KR20020079806A - 뉴클레오티드 고정용 담체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

DNA의 말단 부분를 손상하지 않고 DNA의 효율적인 해명에 기여하는 뉴클레오티드 고정용 담체는 분자 생물학, 생화학 등의 분야에 유용하다. 상기 뉴클레오티드 고정용 담체는 올리고뉴클레오티드를 고정하는 화학적 개질 기체로서, 올리고뉴클레오티드가 제한 효소 절단 부위를 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 담체는 기체를 화학적으로 개질하여 제조되고, 단일 사슬 올리고뉴클레오티드을 고정하고, 상보적인 염기 서열을 가지는 다른 단일 사슬 올리고뉴클레오티드와 단일 사슬 올리고뉴클레오티드을 하이브리드하고, 말단에 제한 효소 부위를 가지는 올리고뉴클레오티드를 결합한다.

Description

뉴클레오티드 고정용 담체 및 이의 제조 방법{SUPPORT FOR FIXING NUCLEOTIDE AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
유전자 분석은 분자 생물학 및 유전 공학 분야에 유용하고, 최근에는 질병의 발견 등과 같은 의료 분야에도 이용할 수 있게 되었다.
유전자 분석에서, DNA 칩(chip)이 최근 개발되어 분석 속도가 상당히 가속되었다. 그러나, 통상적인 DNA 칩에서는, 폴리리신 같은 고분자 물질을 슬라이드 글래스 또는 실리콘 기판 표면 상에 도포해서 DNA을 고정하는 방법을 사용한다. 다른 방법은 포토리소그래프(photolithograph) 같은 반도체 기술을 이용해서 올리고뉴클레오티드를 글래스 기판 상에 합성한다.
그러나, 폴리리신 같은 고분자 물질을 슬라이드 글래스 또는 실리콘 기판 표면 상에 도포해서 DNA를 고정하는 방법에서는, DNA의 고정 상태가 불안정하고 하이브리드 형성 공정 또는 세척 공정 동안 DNA가 분리되는 문제가 발생한다. 더욱이, 반도체 기술을 이용하는 DNA 칩에서는, 제조 공정의 복잡성 때문에 고비용의 문제가 생긴다.
상기 문제를 해결하기 위해, DNA를 고체 지지체 표면 상에 고밀도로 강하게 고정하는 것이 필요하다.
고체 기체의 표면이 화학적으로 개질되는 기체도 공지되어 있다. 그러나, 목적하는 DNA가 화학적으로 개질된 부분에 아미드 결합으로 직접 결합될 때, DNA의 말단 부분이 화학 결합 동안 상기 처리 등에 의해 손상되는 위험이 있고, 따라서 이의 개선이 요구되어 왔다.
본 발명의 목적은 DNA 말단부의 손상없이 DNA의 해명을 효율적으로 수행하는, 분자 생물학, 유전 공학 등의 분야에서 유용한 뉴클레오티드 고정용 담체를 제공하는 것이다.
본 발명은 분자 생물학 분야 및 유전 공학 관련 분야에 유용한 핵산 등을 고정할 수 있는 뉴클레오티드 고정용 담체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명자는 예정된 제한 효소 절단 부위를 가지는 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 개질된 기체에 고정시켜 고정된 DNA에 대응하는 제한 효소 부위가 형성될 때, 안정하게 고정하는 것이 가능한 것을 발견하고 본 발명을 성취하였다.
따라서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 고정용 담체는 올리고뉴클레오티드를 고정하는 화학적으로 개질된 기체이고, 올리고뉴클레오티드가 제한 효소 절단 부위를 가지는 것을 특징으로 한다.
상기의 경우에, 올리고뉴클레오티드의 한쪽 사슬만 화학적으로 개질된 기체에 결합되는 것이 바람직하고, 또한 올리고뉴클레오티드가 아미드 결합으로 화학적으로 개질된 기체에 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 고정용 담체의 제조 방법은 상기 기체를 화학적으로 개질하고, 단일 사슬 올리고뉴클레오티드를 고정하고, 그후 상기 단일 사슬 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열을 가진 다른 단일 사슬 올리고뉴클레오티드를 상기 단일 사슬 올리고뉴클레오티드에 하이브리드시키고, 그 결과 말단에 제한 효소 부위를 가지는 올리고뉴클레오티드가 결합되는 것을 특징으로 한다.
상기 경우에, 기체의 화학적 개질은 기체 표면의 염소화, 아미노화 및 카르복실화를 포함하고 기체가 화학적으로 개질된 후, 말단을 탈수축합제의 존재하에 활성화하는 것이 바람직하다.
상기 경우에, 기체의 화학적 개질은 기체 표면을 염소화 및 아민화하고 생성된 일차 아미노기를 활성화된 디에스테르의 한 에스테르기로 탈수축합하는 것이 바람직하고, 활성화된 디에스테르의 에스테르기가 N-히드록시숙신이미드 또는 p-히드록시숙신이미드인 것이 더 바람직하다.
상기 경우에, 기체에 고정된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 고정된 측의 말단에 일차 아민을 가지는 1-10 뉴클레오티드를 가지는 것이 또한 바람직하다. 기체에 고정된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드는 고정된 측의 말단에 1-10 일차 아민(들) 이어서 1-5 티민 또는 구아닌을 가지는 것이 더욱 바람직하다. 기체에 고정된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 고정된 측의 말단에 1-5 아데닌 또는 시토신 및 1-5 티민 또는 시토신을 가지는 것이 더 바람직하다.
본 발명을 실시하기 위한 최량의 형태
본 발명에 따른 뉴클레오티드 고정용 담체는 올리고뉴클레오티드가 화학적 개질에 의해 고정된 기체이고 올리고뉴클레오티드가 제한 효소 절단 부위를 가지는것을 특징으로 한다.
제한 효소 절단 부위는 후에 제한 효소에 의해 특정적으로 절단되는 핵산의 서열을 의미한다. 제한 효소에 관해서, 일반적으로 사용되는 것인 한 특별한 제한이 없다. 이들 예는 AatⅠ, AatⅡAccⅠ, AflⅡ, AluⅠ, Alw44Ⅰ, ApaⅠ, AseⅠ, AvaⅠ, BamHⅠ, BanⅠ, BanⅡ, BanⅢ, BbrPⅠ, BclⅠ, BfrⅠ, BglⅠ, BglⅡ, BsiWⅠ, BsmⅠ, BssHⅡ, BstEⅡ, BstXⅠ, Cfr9Ⅰ, Cfr10Ⅰ, Cfrl3Ⅰ, CspⅠ, Csp45Ⅰ, DdeⅠ, DraⅠ, Eco47Ⅰ, Eco47Ⅲ, Eco52Ⅰ, Eco81Ⅰ, Eco105Ⅰ, EcoRⅠ, EcoRⅡ, EcoRⅤ, EcoT22Ⅰ, EheⅠ, FspⅠ, HaeⅡ, HaeⅢ, HhaⅠ, Hin1Ⅰ, HincⅡ, HindⅢ, HinfⅠ, HpaⅠ, HpaⅡ, KpnⅠ, MboⅡ, MluⅠ, MroⅠ, MscⅠ, MspⅠ, MvaⅠ, NaeⅠ, NarⅠ, NciⅠ, NcoⅠ, NheⅠ, NotⅠ, NruⅠ, NspⅤ, PacⅠ, PpuMⅠ, PstⅠ, PvuⅠ, PvuⅡ, RsaⅠ, SacⅠ, SacⅡ, SalⅠ, Sau3AⅠ, Sau96Ⅰ, ScaⅠ, ScrFⅠ, SfiⅠ, SmaⅠ, SpeⅠ, SphⅠ, SrfⅠ, SspⅠ, TaqⅠ, TspEⅠ, XbaⅠ 및 XhoⅠ 이고 상기로부터 자유롭게 선택된 제한 효소에 대한 절단 부위는 제한 효소 절단 부위라고 한다.
올리고뉴클레오티드는 상기와 같은 제한 효소 절단 부위를 가질 필요가 있으므로, DNA 같은 이중 사슬 핵산은 불가피하다.
올리고뉴클레오티드에 관해서, 고등 동물, 곰팡이, 박테리아 및 바이러스 같은 천연의 것 및 인공적으로 구조 변화를 받아 합성된 것들을 예시할 수 있으며, 이후에 언급될 것처럼 쉽게 합성될 수 있으므로 합성된 것이 바람직하다. 부수적으로, 올리고뉴클레오티드의 염기수는 바람직하게는 10-50이다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 고정용 담체는 하기 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
(1) 기체의 화학적 개질
본 발명에 따른 뉴클레오티드 고정용 담체에서, 상기 뉴클레오티드를 화학적으로 개질된 기체에 고정한다.
기체의 예는 유리; 다이아몬드; 금, 은, 구리, 알루미늄, 텅스텐 및 몰리브데눔 같은 금속; 상기 언급된 유리, 다이아몬드 또는 금속과 세라믹의 적층 생성물; 및 폴리카보네이트 및 플루오린 수지 같은 플라스틱이다.
또한 화학적으로 안정한 물질인 한 다른 물질이 또한 사용될 수 있고, 흑연 및 다이아몬드 같은 탄소가 예시될 수 있다. 상기 언급된 금속, 유리, 세라믹, 다이아몬드 등과 플라스틱의 혼합체 또는 적층체를 사용하는 것이 또한 가능하다.
상기 중에서, 열 전도성의 관점에서 다이아몬드 그자체 또는 다아아몬드가 부분적으로 사용된 것을 기체로서 사용하는 것이 바람직하다. 다이아몬드는 우수한 열 전도성을 가지고 있고 급속한 가열 및 냉각을 수반할 수 있어서 PCR의 경우에서와 같이 가열 및 냉각이 반복되는 열 순환 시간을 효율적으로 단축할 수 있다.
본 발명의 기체의 열 전도성은 0.1W/cmㆍK 이상, 바람직하게는 0.5W/cmㆍK 이상, 특히 바람직하게는 1.0W/cmㆍK 이상이다. 즉, 1.0W/cmㆍK 이상일 때, DNA가 본 발명의 담체의 화학적 개질 부분에 고정된 후에 PCR 등이 수행될 때, 가열 및 냉각의 수반성이 우수하다.
다이아몬드 기체용 원료에 관해서, 고압 하에서 제조된 다이아몬드인 합성다이아몬드 및 천연 다이아몬드 어느 것이나 사용할 수 있다. 구조는 단결정체 또는 다결정체일 수 있다. 생산성의 관점에서, 마이크로파 플라즈마 CVD (Chemical Vapor deposit) 같은 기체(gas)상 합성 방법에 의해 제조되는 다이아몬드를 사용하는 것이 바람직하다.
다이아몬드 또는 다른 재료가 원료인 기체의 형성 방법은 공지 방법에 의해 수행될 수 있다. 마이크로파 플라즈마 CVD 법, ECR (Electric Cyclotron Resonance) CVD 법, IPC (Inductively Coupled Plasma) 법, 직류 스퍼터링법, ECR 스퍼터링 법, 이온 도금법, arc 이온 도금법, EB (Electron Beam) 증착법 및 저항 가열 증착법을 예시할 수 있다.
더욱이, 결합제로서 수지와 금속 분말 또는 세라믹 분말을 혼합함으로써 결합 및 형성되는 생성물을 기체의 제조 방법으로 예시할 수 있다. 게다가, 금속 분말 또는 세라믹 분말 같은 원료를 프레스 성형기를 사용해서 압착하고 생성물을 고온에서 소결(sinter)하는 방법을 기체 제조 방법으로 예시할 수 있다.
기체의 표면을 의도적으로 조면화하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 조면화된 표면에서, 기체의 표면적이 증가하여 많은 양의 DNA 등을 고정하는데 편리하다. 기체의 형상은 평판상, 사상, 구상, 다각형상, 원반상, 분말상 등일 수 있다. 더욱이, 기체는 다른 물질과 다이아몬드의 복합체 (예컨대 2상체)일 수 있다.
화학적 개질은 폴리뉴클레오티드가 결합될 수 있도록 말단에 히드록시기, 카르복실기, 에폭시기, 아미노기, 티올기 또는 이소시아네이트기 같은 극성기를 가진탄화수소기로 기체 표면을 치환함으로서 수행된다. 상기 탄화수소기의 탄화수소 부분의 탄소수(들)는 0-12가 바람직하고, 더 바람직하게는 0-6이다. 상기 예는 포름산, 아세트산 및 프로피온산 같은 모노카르복실산; 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산 및 푸마르산 같은 디카르복실산; 트리멜리트산 같은 폴리카르복실산; 등이고, 한 종류 이상의 산 무수물의 형태로 사용하는 것이 가능하다. 옥살산 및 숙신산이 특히 바람직하다.
탄화수소기가 기체 표면에 아미노 결합되는 것이 바람직하다. 즉, 아미노 결합의 결과로, 화학적 개질이 용이하고 강하게 이루어질 수 있다.
상기 화학적 개질은 기체 표면에 자외선 조사하여 염소화하고, 암모니아 가스 중에서 자외선 조사하여 아미노화하고, 적당한 산 클로라이드 또는 디카르복실산 무수물을 사용해서 카르복실화하는 방법으로 수행될 수 있다.
(2) 단일 사슬 올리고뉴클레오티드 고정
그 후, 단일 사슬 올리고뉴클레오티드 (이하, 올리고뉴클레오티드 A라고 함)를 아미드 결합으로 화학적 개질 부분에 고정한다. 화학적 개질의 탄화수소기의 말단을 고정전에 활성화할 때, 고정이 용이하게 수행되며, 따라서, 바람직하다. 탈수축합제에 관해서, 카르보디이미드의 사용이 특히 바람직하다.
상기 방법 이외에, 기체 표면을 염소화 및 아미노화된 상태 (카르복실화되지 않음)로 만들어 생성된 일차 아미노기를 N-히드록시숙신이미드 및 p-니트로페놀 같은 에스테르기를 가지는 활성화된 디에스테르의 한 에스테르기와 탈수축합하는 방법으로 형성하는 것도 가능하다.
올리고뉴클레오티드 A의 서열은 임의이지만, 고정되지 않은 말단 (3'-말단)은 다음의 별개의 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화에 의해 수득된 이중 사슬 올리고뉴클레오티드가 제한 효소 절단 부위를 갖도록 설계되는 것이 필요하다.
화학적 개질 기체에 아미드 결합의 용이성을 고려할 때, 고정된 측이 아데닌, 시토신 및 구아닌 같은 일차 아민을 가지는 뉴클레오티드 1-10 염기(들)를 가지는 것이 또한 바람직하다. 특히 바람직하게는, 고정된 측 (5'-말단)의 1-5 염기(들)는 아데닌 또는 시토신이다. 다음 하이브리드화에서 다양성을 억제하기 위해 아데닌 다음의 1-5 염기(들)가 티민 또는 구아닌인 것이 또한 바람직하다.
(3) 다른 단일 사슬 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 A에 하이브리드한다.
다른 단일 사슬 올리고뉴클레오티드 (이하, 올리고뉴클레오티드 B라고 함)가 올리고뉴클레오티드 A에 상보적인 서열을 가지는 것이 필요하다.
하이브리드화에 의해 수득된 이중 사슬 올리고뉴클레오티드에서 기체에 고정된 측에 반대인 말단은 제한 효소 절단 부위를 가지는 것이 본 발명에서 필요하고, 따라서 올리고뉴클레오티드 A 및 올리고뉴클레오티드 B가 제한 효소 절단 부위를 형성하는 것이 필요하다. 하이브리드화에 대한 조건은 통상적으로 요구되는 것과 동일할 수 있다.
상기와 같이 수득되는 본 발명의 뉴클레오티드 고정용 담체는, 접합되고자 하는 DNA에 대응하는 제한 효소 절단 부위를 형성한 후에 그것을 접합할 수가 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 자세하게 예시될 것이다.
실시예 1
(EcoRⅠ 절단 부위를 가지는 뉴클레오티드 고정용 담체의 제조)
(1) 기체의 화학적 개질
다이아몬드를 함유하는 기체에 염소 가스 중에서 자외선을 조사하여 표면을 염소화했다. 그후, 암모니아 가스 중에서 자외선을 조사하여 아미노화하고, 산 클로라이드를 사용해서 클로로포름 중에 환류해서 카르복실화하고, 그 결과 기체 표면이 화학적으로 개질되었다.
(2) 단일 사슬 올리고뉴클레오티드의 고정
상기 (1)에서 제조된 화학적 개질 기체를 카보디이미드 2.5 mg/ml 및 N-히드록시숙신이미드 1.5 mg/ml가 용해된 1,4-디옥산 용액(다이아몬드 기체 1에 100 ㎕ 양) 중에서 15분간 침청하여 말단 카르복실기를 탈수축합하였다. 반응의 완결 후에, 생성물을 물로 세척하고 1,4-디옥산 용액으로 더 세척하여 건조했다.
추가적으로, 서열 목록의 서열 번호 1로 언급된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 A-1의 5'-말단의 아데닌을 활성 부위에 아미드 결합하였다.
(3) 올리고뉴클레오티드 A에 올리고뉴클레오티드 B의 하이브리드화
올리고뉴클레오티드 A (서열= aaaggttttt tttttttttt tttg: 서열 번호 1)에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 B (서열= aattcaaaaa aaaaaaaaaa aaacctt: 서열 목록의 서열 번호 2)를 제조하고 상기 (2)에 고정된 올리고뉴클레오티드 A에 하이브리드했다.
올리고뉴클레오티드 B를 멸균수 78 ㎕ 및 20×ssc(saline-sodium citration solution) 20 ㎕에 용해하고 10 % SDS 용액 2㎕를 첨가하여 전체 100 ㎕를 제조했다. 올리고뉴클레오티드 A가 고정된 기체를 35 ℃에서 상기 용액에 10 시간 침청했다.
결과적으로, EcoRⅠ 절단 부위를 가지는 본 발명에 따른 고정용 담체를 제조했다.
(4) 제한 효소 절단 부위를 가지는 gDNA 제조
목적하는 DNA를 하기 조성을 가지는 완충액 중에서 EcoRⅠ으로 처리하고(37 ℃에서 1시간), 효소를 불활성화하는 반응 후에 가열하고, 전기 영동(아가로스 겔)하여 EcoRⅠ 절단 부위를 가지는 gDNA 분획을 얻었다.
완충액의 조성은 하기와 같다.
ㆍEcoRⅠ 2 ㎕
ㆍ10×H완충액 4 ㎕
ㆍ멸균수 34 ㎕
합계 40 ㎕
(5) 염색체 DNA의 제한 효소 분획을 리가제를 사용하여 기체에 접합했다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 고정용 담체가 제한 효소 절단 부위를 가지는 올리고뉴클레오티드에 리가제를 사용해서 DNA 같은 고정된 핵산을 고정하고, 따라서, 화학 결합에 의한 직접 고정의 통상적인 방법과 비교할 때, DNA 같은 핵산이 안정한 방법으로 고정될 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 제조 방법에 따라, DNA 같은 핵산이 안정하게 고정될 수 있는 뉴클레오티드 고정용 담체가 효율적으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 고정용 담체가 상기 상태로 상품화될 때, 사용자는 대응하는 제한 효소를 사용해서 DNA을 절단해서 제한 효소 절단 부위를 미리 준비하여 사용자는 DNA을 용이하고 안정하게 고정할 수 있다.

Claims (12)

  1. 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 개질된 기체 상에 고정하는 뉴클레오티드 고정용 담체에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 제한 효소 절단 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 고정용 담체.
  2. 제 1 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 한쪽 사슬만이 화학적으로 개질된 기체 상에 결합되는 뉴클레오티드 고정용 담체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 아미드 결합으로 화학적으로 개질된 기체 상에 결합되는 뉴클레오티드 고정용 담체.
  4. 기체를 화학적으로 개질하고, 단일 사슬 올리고뉴클레오티드를 그 곳에 고정하고, 상기 단일 사슬 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열을 가지는 다른 단일 사슬 올리고뉴클레오티드를 상기 단일 사슬 올리고뉴클레오티드에 하이브리드하여 말단에 제한 효소 부위를 가지는 올리고뉴클레오티드를 결합하는 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 기체의 화학적 개질이 기체 표면의 염소화, 아미노화 및 카르복실화를 포함하는 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 기체가 화학적으로 개질되고, 말단이 탈수축합제의 존재하에 활성화되는 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 탈수축합제가 카보디이미드 및/또는 N-히드록시숙신이미드인 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 기체의 화학적 개질이 기체 표면을 염소화 및 아미노화하고 형성된 일차 아미노기를 활성화된 디에스테르 중 한 에스테르기에 탈수축합하는 방법인 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 활성화된 디에스테르의 에스테르기가 N-히드록시숙신이미드 또는 p-히드록시숙신이미드인 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
  10. 제 4 항에 있어서, 기체에 고정된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 고정된 측의 말단에 일차 아민을 가지는 1-10 뉴클레오티드(들)를 가지는 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 기체에 고정된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 고정된 측의 말단에 1-10 일차 아민(들), 이어서 1-5 티민 또는 구아닌을 가지는 뉴클레오티드를 가지는 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 기체에 고정된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 고정된 측의 말단에 1-5 아데닌 또는 시토신, 이어서
    1-5 티민 또는 구아닌을 가지는 뉴클레오티드 고정용 담체 제조 방법.
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