JP4730808B2 - 基板の活性化キット及びこれを用いたdna等の検出方法 - Google Patents
基板の活性化キット及びこれを用いたdna等の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4730808B2 JP4730808B2 JP2002517524A JP2002517524A JP4730808B2 JP 4730808 B2 JP4730808 B2 JP 4730808B2 JP 2002517524 A JP2002517524 A JP 2002517524A JP 2002517524 A JP2002517524 A JP 2002517524A JP 4730808 B2 JP4730808 B2 JP 4730808B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- substrate
- protein
- solution
- spotting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/552—Glass or silica
Description
本発明は、医療分野、生化学や分子生物学等の研究分野において有用な基板の活性化キット、および、前記キットを用いてDNA又は蛋白質等を検出する方法に関する。
背景技術
遺伝子解析は分子生物学、生化学の分野で有用であり、近年では病気の発見等医療分野でも利用されている。
近年DNAを固定化した基板が開発され、遺伝子解析における解析速度が著しく速くなり、これを応用して、医療分野においては疾病診断等も行われている。
基板上にDNAを固定する方法としては、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布した後に固定する方法、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いて基板上にDNAを合成する方法等がある。
しかし、ポリリジン等の高分子を塗布してDNAを固定する方法では、DNAの固定化状態が不安定なため、ハイブリッド形成工程や洗浄工程において、DNAが剥離するといった問題が生じていた。
また、半導体技術を用いた方法は、製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。
このような課題を解決すべく、本発明者らは既に、基体表面を化学修飾してN−ヒドロキシスクシンイミドエステル或いはp−ニトロフェノールエステル等の活性化エステル基で活性化すると、DNAを安定して固定可能なことを見いだしている。
しかし、このような化学修飾には、いくつもの化学反応を経る煩雑な操作が必要であった。
また、化学修飾して活性化された基板は、基板上にDNAをスポッティングした後も余分な活性点がそのまま残っていることがあった。
そのために、スポッティングしたDNAに、検出したいDNAをハイブリダイズさせようとすると、余分な活性点にもDNAが付着してしまい、正確なDNA検出ができないという問題もあった。
本発明は、DNA等の固定化における上記従来の問題点を解決し、基板にDNA等を簡便に、しかも従来の方法と同様に高密度で且つ強固に固定化するための方法および、正確にDNA等を検出する方法の提供を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討の結果、2種類の溶液を混合するだけで簡単に基板の活性化が可能なことを見出した。
また、基板を活性化してDNA又は蛋白質をスポッティング後、ハイブリダイゼーションする前に、プレハイブリダイゼーション工程により余分な活性点をマスキングすることにより、正確なDNA又は蛋白質等の検出が可能となることを見出し、本発明に到達した。また、このマスキングはスポッティング後の後処理工程で乾燥および洗浄を行い、活性基が十分に失活した場合には、行わなくても良いことも見出した。
更に、ハイブリダイゼーション工程前あるいはプレハイブリダイゼーション工程前のインキュベーション工程において、ゲル溶液を使うことにより、より正確なDNA又は蛋白質等の検出が可能となることを見出した。
本発明の基板の活性化キットは、リン酸バッファー(pH6)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)からなる溶液Aと、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−ethylcarbodiimide)からなる溶液Bとを主成分とすることを特徴とする。
本発明の基板の活性化キットは、溶液Aが、リン酸バッファー(pH6):0.01〜5M及びN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide):1〜500mM(0.115〜57.5g/L)の水溶液であることを第2の特徴とする。
本発明の基板の活性化キットは、溶液Bが、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−ethylcarbodiimide)が0.05〜10M(9.59〜1918g/L)のジオキサン溶液であることを第3の特徴とする。
本発明の基板の活性化キットは、溶液A:50〜99容量%に対し、溶液B:1〜50容量%を配合して用いることを第4の特徴とする。
本発明のDNA又は蛋白質の検出方法は、活性化キットを用いて活性化した基板にDNA又は蛋白質をスポッティング後であって、スポッティングされたDNA又は蛋白質への蛍光標識DNAのハイブリダイゼーションを行う前において、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする。
本発明のDNA又は蛋白質の検出方法は、プレハイブリダイゼーションが、基板表面にスポッティングされたDNA又は蛋白質とは異なるDNA又は蛋白質を固定化することを特徴とする。
本発明のDNA又は蛋白質の検出方法は、活性化キットを用いた基板の活性化工程、活性化された基板へのDNA又は蛋白質のスポッティング工程、スポッティング後の基板のインキュベーション工程或いは乾燥工程、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーション工程、スポッティングされたDNA又は蛋白質への蛍光標識DNAのハイブリダイゼーション工程、及び、ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とする。
本発明のDNA又は蛋白質の検出方法は、プレハイブリダイゼーション工程が、基板表面にスポッティングされたDNA又は蛋白質とは異なるDNA又は蛋白質を固定化する工程であることを特徴とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明について以下詳細に説明する。
(1)基板の準備
