CN114653415A - 脱氧核糖核酸合成芯片及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脱氧核糖核酸合成芯片及其合成方法,脱氧核糖核酸合成芯片包括:本体，顶面开设有多个定位孔，所述定位孔的内侧面设有至少一个沿轴线延伸的缺口，所述定位孔沿轴线包括相连接的上端部及下端部，且所述上端部及所述下端部均开口，所述上端部的横截面宽度大于所述下端部的横截面宽度；以及多个固相载体，所述固相载体设于所述定位孔内，且所述固相载体的外侧面设有至少一个沿轴线延伸的切面，所述固相载体包括沿轴线的大头端及小头端，所述小头端容置于所述下端部，所述大头端容置于所述上端部，所述切面与所述缺口抵接。这种脱氧核糖核酸合成芯片能够使载体能够快速地正确装载，且操作精准、稳定。
Description
技术领域
本发明涉及生物合成的技术领域，特别是涉及脱氧核糖核酸合成芯片及其合成方法。
背景技术
合成生物学被认为是21世纪的颠覆性生物科技，DNA是合成生物学三大核心工具之一。
从1980年代初到现在，柱式合成技术一直是DNA合成的主流技术，合成产量通常在nmol-umol之间，通量在96-1536之间。但随着合成生物学的发展，对DNA合成的产量及通量提出了新的要求。大规模DNA合成新技术不断涌现，如光化学合成、电化学合成、喷墨合成,逐步满足了基因测序捕获探针，突变体库，基因合成等应用需求。这些新技术无论在长度和通量上都有长足进步，但单种DNA产量有限，通常在fmol级别，产量难以满足大片段基因合成的快速度，低成本，中高通量的合成需求。最适合基因合成的的产量通过在0.1pmol-10pmol间，而通量通常要求在1536以上。这一实际情况，为高通量，中等产量的快速DNA合成设备的开发提供了空间。
通过带漏斗状的微孔板进行合成上述DNA是一种巧妙的方案，其合成芯片是通过载体原料与芯片一起烧结，温度在140℃至200℃范围，烧结后得到所需要的含有合成载体的芯片，而后通过喷墨技术将亚磷酰胺化学合成所需的试剂打印到微孔中，以实现高通量，中等产量的DNA合成。这种合成芯片的结构，芯片载体安装的效果较差，安装的准确率较低，芯片载体与孔位无法形成快速、稳定、顺畅地安装，同时对芯片材料也有很大限制，比如pp等常规低熔点塑料无法使用。
发明内容
基于此，有必要针对合成载体无法快速精准安装的问题，提供一种能够使载体能够快速地正确装载，且操作精准、稳定的脱氧核糖核酸合成芯片及其合成方法。
一种脱氧核糖核酸合成芯片，包括：
本体，顶面开设有多个定位孔，所述定位孔的内侧面设有至少一个沿轴线延伸的缺口，所述定位孔沿轴线包括相连接的上端部及下端部，且所述上端部及所述下端部均开口，所述上端部的横截面宽度大于所述下端部的横截面宽度；以及
多个固相载体，所述固相载体设于所述定位孔内，且所述固相载体的外侧面设有至少一个沿轴线延伸的切面，所述固相载体包括沿轴线的大头端及小头端，所述小头端容置于所述下端部，所述大头端容置于所述上端部，所述切面与所述缺口抵接。
上述脱氧核糖核酸合成芯片，可以实现将固相载体的小头端快速置于本体的定位孔内，使得固相载体的小头端容置于本体的下端部，固相载体的大头端容置于本体的上端部，并且定位孔的缺口能够与固相载体的切面抵接，在配合安装时，能够快速地实现正确安装，对位操作更加精准、稳定。
在其中一个实施例中，所述缺口由所述上端部的内侧面延伸至所述下端部的内侧面形成。形成固相载体与定位孔整体的精准对位。
在其中一个实施例中，所述上端部包括相连接的第一基体及第二基体，所述第二基体与所述下端部连接，且所述第一基体的横截面宽度大于所述第二基体的横截面宽度。可以便于固相载体的小头端的快速置入，且上端部的这种结构还能起到快速导向的作用。
在其中一个实施例中，所述第一基体的横截面宽度由与所述第二基体连接的一端向另一端逐渐变宽；所述第二基体的横截面宽度由与所述下端部连接的一端向另一端逐渐变宽。
在其中一个实施例中，所述第一基体及所述第二基体呈圆台状。
