JP5322240B2

JP5322240B2 - アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット

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Publication number: JP5322240B2
Application number: JP2010129694A
Authority: JP
Inventors: 博木戸; 仁美多田; 貴子澤淵
Original assignee: University of Tokushima
Current assignee: University of Tokushima
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2025-03-25
Also published as: JP2010266448A

Description

本発明は、アレルギー疾患の判定キット、より詳しくは、基板上にダイヤモンドやダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）をコーティングしたチップに食物アレルゲン等やアレルゲンエピトープが結合したアレルゲンエピトープ判定チップを用いたアレルギー疾患の判定用キットに関する。

アレルギーの原因には、食物を原因とする食物アレルギー、ごみ・埃を原因とする塵アレルギー、家ダニを原因とするアレルギー、花粉症、接触性皮膚炎、金属アレルギー、薬物アレルギー、アトピーなど様々なアレルギーが知られている。これらの中でも、特に食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題が生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン、κ-カゼイン、α−ラクトアルブミンや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβ−ラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１が知られている。

現行の食物アレルギーに関する検査法は２種類に大別することができる。一つは、「アレルギー物質を含む食品に関する表示」（食品衛生法、厚生省令第２３号、２００２年４月）に基づく、アレルギーの原因となる食品素材を原料として使用していることの表示が義務づけられたため、食品成分を検出する方法であり、例えば、食品成分として卵や牛乳を使用しているかどうかを検出する目的のため、食物アレルギーの原因物質を検出する方法ではない。このような食品成分を検出する方法には、主としてイムノクロマト法が用いられている。もう一つの検査法としては、医師と患者から強い要望がある食物アレルギーの原因物質と原因部位を診断・判定する検査法であるが、現在最も汎用されている評価の高い検査法であるＣＡＰＲＡＳＴ（スエーデンダイアグノスティクス）では、１度に同じ条件で抗原を検出するには６項目が限度で、しかも１項目の検査には５０μＬの血液を必要とする。しかも、検定可能なアレルゲンは限定されている。臨床の現場では、ＣＡＰＲＡＳＴの検査結果では治療効果の判定に十分満足しうるものではないといわれている。

他方、シリコン等の基板上にダイヤモンドをコーティングしたり、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）をコーティングする技術は一般に広く利用されている。例えば、これらを利用したＤＮＡ固定化チップ（例えば、特許文献１〜４参照）、本発明者らによるダイヤモンドコーティング高密度集積タンパクチップ（例えば、非特許文献１参照）、ダイヤモンド基板上に有機単分子膜を直接的な検出部として形成してなる有機単分子膜／半導体構造を有する半導体センシングデバイス（例えば、特許文献５参照）が提案されている。その他、様々な種類のアレルゲンから抽出した、各スポットに付着させた一つの粗蛋白を有する固体の基板をアレルギー疾患患者から得た検体と反応させることによって、様々な種類のアレルゲンを同時に検出することができ、特定アレルゲンにより起こされるアレルギー反応に関連する抗体の種類を検出することができるアレルギー診断用蛋白質チップとアレルゲンの検出方法及びアレルギー誘発抗体の検出方法（例えば、特許文献６参照）が知られている。

ＷＯ９９／４０１７３号公報ＷＯ９９／４１３６２号公報ＷＯ９９／６３０７２号公報特開２００５−５５３６５号公報特開２００４−４００７号公報特表２００４−５３３６２５号公報

NEW DIAMOND, Vol.20, No.3(2004), 30-31

現行のアレルゲン診断方法では、ごく限られた抗原（アレルゲン）について個々の条件で反応を測定しているため、食物アレルギーとしての抗原の拡大を同一条件において網羅的に測定し、診断する方法は知られていない。しかし、通常の食物アレルギーでは抗原が拡大することが多く、抗原となるエピトープの拡大を正確に把握し、アレルギー状態を診断することが必要であるといわれている。本発明の課題は、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定することができるアレルギー疾患の判定方法に用いることができるアレルギー疾患の判定キットを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に２５種類以上のアレルゲン蛋白のアレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチドを溶解した溶液をスポッティングして、アレルゲンのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基のブロッキング操作を行ったアレルゲンエピトープ判定チップに、検体を接触させ、アレルゲンエピトープ判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体をイムノアッセイにより検出することにより、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定することにより、アレルギー疾患の予后の予測が可能となることを見い出した。また、アレルゲンエピトープ判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体を、Ｃｙ３標識２次抗体を用いるイムノアッセイにより検出すると検出感度が顕著に向上することを見い出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成するに至ったものである。