本発明において用いる基板は、ガラス、プラスチック、シリコンなどの支持体に表面処理層を形成し、更に化学修飾を施すことによって、DNAプローブ、蛋白質、ペプチド等の生体物質等を載せた場合に、基板を洗浄してもDNA断片、蛋白質、ペプチド等が洗い流されずに強固に固定化され、蛍光照射した際に、蛍光スポットが明瞭となることを特徴とする。表面処理層としては、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものであることが望ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物でもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン(DLC)等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定しなくても良い。
このような基板の一例としては、スライドグラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。
このような基板は、前記表面処理層の厚みが、1nm〜1000nmであることが好ましい。
このような基板は、前記ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス1〜99体積%、残りメタンガス99〜1体積%を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
また、このような基板の表裏面に、反射層としてTi、Au、Pt、Nb、WC、等の単層又はこれらの複合膜を製膜しても良い。反射層の厚みは、全体に均一に被覆されなければならないことから、100nm以上が好ましい。さらに好ましくは1000nm以上である。
なお、ガラス基体の表面は、Ra(JIS B 0601)で1nm〜1000nmの範囲で意図的に粗面化されていることも望ましい。このような粗面化表面は基体の表面積が増えて、多量のDNAプローブ等を密度を上げて固定化することに好都合である。
基板の表面処理層の製造は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマCVD法、ECRCVD法、IPC法、直流スパッタリング法、ECRスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、EB蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法などによることができる。
基板は支持体に表面処理層を形成した構造だけではなく、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然のダイヤモンド、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン等の金属、ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック、また、金属粉末や、セラミック粉末等に樹脂をバインダーとして混合して結合形成したものでもよい。また、金属粉末やセラミック粉末等の原料をプレス形成機を用いて圧粉したものを高温で焼結してもよい。また、ダイヤモンドと他の物質との複合体(例えば、2相体)であってもよい。
基体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。
基体表面には、DNAや蛋白質を固定するために、更に化学修飾を施す。化学修飾の一例としては、炭化水素基の末端に活性化エステル基が結合した基を、支持体表面にアミド結合を介して固定化することをいう。このような化学修飾によって、DNA、蛋白質、ペプチド等の生体物質を基体の表面に固定化しやすくする。その他の化学修飾は、末端に極性基、例えば、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基、イソシアネート基等を有する炭化水素基で固体支持体表面を置換することによる。
前期炭化水素基としては、炭素数が1〜12のもの、中でも1〜6のものが好ましい。例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸などのモノカルボン酸;シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などのジカルボン酸;トリメリト酸等の多価カルボン酸が挙げられる。中でも、シュウ酸、コハク酸が好ましい。
化学修飾方法としては、例えば、塩素ガス中で支持体に紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化する。また、別の化学修飾方法として、表面を塩素化しないで、アンモニアガス中でプラズマによりアミノ化した後、酸クロリドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化する。
(2)活性化キット
本発明の活性化キットは、リン酸バッファー(pH6)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)からなる溶液A(水溶液)と、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−ethylcarbodiimide)からなる溶液B(ジオキサン溶液)の2種類からなる。
N−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)の代わりにp−ニトロフェノールを使用することもできる。
本発明の活性化キットにより、基板表面にカルボキシル基を導入した軟ダイヤモンドをコーティングしたスライドグラス(軟ダイヤモンドコートスライドグラス)等をN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)で活性エステル化し、図1のような基板を得ることができる。
すなわち、ダイアモンド表面を活性化した後に、DNAの塩基に含まれる第1級アミノ基とアミド結合させることができる(図2参照)。
溶液A(水溶液)中に占める濃度は、リン酸バッファー(pH6)は、0.01〜5Mであるのに対し、N−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)は、1〜500mM(0.115〜57.5g/L)とすることができる。
リン酸バッファー(pH6)は、例えば0.1M リン酸二水素カリウム溶液および0.1M リン酸水素二カリウム溶液を用意した上で、リン酸二水素カリウム溶液のpHをモニターしながらpH6になるまでリン酸水素二カリウム溶液を添加することにより調整することができる
溶液B(ジオキサン溶液)については、ジオキサンに、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−ethylcarbodiimide)を0.05〜10M(9.59〜1918g/L)の濃度で添加したものが用いられる。