在其中一个实施例中，所述下端部包括相连接的第三基体及第四基体，所述第三基体与所述上端部连接，所述第三基体的横截面宽度大于所述第四基体的横截面宽度。可以实现固相载体的小头端置入时，形成类似于滑动定位，并且定位的一致性较强，能够保证定位的精准度。
在其中一个实施例中，所述第三基体的横截面宽度由与所述第四基体连接的一端向另一端逐渐变宽。
在其中一个实施例中，所述第三基体呈圆台状，所述第四基体呈圆柱状。
本发明还提出了一种如上所述的脱氧核糖核酸合成芯片的合成方法，包括以下步骤：
S1.取玻璃或者塑料微球与树脂材料，按照比例混合均匀；
S2.将S1所得的混合材料置于模具内密封，并加热至180℃至250℃，反应25分钟至35分钟，冷却后得到所述固相载体；
S3.注塑形成所述本体；
S4.将所述本体上铺满所述固相载体，并通过振动使得所述固相载体装入所述本体的定位孔内，且去除多余未装载的固相载体；
S5.通过离心机将本体进行离心操作，使得所述固相载体更加深入地装入所述定位孔内，完成芯片的合成。
玻璃或者塑料微球与树脂材料的质量配比可以是1:1、1:2、1:3、1:4，或者相反比例的其他比例，此处不作限制。
本发明的合成方法，通过预制固相载体，后安装于本体的定位孔的方法，解决了烧结温度过高的限制，可使用常规的PP聚丙烯等塑料材料制作芯片，大大降低芯片制作成本。并且，固相载体置入本体的定位孔时，能够确保固相载体与本体的正确装配与稳定性，使得固相载体与本体的定位孔快速地紧密结合。通过震动及离心操作，可以实现固相载体与本体快速自动化装配，减少人为干预带来的污染及误操作。
在其中一个实施例中，包括以下技术方案中的至少一个：
所述玻璃或者塑料微球为CPG微孔玻璃微球、PS聚苯乙烯微球、修饰有连接基团的CPG微孔玻璃微球或者修饰有连接基团的PS聚苯乙烯微球；
树脂材料为HMHDPE高分子量的高密度聚乙烯、HDPE高密度聚乙烯或者PS聚苯乙烯；
所述本体采用PS聚苯乙烯、PP聚丙烯、PC聚碳酸酯、COC环状烯烃共聚物、HDPE高密度聚乙烯或者HMHDPE高分子量的高密度聚乙烯注塑而成；
所述固相载体与所述本体的定位孔的数量比例大于或等于3:1。
附图说明
图1为本发明的脱氧核糖核酸合成芯片实施例一的结构示意图；
图2为本发明的脱氧核糖核酸合成芯片实施例二的结构示意图；
图3为本发明的本体实施例一的结构示意图；
图4为本发明的本体实施例二的结构示意图；
图5为本发明的固相载体实施例一的结构示意图；
图6为本发明的固相载体与本体的安装结构示意图一；
图7为本发明的固相载体与本体的安装结构示意图二；
图8为本发明的本体实施例三的结构示意图；
图9为本发明的合成芯片的制作流程图；
图10为本发明的芯片系统用于DNA合成的流程图；
图11为合成后DNA的毛细管电泳测试图；
图12为合成的一条120bpDNA的Sanger测序图一；
图13为合成的一条120bpDNA的Sanger测序图二。
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
100、脱氧核糖核酸合成芯片；1、本体；11、定位孔；111、缺口；112、第一基体；113、第二基体；114、第三基体；115、第四基体；2、固相载体；21、大头端；22、小头端；23、切面。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做清楚、完整的描述。显然，以下描述的具体细节只是本发明的一部分实施例，本发明还能够以很多不同于在此描述的其他实施例来实现。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例，均属于本发明的保护范围。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
请参阅图1至图6，在一实施例中，一种脱氧核糖核酸合成芯片100包括：本体1以及多个固相载体2，多个固相载体2装入本体1上。具体地，本体1的顶面开设有多个定位孔11，定位孔11的内侧面设有至少一个沿轴线延伸的缺口111。定位孔11沿轴线包括相连接的上端部及下端部，且上端部及下端部均开口，上端部的横截面宽度大于下端部的横截面宽度。每个定位孔11内均安装一个固相载体2，且固相载体2的外侧面设有至少一个沿轴线延伸的切面23。固相载体2包括沿轴线的大头端21及小头端22，小头端22容置于下端部，大头端21容置于上端部，切面23与缺口111抵接。
该脱氧核糖核酸合成芯片100，可以实现将固相载体2的小头端22快速置于本体1的定位孔11内，使得固相载体2的小头端22容置于本体1的下端部，固相载体2的大头端21容置于本体1的上端部，并且定位孔11的缺口111能够与固相载体2的切面23抵接，在配合安装时，能够快速地实现正确安装，对位操作更加精准、稳定。本发明中，芯片结构具有特殊设计，载体的装载更加快速、稳定，且摆脱了烧结温度对芯片本体材料的限制，固相载体2与本体1安装后，不需要过高温度的烧结即可合成芯片，这就使得本体1能够使用常规的PP聚丙烯等材料制作，大大降低了芯片的制作成本。
请参阅图1及图3，可以理解的是，多个定位孔11可以呈线性阵列排布设于本体1的顶面上。定位孔11的上端部的横截面宽度略大于固相载体2的大头端21的横截面宽度，定位孔11的下端部的横截面宽度略大于固相载体2的小头端22的横截面宽度，保证安装配合更加顺畅。通过这种对固相载体2及定位孔11的结构优化设计，可有效防止对芯片进行反应操作时，试剂飞溅，增加溶剂使用量，提高了固相载体2的装载效率、准确率，以及装载后的稳定性。
请参阅图3及图4，在缺口111的一实施方式中，缺口111由上端部的内侧面延伸至下端部的内侧面形成，可以形成固相载体2与定位孔11整体的精准对位。
请参阅图3及图7，在另外的实施例中，定位孔11的上端部包括相连接的第一基体112及第二基体113，第二基体113与下端部连接，且第一基体112的横截面宽度大于第二基体113的横截面宽度。可以便于固相载体2的小头端22的快速置入，且上端部的这种结构还能起到快速导向的作用。
请参阅图7及图8，进一步地，第一基体112顶部的横截面宽度由与第二基体113连接的一端向另一端逐渐变宽，第二基体113的横截面宽度由与下端部连接的一端向另一端逐渐变宽。能够让固相载体2更好的进入定位孔11内，同时起到限制液体溅射和提供更大液体载量的作用，第一基体112最上边的开口直径为2mm～3mm，开口角度为60°～90°，有利于固相载体2的小头端22进入定位孔11内。第一基体112及第二基体113可以呈圆台状。第二基体113可以保证固相载体2的确定装载，限制非正确体位的固相载体2进入，第二基体113最上边的开口直径1.8mm～2.8mm，开口角度为6°～10°，有利于固相载体2更好进入定位孔11中。
请参阅图3及图7，在另外的实施例中，定位孔11的下端部包括相连接的第三基体114及第四基体115，第三基体114与上端部连接，第三基体114的横截面宽度大于第四基体115的横截面宽度。可以实现固相载体2的小头端22置入时，形成类似于滑动定位，并且定位的一致性较强，能够保证定位的精准度。
请参阅图7及图8，进一步地，第三基体114的横截面宽度由与第四基体115连接的一端向另一端逐渐变宽。第三基体114可以呈圆台状，第四基体115可以呈圆柱状。第三基体114的结构能够起到导流作用，有利于使得液体顺利汇集到第四基体115的底端排出，第三基体114最上边的开口直径1.6mm～2.6mm，斜度30°～45°，有利于液体的流动。第四基体115的结构对固相载体2起到一定的固定作用，同时也利于液体的排出，圆柱孔直径0.05mm～0.1mm。
需要说明的是，本体1的定位孔11形状还可以是各种圆柱状、圆锥状、椭球状、三角锥状、四角锥状、漏斗状等单独结构或任意组合，可以达到同样效果。固相载体2的大头端21的形状及尺寸与第一基体112及第二基体113对应，固相载体2的小头端22的形状及尺寸与第三基体114及第四基体115对应。
请参阅图9，本发明还公开了一种脱氧核糖核酸合成芯片100的合成方法，在实施例一中，包括以下步骤：
S1制备固相载体2：
