JP4157947B2 - 小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの判定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーに対する高感度のin vitro判定が可能な即時型小麦アレルギーの判定方法および診断キットに関する。
重篤な即時型アレルギーを引き起こす食物アレルギーの原因として、小麦は、卵，乳製品に続いて３番目に患者数の多い食物として知られている。その症状としては、全身のかゆみ、おう吐、喘息や腸炎といったものが挙げられる。また近年、食物を摂取するのみでは症状が誘発されず、食物摂取後の運動や非ステロイド性消炎鎮痛薬の内服などの２次的要因が加わることにより重篤な症状が誘発される、いわゆる食物依存性運動誘発アナフィラキシーが存在することが明らかになってきた。そして、食物依存性運動誘発アナフィラキシーの原因食物としては、小麦が最も多く報告されている（非特許文献２）。
特に、２次的要因を必要とする食物依存性運動誘発アナフィラキシーに関しては発見および確定が困難であるので、病気の確定診断方法として、患者を入院させ、小麦製品の摂取と運動やアスピリンの内服とを組み合わせた負荷試験を行い、実際に症状が再現されるかどうかを確認する方法が知られている。
松尾裕彰，他9名，「Identification of the IgE-binding epitope in omega-5 gliadin, amajor allergen in wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis」， The Journal ofBiological Chemistry，2004年，279巻，13号，p.12135-12140
望月満，他２名，「食物依存性運動誘発性アナフィラキシー」小児科診療２００３年，４月 第66巻，増刊号，P.39-43
Kati Palosuo 他７名，「A novel wheat gliadin as a cause of exercise-induced anaphylaxis.」，Journal of Allergy andClinical Immunology，1999年，103巻，5号，P.912-917.
Kati Palosuo 他６名， 「Wheat omega-5 gliadin is amajor allergen in children with immediate allergy to ingested wheat.」，Journal of Allergy andClinical Immunology， 2001年，108巻，4号，P.634-638
しかしながら、従来の、食物依存性運動誘発アナフィラキシーの確定診断方法に至っては、その食物負荷試験の性質上、試験中に被験者がショックを起こす場合があるという本質的問題点があった。従って、被験者の負荷がきわめて大きいという問題点があり、さらに、入院が必要である点からも被験者の負担が大きくなるという問題点があった。また、症状が再現されない場合があるという問題点もあった。
また、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの発症可能性の有無の判定に際しては、グルテン構成タンパク質であるω−５グリアジンが原因抗原として知られているため（非特許文献３）、血液中のグルテン特異的ＩｇＥ抗体を測定する診断方法が存在する。しかしながら、グルテンは多種のタンパク質より構成されており、また、小麦の品種によってもその成分含量が異なる。従って、正確な診断ができず、結局上述した確定診断方法が必要となるという問題点があった。
また、非特許文献１に記載の本願発明者らによる報告では、ω−５グリアジンのいくつかのＩｇＥ結合エピトープ配列を特定できたものの、他にも存在するはずの原因抗原およびそのエピトープ配列が特定できていない。その結果として、ω−５グリアジン、または、そのエピトープ配列特異的ＩｇＥ抗体の測定のみでは、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者の診断にもれが出てしまうという問題点があった。
本発明は上記に鑑みてなされたものであって、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーを被験者の負担が少なくかつ高感度で診断できるようになることを目的とする。
また、本発明は、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーを被験者の負担が少なくかつ簡易に診断できるようになることを目的とする。
上記の目的を達成するために、本願発明者は鋭意検討の結果、特に、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者であれば、グルテン中の特定タンパク質、すなわち、ＨＭＷ（Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ）−グルテニンの所定アミノ酸配列とω−５グリアジンの所定アミノ酸配列がエピトープ（ＩｇＥ反応部位）となりうることを突き止めた。そして、患者によっては、片方のタンパク質（中の所定アミノ酸配列）のみに反応する場合もあれば両方のタンパク質（中の所定アミノ酸配列）に反応する場合もあることを突き止めた。これらの知見により、本発明はなされたものである。
また、請求項１に記載の発明は、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーのin vitro判定に際しての、配列番号１〜３に記載の３種のペプチドすべての使用である。すなわち、請求項１にかかる発明によれば、少なくともＨＭＷ−グルテニンが発症主原因である患者、特に、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者を効率的に発見可能となる。ここで効率的にとは、擬陽性または擬陰性と判断される可能性が小さくなることをいう。なお、本願ではin vitro判定とは血液判定、血清判定、血漿判定など、一旦体内から取り出したＩｇＥを含む体液による判定を指すものとする。
また、請求項２に記載の発明は、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーのin vitro判定に際しての、配列番号１〜１０に記載の１０種のペプチドすべての使用である。すなわち、請求項２にかかる発明によれば、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者を最も効率的かつ高感度に発見可能となる。
また、請求項３に記載の発明は、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーのin vitro判定に際しての、配列番号２，３，４および５に記載の４種のペプチドすべての使用である。すなわち、請求項３にかかる発明によれば、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの簡易判定が可能となる。
また、請求項４に記載の発明は、配列番号１〜３に記載の３種のペプチドすべてを抗原として使用した小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの診断キットである。すなわち、請求項４にかかる発明によれは、少なくともＨＭＷ−グルテニンが発症主原因である患者、特に、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者を効率的に発見可能となる。ここで効率的にとは、擬陽性または擬陰性と判断される可能性が小さくなることをいう。
また、請求項５に記載の発明は、配列番号１〜１０に記載の１０種のペプチドすべてを抗原として使用した小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの診断キットである。すなわち、請求項５にかかる発明によれば、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者を最も効率的かつ高感度に発見可能となる。
また、請求項６に記載の発明は、配列番号２，３、４および５に記載の４種のペプチドすべてを抗原として使用した小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの診断キットである。すなわち、請求項６にかかる発明によれば、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの簡易診断が可能となる。
本発明によれば、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの有無を被験者の負担が少なくかつ高感度で診断できるようになる。また、本発明によれば、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの有無を被験者の負担が少なくかつ簡易に診断できるようになる。
（小麦依存性運動誘発アナフィラキシーに対する抗原タンパク質の絞込み）
まず、負荷誘発試験により小麦依存性運動誘発アナフィラキシーと確定されている患者１７名を被験者として、小麦のどのタンパク質が抗原であるのかを決定することとした。そこで、小麦粉から、α−グリアジン、β−グリアジン、γ−グリアジン、ω−５グリアジン、ω−１，２グリアジン、および、ＨＭＷ−グルテニン、ＬＭＷ（Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ）−グルテニンを、分子サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。
まず、負荷誘発試験により小麦依存性運動誘発アナフィラキシーと確定されている患者１７名を被験者として、小麦のどのタンパク質が抗原であるのかを決定することとした。そこで、小麦粉から、α−グリアジン、β−グリアジン、γ−グリアジン、ω−５グリアジン、ω−１，２グリアジン、および、ＨＭＷ−グルテニン、ＬＭＷ（Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ）−グルテニンを、分子サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。
ついで、精製各種グリアジンおよびグルテニンをＰＶＤＦメンブレン（Millipore社製）にスポットし、これに１０％患者血清を反応させた。続いて、メンブレンに結合したＩｇＥ抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体（バイオソース社製）およびECL-Plus Western blot detection regent（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて検出した。このとき、スポット強度を画像解析ソフトであるゲルプロアナライザー（GelPro analyzer：Media Cybernetics社製）にて数値化し、血清ＩｇＥの反応性を解析することとした。
図１は、負荷誘発試験により小麦依存性運動誘発アナフィラキシーと確定されている患者１７名について、小麦中の各タンパク質に対するＩｇEの反応強度を示した図である。図より、患者番号４、１１、１３および１７の４名はＨＭＷ−グルテニンに、残りの１３名はω−５グリアジンに最も強く反応することが確認できた。なお、図中の単位は積算光学強度を示している。
（ＨＭＷ−グルテニンのＩｇＥ結合エピトープの同定）
次に、このＨＭＷ−グルテニンに反応するＩｇＥ抗体を保有する４名の患者の血清を再度準備し、ＩｇＥ結合エピトープ配列を確定する作業を行った。初めに、既にデータベースに登録されているＨＭＷ−グルテニンのアミノ酸配列を基に、１４長ペプチドを、アミノ酸の重複長を７長としてSPOTsメンブレン（シグマジェノシス社製）上に合成し、計１６本のペプチドアレイを作製した。ＨＭＷ−グルテニンの配列を配列表１１に示した。また、図２に、１４長×１１６本のペプチドアレイの対応図を示した。
次に、このＨＭＷ−グルテニンに反応するＩｇＥ抗体を保有する４名の患者の血清を再度準備し、ＩｇＥ結合エピトープ配列を確定する作業を行った。初めに、既にデータベースに登録されているＨＭＷ−グルテニンのアミノ酸配列を基に、１４長ペプチドを、アミノ酸の重複長を７長としてSPOTsメンブレン（シグマジェノシス社製）上に合成し、計１６本のペプチドアレイを作製した。ＨＭＷ−グルテニンの配列を配列表１１に示した。また、図２に、１４長×１１６本のペプチドアレイの対応図を示した。
作製したメンブレンを１０％患者血清と反応させ、結合したＩｇＥ抗体を同様に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体およびECL-Plus Western blot detection regentにて検出した。
図３は、４人の患者のＩｇＥ抗体反応結果である。図中、写真は８マス×１５列のメンブレンであり、左右の数字は１４長ペプチドの番号を示している。また、写真下は、血清と反応したペプチドの番号とそのアミノ酸配列を示している。特異的に血清ＩｇＥが結合したペプチドを位置決めすると、４人すべての患者にＱＱＳＧＱＧＱ（配列番号３）が含まれ、また、患者１と患者４には、それぞれ、ＱＱＰＧＱ（配列番号１）、および、ＱＱＰＧＱＧＱＱ（配列番号２）が含まれていた。従って、これらが、ＩｇＥ抗体と結合するエピトープであると想定できた。なお、血清の代わりに水を添加した場合に検出されたペプチドは除外することとした（図４参照）。
次に、エピトープであることを確定するため、ＱＱＰＧＱ（配列番号１）とアミノ酸配列ＱＱＰＧＱＧＱＱ（配列番号２）とを含むペプチド番号１７（図２および配列番号１１参照）、および、ＱＱＳＧＱＧＱ（配列番号３）を含むペプチド番号６９（図２および配列番号１１参照）について、前後を欠失させたものをメンブレン上に合成し、患者血清ＩｇＥとの反応性を比較した。
図５は、ペプチド番号１７およびペプチド番号６９を用いたエピトープ配列の決定実験の結果を示した図である。図中、写真は、ペプチド１７の前端もしくは後端を欠失させた１４パターンのペプチドに対する反応結果である。なお、写真横の数字はパターン番号を、その右側の配列はペプチドのアミノ酸配列を示している。図から明らかなように、ＱＱＳＧＱＧＱ（配列番号３）、ＱＱＰＧＱ（配列番号１）、および、ＱＱＰＧＱＧＱＱ（配列番号２）はエピトープ配列であることが確認できた。
（ω−５グリアジンのＩｇＥ結合エピトープの同定）
次に、ω−５グリアジンに最も強く反応するＩｇＥ抗体を保有する患者４名（図１の患者１，２，３，および、５）の血清を用いてω−５グリアジンのＩｇＥ結合エピトープ配列を確定する作業を行うこととした。ω−５グリアジンの全長型のアミノ酸配列は報告されていなかったので、小麦ＥＳＴ（Expression Sequence Tag）データベースに報告されていたω−５グリアジン断片のアミノ酸配列から、全長型のアミノ酸配列を推測した。この推定ω−５グリアジンのアミノ酸配列を基に、１３長ペプチドを、アミノ酸の重複長を６長としてSPOTsメンブレン（シグマジェノシス社製）上に合成し、計６６本のペプチドアレイを作製した。推定ω−５グリアジンの配列を配列表１２に示した。また、図６に、１３長のペプチドアレイ６６本を示した。
次に、ω−５グリアジンに最も強く反応するＩｇＥ抗体を保有する患者４名（図１の患者１，２，３，および、５）の血清を用いてω−５グリアジンのＩｇＥ結合エピトープ配列を確定する作業を行うこととした。ω−５グリアジンの全長型のアミノ酸配列は報告されていなかったので、小麦ＥＳＴ（Expression Sequence Tag）データベースに報告されていたω−５グリアジン断片のアミノ酸配列から、全長型のアミノ酸配列を推測した。この推定ω−５グリアジンのアミノ酸配列を基に、１３長ペプチドを、アミノ酸の重複長を６長としてSPOTsメンブレン（シグマジェノシス社製）上に合成し、計６６本のペプチドアレイを作製した。推定ω−５グリアジンの配列を配列表１２に示した。また、図６に、１３長のペプチドアレイ６６本を示した。
作製したメンブレンを１０％患者血清と反応させ、ＨＭＷ−グルテニンの時と同様に、結合したＩｇＥを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体およびECL-Plus Western blot detection regentにて検出した。
図７は、４人の患者のＩｇＥ抗体反応結果である。図中、４名の患者血清ＩｇＥ抗体が共通して比較的強く反応したペプチドはペプチド番号５，８，１０，１３，１８，２１，２３，２４，２６，２８，３２，３４，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４３，４５，４６，４７，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５７，５８，６０および６４であった。なお、ペプチド番号６１と６２は患者３のＩｇＥ抗体にのみ結合した。
この結果から特異的に血清ＩｇＥが結合したペプチドを位置決めすると、ペプチド番号１０，２６および４３中に見られるＱＱＩＰＱＱＱ（配列番号４）、ペプチド番号５，８，２１，３２，３６，３７，３９，４０，４５，４６，４７，４９，５１，５２，５３，５４，５８および６０中に見られるＱＱＦＰＱＱＱ（配列番号５）、並びに、ペプチド番号１３，１８，２３，２４，２８，３４，４１および５０中に見られるＱＱＬＰＱＱＱ（配列番号８）がＩｇＥ結合エピトープの一部として予想された。さらに、ＩｇＥの反応が強く認められたペプチド番号３８，５７，６１，６２および６４のアミノ酸配列中にもＱＱＩＰＱＱＱ（配列番号４），ＱＱＦＰＱＱＱ（配列番号５），ＱＱＬＰＱＱＱ（配列番号８）以外のＩｇＥ結合エピトープ配列が存在すると予想された。
この知見を基に、ペプチド番号２６，２８，３８，４７，５７，６１，６２および６４について、ＨＭＷ−グルテニンと同様に一部欠失させたペプチドをSPOTsメンブレン上に合成し、患者血清ＩｇＥとの反応性を比較した。その結果、ＱＱＩＰＱＱＱ（配列番号４），ＱＱＦＰＱＱＱ（配列番号５），ＱＱＬＰＱＱＱ（配列番号８）はＩｇＥ結合エピトープ配列であると確認できた。さらに、ＱＱＳＰＱＱＱ（配列番号７），ＱＱＳＰＥＱＱ（配列番号６），ＱＱＹＰＱＱＱ（配列番号９），ＰＹＰＰ（配列番号１０）もＩｇＥ結合エピトープであることが明らかとなった。
（小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者血清ＩｇＥのエピトープに対する反応性の検討）
次に、負荷試験により確定診断された小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者２８名の血清が、上記手法により決定された１０種のエピトープ配列に対してどのように反応するかを調べた。図８に結果を示す。図示したように、すべての患者は、何れかのエピトープ配列に結合するＩｇＥ抗体を保有していた。
次に、負荷試験により確定診断された小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者２８名の血清が、上記手法により決定された１０種のエピトープ配列に対してどのように反応するかを調べた。図８に結果を示す。図示したように、すべての患者は、何れかのエピトープ配列に結合するＩｇＥ抗体を保有していた。
なお、図中の最下段は、従来、診断に有効であるとされていたグルテン特異的ＩｇＥ検査結果を示している。従来検査では、陽性判定数値とされる０．３５を超えず、陰性と判定されてしまっていた患者８名（図８中の患者番号１，８，１３，１６，１８，１９，２３および２４）に関しても、本試験では陽性と判定され、感度が高いことが確認できた。
従って、小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの発症可能性の有無に関しては、被験者の血液を用いて、配列番号１〜１０に記載のペプチドと反応するか否かによって判定可能となる。診断キットとして適用も可能であり、担体に配列番号１〜１０のペプチドを結合させたもの作製してもよい。用法としては、被験者の血清を診断キットに滴下し、所定時間経過後血清を洗い流し、ＩｇＥ抗体反応があった場合にのみ反応する試薬を滴下する方法が挙げられる。
なお、図８から明らかなように、２８名の患者は、ＨＭＷ−グルテニンとω−５グリアジンの何れかにもしくは何れもにＩｇＥ抗体を有するが、ＨＭＷ−グルテニンに対してＩｇＥ抗体を有する患者は必ずＱＱＰＧＱＧＱＱ（配列番号２）またはＱＱＳＧＱＧＱ（配列番号３）に反応し、ω−５グリアジンに対してＩｇＥ抗体を有する患者は必ずＱＱＩＰＱＱＱ（配列番号４）およびＱＱＦＰＱＱＱ（配列番号５）に反応する。従って、配列番号２，３、４および５のペプチドを用いた簡易診断キットとしての応用も可能である。
また、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者であれば、そのＩｇＥ抗体が必ず配列番号１〜１０のいずれかに記載のエピトープに結合するが、逆に、並列番号１〜１０のいずれかのエピトープに結合するＩｇＥ抗体を有する人が、必ずしも、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者ではなく、発症に特に運動負荷を必要としない即時型小麦アレルギー患者である場合がある。実際に、ω−５グリアジンは即時型小麦アレルギーの原因抗原としても報告されている（非特許文献４）。従って、配列番号１〜１０のいずれかに記載のエピトープ配列を含むペプチドないしタンパク質を用いて、一般的な即時性小麦アレルギーの診断も可能である。
本発明によれば、自覚症状のない潜在的な小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者を発見可能となる。
Claims (6)
- 小麦依存性運動誘発アナフィラキシーのin vitro判定に際しての、配列番号１〜３に記載の３種のペプチドすべての使用。
- 小麦依存性運動誘発アナフィラキシーのin vitro判定に際しての、配列番号１〜１０に記載の１０種のペプチドすべての使用。
- 小麦依存性運動誘発アナフィラキシーのin vitro判定に際しての、配列番号２，３，４および５に記載の４種のペプチドすべての使用。
- 配列番号１〜３に記載の３種のペプチドすべてを抗原として使用した小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの診断キット。
- 配列番号１〜１０に記載の１０種のペプチドすべてを抗原として使用した小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの診断キット。
- 配列番号２，３、４および５に記載の４種のペプチドすべてを抗原として使用した小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの診断キット。
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