本発明は、（１）アレルギー疾患の判定キットであって、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、２５種類以上のアレルゲンのアレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基のブロッキング操作を行ったアレルゲンエピトープ判定チップと、アレルゲンエピトープ判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体をイムノアッセイにより検出する試薬とを含み、同一条件下、２５種類以上のアレルゲンを一度に定量的に測定する、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンの判定用キットや、（２）アレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチドが、化学修飾されたペプチドであることを特徴とする上記（１）記載のアレルギー疾患の判定キットや、（３）アレルゲンエピトープを含むペプチドが、ＭＨＣクラスII分子に結合するペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチドであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のキットや、（４）アレルゲンエピトープを含むペプチドが、アレルゲンのエピトープを含むプロテアーゼ分解ペプチドであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のキットや、（５）プロテアーゼ分解ペプチドが、トリプシン分解ペプチドであることを特徴とする上記（４）記載のキットや、（６）アレルゲンが、食物アレルゲンであることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のキットや、（７）食物アレルゲンが、カゼインナトリウム、α−カゼイン、β−カゼイン、κ-カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンから選ばれる１種又は２種以上のアレルゲンであることを特徴とする上記（６）記載のキットや、（８）イムノアッセイにより検出する試薬が、蛍光標識した２次抗体を含む試薬であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載のキットや、（９）蛍光標識した２次抗体が、Ｃｙ３標識２次抗体であることを特徴とする上記（８）記載のキットや、（１０）２次抗体が、抗ＩｇＧ抗体又は抗ＩｇＥ抗体であることを特徴とする上記（８）又は（９）記載のキットに関する。

さらにまた本発明は、（１１）ダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップの活性化試薬が、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ及びＮＨＳを含有する溶液であることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれか記載のキットや、（１２）チップを活性化試薬により活性化した後、チップを洗浄した洗浄水の乾燥処理として減圧乾燥処理を行うことを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれか記載のキットや、（１３）洗浄水が、MilliQ水であることを特徴とする上記（１２）記載のキットに関する。

食物アレルギーの中で最も高頻度に起きるアレルギーが、牛乳アレルギーと卵アレルギーである。現行のアレルゲンの測定では、牛乳や卵の成分一つずつについて、限られたアレルゲンの中から、医師が適当にアレルゲンを選んで反応させる方法が採用されており、患者のアレルゲンを検出するためには、従来の報告から確立的に高いアレルゲンを予測して選択するしか無く、アレルゲンを検出できるか否かはある意味では“運”に頼っていると言っても過言では無い。本発明によると、牛乳と卵を構成する成分の約８０％以上を占める成分を搭載したアレルゲンチップとそのエピトープ診断チップを実現したもので、アレルゲンを科学的に診断できるチップを用いて、食物アレルゲンの拡大／縮小を診断することが可能となる。患者によっては、牛乳と卵の成分それぞれについて、単独、あるいは複数の反応を示している場合もあるが、患者によっては卵アレルギーから牛乳アレルギーにアレルゲンが拡大したり、逆に牛乳アレルギーから卵アレルギーにアレルゲンが拡大した結果を的確に診断できる。さらに、アレルゲンエピトープの拡大／縮小もアレルゲンの拡大／縮小と同様に検出可能である。

このように、本発明によると、アレルゲンとアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターン解析が可能となり、パターン解析の結果から病気の進展と予后を予測できる。さらに詳しくは、パターンによっては食物アレルギーから喘息、食物アレルギーからアトピーや花粉症などと言った病気の進展予測と、病気の進展の予防的処置の推測が可能となる。また同一人でもＩｇＥとＩｇＧの反応性に異なる例が出現しており、体内のアレルギー状態を的確に測定することが可能となる。

オボムコイドのトリプシンによるフラグメントペプチドのアルゲンエピトープライブラリーを示す図である。 αＳ１−カゼインのトリプシンによるフラグメントペプチドのアルゲンエピトープライブラリーを示す図である。 αＳ２−カゼインのトリプシンによるフラグメントペプチドのアルゲンエピトープライブラリーを示す図である。 β−カゼインのトリプシンによるフラグメントペプチドのアルゲンエピトープライブラリーを示す図である。 κ−カゼインのトリプシンによるフラグメントペプチドのアルゲンエピトープライブラリーを示す図である。ダイヤモンド／ＤＬＣチップに結合した抗原の濃度変化による抗体の結合量の測定結果を示す図である。チップに載せるアレルゲンエピトープのペプチドサイズの検討結果を示す図である。抗体濃度と抗原濃度の最適化条件の検討結果を示す図である。抗体濃度と抗原濃度の最適化条件の検討結果を示す図である。小児及び健常人の食物（牛乳・卵）アレルギー検査（ＩｇＧ）の結果を示す図である。小児及び健常人の食物（牛乳・卵）アレルギー検査（ＩｇＧ）の結果を示す図である。小児及び健常人の食物（牛乳・卵）アレルギー検査（ＩｇＥ）の結果を示す図である。化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣチップの活性化とカップリング反応の概略を示す図である。

本発明のアレルギー疾患の判定キットとしては、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣチップを活性化試薬により活性化した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に２５種類以上のアレルゲンのアレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチドを溶解した溶液をスポッティングして、アレルゲンのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基のブロッキング操作を行ったアレルゲンエピトープ判定チップと、アレルゲンエピトープ判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体をイムノアッセイにより検出する試薬とを含み、同一条件下、２５種類以上のアレルゲンを一度に定量的に測定し、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンの判定用のキットであれば特に制限されず、上記判定用キットには、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定するために用いることが表示されていてもよい。この判定キットにおける「表示」とは、判定キットにおいて、その本体、包装、説明書、宣伝物のいずれかに「アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定する」旨の表示を意味する。