1、称取带有连接基团修饰的CPG微孔玻璃微球(载量20umol/g)与HDPE粉末(分子量300万)，按照质量比1：1，在离心管中震荡混合均匀。
2、将上述混合物均匀添加到铝制模具内，在振动装置上振平，并密封。
3、将密封有混合物的铝模放在烘箱内，加热到190度，反应28分钟，冷却后，取出。
4、用干净的心管，收集预制好的固相载体2，氮气下保存，备用。
S2制作芯片本体1：
用CAD画图软件构建好芯片本体1的微孔结构图后，按照图纸通过注塑的方式制作了PP塑料本体1(本实施例中微孔结构为上述本体1的定位孔11)；
S3合成芯片的装配：
1、将芯片本体1水平放置的定制的振动平台上，在本体1上铺满一层预备的固相载体2，保证固相载体2与孔的数量比例在3：1以上。
2、以中速方式振动1分钟后，再以低速度方式振动3分钟，然后，拿出本体1，用刷子刷掉多余载体。
3、将带有载体的本体1，在孔板离心机上以3000转/分钟的速度，离心1分钟，压实后得到装配好的脱氧核糖核酸合成芯片100。
实施例二：
S1制备固相载体2：
1、称取PS聚苯乙烯微球(载量30umol/g)与PS聚苯乙烯(分子量200万)，按照质量比1：3，在离心管中震荡混合均匀。
2、将上述混合物均匀添加到铝制模具内，在振动装置上振平，并密封。
3、将密封有混合物的铝模放在烘箱内，加热到230度，反应32分钟，冷却后，取出。
4、用干净的心管，收集预制好的固相载体2，氮气下保存，备用。
S2制作芯片本体1：
用CAD画图软件构建好芯片本体1的微孔结构图后，按照图纸通过注塑的方式制作了PS聚苯乙烯本体1(本实施例中微孔结构为上述本体1的定位孔11)；
S3合成芯片的装配：
1、将芯片本体1水平放置的定制的振动平台上，在本体1上铺满一层预备的固相载体2，保证固相载体2与孔的数量比例在3：1以上。
2、以中速方式振动2分钟后，再以低速度方式振动4分钟，然后，拿出本体1，用刷子刷掉多余载体。
3、将带有载体的本体1，在孔板离心机上以3500转/分钟的速度，离心2分钟，压实后得到装配好的脱氧核糖核酸合成芯片100。
本发明的合成方法，通过预制固相载体2，后安装于本体1的定位孔11的方法，解决了烧结温度过高的限制，可使用常规的pp等塑料材料制作芯片，大大降低芯片制作成本。并且，固相载体2置入本体1的定位孔11时，能够确保固相载体2与本体1的正确装配与稳定性，使得固相载体2与本体1的定位孔11快速地紧密结合。
请参阅图10，本发明还公开了芯片系统用于DNA合成，具体实验操作如下：
1、DNA合成：采用标准的亚磷酰胺化学,通过喷墨或自动化移液装置将修饰碱基，催化剂，脱保护试剂，加帽试剂，氧化试剂，清洗试剂等分别加入到芯片上对应定位孔11中，以实现高通量的DNA合成。
具体的主要合成流程如下表格：
注：每一步反应后均有清洗过程，为方便阅读，此处均省略。
请参阅图11、图12及图13，为验证此芯片的基础合成能力，我们在每一个微孔内合成了同一种120nt的DNA，如此合成的DNA产量较大，可直接经简单纯化，在Qsep100设备上进行质控。
120ntDNA合成序列(从5到3端)：ATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCACGTAGTCAGAGTATATGACTCTACGTGAGCACTAGTCAGAGTATATGACTCTACGTGAGCACGATGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATC
2、产品收集：合成后的芯片，放置在气相氨解设备中，在0.5Mpa氨气下室温氨解2小时，在每个微孔中加入适当的纯水后，在特制设备中，通过芯片上下压力差，将含有DNA产品的水溶液收集在离心管中。
3、产品质控：将离心管中的DNA水溶液，经浓缩和纯化后,取少量溶液与标准Marker一起在Qsep100测试。
4、序列验证：外送DNA，构建载体，挑选20个单克隆进行Sanger测序，其中18个单克隆测得序列与目标测序一致，只有2个克隆中各有一个碱基错误，初步计算得到此次合成错误率为一千二百分之一。