本発明の活性化キットにおいて、溶液Aと溶液Bとの配合割合は、溶液Aが50〜99容量%であるのに対し、溶液Bが1〜50容量%とすることが好ましい。
ビーカー等の容器中で溶液AとBとを混合後、混合溶液中に基板を浸漬し、好ましくは撹拌しながら、4〜50℃で5〜120分間反応させる。軟ダイヤモンドコートスライドグラス等の基板表面のカルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)で活性エステル化、すなわち、ダイアモンド表面を活性化した後に、DNAの塩基に含まれる第1級アミノ基とアミド結合させることができる(図2)。活性化した基板は、滅菌水等により洗浄する。
活性化後の基板は、活性が落ちてしまわないように、なるべく早く使用することが望ましい。保管する場合は、乾燥後、デシケータ中で保管することが望ましい。
本発明においては、前記のように活性化キットで活性化した基板を用いて、以下の工程を経ることにより、DNAを検出することができる。
(3)スポッティング工程
本発明の活性化キットにより活性化した基板に、以下のようにしてDNAを貼り付ける(スポッティング)。
まず、濃度が0.01〜10μg/μLとなるように超純水を用いてDNA溶液を調製する。また、スポッティング用バッファーとしてはSSCやTE等も用いることができるが、1〜50%ホルムアミド溶液あるいは1〜50%グリセリン溶液、1〜50%DMSO溶液を用いると、粘性が高くなり安定してスポットでき、更に蒸発を抑制することが出来る。
続いてスポッティング用溶液を、活性化された基板上にスポッターを用いてスポットする。このとき、スポッティング用溶液を熱変性またはアルカリ変性して、DNA2本鎖を1本鎖とし、急冷してもよい。このスポッティング用溶液を、例えば、図3に示すようにスポッターの針で液を吸取り(図3のa)、基板に押し付けて(同b)、DNA液を基板に押し付ける(同c)。このようにしてスライドグラス表面に多種類のDNAを貼り付ける(同d)。
(4)インキュベーション工程
次に、スポッティングしたDNAが基板表面に固定する反応を進行させるべく、インキュベーションを行う。DNAの基板への固定化は、化学反応による共有結合であるため、反応を確実に進めるべく、スポット後に速やかにインキュベーションを行う必要がある。
インキュベーションは、高湿化で行うことが望ましいが、例えば、図4に示すタイトボックスを用いて行うことができる。タイトボックスには飽和NaCl溶液を入れ、湿度を一定に調整した調湿チャンバーとする。例えば0〜80℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が0〜80℃前後になるまで放置することによる。好ましくは45〜70℃程度である。また、飽和NaCl溶液は、例えば50%ホルムアミド水溶液とすることができる。NaCl溶液以外にも、水や塩化カリウム溶液を用いることもできる。
インキュベーターは0〜80℃の範囲とすることができるが、固定化反応をより進行させるためには、45〜70℃程度とすることが好ましい。
タイトボックスが調湿チャンバーとなったら、スポッティング済みの基板を入れ、一定湿度に調整してインキュベーションを行う。
基板は、NaCl飽和水あるいは50%ホルムアミド水溶液にふれないようにすることが好ましい。例えば図4のように底上げをした上に載せることができる。
インキュベーションは、0.1〜24時間程度行うことが好ましい。
また、インキュベーション後、65〜90℃の恒温室の中に1時間以上放置して乾燥することが好ましい。
上記のようにインキュベーションを高湿度雰囲気中で行う方法以外に、ゲル溶液を使うことにより、より安定し、より促進した固定化反応を得ることができる。例えば、ゲル溶液の成分として、アガロース、ゼラチン、架橋ポリエチレンオキサイド等の吸水性の高分子が好ましい。添加剤として、アルブミン等の蛋白質、サーモン精子DNA、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、デンハルト液等ブロッキング効果のあるものが好ましい。ゲル溶液の濃度は、0.01〜99%の範囲が好ましい。より好ましくは、0.3〜3%の範囲が良い。
作成したゲル断片を、DNAをスポットした場所に載せ、0〜80℃に設定した調湿チャンバー中で反応を進ませることが出来る。このとき、DNAの流れ出しを抑制するために、ゲルを載せる前に、40〜80℃の恒温室中で、基板を乾燥させることが望ましい。
基板を調湿チャンバーから出した後に基板の洗浄を行う。まず洗浄液(例えば2×SSC、0.2%SDS)をはったバット中に基板を浸す。このとき、DNAをスポットした面を上にして入れる。その後、振とう機等を用いて振とう洗浄し、更にもう一度洗浄液を入れ替えて洗浄する。さらに薄い洗浄液(例えば0.1×SSC)で濯いだ後、遠心機やブロアーを用いて基板を乾燥させる。
なお、蛋白質等の添加剤を含むゲル溶液を用いてインキュベーション工程を行った場合には、次のプレハイブリダイゼーション工程は必要ない。
(5)プレハイブリダイゼーション工程
次に、インキュベーション後の基板にハイブリダイゼーションの前処理として余分な活性点をマスキングするためのプレハイブリダイゼーションを行う。プレハイブリダイゼーションとしては、牛血清アルブミン(BSA)、カゼイン、サケ精子DNA、デンハルト液等を用いることが出来るが、これらに20×SSC、SDS、ホルムアミド等を加えて溶液を調製し、プレハイブリダイゼーション用溶液とする。プレハイブリダイゼーション用溶液中にサケ精子DNA等のDNAが含まれる場合、熱変性により、2本鎖を1本鎖にすべく、加熱して、急冷する。
プレハイブリダイゼーション用溶液の一例としては、溶液にデンハルト液とホルムアミドを加えたもの(5×デンハルト液、50%ホルムアミド)が挙げられる。
基板中の予めDNAをスポットした場所に、プレハイブリダイゼーション用溶液を滴下し、気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せる。
プレハイブリダイゼーションは、0.1〜24時間行うことが好ましい。
プレハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイゼーション溶液が乾燥しないように高湿で行うことが望ましく、(4)インキュベーションの項で述べたような調湿チャンバーを利用できる。
タイトボックスが0〜80℃に設定したインキュベーター内で調湿チャンバーとなった状態で、(4)と同様にNaCl飽和水または50%ホルムアミド溶液に触れないように軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れ(底上げをした上に載せる)、再びインキュベーターに入れる。 こうして、基板上にスポットしたDNAとは無関係なDNAで、スポット部位以外のスライドグラス表面がマスキングされる(図5)。