上記アレルゲンとしては、免疫原性を有するものであれば特に制限されず、ハプテンであってもペプチドと結合させることにより免疫原性を生じるものであれば本発明におけるアレルゲンペプチドとして用いることができるが、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母、ゼラチンなどの食物アレルゲンを好適に例示することができ、中でも乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン、κ-カゼイン、α−ラクトアルブミンや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβ−ラクトグロブリンや、卵白アレルゲンの主要成分としてのオボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンや、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１を具体的に例示することができ、とりわけ、カゼインナトリウム、α−カゼイン、β−カゼイン、κ-カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンから選ばれる１種又は２種以上、好ましくは８種のアレルゲンを用いることが望ましい。

また、本発明におけるアレルゲンペプチドとして、糖鎖修飾ペプチド、リン酸化ペプチド、アシール化ペプチド、アセチル化ペプチド、メチル化ペプチド、ユビキチン化ペプチド等の化学修飾ペプチドを用いることもでき、かかる化学修飾ペプチドは、天然の化学修飾ペプチドであっても、人為的な化学修飾ペプチドであってもよい。前記アレルゲンエピトープを含むペプチドとして、ＭＨＣクラスII分子に結合する７〜１５アミノ酸サイズ等のペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチドを用いると、患者抗体と数倍から数十倍高感度に反応する点で好ましい。かかるＭＨＣクラスII分子に結合するペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチド等のアレルゲンエピトープを含むペプチドは、ペプチド合成により作製することもできるが、アレルゲンのエピトープを含むプロテアーゼ分解ペプチドとして作製することもできる。かかるプロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、リジルエンドペプチダーゼを挙げることができる。特に、アレルゲンが食物アレルゲンのとき、トリプシン分解ペプチドをプロテアーゼ分解ペプチドとして好適に例示することができる。

上記化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣチップとしては、シリコン、ガラス、ステンレス、プラスチック等の基板上にダイヤモンド又はダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）をコーティングしたダイヤモンド／ＤＬＣチップに、アレルゲンのアレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチド（以下、「アレルゲンペプチド」ということがある）をカップリング反応等により結合させることができるような化学修飾がなされたダイヤモンド／ＤＬＣチップであれば特に制限されず、例えば、かかる化学修飾としては、ダイヤモンド／ＤＬＣチップ表面を塩素処理、アンモニア処理、ジカルボン酸処理等による塩素化、アミノ化、カルボキシル化等がなされたダイヤモンド／ＤＬＣチップを例示することができるが、中でも、カルボキシル化ダイヤモンド／ＤＬＣチップを好適に例示することができる。

上記化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣチップは、活性化試薬により活性化処理に付される。例えば、カルボキシル化ダイヤモンド／ＤＬＣチップにアレルゲンのアレルゲンペプチドを固定化させる方法として、基盤表面に導入されたカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を利用し、アミノ基（−ＮＨ_２基）を持つアレルゲンペプチドを1-Etyl-3-(3-dimethylamino Propyl)-carbodiimide, hydrochloride（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）やN-Hydroxy- succinimide（ＮＨＳ）やその他の化学架橋剤を用いて共有結合により固定化させることが好ましい。チップの活性化とカップリング反応の概略を図１３に示す。

上記活性化処理後のチップはMilliQ水（超純水）で洗浄され、ペプチドのカップリング反応（固定化操作）が行われるが、このペプチドの固定化操作の前処理として、十分な除湿、乾燥がペプチドの固定化量と固定化量の均一性に重要な因子であり、そのため真空デシケーターで１時間減圧乾燥処理することが好ましい。また、ペプチドのカップリング反応は、活性化処理後のチップ、好ましくは乾燥処理が施されたチップにアレルゲンペプチド溶液をスポッティングして、例えば３７℃で３時間インキュベーションすることにより行うことができるが、かかるアレルゲンペプチド溶液として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む溶液にアレルゲンペプチドを溶解した溶液を用いると、抗体の結合量が増加する。アレルゲンペプチドのカップリング反応後に、ＢＳＡ等を用いた未反応活性基のブロッキング操作を行うことにより、アレルゲンエピトープ判定チップを作製することができる。

上記本発明の判定キットにおけるイムノアッセイにより検出する試薬としては、アレルゲンエピトープ判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体をイムノアッセイにより検出することができる公知の試薬であれば特に制限されないが、ＥＬＩＳＡに用いられる標識２次抗体を挙げることができ、標識２次抗体としては、Ｃｙ３，Ｃｙ５，ＦＩＴＣ，ローダミン等の蛍光標識２次抗体、ペルオキシダーゼ，アルカリフォスファターゼ等の酵素標識２次抗体、磁気ビーズ標識２次抗体、赤外標識２次抗体を例示することができ、２次抗体としては抗ＩｇＧ抗体又は抗ＩｇＥ抗体を例示することができるが、Ｃｙ３標識抗ＩｇＧ抗体やＣｙ３標識抗ＩｇＥ抗体を好適に挙げることができる。さらに、そして、本発明の判定キットにおける２次抗体としては、抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）_２断片等も使用することがき、例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）_２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。

