而具多種形狀之鑽石固定基材。 核酸有DNA與RNA。於本實施形態兩者均適合使用。核酸 分子量之大小亦無關。在鑽石表面可組合混存構造式不同 之DNA與RNA，但通常均勻結合適合使用用途之同一構造式 複製DNA或RNA。以DNA當做核酸結合時，一般多用雙股 DNA ^雙股DNA時只有成互補關係之一方之核酸分子與鑽石 表面結合’而另一方之核酸分子則與錯石表面結合之核酸 分子以互補結合而與鑽石表面間接結合。如此則雙股DN a 亦可能變成單股DNA。

C:\2D-CODE\91-03\90132000.ptd 第12頁 1318297 五、發明說明（ίο) 鑽石與核酸之結合，鑽石方由鑽石表面碳原子介酯鍵結 合之核誓與核酸互補結合。核酸方則由螺旋體最末端核苷 構造體與鑽石表面碳原子酯鍵結合之核苷互補結合。例如 核酸最末端為腺嘌呤核苔構造體時，則胸腺核苔構造體與 鑽石表面碳原子酯鍵結合。 核酸與鑽石結合之鑽石-核酸結合體，如以下述方法製 造。 最好以3步驟或4步驟進行。第1步驟為結合單核苷於鑽 石表面之步驟。第2步驟為複製核酸本體之步驟。第3步驟 為結合單核苔之鑽石、即鑽石-單核苔結合體與核酸本體 結合之步驟。鑽石-單核苔結合體與核酸本體結合時，可 製成核酸結合鑽石之鑽石-核酸結合體。第4步驟為確認鑽 石-單核苔結合體與核酸本體結合之步驟。 又如預先充分確保須要量核酸本體時可省略第2步驟。 第1步驟如以下述方法進行。 鑽石以濃硝酸與濃硫酸之酸混合液加熱氧化其表面。酸 混合液之濃度比為濃硝酸對濃硫酸之質量比為1 : 8〜9。 鑽石與酸混合液之混合比率為鑽石1 0 0質量部對酸混合 液5000〜900 0質量部較好。反應溫度為1 50〜20(TC，反應 時間為數小時（約7〜8小時）〜3日較好。反應中迴流反應 液較好。 表面與酸混合液接觸之鑽石其次以鹼水解。水解之前最 好以純水充分清洗。使用於水解之驗如N a Ο Η水溶液較適 合。濃度為0.1〜0.2mol/L較好。使用量為鑽石100質量部

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1318297 五、發明說明（12) 代表鑽石結晶，-C則表示鑽石結晶表面之碳原子 【化1】 (i) HN〇3, H2S〇4 CC>- ch3

CC>- COOH (2) 0.1M NaOH, 0.1M HC1 CC>- COOH +SO C 15

ch3 + HC1 第2步驟可如以下述方法進行。 CC>- coci + s〇2 +HC 1 例如使用PCR(P〇lymerase Chain Reaction、聚合酶鏈 鎖反應）法較好。對與鑽石結合核酸所含訊息基因，利用 轉錄該範圍之引子進行放大。放大可使用熱循環裝置 (Thermal cycler)等自動進行。 引子最好使用5 ’末端付加磷酸根者。如此則被放大之核 酸5’末端亦結合磷酸根。大多數PCR放大之DNA，其3’末端 結合腺°票吟核苷，故如結合腺嘌吟核苷，則可順利與其立 補之胸腺核苷進行連接（酵素反應）。 又並不限定使用PCR法。應綜合判斷工夫、時間、回收 率’以選擇最適當方法。