次に、洗浄を行う。例えば、基板を0.1×SSC溶液に入れて、カバーグラスをはずす。次に、振とう機等を用いて滅菌水で洗浄した後に、遠心機やブロアーを用いて基板を乾燥させる。
なお、このプレハイブリダイゼーション工程は、インキュベーション工程の後に、30℃〜80℃の恒温室中で0.1〜24時間基板を乾燥させ、その後洗浄液(例えば、2×SSC、0.2%SDS)をはったバット中で十分洗浄し、リンス液(例えば、0.1×SSC)で洗浄して乾燥し、活性化エステルが完全に加水分解し、失活した場合には行わなくても良い。ただし、失活が不十分な場合、後のハイブリダイゼーション工程においてスポット以外の部分へのDNAの固定化が起こるため、確実な結果を得るには、プレハイブリダイゼーション工程を行うことが好ましい。
(6)ハイブリダイゼーション工程
ターゲットとなるDNAサンプルを、蛍光標識ラベルキットにしたがって行うか、あるいは逆転写酵素反応を利用して蛍光標識する。
この蛍光標識DNAサンプルに滅菌水、20×SSC、SDS、ホルムアミド等を添加し、撹拌してハイブリダイゼーション用溶液を調製する。
このとき、スポッティング工程において、スポッティング用溶液の熱変性あるいはアルカリ変性を行わず、2本鎖のままでスポットした場合には、基板上DNAの熱変性を行う。(5)のプレハイブリダイゼーション工程が終了した基板を3〜5分間熱水に浸漬し、その後に氷冷する。スポッティング溶液を熱変性あるいはアルカリ変性してからスポットした場合には、この工程は必要ない。
作成したハイブリダイゼーション用溶液を基板のDNAをスポットした場所にに滴下し、気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せる。
ハイブリダイゼーションも高湿で行うことが望ましく、(4)インキュベーションの項で述べたような調湿チャンバーを利用できる。
タイトボックスが0〜80℃に設定したインキュベーター内で調湿チャンバーとなった状態で、(4)と同様にNaCl飽和水あるいは50%ホルムアミドに触れないように基板を入れ(底上げをした上に載せる)、再びインキュベーターに入れる。
こうして、図7のように、蛍光標識したDNAが基板上に予めスポッティングしたDNAにハイブリダイズする。
最後に洗浄を行う。洗浄は基板を0.1×SSC溶液でカバーグラスを外し、その後洗浄液(例えば、2×SSC、0.2%SDS)をはったバット中で2度繰り返して洗浄し、リンス液(例えば、0.1×SSC)で洗浄して遠心機やブロアーを用いて乾燥する。
(7)蛍光部位検出工程
検出は、基板表面のDNAとハイブリダイズしたDNAの蛍光標識を、蛍光画像読み取り用スキャナー等を用いて読み取ることで行うことができる。
実施例
(実施例1)
軟ダイヤモンドコートスライドグラスの使用プロトコルについて説明する。
(1)軟ダイヤモンドコートスライドグラスの準備
まず、25mm(幅)×75mm(長さ)×1mm(厚み)のガラス表面に、イオン化蒸着法により、メタンガス95体積%と水素ガスを5体積%を混合したガスを原料として、DLC膜25nmの厚みに形成したスライドグラスを作成した。
次に、このスライドガラス表面を化学修飾した。
すなわち、ガラス基板表面をアンモニア雰囲気下で高圧水銀灯を10分間照射してアミノ化し、さらに無水コハク酸のN−メチルピロリドン溶液中に60分間浸漬した。このようにして、基板表面にカルボキシル基を持つ、軟ダイヤモンドコートスライドグラスを得た。
軟ダイヤモンドコートスライドグラスへのDNAの固定化は、図1のように表面のカルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)で活性化エステル化した後に行う。
ダイヤモンド表面のN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)活性エステル基を、DNAの塩基に含まれる第1級アミノ基とアミド結合させる(図2)。
(2)活性化
活性化は活性化キットを用いて行う。活性化キットの溶液組成は以下のものを用いた。
・溶液A(水溶液)
リン酸バッファー(pH6): 0.1M
N−ヒドロキシスクシンイミド
(N−hydroxysuccinimide): 22mM(2.5g /L)
・溶液B(ジオキサン溶液)
1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド:1M(191.8g/L)
(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−ethylcarbodiimide)
次に、リン酸バッファー(pH6)は以下のようにして作成した。
まず、0.1M リン酸二水素カリウム溶液(13.6g/L)および0.1M リン酸水素二カリウム溶液(17.4g/L)を用意する。リン酸二水素カリウム溶液のpHをpH計で測定し、pHをモニターしながらpH6になるまでリン酸水素二カリウム溶液を添加する。
活性化後の基板は、活性が落ちてしまわないように、なるべく早く使用することが好ましい。保管する場合は、65℃で30分乾燥後、デシケータ中で保管するのが好ましい。
溶液Aを90mLビーカーに入れ、更に溶液Bを10mL加える。液を良く撹拌したあとに、この溶液をシャーレに入れ、軟ダイヤモンドコートスライドグラスを溶液に浸漬し、30分間室温放置する(振とう機等の撹拌装置がある場合は撹拌を行う)。活性化後の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを、滅菌水により2回洗浄した。
活性化後の基板は、活性が落ちてしまわないように、なるべく早く使用することが好ましい。保管する場合は、65℃で30分乾燥後、デシケータ中で保管することが好ましい。
一方、活性化キットを用いないで基板を活性化することもできる。この場合は、以下のようにして行う。
まず、基板表面を活性化する。以下のものを準備する。
・軟ダイヤモンドコートスライドグラス
・1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド
(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−et
hylcarbodiimide)
・N−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimid
e)
・リン酸二水素カリウム
・リン酸水素二カリウム
・滅菌水
まず、活性エステル化(カルボキシル基のN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)活性エステル化)を行う。活性化液の組成は以下のとおりのものを用いた。
・N−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimid
e):20mM
・1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド:0.