上記検体としては、アレルゲンに対する抗体を含む可能性があるものであれば特に制限されないが、血清又は血漿、好ましくはヒト血清又は血漿を具体的に例示することができる。本発明の判定用キットを用いると１〜５μＬの血清又は血漿、好ましくはヒト血清又は血漿を用い、検体中の抗体を定量的に測定することができる上に、同一条件下、２５種類以上、例えば２５〜３０種類のアレルゲンを一度に定量的に測定することができ、これにより、同一患者におけるＩｇＥとＩｇＧの反応性の異同や、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定することが可能となる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［実験材料］
ジーンシリコンＣ４（３ｍｍ×３ｍｍ）、ジーンスライドＤＬＣ（東洋鋼鈑）、９６穴マイクロプレートＵ底 (Greiner)、３８４穴マイクロプレート平底(NUNC)を購入して用いた。オボムコイド (ＯＶＭ) (SIGMA)、フロイントの完全アジュバント (DIFCO)、ネンブタール(大日本製薬), Hybond-C Gridded membranes (Amersham)、スキムミルク、Peroxidase-F(ab’)2 goat anti rabbit ＩｇＧ (H+L) (ZYMED)、ECL (Amersham)、CNBr-cativated Sepharose 4B (Pharmacia)、ImmunoPure ＩｇＧ Purification Kit (PIERCE)、7M Guanigine-HCl (pH8.6)、Dithiothreitol (DTT)、トリプシン (SigmaまたはPromega)、α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(Sigma)、Non-immunized rabbit ＩｇＧ、Goat anti- rabbit ＩｇＧ (H+L) Cy3, Cy5 conjugate (ZYMED)、抗ヒトＩｇＧ抗体(Fc specific) Ｃｙ３，Ｃｙ５conjugate (ZYMED)、抗ヒトＩｇＥ抗体(Fc specific) Ｃｙ３，Ｃｙ５conjugate (ZYMED)、1-Etyl-3-(3-dimethylamino Propyl) -carbodiimide, hydrochloride (WSCD・HCl) (ペプチド研究所)、N-Hydroxy- succinimide (NHS) (ペプチド研究所)、ＤＭＳＯ(和光純薬)、防腐剤(0.5% チメロサール)、抗原エピトープ合成ペプチド(Thermo) : ＯＶＭ−１（ＮＨ_２−ＳＲＦＰＮＡＴＤＫＥ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−２（ＮＨ_２−ＧＴＤＧＶＴＹＴＮ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−３（ＮＨ_２−ＤＣＬＬＣＡＹＳＩＥＦ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−４（ＮＨ_２−ＫＥＨＤＧＥＣＫＥＴＶ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−５（ＮＨ_２−ＳＳＹＡＮ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−６（ＮＨ_２−ＤＧＫＶＭＶＬＣＮＲＡ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−７（ＮＨ_２−ＴＹＤＮＥ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−８（ＮＨ_２−ＫＲＨＤＧＧＣＲＫＥ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−９（ＮＨ_２−ＫＴＹＧＮＫＣＮＦＣＡＮ−ＶＶＥＳ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−１０（ＮＨ_２−ＴＬＴＬＳＨＦＧＫＣ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−１１（ＮＨ_２−ＧＦＬＰ−ＤＡＡＦＧ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−１２（ＮＨ_２−ＤＶＬＶＣ−ＣＯＯＨ），ＯＶＭ−１３（ＮＨ_２−ＶＳＶＤＣＳ−ＣＯＯＨ）を購入して用いた。

［実験方法］
１．ウサギの免疫と抗体価の確認
日本白色種のウサギ三羽（１１週齢，２Ｋｇ，ＳＬＣより購入）を約一週間飼育環境に慣らした。抗原タンパク（ＯＶＭ等）１ｍｇを生理食塩水（１ｍＬ）に溶解しフロイントの完全アジュバントを等量 (１ｍＬ) 加え、超音波処理により均一な乳濁液にした。ウサギの背部と頚部の毛をバリカンで刈った後、抗原を注射する前にNon-immunized serumを採取した。次に、２ｍｌの抗原乳濁液を少量ずつ約３０〜５０ヵ所に分けて皮内に注射する（１次免疫）。１次免疫から３週間後に２次免疫として、同様に調整した２ｍＬの抗原乳濁液を、頚部リンパ組織周辺の皮下組織と、臀部筋肉内に注射を行った。２次免疫後、１週間隔に採血を数回行った。抗体価の確認は、ドットブロッティングにより測定した。Hybond-C Gridded membranesに抗原として用いたＯＶＭを４μＬ（１０ｎｇ）スポッティングし自然乾燥させた後、ＴＴＢＳ (０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ) に溶解したスキムミルク（３．５％）で１時間ブロッキングする。洗浄液ＴＴＢＳで４回洗浄後、採取したウサギ血清を室温で３時間反応させる。反応後メンブレンを４回洗浄液で洗浄し、ブロッキング液に２次抗体（４０００倍希釈）を加え室温で３０分間反応後、洗浄する。最後にAmersham のマニュアルに準じてＥＣＬと反応させ、増感板を用いてフィルムに露光し、現像した。

