JP5462293B2 - 生体関連分子の相互作用を検出するための方法及びユニット - Google Patents

Description

本発明は、生体関連分子が固定化された担体を用いて生体関連分子の相互作用を検出する方法及びそれに使用するためのユニットに関する。

ゲノム解析の進展により、種々の生物の生理反応に関与する生体関連分子が解明されてきた。これら生体関連分子には、ＤＮＡ、蛋白質、糖鎖、細胞などがあり、機能や構造等が解明されたものは、創薬や臨床検査、食品検査、環境検査などの各種産業用途に利用される。

臨床検査を始めとする検査では、以下の方法が一般的によく採用される。すなわち、検出したい生体関連分子（以下、アナライトと呼称する）と特異的に結合するプローブ分子（以下、リガンドと呼称する）を担体上に固定したデバイスに検体を接触させると、検体にアナライトが存在する場合、リガンドと結合してアナライトが担体上に捕捉されるので、この補足されたアナライトが検出される。

上記のような検査方法においても、近年、高速化、自動化が求められ、数百〜数万の生体関連分子を同時に網羅的に計測する検出方法が要望されるようになり、生体関連分子固定の集積化技術、いわゆる、ＭＥＭＳ技術を用いたデバイス設計が可能となり、いわゆるマイクロアレイとして、創薬研究やバイオ研究における網羅的解析に用いられている。

デバイスとしてのマイクロアレイは、担体上に固定されるプローブ分子の種類により、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップとも呼ばれる）、蛋白質マイクロアレイ（蛋白質チップとも呼ばれる）、細胞マイクロアレイ（細胞チップとも呼ばれる）等がある。

解析は、マイクロアレイ上に、例えば、蛍光物質で予め蛍光標識を行った検体を接触させ、その後にマイクロアレイを洗浄してから蛍光物質が発する蛍光シグナルを検出測定することにより検体に含まれるアナライトを同定又は定量する(特許文献１)。

ＤＮＡチップ等のマイクロアレイは、通常、スライドガラス様の大きさで、専らその上に検体を垂らしプレパラートで覆い反応させる。今後は用途に応じてマイクロアレイを大量に自動処理する必要がある。その場合、マイクロアレイの小型化が望まれ、さらに小型化したマイクロアレイを自動で処理するための効率的な手段の開発が望まれる。

特表２００６−５１５０６５号公報

本発明者らは、小型化したマイクロアレイを自動で処理するために、マイクロアレイを支持部材に固定化し、これを検体を収容した中空ホルダーに挿入して反応させたところ、検体の容積が微量（数〜数百μ）であるために、表面張力の影響により検体とマイクロアレイの接触が十分行われず、反応不十分となることを見出した。