1M
(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−eth
ylcarbodiimide)
・リン酸バッファー(pH6):0.1M
200mLビーカーに、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−ethylcarbodiimide)959mgと、N−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)115mgを採り、50mLのリン酸バッファー(pH6)で溶解し、これにスライドグラスを浸漬して前記の活性化キットを用いた場合と同様に反応させ、洗浄した。
(3)スポッティング
次に、活性化した基板にDNAを貼り付けた(いわゆるスポッティング)。
まず、以下のものを準備した。
・軟ダイヤモンドコートスライドグラス(活性化済み)
・DNAサンプル
・ホルムアミド
・滅菌水
・スポッター
DNAサンプルを濃度が1μg/μLとなるように10%ホルムアミド溶液(スポッティング用バッファー)に溶解してスポッティング用溶液を準備した。スポッティング用溶液を95℃で5分熱変性し、4℃まで急冷した。図3に示すようにスポッターの針で液を吸取り(図3のa)、軟ダイヤモンドコートスライドグラス表面に押し付けて(同b)、DNA液を基板に押し付けた(同c)。このようにしてスライドグラス表面に多数貼り付けた(同d)。
(4)インキュベーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス、飽和NaCl水溶液、タイトボックス及びインキュベーターを準備して行った。飽和NaCl溶液(例えば水+ホルムアミド(1:1)溶液)を入れたタイトボックスを、4℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が4℃になるまで約1時間放置し、調湿チャンバーを準備した。
タイトボックスが調湿チャンバーとなった状態でインキュベーターから取り出し、NaCl飽和水にふれないようにタイトボックス内に軟ダイヤモンドコートグラスを入れた(底上げをした上に載せた)。タイトボックスを再びインキュベーターに入れ、1時間放置した。この間も湿度を高く保つべく温度調整を行った。軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れた状態のタイトボックスを図4に示す。その後、80℃のオーブン中で3時間乾燥した。
(5)プレハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス(スポット及びインキュベーション済み)、カバーグラス、サーモンDNA、20×SSC、1×SSC、10%SDS、ホルムアミド、滅菌水、1.5mL 反応チューブ、200μLエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、200mL ビーカー、ブロアー、飽和NaCl水溶液、タイトボックス及びインキュベーターを用意して以下の操作を行った。
まず、前記(4)インキュベーションの場合と同様に、飽和NaCl溶液を入れたタイトボックスを、37℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が37℃になるまで約1時間放置し、調湿チャンバーを準備した。これとは別にプレハイブリダイゼーション用溶液を調製した。
サーモンDNA(サンプルとは関係のないDNAをいう)サンプルを1mg反応チューブに測り採り、500μL滅菌水で溶解する。その後、20×SSCを250μL、10%SDSを50μL、ホルムアミドを200μL添加する。攪拌後、必要な量をエッペンドルフチューブに採り、プレハイブリダイゼーション用溶液とした。
本実施例においてはスポット範囲が1cm×1cmの場合、基板1枚あたり15μLとした。
続いて、プレハイブリダイゼーション用溶液を95℃で5分間熱変性し、4℃まで急冷した。軟ダイヤモンドコートスライドグラス中の予めDNAをスポットした場所に、プレハイブリダイゼーション用溶液を滴下し、気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せた。こうして、サーモンDNAでスポット部位以外のスライドグラス表面をマスキングした(図5参照)。
次に、タイトボックスをインキュベーターから取り出し、NaCl飽和水に触れないように軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れ(底上げをした上に載せる)、再びインキュベーターに入れ、反応を進めるため1時間放置した。
次に、洗浄を行った。軟ダイヤモンドコートスライドグラスをインキュベーターから取り出し、200mLビーカーに入れた1×SSC溶液中で、カバーグラスをはずした。次に、1×SSCと0.2%SDSをはったバット中に表面を上にして入れ、振とう機を用いて5分間振とうした(図6)。その後、1×SSCと0.2%SDSを捨ててもう一度1×SSCと0.2%SDSを入れ、5分間振とうした。もう一度同様に1×SSCと0.2%SDSで洗浄した後、0.1×SSCで軽くリンスし、ブロアーを用いて基板表面の溶液を除去した。
(6)ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス(プレハイブリダイゼーション済み)、カバーグラス、ターゲットDNA、20×SSC、1×SSC、10%SDS、ホルムアミド、滅菌水、200μLエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、200mL ビーカー、ブロアー、蛍光標識キット、飽和NaCl水溶液、タイトボックス、インキュベーターを用意した。
まず、飽和NaCl溶液を入れたタイトボックスを、37℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が37℃になるまで約1時間放置して、調湿チャンバーを準備した。
次に、DNAサンプルの蛍光標識を行った。蛍光標識は、蛍光標識ラベルキットに従って行うか、あるいは逆転写酵素反応を利用して蛍光標識することができる。
続いて、1μg/μLの蛍光標識DNAサンプル2μLを反応チューブに採り、48μLの滅菌水を加えた。その後、20×SSCを25μL、10%SDSを5μL、ホルムアミドを20μL添加し、撹拌し、ハイブリダイゼーション用溶液を調製した。
ハイブリダイゼーション用溶液を軟ダイヤモンドコートスライドグラスに滴下し、気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せた。次に、タイトボックスをインキュベーターから取り出し、NaCl飽和水に触れないように前記スライドグラスを入れ(底上げをした上に載せる)、再びインキュベーターに入れ、1時間放置した。このようにして、蛍光標識したDNAが基板上に予めスポッティングしたDNAにハイブリダイズさせた(図7参照)。
最後に洗浄を行った。基板をインキュベーターから取り出し、200mL ビーカーを入れた1×SSC溶液中で、カバーグラスをはずした。次に、1×SSCと0.2%SDSを張ったバット中に表面を上にして入れ、振とう機を用いて5分間振とうした。もう一度同様に1×SSCと0.2%SDSで洗浄した後、0.1×SSCで軽くリンスし、ブロアーを用いて基板表面の溶液を除去した。(7)検出
検出は蛍光画像読み取り用スキャナーを用意し、軟ダイヤモンドコートスライドグラス表面のDNAとハイブリダイズしたDNAの蛍光標識を、蛍光画像を読み取ることにより行った。
なお、上記説明では、DNAの検出について説明したが、DNAの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
(実施例2)
実施例1と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、実施例1と同様な活性化を行った。スポッティングは、実施例1で用いた溶液のうち、ホルムアミドの替わりに10%グリセリンを用いた。
(4)インキュベーション
インキュベーションはNaCl飽和水を入れたタイトボックスを、4℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が4℃になるまで、約1時間放置する。タイトボックスをインキュベーターから取り出し、NaCl飽和水にふれないように基板を入れ(底上げをした上に載せる)、再びインキュベーターに入れ、1時間放置する。NaCl飽和水を入れたタイトボックスを、65℃に設定したインキュベーターに入れ、1時間放置し、乾燥した。乾燥後、20xSSCと10%SDSを含んだバッファー液で洗浄した。なお、実施例1で実施したプレハイブリダイゼーションは行わなかった。
(6)ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス(プレハイブリダイゼーション済み)、カバーグラス、ターゲットDNA、20×SSC、1×SSC、10%SDS、ホルムアミド、滅菌水、200μLエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、200mL ビーカー、ブロアー、蛍光標識キット、飽和NaCl水溶液、タイトボックス、インキュベーターを用意した。