２．ＩｇＧ分画と抗原特異的ＩｇＧの精製
IgG purification Kit（PIERCE）を使用して得られた抗体からマニュアルに準じて全ＩｇＧを精製した。 Protein A カラムにBinding Buffer を加えてカラムを平衡化する。Binding Bufferで３倍に希釈したウサギ血清をカラムに加え、Ａ２８０の吸収が０．００５以下になるまでBinding Bufferで洗浄する。その後、酸性のElution Buffer を加えてＩｇＧをゆっくり溶出し、溶出液はｐＨをチェックしながら速やかにアルカリ溶液を加えて中和しＩｇＧの失活を防いだ。回収したＩｇＧ分画の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検定した後、吸光度を測定して抗体濃度を確認した。抗原特異的ＩｇＧの精製は、抗原を固定化したCNBr-ativated Sepharose ４Bカラム(Pharmacia) を用いて精製した。 Binding bufferで３倍に希釈した抗血清をカラムに添加した後、Ａ２８０の吸収が０．００５以下になるまでBinding bufferで洗浄した。その後ｐＨ２．８の０．１Ｍグリシン塩酸バッファーによって抗原カラムに結合した抗体を溶出し、速やかに中和した後ＰＢＳで一晩透析してバッファー交換を行った。続いてAmicon社のUltrafiltration YM-30限外濾過膜を使用して濃縮し、吸光度を測定した。

３．タンパク質の断片化と断片化ペプチドの分離精製
抗原タンパク質をこれまでに報告した方法に準じてカルボキシメチル化した後、トリプシンを加え断片化した（Meiko Murakami et al. Eur. J. Biochem 268 : 2847 - 2855 , 2001）。抗原タンパク質２ｍｇを７Ｍグアニジン塩酸塩液０．５ｍＬで溶解し２ｍｇのDithyothreitol（ＤＴＴ）を加えて混合し、室温で２時間還元した。５ｍｇヨード酢酸アミドを反応液に加えてよく混合し、遮光して３０分間反応させた後、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で一晩透析を行った。還元カルボキシメチル化した蛋白質に２０μｇのトリプシンを加え３７℃，２４時間反応させて、抗原蛋白質を断片化した。断片化ペプチドの分離精製は、Ｃ１８逆相カラム（Tsk-gel ODS 80TM, 4.6×250mm, TOSOH）を使用し高速液体クロマトグラフィー装置（Parmaciaと日立）（溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸‐アセトニトリル）にておこなった。酵素消化ペプチドは、アセトニトリルの０−５０％グラジエント系で溶出した。溶出したペプチド溶液はTHERMO BIO ANALYSIS社の減圧濃縮遠心機AES1010を用いて濃縮し、質量分析計とプロテインシクエンサーにてアミノ酸配列を確認した後、ASAHI LIFE SCIENCE社の真空凍結乾燥機LABCONCO FREEZONE 4.5を使用して凍結乾燥した。

４．精製ペプチドの質量分析とアミノ酸配列の解析
高速液体クロマトグラフィー装置で精製したペプチドのアミノ酸配列を、質量分析計4700 Proteomics Analyzer (ABI) でMS及びMS/MS解析を（丹波利充最新のマススペクトロメトリー 1995，丹波利充ポストゲノムマススペクトロメトリー 2003，谷口寿章プロテオミクス実験プロトコール 2003）、Ｎ末端アミノ酸シークエンサー(Procise 492, ABI)でN末端アミノ酸配列を測定し同定した。質量分析計ではMatrix［２．５ｍｇ α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(Sigma)/ｍｌ０．１％ＴＦＡ，５０％アセトニトリル]と酵素消化ペプチドを等量混合後、MALDI Plateに１μＬアプライして測定した。ペプチドシークエンスタグ法により、トリプシン消化断片の質量数、及びそのＭＳ／ＭＳ（ＴＯＦ／ＴＯＦ）スペクトルで観察されたフラグメントイオンの質量数をもとにしてMascot (matrix science) によりデータベースを検索し、アミノ酸配列を同定した。アミノ酸シークエンサーでの分析は、Procise 492(Applied Biosystems)の使用方法に従って実施した。