测得的序列示例：
该单克隆去载体序列前60位核苷酸序列
ATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCACGTAGTCAGAGTATATGACTCTACGTGAGCAC
该单克隆去载体序列后60位核苷酸序列
TAGTCAGAGTATATGACTCTACGTGAGCACGATGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATC
由此可见，本发明DNA合成芯片能够准确的合成目标核苷酸片段。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、替换及改进，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (10)
1.一种脱氧核糖核酸合成芯片，其特征在于，包括：
本体，顶面开设有多个定位孔，所述定位孔的内侧面设有至少一个沿轴线延伸的缺口，所述定位孔沿轴线包括相连接的上端部及下端部，且所述上端部及所述下端部均开口，所述上端部的横截面宽度大于所述下端部的横截面宽度；以及
多个固相载体，所述固相载体设于所述定位孔内，且所述固相载体的外侧面设有至少一个沿轴线延伸的切面，所述固相载体包括沿轴线的大头端及小头端，所述小头端容置于所述下端部，所述大头端容置于所述上端部，所述切面与所述缺口抵接。
2.根据权利要求1所述的脱氧核糖核酸合成芯片，其特征在于，所述缺口由所述上端部的内侧面延伸至所述下端部的内侧面形成。
3.根据权利要求1所述的脱氧核糖核酸合成芯片，其特征在于，所述上端部包括相连接的第一基体及第二基体，所述第二基体与所述下端部连接，且所述第一基体的横截面宽度大于所述第二基体的横截面宽度。
4.根据权利要求3所述的脱氧核糖核酸合成芯片，其特征在于，所述第一基体的横截面宽度由与所述第二基体连接的一端向另一端逐渐变宽；所述第二基体的横截面宽度由与所述下端部连接的一端向另一端逐渐变宽。
5.根据权利要求4所述的脱氧核糖核酸合成芯片，其特征在于，所述第一基体及所述第二基体呈圆台状。
6.根据权利要求1所述的脱氧核糖核酸合成芯片，其特征在于，所述下端部包括相连接的第三基体及第四基体，所述第三基体与所述上端部连接，所述第三基体的横截面宽度大于所述第四基体的横截面宽度。
7.根据权利要求6所述的脱氧核糖核酸合成芯片，其特征在于，所述第三基体的横截面宽度由与所述第四基体连接的一端向另一端逐渐变宽。
8.根据权利要求7所述的脱氧核糖核酸合成芯片，其特征在于，所述第三基体呈圆台状，所述第四基体呈圆柱状。
9.一种如权利要求1至8中任一项所述的脱氧核糖核酸合成芯片的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取玻璃或者塑料微球与树脂材料，按照比例混合均匀；
S2.将S1所得的混合材料置于模具内密封，并加热至180℃至250℃，反应25分钟至35分钟，冷却后得到所述固相载体；
S3.注塑形成所述本体；
S4.将所述本体上铺满所述固相载体，并通过振动使得所述固相载体装入所述本体的定位孔内，且去除多余未装载的固相载体；
S5.通过离心机将本体进行离心操作，使得所述固相载体更加深入地装入所述定位孔内，完成芯片的合成。
10.根据权利要求9所述的合成方法，其特征在于，包括以下技术方案中的至少一个：
所述玻璃或者塑料微球为CPG微孔玻璃微球、PS聚苯乙烯微球、修饰有连接基团的CPG微孔玻璃微球或者修饰有连接基团的PS聚苯乙烯微球；
树脂材料为HMHDPE高分子量的高密度聚乙烯、HDPE高密度聚乙烯或者PS聚苯乙烯；
所述本体采用PS聚苯乙烯、PP聚丙烯、PC聚碳酸酯、COC环状烯烃共聚物、HDPE高密度聚乙烯或者HMHDPE高分子量的高密度聚乙烯注塑而成；
所述固相载体与所述本体的定位孔的数量比例大于或等于3:1。
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