まず、飽和NaCl溶液を入れたタイトボックスを、45℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が45℃になるまで約1時間放置して、調湿チャンバーを準備した。以後の処理は実施例1と同様に行った。
検出も実施例1と同様に、行った。なお、DNAの検出について説明したが、DNAの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
(実施例3)
実施例1と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、実施例1と同様な活性化を行った。スポッティングは、実施例1で用いた溶液のうち、ホルムアミドの替わりに10%グリセリンを用いた。
(4)インキュベーション
インキュベーションはNaCl飽和水を入れたタイトボックスを、4℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が4℃になるまで、約1時間放置する。タイトボックスをインキュベーターから取り出し、NaCl飽和水にふれないように基板を入れ(底上げをした上に載せる)、再びインキュベーターに入れ、1時間放置する。NaCl飽和水を入れたタイトボックスを、65℃に設定したインキュベーターに入れ、1時間放置し、乾燥した。基板表面に、濃度が0.5%のアガロースゲルを載せた後、基板をタイトボックス中に入れ、タイトボックスを45℃インキュベーターに12時間入れた。
2xSSCと0.2%SDSを含んだバッファー溶液で洗浄後、更に、0.1xSSCで洗浄した。最後に、70%エタノール溶液で洗浄した。なお、実施例1で実施したプレハイブリダイゼーションは行わなかった。
(6)ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス(プレハイブリダイゼーション済み)、カバーグラス、ターゲットDNA、20×SSC、1×SSC、10%SDS、ホルムアミド、滅菌水、200μLエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、200mL ビーカー、ブロアー、蛍光標識キット、飽和NaCl水溶液、タイトボックス、インキュベーターを用意した。
まず、飽和NaCl溶液を入れたタイトボックスを、45℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が45℃になるまで約1時間放置して、調湿チャンバーを準備した。以後の処理は実施例1と同様に行った。
検出も実施例1と同様に、行った。なお、DNAの検出について説明したが、DNAの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
(実施例4)
実施例1と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、実施例1と同様な活性化を行った。スポッティングは、実施例1で用いたホルムアミドを添加せず、超純水のみで調製した。
(4)インキュベーション
インキュベーションは50%ホルムアミド水溶液を入れたタイトボックスを、60℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が60℃になるまで、約1時間放置する。タイトボックスをインキュベーターから取り出し、50%ホルムアミド水溶液にふれないように基板を入れ(底上げをした上に載せる)、再びインキュベーターに入れ、3時間放置した。2xSSCと0.2%SDSを含んだバッファー溶液で洗浄後、更に、0.1xSSCで洗浄し、滅菌水で濯いだ後にブロアーで乾燥した。次にプレハイブリダイゼーション溶液(5×デンハルト液、50%ホルムアミド)を基板に滴下し、気泡が入り込まないようにカバーバラスを静かに載せる。タイトボックスを60℃に設定したインキュベーターから取り出し、50%ホルムアミドにふれないように基板をいれた。基板の入ったタイトボックスを60℃に設定したインキュベーターに入れ、1時間プレハイブリダイゼーションを行った。
0.1×SSCでカバーグラスを洗い落とし、滅菌水で15分間洗浄した。その後、ブロアーで氷塩の溶液を吹き飛ばした。
(6)ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス(プレハイブリダイゼーション済み)、カバーグラス、ターゲットDNA、20×SSC、1×SSC、10%SDS、ホルムアミド、滅菌水、200μLエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、200mL ビーカー、ブロアー、蛍光標識キット、50%ホルムアルデヒド水溶液、タイトボックス、インキュベーターを用意した。
まず、50%ホルムアルデヒド水溶液を入れたタイトボックスを、45℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が45℃になるまで約1時間放置して、調湿チャンバーを準備した。以後の処理は実施例1と同様に行った。
検出も実施例1と同様に、行った。なお、DNAの検出について説明したが、DNAの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
産業上の利用可能性
本発明の活性化キットを用いることにより、A液とB液とを調整し、一段階の反応だけで基板を活性化できるので、基板を簡便にかつ迅速に活性化できる。
また、本発明のDNA又は蛋白質の検出方法によれば、プレハイブリダイゼーションを行うので、余分な活性点にもDNAが付着してしまうことなく、正確なDNA検出が可能である。
さらに、ゲル溶液を使ってインキュベーションを行うと、安定かつ促進した固定化反応が行われるので、正確なDNA又は蛋白質の検出が可能である。
したがって、本発明は、医療分野での疾病診断、生化学、分子生物学分野での研究等、各分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
図1は、表面が活性エステル化された基板の模式図である。図2は、基板表面にDNAを固定化する反応の概略を示す図である。図3は、スポッティングのプロセスを示す図である。図4は、タイトボックスの断面図である。図5は、プレハイブリダイゼーションのプロセスを示す図である。図6は、洗浄工程を示す図である。図7は、ハイブリダイゼーションのプロセスを示す図である。
Claims (17)
- リン酸バッファー(pH6)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide)からなる溶液Aと、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−ethylcarbodiimide)からなる溶液Bとを主成分とする基板の活性化キット。
- 前記溶液Aが、リン酸バッファー(pH6):0.01〜5M及びN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide):1〜500mM(0.115〜57.5g/L)の水溶液である請求項1記載の活性化キット。
- 前記溶液Bが、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]3−エチルカルボジイミド(1−[3−(dimethylamino)propyl]3−ethylcarbodiimide)が0.05〜10M(9.59〜1918g/L)のジオキサン溶液である請求項1又は2記載の活性化キット。
- 前記溶液A:50〜99容量%に対し、溶液B:1〜50容量%を配合して用いる請求項1〜3のいずれかに記載の活性化キット。
- 前記基板が、ダイヤモンドライクカーボンの表面処理層を有するスライドグラスに化学修飾を施した基板であることを特徴とする請求項1記載の基板の活性化キット
- 前記化学修飾が、末端に水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基を有することを特徴とする請求項5記載の基板の活性化キット
- 前記化学修飾が、基板にアンモニアガス中でプラズマによりアミノ化することを特徴とする請求項5または6記載の基板の活性化キット
- 請求項1記載の活性化キットを用いて活性化した基板にDNA又は蛋白質をスポッティング後であって、スポッティングされたDNA又は蛋白質への蛍光標識DNAのハイブリダイゼーションを行う前において、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーションを行うことを特徴とするDNA又は蛋白質の検出方法。
- プレハイブリダイゼーションが、基板表面にスポッティングされたDNA又は蛋白質とは異なるDNA又は蛋白質を固定化することによる請求項8記載のDNA又は蛋白質の検出方法。
- 請求項1記載の活性化キットを用いた基板の活性化工程、活性化された基板へのDNA又は蛋白質のスポッティング工程、スポッティング後の基板の乾燥工程、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーション工程、スポッティングされたDNA又は蛋白質への蛍光標識DNAのハイブリダイゼーション工程、及び、ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とするDNA又は蛋白質の検出方法。