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五、發明說明（13) 第3步驟可如以下述方法進行 使螺旋狀核酸本體分子與鑽石—單核苷結合體進行纟士 — 反應。結合於鑽石之單核苷與螺旋狀核酸本體分子τ^、'σ山合 單核誓構造體有時不是互補。此時最好結合與鑽石之，之 苷成互補之單核苷於螺旋狀核酸本體分子末端使其=單核 或縮短核酸本體分子至互補之單核苷於末端出現乂止=。 可。 "'、亦 3’末端結合腺嘌呤核苷之核酸與結合胸腺核普之鑽石_ 胸腺核苷結合體在Τ4 DNΑ連接酶存在下結合。結合反應_ 般在緩衝液中進行。緩衝液多使用聚胺與2價金屬鹽與"聚 乙二醇之混合液。2價金屬鹽使用如Mg2+鹽。曰本寶 (Takara)酒造公司有套件出售。反應溫度以約16 〇c較好。 反應時間為90〜120小時。一般使用加熱磚裝置（Heat block)。已知有Takara PCR Thermal Cycler480 (商品名 稱）。此為利用T A選殖法之連接方法。胸腺核苷與腺嘌呤 核苷為互補，故DNA末端形成鹼基對，使反應容易進行。 玆以鑽石-胸腺核苷結合體與末端為腺嘌呤核苷之雙股 DNA之結合反應例示如下。COT為胸腺核苷酯。胸腺核苷構 造部與腺嘌呤核苷構造部以互補結合。 【化2】

ccD-coT+f^ DNA-卜 co-coijir DNA

-—- A

1318297 五、發明說明（14) 經過反應時間後，由推定有核酸結合之鑽石去除未反應 D N A。例如用水清洗。清法次數可重複5〜7次。 第4步驟可如以下述方法進行。 加核酸螢光染色劑以紫外線進行螢光檢測。DNA螢光染 色劑如EtBr (Ethidium Bromide、漠化乙錠）。一般以使 用Gelster液（商品名稱、BMA公司製品、正式商品名

Gelster Nucleic Acid Stain、Gelster核酸染色劑）為方 便。 螢光檢測以下述方法進行。例如稀釋TBE緩衝液（Tr is_

Borate-EDTA buffer)為 0.5倍。加Gelster 液於該 TBE 缓衝 稀釋液，使Gelster液以ΤΒ£緩衝稀釋液稀釋50 00〜；ιοοοο 倍。進行螢光檢測時，為與ΤΒΕ緩衝稀釋液比較，另外準 備與ΤΒΕ緩衝稀釋液大約同量之純水當做比較標準。未稀 f成0.5倍以前之正常濃度ΤΒΕ緩衝液，可預先溶解（既定 量）之Trisaminomethane、硼酸 '及EDTA於純水調製。正 常濃度TBE緩衝液為TBE緩衝液全量1公升中含有 Τι·ι_ίη_ίίν_1〇·8£、石朋酸 5.5g、及〇 5m〇1/mL 濃度 EDTA溶液4毫升。

，其··人將推疋有核酸結合之鑽石放入稀釋1 s液之TBE 、土衝稀釋液中。如有核酸結合時’通常約經2 〇分鐘即顯現 :果此時將推定有核酸結合之鑽石之一部分放入純水中 當做比較標準。 f射紫外線以確認有無螢光。紫外線波長以3〇2〜3i2nm 〒確1^裝置最好使用透射照明器。如市售船越

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五、發明說明（15) (Funakoshi)公引制 qnvT .11 · 別 ΒΠΙΙ。衣3UVTranSlUuminat〇r(透射照明器）、 3i 式 N L M S - 2 0 裝。. 寺要有相同程度性能則機種無關重要。 f ,比較私準之純水無法確認螢光’而稀釋Gelster液之ΤΒΕ 緩衝稀釋液確切路出卩主 Bn -n- ^ j-ji %。心螢光時，即可確認核酸結合於鑽石。 又未結合螺旋狀核酸之鑽石_單核苷結合體亦依上述方 法進行螢光試驗，以比較確認。 …士此^彳于之本實施形態之鑽石-核酸結合體其化學性安 疋在夕數有機溶劑、多數酸性液、多數驗性液中均可安 定存在》 有機，劑可舉例如醋酸乙酯、苯酚、氯仿、吼啶、苯、 四氣化碳、—曱亞砜（DMS0)、二甲替甲醯胺（dmf)等。其 他亦可舉例如乙醇等多數醇類。此等有機溶劑可單獨使 用’亦可依物理化學特性而組合使用。 酸性液可舉例如醋酸、苯曱酸溶液、硼酸水、碳酸水 等三又y舉例如濃度約〇. lm〇1之氟化氫水、濃度約〇· lm〇1 之氣化氫水。此等酸可單獨使用’亦可依物理化學特性而 組合使用。 驗性液可舉例如碳酸氫鈉鹽水溶液、鱗酸二氫鈉 (N a IP 〇3)水溶液等。此等驗可單獨使用，亦可依物理化學 特性而組合使用。 如此製得之本實施形態之鑽石-單核苷結合體應在如下 述之領域廣泛使用。茲例示幾項影響效果較大者。 (1)應用於DNA晶片技術