従って、本発明の課題は、小型化したマイクロアレイの自動処理において微量の検体とマイクロアレイの接触を十分行うための手段を提供することである。

本発明者らは、マイクロアレイを支持部材に固定化し、これを反応液を収容した中空ホルダーに挿入して反応させる際に、支持部材が中空ホルダー内に偏りなく挿入されるよう位置決めを行うことにより、検体とマイクロアレイの接触が十分行われることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）生体関連分子が固定化された担体を用いた生体関連分子の相互作用の検出に使用するためのユニットであって、一端に開口部を有し他端が閉塞している中空ホルダーと、生体関連分子が固定化された担体が固定化されており中空ホルダーに挿入可能な担体支持部材とを有し、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合することによって、中空ホルダーが密閉されるとともに担体支持部材と中空ホルダーとが位置決めされ、位置決め姿勢で中空ホルダーの軸心を含む面で切った断面図において、中空ホルダーの内側と担体が固定化された担体支持部材の外側とで画成される面積が、担体支持部材の担体固定部から先端部までの領域で、軸心の左右で略同一である、前記ユニット。
（２）担体支持部材における担体固定部が底面と側面とを有する凹部であり、担体が凹部の底面に配置されている、（１）記載のユニット。
（３）担体支持部材凹部の少なくとも後端部側の側面が傾斜面である、（２）記載のユニット。
（４）傾斜面の表面粗さが１０μｍ以下であり、傾斜面と底面とのなす角度が７５°以下である、（３）記載のユニット。
（５）担体支持部材凹部の先端部側の側面から先端部まで廃液溝が形成されている、（２）〜（４）のいずれかに記載のユニット。
（６）担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の担体固定部より先端部側の領域で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が６０％以上である、（１）〜（５）のいずれかに記載のユニット。
（７）担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が２５〜７０％である、（１）〜（６）のいずれかに記載のユニット。
（８）それぞれ担体が固定化された複数の担体支持部材を有し、担体支持部材の後端部がそれぞれ面材に固定されており、それぞれの支持部材に対応した複数の中空ホルダーを有する、（１）〜（７）のいずれかに記載のユニット。
（９）生体関連分子が固定化された担体を用いて生体関連分子の相互作用を検出する方法であって、一端に開口部を有し他端が閉塞しており反応液を収容している中空ホルダーに、生体関連分子が固定化された担体が固定されている担体支持部材を挿入することによって、担体上の生体関連分子と反応液中の蛍光標識された生体関連分子とを相互作用させる相互作用工程、担体を洗浄することにより、担体に固定化された生体関連分子と相互作用しなかった生体関連分子を除去する洗浄工程、担体に励起光を照射し、検出器で蛍光を検出する検出工程を含み、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合することによって、中空ホルダーが密閉されるとともに担体支持部材と中空ホルダーとが位置決めされ、前記位置決め姿勢で中空ホルダーの軸心を含む面で切った断面図において、中空ホルダーの内側と担体が固定化された担体支持部材の外側とで画成される面積が、担体支持部材の担体固定部から先端部までの領域で、軸心の左右で略同一である、前記方法。
（１０）担体支持部材における担体固定部が底面と側面とを有する凹部であり、担体が凹部の底面に配置されている、（９）記載の方法。
（１１）担体支持部材凹部の少なくとも後端部側の側面が傾斜面である、（１０）記載の方法。
（１２）傾斜面の表面粗さが１０μｍ以下であり、傾斜面と底面とのなす角度が７５°以下である、（１１）記載の方法。
（１３）担体支持部材凹部の先端部側の側面から先端部まで廃液溝が形成されている、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の担体固定部より先端部側の領域で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が６０％以上である、（９）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が２５〜７０％である、（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）それぞれ担体が固定化された複数の担体支持部材を有し、担体支持部材の後端部がそれぞれ面材に固定されており、それぞれの支持部材に対応した複数の中空ホルダーを有する、（９）〜（１５）のいずれかに記載の方法。

本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００８−１４１１５５号の明細書、特許請求の範囲及び図面に記載された内容を包含する。

本発明により、小型化したマイクロアレイの自動処理において微量の検体とマイクロアレイの接触を十分行うための手段が提供される。

本発明の一実施形態を示す。 本発明の一実施形態を示す。 本発明の一実施形態を示す。 本発明の一実施形態を示す。 本発明の一実施形態を示す。 担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合している場合（ａ）と係合していない場合（ｂ）を比較した結果を示す。 廃液溝を有する担体支持部材（ａ）と廃液溝を有しない担体支持部材（ｂ）と中空ホルダー（ｃ）の一実施形態を示す。 廃液溝を有する担体支持部材と廃液溝を有しない担体支持部材を用いた場合の検出結果を示す。 中空ホルダーに挿入された姿勢で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が８０％である担体支持部材（ａ）と、５０％である担体支持部材（ｂ）を、反応液を収容した中空ホルダーにそれぞれ挿入した結果を示す。

本発明において、生体関連分子には、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸、ペプチド、糖鎖及び細胞、これらの複合体、並びにこれらとその他の分子との複合体などが包含される。本発明において、ペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が包含される。担体に固定化される生体関連分子が、ペプチドである場合、通常１〜１０００ｋＤａ、好ましくは１〜２００ｋＤａのペプチドが好適である。また、担体に固定化される生体関連分子が核酸である場合、通常３〜５０００塩基、好ましくは１０〜１０００塩基の核酸が好適である。また、担体に固定化する生体関連分子が糖鎖である場合、通常１〜１００糖、好ましくは１〜３０糖の糖鎖が好適である。本発明において、生体関連分子は、好ましくは核酸、より好ましくはＤＮＡである。

生体関連分子の相互作用は、好ましくは生体関連分子間の特異的な相互作用をさし、例えば、タンパク質間の相互作用、タンパク質とペプチドの相互作用、核酸間の相互作用、タンパク質と核酸の相互作用、タンパク質と化合物との相互作用などが包含される。より具体的には、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーション、抗原と抗体又はその断片との反応、酵素と基質又は阻害剤の結合反応、リガンドとレセプターの結合反応、アビジンとビオチンの結合反応、核酸と転写因子の結合反応、細胞接着因子の結合反応、糖鎖とタンパク質の結合反応、脂肪鎖とタンパク質の結合反応、リン酸基とタンパク質の結合反応、補欠因子とタンパク質の結合反応などが挙げられる。

本発明は、生体関連分子が固定化された担体（マイクロアレイと称する場合もある）を用いた生体関連分子の相互作用の検出において、一端に開口部を有し他端が閉塞している中空ホルダーと、マイクロアレイが固定化されており中空ホルダーに挿入可能な担体支持部材とを有するユニットを用いることを特徴とし、反応液を収容している中空ホルダーに担体支持部材を挿入することにより、マイクロアレイと反応液とを接触させ、生体関連分子を相互作用させる。

一端に開口部を有し他端が閉塞している中空ホルダーは、反応液を収容できるものであれば特に制限されない。中空ホルダーは単独のものでもよいし、複数が連結されたものでもよい。中空ホルダーとしては、当技術分野で通常用いられるマイクロチューブやマイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート）などが挙げられる。中空ホルダーの寸法は、当業者であれば用途に応じ適宜設定できるが、例えば、開口部の直径が６〜１２ｍｍの範囲にあり、長さが１５〜３５ｍｍのチューブ状のものを使用できる。

中空ホルダーには反応液として、蛍光標識された生体関連分子を含む検体を収容させ、これに担体支持部材を挿入することにより、担体と反応液とを接触させ、担体上の生体関連分子と反応液中の蛍光標識された生体関連分子とを相互作用させる。反応液として核酸増幅産物を収容させてもよい。担体を洗浄することにより担体に固定化された生体関連分子と相互作用しなかった生体関連分子を除去する洗浄工程においては、中空ホルダーに洗浄液を収容し、相互作用後に担体支持部材をこれに挿入することにより、洗浄を行うこともできる。反応液として検体を収容した中空ホルダーと、反応液として洗浄液を収容した中空ホルダーを、それぞれ用いてもよい。

担体上の生体関連分子と反応液中の蛍光標識された生体関連分子とを相互作用させる相互作用工程においては、中空ホルダーを加熱することにより反応液を加熱することが好ましい。本発明では、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合することによって中空ホルダーが密閉されることから、反応液の蒸発を抑制するとともに効率的に加熱することができる。加熱の際に一部蒸発した反応液が、中空ホルダーを密閉している担体支持部材後端部において冷却されて液滴を形成する場合がある。従って、相互作用工程において、担体支持部材後端部も合わせて加熱することにより、液滴の形成を抑制し、微量な反応液が減少して反応液における生体関連分子の濃度が変化することを防止できる。相互作用工程における加熱温度は３０〜６０℃、好ましくは３５〜５５℃であり、担体支持部材後端部の加熱温度も同様である。

本発明では、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合することによって、担体支持部材と中空ホルダーとが位置決めされる。例えば、図１に示すように、担体支持部材１２の後端部１３と中空ホルダー１１の開口部のエッジ１５とが係合することによって、担体支持部材が中空ホルダー内において所定の位置に位置決めされるが（図１ａ）、担体支持部材１２の後端部１３と中空ホルダー１１の開口部のエッジ１５とが係合していないと、担体支持部材を中空ホルダーに挿入するたびに、中空ホルダー内における担体支持部材の位置が変わってしまい、所定の位置に位置決めすることができない（図１６）。

本発明では、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された上記位置決め姿勢で、中空ホルダーの軸心を含む面で切った断面図において、中空ホルダーの内側と担体が固定化された担体支持部材の外側とで画成される面積が、担体支持部材の担体固定部から先端部までの領域で、軸心の左右で略同一となるように、担体支持部材と中空ホルダーとが構成される。

例えば、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された上記位置決め姿勢で、中空ホルダーの軸心２１を含む面で切った断面図の一例を図２に示す。この断面図において、中空ホルダーの内側と担体が固定化された担体支持部材の外側とで画成される面積のうち担体支持部材の担体固定部から先端部２４までの領域の面積は、軸心の左側は２２で表される部分の面積であり、軸心の右側は２３で表される部分の面積である。この２２の面積と２３の面積が略同一となるように、担体支持部材と中空ホルダーとを構成することにより、左右の表面張力が等しくなり、反応液の液面が偏ることなく、担体１４と反応液を十分接触させることができる。図２ａでは２２の面積と２３の面積が略同一ではないため、反応液は点線のように偏ってしまう。一方、図２ｂでは２２の面積と２３の面積が略同一であるため、反応液は水性になる。略同一とは、相違が２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下であることを意味する。図２は、中空ホルダーの軸心２１を含む面で切った断面図のうち担体１４を切断するような断面図を示しており、従って中空ホルダーの軸心に対して左右対称ではないが、中空ホルダーの軸心に対して左右対称となる断面についても同様である。すなわち、中空ホルダーの軸心を含むいずれの断面でも上記左右の面積は略同一となる。

好ましい実施形態では、例えば図３に示すように、担体支持部材における担体固定部３１が底面３２と側面３３（３３ａと３３ｂ）とを有する凹部であり、担体１４が凹部の底面３２に配置されている。さらに好ましくは、担体支持部材凹部３１の少なくとも後端部１３側の側面３３ａは傾斜面である。担体支持部材凹部３１の先端部２４側の側面３３ｂも傾斜面であることが好ましい。後端部側の側面３３ａを傾斜面とすることにより、担体支持部材を中空ホルダー内の反応液に挿入するときに混入しうる気泡が上部に逃げやすくなる。また、この傾斜面の表面粗さを１０μｍ以下、好ましくは１μｍ以下とし、傾斜面と底面とのなす角度（図３の３４）を７５°以下、好ましくは４５°以下とすることにより、気泡がより逃げやすくなる。気泡がうまく逃げないと、担体と反応液との接触が阻害され、担体の一部で生体関連分子の相互作用が阻害される場合もあるが、気泡をうまく逃がす上記構成とすることにより、担体と反応液との良好な接触が達成できる。

担体支持部材には、凹部の先端部側の側面から先端部まで廃液溝が形成されていることが好ましい。例えば図４に示すように、凹部の先端部側の側面３３ｂから先端部２４まで廃液溝４１が形成されていることにより、中空ホルダー内の反応液から担体支持部材を引き上げたときに凹部に残留しうる反応液を、効率よく廃液することができる。担体支持部材を引き上げた後、担体支持部材の先端部２４をろ紙と接触させることにより、より効率的に廃液することができる。本発明では、生体関連分子の相互作用後に、担体に固定化された生体関連分子と相互作用しなかった生体関連分子を除去する洗浄工程において、潮解性の物質を含む洗浄液を用いることにより、担体を乾燥させることなくそのまま担体に励起光を照射し、検出器で蛍光を検出することができる。生体関連分子の相互作用及び洗浄では塩を含む溶液が使用されることから、担体を乾燥させると塩による乾燥ムラが発生し、乾燥ムラによる散乱光が強く、正確な検出が困難な場合がある。特に、結像光学系の検出器においては、乾燥ムラによる散乱光が強く、走査型検出器と比較して、正確な検出が非常に難しい場合があるが、潮解性物質を含む洗浄液を用いて乾燥させずに検出を行えば、乾燥ムラによる散乱光の発生を抑制できる。担体を乾燥させないで検出する態様においても、担体支持部材の凹部に液溜まりができてしまうと検出誤差が生じる可能性があるが、廃液溝を設けることにより、凹部に残留した余分な洗浄液をすみやかに廃液することができ、検出誤差を低減させることができる。

潮解性物質は、生体関連分子の相互作用を阻害しないものであれば、特に制限されないが、例えば、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、水酸化マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、炭酸カリウム、臭化ナトリウムなどのアルカリ金属塩などが挙げられる。洗浄液における潮解性物質の濃度は、通常０．０１〜３．０ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０５〜１．０ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは０．２〜０．５ｍｏｌ／ｌである。

本発明の好ましい態様では、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の担体固定部より先端部２４側の領域で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合は、６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０〜９５％である。例えば図５においては、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材１２の担体固定部より先端部側の領域（点線より下の領域）、即ち、担体固定部の先端部側末端で中空ホルダー１１の軸心と垂直な面で切った場合に、担体固定部を含まない側において中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が上記値となる。担体支持部材の担体固定部より先端部側を大きめに設計することで、中空ホルダーに担体支持部材を挿入したときに、中空ホルダーに収容された反応液が微量の場合にも、液面が上昇して担体と十分接触させることが可能になる。従って、操作の際の液量を少なくすることができる。

また、担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合は、好ましくは２５〜７０％、より好ましくは４０〜５０％である。担体支持部材の体積の割合を一定の値以下とすることで担体支持部材の挿入時に液体がこぼれるのを防ぐことができる。

本発明で用いるユニットは複数の担体支持部材と、それぞれの支持部材に対応した複数の中空ホルダーを有していてもよい。複数の担体支持部材にはそれぞれ担体が固定化されており、好ましくは担体支持部材の後端部がそれぞれ面材に固定されており、一体として動作することができる。それぞれの担体支持部材に対応した複数の中空ホルダーを有するとは、複数の中空ホルダーに担体支持部材がそれぞれ挿入されるよう構成されていることをさす。それぞれ担体が固定化された複数の担体支持部材と複数の中空ホルダーを用いることで、大量の試験を効率的に実施することが可能になる。

本発明の検出方法では、担体を洗浄することにより、担体に固定化された生体関連分子と相互作用しなかった生体関連分子を除去する洗浄工程の後、担体に励起光を照射し、検出器で蛍光を検出する検出工程を実施する。

本発明では、検出器として結像光学系の検出器を用いることが好ましい。結像光学系の検出器は、励起光を担体に照射し、得られる蛍光の強度を検出するものである。結像光学系の検出器は、通常、励起光を照射するためのレーザー、目的の波長の蛍光のみを透過させる蛍光フィルター、蛍光フィルターを透過した蛍光を検出するための光検出部（例えば、ＣＣＤカメラ）を有する。本発明では、通常、レーザーで一度に担体全体に斜めに励起光を照射し、担体の正面から蛍光を検出する。励起光を担体に対して斜めに照射するとは、担体表面とレーザー光のなす角度が、９０°未満であることをさし、通常、３０〜７０°、好ましくは４０〜６０°の角度で照射する。結像光学系の検出器では、担体の全面にレーザーを走査させる必要がなく、検出を短時間で実施することができる。一度に担体全体に励起光を照射するため、生体関連分子を固定化する担体としては、比較的サイズの小さいもの、例えば、寸法が１０ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以下、さらに好ましくは３ｍｍ以下の担体、最も好ましくは１〜５ｍｍ四方の担体を用いる。

生体関連分子を固定化する担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン及びそれらの化合物などの貴金属、及びグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。

本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、及びカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料と同様のものを使用できる。

本発明は、微細な平板状の構造を有する担体に対し好適に用いられる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層及び化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ（格子欠陥）が含まれているものも包含される。

基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や生体関連分子との結合における反応に耐えることができる点、生体関連分子と静電結合によって結合できるためその結合が柔軟性を持っている点において有利である。また、生体関連分子との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。

本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。

高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成してもよい。

アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。

レーザー蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザー（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。

基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。

カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、生体関連分子を担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基、金属キレート、及び活性エステル基が挙げられる。

アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することにより又はプラズマ処理することにより実施できる。又は、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。又は、メチレンジアミン、エチレンジアミン等の多価アミン類ガス中で、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。

カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ^１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^１は炭素数１０〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ^２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^２は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ^３−ＣＯ−Ｒ^４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ^４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。

エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。

ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。

ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。

活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。

活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開２００１−１３９５３２）。

ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸を固定化する場合は、アミノ基、エポキシ基、カルボジイミド基、ホルミル基又は活性エステル基を導入するのが好ましい。ポリペプチドを固定化する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレート又は活性エステル基を導入するのが好ましい。金属キレートを導入した担体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するポリペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。

本発明の担体に生体関連分子を固定化する方法は、特に制限されない。例えば、生体関連分子をバッファーに溶解して溶液を作成し、これに上記のような担体を浸漬することによって、担体表面に生体関連分子を固定化することができる。浸漬は、通常、０〜９８℃、好ましくは４℃〜５０℃で、通常、１分〜２４時間、好ましくは１０分〜１時間行う。この場合、一定時間浸漬した後、担体を洗浄することによって、固定化されていない生体関連分子を除去することができる。また、スポッターといわれる装置を使用することによって、多種類の生体関連分子を担体の表面に固定化できる。スポッターを用いる場合には、例えば、スポッターで生体関連分子溶液を担体上にスポットした後、加熱したオーブン中で一定時間ベーキングを行い、その後洗浄によって固定していない分子を除去する。スポッター装置を用いることにより他種類の生体関連分子を担体上の異なる位置に固定化できるため一度に多数の試験を実施することができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１
図１のａとｂに示す担体支持部材を反応液の入った中空ホルダーに挿入した。結果を図６のａとｂにそれぞれ示す。図６ａでは、担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合することにより担体支持部材が中空ホルダーの中央部に挿入されるよう位置決めされ、その結果、反応液の液面が水平となり担体と反応液が接触している。図６ｂでは、担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合していないため、担体支持部材が中空ホルダー内で右側に偏ったかたちで挿入されてしまい、その結果、表面張力によって反応液の液面が傾き、担体と反応液が接触していない部分が生じている。

実施例２
３ｍｍ角のシリコン基板にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で２層のＤＬＣ層の製膜を行った。

得られた表面にＤＬＣ層を有するシリコン基板上に、下記の条件でアンモニアプラズマを用いて、アミノ基を導入した。

１４０ｍＭ 無水コハク酸及び０．１Ｍ ホウ酸ナトリウムを含む１−メチル−２−ピロリドン溶液に３０分間浸漬し、カルボキシル基を導入した。０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー、０．１Ｍ １−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、２０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシイミドを含む溶液に３０分間浸漬し、活性化を行い、シリコン基板表面にＤＬＣ層及び化学修飾基としてのＮ−ヒドロキシスクシイミド基を有する担体を得た。

ＤＮＡプローブをＳｏｌ．６（東洋鋼鈑製）で１０μＭに溶解し、担体上にスポットした。８０℃で１時間、ベーキングを行い、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した後、超純水で洗浄し、遠心乾燥を行うことにより、担体にＤＮＡプローブを固定化した。上記プローブとハイブリダイズする領域をＰＣＲで増幅した。標識は、ＣｙＤｙｅを用いて行った。ＰＣＲ溶液の組成は以下のとおりとした。得られたＰＣＲ産物３０μｌを、ハイブリダイズ溶液（４×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液）３０μｌに溶かして試料を調製した。試料５０μｌを図７ｃに示す中空ホルダーに入れた。図７ａ及びｂに示す担体支持部材に、上記で得られたＤＮＡプローブを固定化した担体をそれぞれ固定化し、試料が入った中空ホルダーにそれぞれ挿入した。図７ａに示す担体支持部材は廃液溝を有するが、図７ｂに示す担体支持部材は廃液溝を有しない。担体支持部材を挿入後、５５℃で２分間反応させ、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１回、１Ｎ酢酸ナトリウム／０．５％ｔｗｅｅｎ２０で１回、１ＮＭｇＣｌ_２／０．５％ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄した。冷却ＣＣＤカメラを用い、蛍光フィルター（Ｃｙ５用、エドモンド社製）を介して、担体上の相互作用した生体関連分子の蛍光標識を検出した。φ５ｍｍのレーザー（６４０ｎｍ波長）を用いて、担体表面に対して５０°の角度で励起光を照射した。結果を図８に示す。

廃液溝を有する担体支持部材（図７ａ）を用いた場合には、担体固定部に液溜まりができず、良好に検出することができた（図８ａ）。一方、廃液溝を有しない担体支持部材（図７ｂ）を用いた場合には、一部液溜まりが観察された（図８ｂ）。

実施例３
中空ホルダーに挿入された姿勢で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が８０％である担体支持部材（図９ａ）と、５０％である担体支持部材（図９ｂ）を、反応液を収容した中空ホルダーにそれぞれ挿入した。図９ａの場合は、挿入時に気泡が生成したが、図９ｂの場合には、挿入時に気泡が生成せず反応液と担体の接触が良好であることがわかる。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

１１：中空ホルダー、１２：担体支持部材、１３：担体支持部材の後端部、１４：担体、１５：中空ホルダー開口部、２１：中空ホルダー軸心、２４：担体支持部材の先端部、３１：担体固定部、３２：担体固定部の底面、３３：担体固定部の側面（傾斜面）、３４：底面と側面（傾斜面）のなす角度、４１：廃液溝

Claims (6)

1. 生体関連分子が固定化された担体を用いた生体関連分子の相互作用の検出に使用するためのユニットであって、
   一端に開口部を有し他端が閉塞している中空ホルダーと、生体関連分子が固定化された担体が固定化されており中空ホルダーに挿入可能な担体支持部材とを有し、
   担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合することによって、中空ホルダーが密閉されるとともに担体支持部材と中空ホルダーとが位置決めされ、
   位置決め姿勢で中空ホルダーの軸心を含む面で切った断面図において、中空ホルダーの内側と担体が固定化された担体支持部材の外側とで画成される面積が、担体支持部材の担体固定部から先端部までの領域で、軸心の左右で略同一であり、
   担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の担体固定部より先端部側の領域で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が８０％以上であり、
   担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が２５〜７０％である、
   前記ユニット。
2. 担体支持部材における担体固定部が底面と側面とを有する凹部であり、担体が凹部の底面に配置されている、請求項１記載のユニット。
3. それぞれ担体が固定化された複数の担体支持部材を有し、担体支持部材の後端部がそれぞれ面材に固定されており、それぞれの支持部材に対応した複数の中空ホルダーを有する、請求項１又は２記載のユニット。
4. 生体関連分子が固定化された担体を用いて生体関連分子の相互作用を検出する方法であって、
   一端に開口部を有し他端が閉塞しており反応液を収容している中空ホルダーに、生体関連分子が固定化された担体が固定されている担体支持部材を挿入することによって、担体上の生体関連分子と反応液中の蛍光標識された生体関連分子とを相互作用させる相互作用工程、
   担体を洗浄することにより、担体に固定化された生体関連分子と相互作用しなかった生体関連分子を除去する洗浄工程、
   担体に励起光を照射し、検出器で蛍光を検出する検出工程
   を含み、
   担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の後端部と中空ホルダー開口部のエッジとが係合することによって、中空ホルダーが密閉されるとともに担体支持部材と中空ホルダーとが位置決めされ、
   前記位置決め姿勢で中空ホルダーの軸心を含む面で切った断面図において、中空ホルダーの内側と担体が固定化された担体支持部材の外側とで画成される面積が、担体支持部材の担体固定部から先端部までの領域で、軸心の左右で略同一であり、
   担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢において、担体支持部材の担体固定部より先端部側の領域で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が８０％以上であり、
   担体支持部材が中空ホルダーに挿入された姿勢で、中空ホルダーの容積に占める担体支持部材の体積の割合が２５〜７０％である、
   前記方法。
5. 担体支持部材における担体固定部が底面と側面とを有する凹部であり、担体が凹部の底面に配置されている、請求項４記載の方法。
6. それぞれ担体が固定化された複数の担体支持部材を有し、担体支持部材の後端部がそれぞれ面材に固定されており、それぞれの支持部材に対応した複数の中空ホルダーを有する、請求項４又は５記載の方法。

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