- 請求項1記載の活性化キットを用いた基板の活性化工程、活性化された基板へのDNA又は蛋白質のスポッティング工程、スポッティング後の基板のインキュベーション工程、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーション工程、スポッティングされたDNA又は蛋白質への蛍光標識DNAのハイブリダイゼーション工程、及び、ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とするDNA又は蛋白質の検出方法。
- プレハイブリダイゼーション工程が、基板表面にスポッティングされたDNA又は蛋白質とは異なるDNA又は蛋白質を固定化する工程である請求項10記載のDNA又は蛋白質の検出方法。
- 請求項1記載の活性化キットを用いた基板の活性化工程、活性化された基板へのDNA又は蛋白質のスポッティング工程、スポッティング後の基板のインキュベーション工程、スポッティングされたDNA又は蛋白質への蛍光標識DNAのハイブリダイゼーション工程、及び、ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とするDNA又は蛋白質の検出方法。
- 前記インキュベーション工程が、ゲルからなる溶液で処理することを特徴とする請求項11乃至13記載のDNA又は蛋白質の検出方法。
- 前記ゲルからなる溶液が、吸水性高分子を含むことを特徴とする請求項14記載のDNA又は蛋白質の検出方法。
- 前記吸水性高分子が、アガロース、ゼラチン、架橋ポリエチレンオキサイドであることを特徴とする請求項15記載のDNA又は蛋白質の検出方法。
- 前記ゲルからなる溶液が、蛋白質、サーモン精子DNA、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、デンハルト液を含むことを特徴とする請求項14乃至16記載のDNA又は蛋白質の検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002517524A JP4730808B2 (ja) | 2000-08-08 | 2001-06-20 | 基板の活性化キット及びこれを用いたdna等の検出方法 |
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000240496 | 2000-08-08 | ||
JP2000240496 | 2000-08-08 | ||
JP2000336640 | 2000-11-02 | ||
JP2000336640 | 2000-11-02 | ||
JP2000401867 | 2000-12-28 | ||
JP2000401867 | 2000-12-28 | ||
JP2002517524A JP4730808B2 (ja) | 2000-08-08 | 2001-06-20 | 基板の活性化キット及びこれを用いたdna等の検出方法 |
PCT/JP2001/005246 WO2002012891A1 (fr) | 2000-08-08 | 2001-06-20 | Coffret d'activation de substrat et procede de detection d'adn ou similaire a l'aide dudit coffret |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2002012891A1 JPWO2002012891A1 (ja) | 2004-01-15 |
JP4730808B2 true JP4730808B2 (ja) | 2011-07-20 |
Family
ID=27344295
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002517524A Expired - Fee Related JP4730808B2 (ja) | 2000-08-08 | 2001-06-20 | 基板の活性化キット及びこれを用いたdna等の検出方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7078172B1 (ja) |
EP (1) | EP1310793A4 (ja) |
JP (1) | JP4730808B2 (ja) |
KR (1) | KR100544850B1 (ja) |
CN (1) | CN1284972C (ja) |
AU (1) | AU2001274560A1 (ja) |
WO (1) | WO2002012891A1 (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004097173A (ja) | 2002-07-17 | 2004-04-02 | Toyo Kohan Co Ltd | 静電層を有する固体支持体及びその用途 |
US7943388B2 (en) * | 2003-11-14 | 2011-05-17 | 3M Innovative Properties Company | Acoustic sensors and methods |
KR101130956B1 (ko) * | 2003-11-14 | 2012-03-30 | 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 | N-술포닐아미노카르보닐 함유 화합물 |
US7169933B2 (en) * | 2003-11-14 | 2007-01-30 | 3M Innovative Properties Company | N-sulfonylaminocarbonyl containing compounds |
US7423155B2 (en) * | 2003-11-14 | 2008-09-09 | 3M Innovative Properties Company | N-sulfonyldicarboximide containing tethering compounds |
US7361767B2 (en) * | 2003-11-14 | 2008-04-22 | 3M Innovative Properties Company | N-sulfonyldicarboximide containing tethering compounds |
JP4568841B2 (ja) * | 2005-03-25 | 2010-10-27 | 国立大学法人徳島大学 | アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット |
JP4660756B2 (ja) * | 2005-03-25 | 2011-03-30 | 国立大学法人徳島大学 | ダイヤモンドチップへの蛋白質/ペプチドの固定化方法 |
US7544756B2 (en) * | 2005-09-30 | 2009-06-09 | 3M Innovative Properties Company | Crosslinked polymers with amine binding groups |
US7544754B2 (en) | 2005-09-30 | 2009-06-09 | 3M Innovative Properties Company | Crosslinked polymers with amine binding groups |
GB0804495D0 (en) * | 2008-03-11 | 2008-04-16 | Iti Scotland Ltd | Surface attachment |
CN102115737B (zh) * | 2009-12-31 | 2015-06-03 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 稳定碱性磷酸酶或其标记物的试剂和方法 |
CN102269761A (zh) | 2010-06-04 | 2011-12-07 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种碱性磷酸酶结合物的合成工艺 |
CN102269762B (zh) | 2010-06-04 | 2014-12-10 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 结合物的制备方法及相关试剂盒 |
JP5322240B2 (ja) * | 2010-06-07 | 2013-10-23 | 国立大学法人徳島大学 | アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット |
JP5322242B2 (ja) * | 2010-06-25 | 2013-10-23 | 国立大学法人徳島大学 | ダイヤモンドチップへの蛋白質/ペプチドの固定化方法 |
JP2013088378A (ja) * | 2011-10-21 | 2013-05-13 | Sony Corp | ケミカルセンサ、ケミカルセンサモジュール、生体分子検出装置及び生体分子検出方法 |