可當做DNA晶片利用。現有DNA晶片為使用載玻片之DNA

C:\2D-GODE\91-03\90132000.ptd 第18頁 1318297 五、發明說明（16) ------ :片與使用載玻片之DNA晶片比較時，本實施形態可形 成更安定^信賴性高、集成度高之晶片。 —於本貝鈿形態，DNA構成單位之核苷以化學結合堅固固 ， 广石基片’其固定強度安定。基片本身之鑽石亦化學. =安疋。結果本實施形態之鑽石_核酸結合體之耐久性 . ，，能夠長時間安定維持起初之化學構造。分析數據之信 賴性亦高。亦可能使用各種有機溶劑。鑽石表面每一格子 點都有結合位點，故DNA可以平面性高密度配置。鑽石本 身為具生體適合性之材料，故誘致生體分子破壞或變質之 可能性少。 φ (2 )應用於生物感測器 可使用為單股DNA雜交以識別基因、或識別藥物對DNA作 用等之認知感測器。 例如以電氣信號讀取DNA作用之反應，將此電氣·信號在 元件内理論回路適當演算、鑑別，實現特定機能。使用導 電性鑽石基片可能形成此種智慧元件，期待應用於廣泛領 域。 DNA感測器須要以某種信號高感度讀取與其他分子接觸 而產生之變化。在DNA發生任何新的狀態變化時，在DNA與 鑽石間發生電氣能量移動、電荷移動、或雙極離子一春 (dipole)相互作用之變化。使用導電性鑽石可讀取此等電 氣變化，而檢測數據之影像化亦有可能。 s (3)應用於DNA-RNA之分離 使用固定特定驗基序列單股DNA-RNA之鑽石為液相色析‘

1318297 五、發明說明（17) 用管柱，可分離與被固定之DNA-RNA具相同或不相同驗基 序列者。又利用此管枉’可能進行電泳分離。 (4)應用於解析生體分子構造

i )利用於各種蛋白質-DNA相互作用（interaction)之研究 目前蛋白質與DNA間之相互作用，主以形成蛋白質-DNA 複合體之結晶或溶液後’再用NMR等機器分析法進行調 杳〇 溶液中之核酸分子通常為可能游動之自由狀態，故目前 尚難有效抑制不在生體内部發生之作用。D N A固定於錢石 後，在溶液中與蛋白質作用時，可能獲得誤差少、精度高 之數據。例如可詳細調查蛋白質分子上那一位點較容易作 用及其相互作用為那一種等等。 11 )應用於難結晶性生體蛋白質之結構解析技術 大分子量蛋白質一般難以用NMR解析而以結晶化後用χ線 構造解析決定其構造。因此雖然已知其有用性且急於 結構之蛋白質，因其結晶化困難而未進行解析者亦辦 =此種決定蛋白質分子之結構利用有機化學技術（曰 特有有機反應或振盪分光光譜）及如AMF盥原子探 Probe)之組合技術等。以原子探針解析複雜分 要固定蛋白質分子形狀，使接受探針操作時有須 不發生形狀變位。 、王°丨或部分 因此可 化DNA 能性。 直接固定結構不明之蛋白質分子通常極為困 考慮蛋白質不直接固定於基片，而利用與鑽石固 之相互作用，或使蛋白質與該DNA結合_固定化之

1318297 五 '發明說明（18) 本發明為其基礎技術。 ^ =原子探針決定分子結構理論上雖可能，但可預測為相 當花費時間之工作。因此當做更有效率且實際技術’可考 慮在原子探針前階段加入利用多種DNA，根據蛋白質立體 結構差別進行大約分類之『篩選』操作。例如準備固定具 有幾種不同立體結構選擇性DNA之基板，以此進行利用未 知蛋白質局部結構特徵之篩選操作。如此即可快速把握構 成未知分子之立體結構。以一個或多數個位置固定DNA於 基板之技術，本發明為其基礎技術。 【實施例] 以下說明實施例’但本發明不被該實施例限定。 〔實施例1〕 <調整原料鑽石> 市售鑽石粉（分級為粒徑1〜2 # m者）以硫酸-硝酸混合液 處理以去除金屬等可能混入之不純物。純水清洗、乾燥後 用微波等離子CDV裝置，以壓力40Torr之氫等離子、約800 C加熱處理1小時進行鑽石表面平滑化及氫化。 <結合胸腺核苷> 混合濃硝酸1公升與濃硫酸9公升調製混合酸。此混合酸 1 0公升加上得鑽石i g，以丨5 〇 °c恒溫槽迴流混合酸，使混 合酸與鑽石反應1日。反應終止後用純水清洗與混合酸反 應之鑽石。其次浸潰該以水清洗之全部鑽石於濃度〇· f氧化鈉水溶液〇. 03公升中，於9〇它恒溫槽靜置數日。其 次以純水充分清洗後在濃度〇. 1M/L鹽酸中，於9〇t恒溫槽

1318297 五、發明說明（19) 靜巧曰。依此結合多數羧基於鑽 其次，將上述結合多數羧基之鑽石。 得鑽石-酸齒化物。反應量為鑽石；虱化亞硫醯反應而 〇·04mo1 ^反應溫度維持常溫以上虱化亞硫醯 油浴槽並以電磁迴轉棒揽掉。 c以下。使用恒溫 其次，導入上得鑽石_酸齒化物盥 無水吡啶中反應。反應量為鑽石_酸幽化1甘於有機溶劑 O.OSg、有機溶劑〇.〇3卜反應催化劑使/_、胸腺核菩 ::反應溫度為常溫之18〜25t、反應時間:二= 〈放大DNA > 用pUC系選殖載體PUC18DNA，與2個引子M13PrimerM4與 MUPrimerRV、及熱循環PCR放大器，放大抗安比西林” (Ainpicilin)基因之部分123驗基對。此時引子使用5’末端 為填酸根者，則被放大DNA5’末端亦為破酸根。 <連接> 製造全量為U之鑽石-胸腺核苷結合體，取其〇. 〇〇 lg與 核酸互補結合，其餘保存為對照比較樣品。 以PCR法放大器放大之核酸與鑽石-胸腺核苷結合體以下 述方法互補結合6 連接酶使用T4DNA連接酶’以寶酒造公司製套件〈商品 名稱 DNA Ligation kit Ver 2>在TBE緩衝液中進行反 應。反應裝置使用加熱磚’反應溫度為1 6 °C、反應時間為 2小時。經反應時間後推測已結合核酸之鑽石以水清洗數 C:\2D-00DE\91-〇3\9013200〇，Ptd 第22頁 1318297

五、發明說明（20) 次。 <合成物確認> 其次使用DNA螢光染色劑以紫外線進行螢光檢測試驗。 DNA發光染色劑使用Gelster °Gelster以通常之q 農产 TBE緩衝液稀釋成1 〇〇〇〇倍後再加等量純水。 "J又 其次加推測已結合核酸之鑽石於以TBE緩衝液稀釋 Gelster之稀釋液中。 經數1 0分鐘後照射波長302nm紫外線，用透射照明器（妒

越（？1^吐05}1〇公司製31^11'31^111111^11以0〇確認鑽石！} 光之存在。 u 愛 以保存之鑽石-胸腺核苷結合體為對照比較樣品，依上 述方法進行螢光檢測試驗結果未能確認螢光之存在。又 〔實施例2〕 與實施例1相同之市售鑽石粉（分級為粒徑〗〜2以m者 同樣以硫酸-硝酸混合液處理以去除不純物。純水清洗、’ 乾燥後用微波等離子CDV裝置，以曱烷氣（Cl) 〇5ν〇ι%、 乙硼烷氣（B2H6)50v〇1 ppm、餘量氫氣（約95v〇1%)之混人 體為原料’於試料溫度85(rc進行2小時之生長。依此，房 來之鑽石被覆平均厚度約0.5 _摻雜硼之?型鑽石晶膜生

長層彳寸粒徑2〜之半導體鑽石❶以此半導體鑽石為 起始原料，經與實施例丨相同之胸腺核苷結合、dna放大、 連接等處理過程，最後以螢光檢測試驗確認DNA之結合。 〔實施例3〕 實施例1所付鑽石-核酸結合體浸潰於〇 · 〇〇2公升氟化氫

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五、發明說明（21) 水並以2 0 0rpm攪拌2小時。氟化氫水濃度預先調整為〇. j mol/L 〇

經攪拌後之鑽石-核酸結合體以擴散反射紅外線傅立葉 (Fourier)轉換光譜儀（通常簡稱DRIFT)進行光譜檢杳。” 果核酸未發生物理、化學性變化。 ''Q 〔實施例4〕 除使用5重量％碳酸氫鈉水溶液以取代氟化氫水外，餘土— 與實施例3相同方法處理實施例1所得鑽石-核酸結合體 '。句 結果核酸未發生物理、化學性變化。 〔實施例5〕 除使用吼啶液以取代氟化氫水外，餘均與實施例3相同 方法處理實施例1所得鑽石-核酸結合體。結果核酸未發生 物理、化學性變化。 〔實施例6〕 實施例1所得鑽石-核酸結合體浸潰於〇. 〇 2公升甲醇納液 並以20 Orpm攪拌2小時。以DRIFT檢查結果獲知錯石上之核 酸完全消失。測定浸潰曱醇鈉液前、後質量，由其差獲知 每1 c m2鑽石表面上結合;[〇 n g核酸。 〔比較例1〕 取被覆表面積lcm2之聚L-離胺酸之磨砂玻璃，付著與實 施例1使用之DNA同一化學構造DNA調製成載玻片-核酸結合 體後，進行與實施例2、實施例3、實施例4相同實驗。 各實驗均以DRIFT進行光譜檢查。所有結果均未能檢測 DNA載玻片之結合信號，確認載玻片上之DNA全部脫落。

C:\2D-00DE\91-03\9013200Q.ptd 第24頁 1318297 五、發明說明（22) 〔比較例2〕 調製與實施例1鑽石-核酸結合體之核酸部分為相同化學 構造之載玻片-核酸結合體’浸潰於〇.02公升氟化氫水 (濃度0. lmol/1)並以200rpm攪拌2小時。 以DR I FT檢查結果獲知載玻片上之核酸完全消失。 測定浸潰前、後質量，在載玻片-核酸結合體中，獲知 每lcm2載玻片表面上結合0. lng核酸。 比較例2之載玻片-核酸結合體與實施例1之鑽石__核g变名士 合體比較時，其DNA結合比率為1 00分之1 〇 /夂m 【發明效果】 由上述說明可知使用本發明之核酸與鑽石結合方、去e a 現與核酸之化學結合性堅固、化學安定性優在；:J 劑、酸或弱鹼溶液中之化學安定性優異，核酸之結人& & 高，且生體親和性' 生體適合性優良之核酸晶片、了0密度 又使用本發明之鑽石-單核誓結合體時，可Βθ ° 之化學結合性堅固、化學安定性優異，在有 用％、核酸 弱鹼溶液中之化學安定性優異，核酸之結人* '合^、酸或 體親和性、生體適合性優良之核酸晶片 Μ A向，且生 又使用本發明之鑽石-核酸結合體時，η ^ 化學結合性堅固、化學安定性優異，、’可^當做與核酸之 鹼溶液中之化學安定性優異，核酸之結^ ^溶，、酸或弱 親和性、生體適合性優良之核酸曰二5密度高，且生體 曰白4更用。 又如以使用本發明之鑽石-單核g結 法時，可檢測核酸存在與否。 組义核酸檢測方

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C:\2D-CQDE\91-03\90132000.ptd 第26頁 1318297 圖式簡單說明 第27頁 C:\2D-CODE\91-03\90132000.ptd ΤΉ 告本' ή ^ ΐ讳頁 JUN - 3 200S 修正 ^逾i 申請日期：9$)-tf-24 Θ j 案號：-- _ i.c i ivT^/fu73Vs：^ Γλ·,^ \/〇ϋ (Ac 1认 η (以上各欄由本局填註) 發明專利說明書

、 發明名稱 中文 核酸和鑽石之結合方法及鑽石-單核苗結合體 英文 二 發明人 姓名 (中文） 1. 安藤壽浩 2. 牛澤浩一 3. 佐藤洋一郎 姓名 (英文） 1. 安藤寿浩(ANDO Toshihiro) 2. USHIZAWA Koichi 3.SATO Yoichiro 國籍 1_曰本2.曰本3_曰本 住、居所 1. 日本國茨城縣〇 市千現一丁目2番1號獨立行政法人 物質·材料研究機構内 2. 日本國茨城縣〇< if市千現1-20-13-203 3. 同1 申請人 姓名 (名稱） (中文） 1. 獨立行政法人科學技術振興機構 2. 獨立行政法人物質.材料研究機構 姓名 (名稱） (英文） 1. 独立行政法人科学技術振興機構 2. 独立行政法人物質.材料研究機構 國籍 1.曰本2.曰本 住、居所 (事務所） 1. 曰本國埼玉縣川口市本町4丁目1番8號 2. 曰本國茨城縣〇< if市千現一丁目2番1號 代表人 姓名 (中文） 1. 沖利*蕙接f 2. 岸輝雄 代表人 姓名 (英文） 1. 2. 第1頁 卯 132000(替換）-2.ptc

Claims (1)

1. 核酉夂和鑽石之結合方法 六、申 1.—種 將鑽石 表面之碳 已鹵化之 反應進行 在包含 單核苷結 而將上 核酸結合 2 ·如申 中，上述 苷、胞喊 3. 如申 中，上述 4. 如申 中，上述 一種或此 5 如申 中，上述 上述單核 為聚胺、: 6. —種 原子和胸 JUN - 3 2Q08 換本 表面以酸氧化祐LV认，A 马耩由 JS V , ^鹼水解，藉此形成羧基於鑽石 羧美知丄化劑將該羧基之羥基進行鹵化’使 釺1，::甘利用於含催化劑之有機溶劑中的酯 i;之緩：石—單核苷結合體之步驟；以及 人體透過連接酵素反應使該鑽石-口體和核。酸進行互補結合之步驟； 二鑽單核苷結合體和核酸結合’以得到鑽石— 圍第1項之核酸和鑽石之結合方法，其 :核=腺核誓、腺嗓吟核[鳥翼嗓吟核、 ^ 及尿喷啶核苔等中之任一種。 :::::Γ第1項之核酸和鑽石之結合方法，其 硫酸之混合液，上述驗為氫氧化鈉。 Lt!:圍第1項之核酸和鑽石之結合方法，其 等之氣化亞硫醢、1氯化-、五氯化碟之任 酸和鑽石之結合方法，其 苷為們#衝液在上述核酸末端為腺嘌呤核苷、 甘為胸腺核ty:時，酵去盔τ, , I ^ 2價金屬趟鱼聚乙一醆、/' 4DNA連接酶，緩衝液 ⑤識興聚乙一醇之混合液。 缘Ϊ二核嘗結合體’其特徵為，鑽石表面之碳 跟核苷進行酯結合。 〜厌