５．ダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップによるアレルゲンの検出と特異抗体の定量
ダイヤモンド/ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップによるアレルゲンの検出と定量は以下に示す（１）〜（８）の一連の操作で行った。
（１）チップの活性化
チップを９６穴マイクロプレートに入れ、MilliQ水で1回洗浄後、５０μＬの活性化試薬（１００ｍＭＷＳＣＤ・ＨＣｌ，２０ｍＭＮＨＳ，０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液；ｐＨ６．０）をプレートに分注し、室温で３０分間遮光した状態で振とうしながら反応させた。反応液を吸引除去後、MilliQ水でチップを十分に洗浄し、８連チューブにチップを移し卓上遠心機を用いチップの水分を直ちに完全に除去した。
（２）アレルゲンのカップリング反応
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にＤＭＳＯを３０％の濃度で添加し、この溶液にスポッティングを行うアレルゲンを溶解した。アレルゲンはSTAMPU MANマイクロアレイヤー (日本レーザー電子(株))を用いてスポッティングした。チップをマイクロアレイヤーのサンプリング用ホルダーにセットしてスポット操作を行った。スポット後、チップを３７℃ の条件下にクールインキュベーター：CN-25A (三菱電機エンジニアリング(株))でインキュベートした。
（３）未反応活性基のブロッキング操作
チップを９６穴マイクロプレートに移し、洗浄バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、プレートシェーカーを用いて洗浄作業を行った。固定化反応後に残存する活性基を処理するため、１５０ｍＭＮａＣｌ含有１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、遮光した状態下に１時間室温で反応させ未反応基を完全に不活性化した。さらに、チップへの抗体の非特異的反応をブロックするため、遮光条件下に０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液と４℃で一晩反応させた。
（４）アレルゲン認識抗体の捕捉反応
ブロッキングバッファーを吸引除去し、抗体希釈バッファー〔６０ｍｇＢＳＡ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）〕で種々の濃度に１次抗体を希釈した後、チップの入ったプレートに分注し遮光条件下に室温で５時間振とうしながら反応させた。
（５）２次抗体の反応
１次抗体反応液を吸引除去し、洗浄バッファーを加え、プレートシェーカーを用いて洗浄作業を行った。次に蛍光標識した２次抗体を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で１．５μｇ／ｍＬに希釈し、チップの入ったプレートに分注して遮光条件下に室温で１時間振とうして反応させた。
（６）抗原チップに捕捉された抗体の検出
２次抗体との反応後、反応液を吸引除去し、洗浄バッファーとMilliQ水でチップを洗浄し、水分を除去するためにスピンダウンを行った。次にFLA-8000蛍光スキャナー：FLA-8000 (FUJIFILM)を用いて蛍光強度を測定し、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。

［結果］
１．抗ＯＶＭ抗体の作製とＯＶＭに対する抗原特異的ＩｇＧの精製
ダイヤモンド/Diamond-like Carbon (ＤＬＣ) チップによるアレルゲンの検出と特異抗体の定量法に対する基礎検討をするため、実験的アレルギー状態にある動物の血清を用いて予備実験を行った。免疫は[実験材料及び方法]の項に示す方法に従ってウサギを用いて行った。食物アレルギーのなかでは、鶏卵アレルギーがもっとも高い頻度で発症しており、卵アレルギーの中でも最もアレルゲン性の高い成分はＯＶＭである（Motohiro Ebisawa, Kaori Ikematsu, Takanori Imai & Hiroshi Tachimoto, Allergy and Clinical Immunology International. 15(5) : 214 - 217 , 2003）。そこでＯＶＭをアレルゲンとして抗体を作製した。

全ＩｇＧおよび抗ＯＶＭＩｇＧ抗体のＯＶＭ抗体価は、ＯＶＭによって免疫されたウサギ血清から精製された各々の検体を、１〜１０ｎｇの抗原の反応が十分な感度をもって検出することができるか、ドットブロットによって確認した。Total ＩｇＧの場合、用いた血清のVolumeに換算して１，０００倍以上の希釈でも抗体を検出できる検体を以後の実験に用いた。抗原特異的ＩｇＧの場合、１００ｎｇ／ｍＬ以下まで希釈しても反応する抗体をもって、以後の実験に用いた。なおＯＶＭの免疫によって得られる抗体価には動物による個体差が大きく認められることから、１抗原に対して３個体以上を用いて免疫を行い、少なくとも２個体以上から検体を採取して実験に供した。

２．ＯＶＭとαS1-, αS2-, β-, κ-カゼインのアレルゲンペプチドライブラリーの作製
食物アレルギーの原因物質としてのアレルゲンの解析は一部を除いていまだ十分に解析されていない現状にあり、抗原エピトープに至っては極めて不十分な情報しか知られていない。一方アレルギーを起こす個体側では、アレルゲンとして認識するエピトープに対する感受性に個体差があるだけでなく、同じ個体でも年齢とともに認識するエピトープが変化したり、エピトープに対する認識の感受性が変化する事から、詳細なアレルゲンエピトープの解析法と個々のアレルゲンエピトープに対するＩｇＥ,ＩｇＧ抗体価の定量が、診断と治療に必須である。食物アレルゲンエピトープの網羅的解析を行うことを目的とし、アレルゲンエピトープライブラリーの作成を試みた。本研究では、卵の中で最も抗原性の高いＯＶＭと、牛乳の中で抗原性の高い３種のカゼインを選び、これらの抗原蛋白質をカルボキシメチレーションした後、トリプシンによる切断アレルゲンエピトープライブラリーを[実験材料及び方法]の項に示す方法に従って作成した。今回の実験では示していないが、ヒトの樹上細胞内で抗原提示に係わるプロテアソーム、カテプシンＥ，Ｂ，Ｌによるアレルゲンエピトープライブラリーも計画している。トリプシンによる限定分解の結果生成したペプチドをＨＰＬＣで分離精製し、精製した蛋白質のアミノ酸配列を、4700 Proteomics Analyzer およびＮ末端アミノ酸シークエンサーを用いて同定した。ＯＶＭ，αＳ１−カゼイン，αＳ２−カゼイン，β−カゼイン，κ−カゼインのトリプシンによるフラグメントペプチドのアルゲンエピトープライブラリーを図１〜５示した。

３．アレルゲンエピトープ解析チップの開発
（１）ＤＬＣチップ上で抗原と抗体は定量性を持って反応した。
本実験ではシリコン基板のＤＬＣチップまたはダイヤモンドチップを用い、抗原分子の濃度に依存した抗体の捕捉が可能か否かを検討した。ＤＬＣチップに抗原としてＯＶＭを1スポット当たり６．３−５０．７ｆｍｏｌ濃度をスポッティングし、１次抗体として１．５μｇ／ｍＬに希釈したRabbit-ＩｇＧ分画を[実験材料及び方法]の項に示す方法に従って反応させ、ＦＩＴＣ標識した２次抗体（Anti-Rabbit ＩｇＧ）で検出した（図６参照）。測定はバッファーのみをスポッティングしたスポットの蛍光強度を各々のスポットの蛍光強度から差し引いて測定値とした。チップ間で反応強度に多少の差を認めるが、図に示すようにこの条件下において得られた蛍光強度は、抗原濃度に依存して直線的に上昇した。データーには示していないが、同様の結果がシリコン基板のダイヤモンドチップでも得られた。以上のことは、ＤＬＣチップまたはダイヤモンドチップに共有結合された抗原ペプチドは、抗体との反応性を保持したまま固定化されている事を示している。
（２）２次抗体標識蛍光色素の感度の比較検討
検出システムの高感度化をめざすため、２次抗体をラベルする蛍光色素をＦＩＴＣからＣｙ５およびＣｙ３標識に変化して、検出感度の差を比較検定した。なおこの実験では、シリコン基板以外にシリコン基板と同様の反応性の確かめられているＤＬＣ化ステンレス基板を用いて検討した。比較的低濃度のＯＶＭ抗原を１２．７ｆｍｏｌ／スポット（５０μｇ／ｍＬ原液）した抗原から得られる反応蛍光強度は、ＦＩＴＣ標識した２次抗体の強度（２３９３２±３１２９）に比べてＣｙ５標識で約４１倍の値（９７８５６５±１２６３９７）を、Ｃｙ３標識で約１８１倍の反応蛍光強度の値（４３２９４５７±５２７８３９）が得られた。このことから高感度化条件では２次抗体をＣｙ３でラベルすることとした。
（３）チップに載せるアレルゲンエピトープのペプチドサイズの検討：ＭＨＣクラスII抗原ペプチドライブラリーとトリプシン切断ライブラリーの比較検討
アレルゲンエピトープとして報告のある部位の合成ペプチド（合成ペプチドＮｏ．１−１３）と、この領域を含む同じモル濃度（５０ｆｍｏｌ／スポット）のトリプシンフラグメントペプチドを抗原とした時の、抗体との反応性を比較検討した。抗体としてはＯＶＭで免疫されたウサギ血清を抗体として用いた。ＭＨＣクラスIIに結合するエピトープとして判明している合成ペプチドは、抗体と反応する最小サイズではあるがいずれのペプチドも反応蛍光強度は低く、同じモル濃度の長いサイズのトリプシンフラグメントペプチドに比較して、大きな差のある事が判明した（図７参照）。例えばＭＨＣクラスIIエピトープペプチドの中で、最も強く反応した9残基のＯＶＭ, Ｎｏ２合成ペプチド（ＮＨ２−ＧＴＤＧＶＴＹＴＮ−ＣＯＯＨ）でも、その両端（場合によっては片側）にペプチド鎖が伸びた３１残基のフラグメントペプチド (Fraction No. 97) と比較すると、約1/10倍の反応蛍光強度を示した。このことは、患者からのアレルゲンエピトープを高感度で効果的に最初にスクリーニングするためには、ペプチド鎖が比較的長く部分的な立体構造を持つと推定されるプロテアーゼのフラグメントペプチドが1次スクリーニングに適していると推定された。今後の研究において行われる抗原提示に係わる数種のプロテアーゼのフラグメントペプチドのアレルゲンエピトープライブラリーの結果と合わせて評価することで、診断と治療に有益な食物アレルゲンエピトープ情報を得る事ができると推定された。
（４）抗体濃度と抗原濃度の最適化条件の検定
チップにスポッティングする最適な抗原濃度を求める為、ＯＶＭを０．６３−１０１．４ｆｍｏｌ／スポットの濃度範囲でスポッティングし、臨床検体を想定して血清を１，０００倍−２０，０００倍の希釈倍率下に反応を行った。血清を１，０００倍−２０，０００倍に希釈した条件では、抗原量が約２．５ｆｍｏｌ〜２５ｆｍｏｌの濃度で高い定量性を得られた（図８参照）。この条件下では、血清を２，５００倍−２０，０００倍希釈した条件下で高い定量性を得られた。そこで抗原の濃度を２．５ｆｍｏｌ〜２５ｆｍｏｌに固定して、血清を１０，０００−２０，０００倍希釈した場合の、抗原濃度依存的な蛍光強度を検討した。抗原濃度に依存して、蛍光強度は直線的に増加した（図９参照）。
（５）小児の食物アレルギー検体の解析
以上のウサギ血清を抗体とした基礎検討を基盤に、小児を対象とした食物アレルギーの検体の解析を行った。徳島大学の倫理委員会の承認と香川国立小児病院の倫理委員会の承認の上で、十分なインフォームドコンセントのもとに承諾の得られた臨床検体を香川小児病院（伊藤道徳先生）から供与いただき、食物アレルギーの無い健常人コントロールとの比較を行った。最初に卵と牛乳のアレルゲン成分を検定する目的で、シリコンを基板としたＤＬＣチップに、アレルゲンのタンパク質をそれぞれ１スポット当たり１０ｆｍｏｌをスポッティングし、血清を１００倍に希釈し反応を行い、２次抗体にＣｙ３標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用い検出した。可能な限り強く免疫したウサギ血清の希釈率は、ヒト血清では参考にならない為、図には示していないが患者と健常人からそれぞれ１検体を選択して５０、１００、２００、４００、８００、１６００倍に希釈してチップとの反応性を検定した。その結果、チップとの反応性において非特異的反応が少なく測定可能な希釈は４００−１６００倍希釈の範囲と判断された。

患者血清を１０００倍に希釈した測定結果を図１０に示した。患者のほとんどはミルクアレルギーで、α-, β-, κ-カゼインとそれぞれの反応強度をもって反応を示した。中にはα-ラクトアルブミン（lactoalbumin）とも反応している患者も認められたが、その比率はカゼインに比較して少数であった。しかしミルクアレルギーを主訴とするアレルギー患者であっても、卵の成分であるＯＶＭ, オボアルブミン（Ovalubumin），コンアルブミン（Conalubumin）に対しても反応性を示す患者が見いだされた（図１１参照）。ダイヤモンド／ＤＬＣチップを用いた上記の測定系では、１マイクロリッターの血清で少なくとも２５項目が定性、定量測定可能であり、従来の検査法が定性的検査のみで１検体当たり２５０〜５００マイクロリッターを必要としていた検査法と比較すると、患者負担と利便性の点で優れていると推定された。

上記ＩｇＧの場合と同様に、卵と牛乳のアレルゲン成分を検定する目的で、シリコンを基板としたＤＬＣチップに、アレルゲンのタンパク質をそれぞれ１スポット当たり１０ｆｍｏｌをスポッティングし、血清を１０倍に希釈し反応を行い、２次抗体にＣｙ３標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用い検出した。測定結果を図１２に示した。

Claims

アレルギー疾患の判定キットであって、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に２５種類以上のアレルゲンのアレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチドを溶解した溶液をスポッティングして、アレルゲンのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基のブロッキング操作を行ったアレルゲンエピトープ判定チップと、アレルゲンエピトープ判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体をイムノアッセイにより検出する試薬とを含み、同一条件下、２５種類以上のアレルゲンを一度に定量的に測定する、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンの判定用キット。
アレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチドが、化学修飾されたペプチドであることを特徴とする請求項１記載のキット。
アレルゲンエピトープを含むペプチドが、ＭＨＣクラスII分子に結合するペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチドであることを特徴とする請求項１又は２記載のキット。
アレルゲンエピトープを含むペプチドが、アレルゲンのエピトープを含むプロテアーゼ分解ペプチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のキット。
プロテアーゼ分解ペプチドが、トリプシン分解ペプチドであることを特徴とする請求項４記載のキット。
アレルゲンが、食物アレルゲンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のキット。
食物アレルゲンが、カゼインナトリウム、α−カゼイン、β−カゼイン、κ-カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンから選ばれる１種又は２種以上のアレルゲンであることを特徴とする請求項６記載のキット。
イムノアッセイにより検出する試薬が、蛍光標識した２次抗体を含む試薬であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のキット。
蛍光標識した２次抗体が、Ｃｙ３標識２次抗体であることを特徴とする請求項８記載のキット。
２次抗体が、抗ＩｇＧ抗体又は抗ＩｇＥ抗体であることを特徴とする請求項８又は９記載のキット。
ダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップの活性化試薬が、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ及びＮＨＳを含有する溶液であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載のキット。
チップを活性化試薬により活性化した後、チップを洗浄した洗浄水の乾燥処理として減圧乾燥処理を行うことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載のキット。
洗浄水が、MilliQ水であることを特徴とする請求項１２記載のキット。