KR102378235B1 (ko) | 2012-12-14 | 2022-03-25 | 민데라 코포레이션 | 바이오마커의 검출 및 취득을 위한 방법 및 디바이스 |
JP6432052B2 (ja) * | 2013-08-28 | 2018-12-05 | 国立大学法人九州大学 | 生体分子親和性含フッ素高分岐ポリマー及び生体分子認識表面 |
CN106702500B (zh) * | 2015-11-17 | 2018-10-26 | 港龙生物技术(深圳)有限公司 | 一种用于固定核酸探针的点样液及其配制方法和核酸探针固定方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999066322A1 (en) * | 1998-06-15 | 1999-12-23 | Biosensor Systems Design, Inc. (1998) | A sensor for analyte detection |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3785658T2 (de) * | 1986-08-11 | 1993-08-12 | Siska Diagnostics Inc | Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden. |
JPH08500722A (ja) | 1992-01-29 | 1996-01-30 | 日立化成工業株式会社 | ポリヌクレオチド固定化担体 |
AU2322099A (en) * | 1998-01-16 | 1999-08-02 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods |
JP3786248B2 (ja) * | 1999-11-11 | 2006-06-14 | 東洋鋼鈑株式会社 | 化学修飾を施した基体およびその製造方法 |
FR2803913B1 (fr) * | 2000-01-13 | 2002-08-16 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Procede d'immobilisation de reactif(s) affin(s) sur phase solide hydrophobe |
-
2001
- 2001-06-20 US US10/344,166 patent/US7078172B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-20 AU AU2001274560A patent/AU2001274560A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-20 JP JP2002517524A patent/JP4730808B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-20 CN CNB018147917A patent/CN1284972C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-20 KR KR1020037001769A patent/KR100544850B1/ko active IP Right Grant
- 2001-06-20 WO PCT/JP2001/005246 patent/WO2002012891A1/ja active IP Right Grant
- 2001-06-20 EP EP01941108A patent/EP1310793A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999066322A1 (en) * | 1998-06-15 | 1999-12-23 | Biosensor Systems Design, Inc. (1998) | A sensor for analyte detection |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1284972C (zh) | 2006-11-15 |
US7078172B1 (en) | 2006-07-18 |
KR20030031145A (ko) | 2003-04-18 |
WO2002012891A1 (fr) | 2002-02-14 |
AU2001274560A1 (en) | 2002-02-18 |
JPWO2002012891A1 (ja) | 2004-01-15 |
CN1606693A (zh) | 2005-04-13 |
EP1310793A1 (en) | 2003-05-14 |
KR100544850B1 (ko) | 2006-01-24 |
EP1310793A4 (en) | 2005-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4730808B2 (ja) | 基板の活性化キット及びこれを用いたdna等の検出方法 | |
JP4764901B2 (ja) | 静電層を有する固体支持体及びその用途 | |
WO2004102194A1 (ja) | 選択結合性物質固定化担体 | |
JP5289843B2 (ja) | 生体関連分子の相互作用を検出するための方法及びそれに用いる担体支持部材 | |
WO2004111644A1 (ja) | 生体分子マイクロアレイ用基板、生体分子マイクロアレイ、相互作用促進用装置および方法、ならびに、相互作用の検出方法 | |
JP2006308307A (ja) | 生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法および生体関連分子検出用キット | |
JP5462293B2 (ja) | 生体関連分子の相互作用を検出するための方法及びユニット | |
JP2002365293A (ja) | 表面処理層が形成された固体支持体 | |
JP2003172737A (ja) | 固体支持体、基体、バイオセンサ、およびそれらを用いた生体物質の解析方法 | |
US20040014080A1 (en) | Solid supports having surface-treated layer formed thereon | |
JP2003014747A (ja) | 表面処理層が形成された固体支持体 | |
JP3888947B2 (ja) | 生体分子の担体への固定法 | |
JP2000083647A (ja) | 遺伝子検出装置および方法 | |
JP4728555B2 (ja) | ポリヌクレオチドマイクロアレイの作製方法、作製装置ならびにポリヌクレオチドマイクロアレイ | |
JP4521556B2 (ja) | ポリヌクレオチド試料の分析において感度を向上させる方法 | |
JP5188228B2 (ja) | 蛍光標識された生体関連分子の検出方法 | |
JP2002082116A (ja) | 表面処理層が形成されたスライドグラス | |
JP3868901B2 (ja) | 化学修飾を施した基体およびその製造方法 | |
JP2002333446A (ja) | 生物学的素材チップ | |
US20040132031A1 (en) | Supports for hybridization and method of immobilizing hybrid | |
JPH08154657A (ja) | 反応容器、反応容器用基材、反応容器用基材の製造方法、反応装置および液体排出方法 | |
JP2006055065A (ja) | 非対称pcrを用いた核酸の検出方法、ポリヌクレオチドプローブ、それを固定するプローブ固定化担体およびキット |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080205 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20080205 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101227 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110112 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110203 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110318 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110413 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110414 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140428 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4730808 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |