JP4569420B2 - 検体反応装置及び標的分子検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡやペプチドに結合するプローブをチップ上に固定したＤＮＡマイクロアレイやペプチドアレイなどを用いて生体試料中に含まれる標的核酸分子やペプチドなどの複数種類の標的分子を検出する検体反応装置及び標的分子検出装置に関する。

生体試料中の分子マーカーとして特定の抗原、抗体、ＤＮＡやＲＮＡなどの標的分子を検出するために、これらの抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡと特異的に結合するプローブを用いた結合反応が利用されている。生体試料中の分子マーカーを検出し定量することで病気の診断やバイオリアクターの活性モニタリングを行う事ができる。

分子マーカーと結合するプローブをスポット状にして基盤表面上に固定化した検出チップを用い、検出チップ上に生体試料を反応させることで分子マーカーを基盤表面上に補足し、補足された分子マーカーを電気化学的あるいは光学的に検出することができる。また、基板表面上に複数種類のプローブをマトリックス上に配置することによって、複数種類の分子マーカーを同時に検出することができる。

特に標的核酸分子とハイブリット形成するｃＤＮＡやオリゴＤＮＡがマトリックス状に固定化されたＤＮＡマイクロアレイの利用が活発になってきている。

ＤＮＡマイクロアレイ上には数千から数万種のＤＮＡプローブがスポットとしてマトリックス状に固定化されており、それぞれのＤＮＡプローブに結合するＤＮＡやＲＮＡを蛍光染色し光学的に検出することで同時に多種類のＤＮＡやＲＮＡを検出する事ができる。

ＤＮＡマイクロアレイに固定化されているＤＮＡプローブは、半導体のホトリソグラフィー技術を利用して基板上で１塩基ずつ光重合させる方法や、予め数十〜数百塩基の長さに合成されたＤＮＡ分子の溶解した液滴を基板上にスポッティングすることによって吸着させて固定化する方法がとられる。

核酸分子を検出する方法として、標的核酸分子と相補的塩基対を形成するプローブ核酸を基板やメンブレン表面に固定化し、予め蛍光分子やＲＩなどの標識分子で標識した標的核酸分子をプローブとハイブリダイゼーションさせ、基板表面に標識分子が結合したかどうかを蛍光検出器等で検出する方法が利用される。

標的核酸分子に標識分子を標識する方法としては、生体試料から抽出されたＤＮＡ分子に酵素反応などを利用して直接蛍光分子を標識する方法や、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成しＰＣＲで増幅する際に蛍光分子を取り込ませる方法が用いられている。

このような生体分子の検出方法は、プローブを固定化した基盤表面上に様々な溶液を順次反応させる必要があり、溶液中の生体分子と固相面上のプローブとの反応効率は両者とも溶液中にある場合の反応効率に比べ悪いため、検出感度が悪く、また、検出工程が多く反応が煩雑であった。

このような生体分子検出方法において、マイクロアレイの取り扱いを容易化する方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。

以下、そのようなプローブを固定化したマイクロアレイを用いた分析方法に関して図１３を参照しながら説明する。

図１３のように、プローブ１０１がメンブレン上にマトリックス状に配置されマイクロアレイ１０２となっている。マイクロアレイ１０２の周縁は枠状の支持具１０３によって支持され、マイクロアレイ１０２を用いた分析方法の実施中、この状態が維持される。周縁が支持具１０３で支持されたマイクロアレイ１０２は上容器１０４と下容器１０５とが組み合わされて形成されるハイブリダイゼーション容器内に収容されて、注入口１０６から標識物質で標識付けられた検体を含有する溶液が注入され、マイクロアレイ１０２が溶液に浸漬され、ハイブリダイゼーション工程が実行される。同様にして洗浄されたマイクロアレイ１０２はハイブリダイゼーション容器から取り出され、乾燥され、マイクロアレイ１０２上に結合した検体が光学顕微鏡や蛍光スキャナーによって検出され、検体中に生体分子が存在することが検知される。このようにマイクロアレイ１０２は周縁が支持された状態で工程が実施されるので、本来扱いにくいマイクロアレイ１０２を容易に扱うことができるようになる。
特開２００１−８３１５８号公報

このような従来の検出方法では、検体を検体保持部に保持して反応を行う際、時間経過に伴い生じる検体量の変化によって標的分子結合素子固定部表面が乾燥したり検体が検体保持部からこぼれたりすることで、非特異的な反応が生じたり検出感度が低化し検出精度が低下するという課題があり、検体反応中に検体量が変化しても、検体の減少量を簡単にモニタリングできる検体反応装置が要求されている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、検体反応中に検体量が変化しても、検体量の変化を簡単にモニタリングできる検体反応装置および標的分子検出装置を提供することを目的としている。

また、このような従来の検出方法では、検体を検体保持部に保持して反応を行う際、検体を載せる位置が標的分子結合素子が固定化されている位置とずれているかどうか判別しにくいという課題があり、検体を載せている位置が標的分子結合素子の固定化されている位置に対してどの位置にあるか簡単にモニタリングできる検体反応装置が要求されている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、検体を載せている位置が標的分子結合素子の固定化されている位置に対してどの位置にあるか簡単にモニタリングできる検体反応装置及び標的分子検出装置を提供することを目的としている。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、標的分子と結合する一種類以上の標的分子結合素子が固定化された標的分子結合素子固定部と、前記標的分子結合素子固定部上に前記標的分子を含んだ検体を保持する検体保持部と、前記検体保持部の蓋部とを備え、前記検体保持部あるいは前記蓋部に検体蒸発限度表示手段を備えることを特徴とする検体反応装置としたものである。

この手段により、検体反応中に検体が蒸発し検体量が減少しても検体の減少量を簡単にモニタリングできるので、検体が蒸発することによる検出精度の悪化を防止できる検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子固定部上に前記標的分子が固定化されている領域を表示する標的分子結合素子固定領域表示手段を備えることを特徴とする請求項１記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、検体が標的分子結合素子固定部上の標的分子結合素子が固定化されている領域に保持されているかモニタリングすることができ、検体が標的分子結合素子が固定化されている領域からずれることによる検出精度の悪化を防止できる検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子が炭素骨格を有する有機分子であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、有機分子と結合する検体中の標的分子も精度良く反応させることのできる検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子が有機金属錯体であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、有機金属錯体と結合する検体中の標的分子も精度良く反応させることのできる検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子が核酸であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、核酸と結合する検体中の標的分子も精度良く反応させることのできる検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子がタンパク質あるいはペプチドであることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、タンパク質あるいはペプチドと結合する検体中の標的分子も精度良く反応させることのできる検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子が糖質であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、糖質と結合する検体中の標的分子も精度良く反応させることのできる検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子が脂質であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、脂質と結合する検体中の標的分子も精度良く反応させることのできる検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は、上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子固定部に金属を蒸着してあること特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、標的分子結合素子固定部表面のノイズが低下した検出精度が高い検体反応装置となる。

本発明の検体反応装置は上記目的を達成するために、前記標的分子結合素子固定部にスポット状に金属が蒸着されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の検体反応装置としたものである。

この手段により、標的分子結合素子が精度良く固定化されていて、さらに標的分子結合素子固定部表面のノイズが低下した検出精度の高い検知反応装置となる。

本発明の標的分子検出装置は、上記目的を達成するために、請求項１乃至１０のいずれかに記載の検体反応装置を固定する検体反応装置固定手段と、前記標的分子結合素子固定部に光を照射する光照射手段と、前記標的分子結合素子固定部から反射する反射光を受光する受光手段と、前記標的分子結合素子固定部と前記受光手段の間に配置された集光レンズとを備えたことを特徴とする標的分子検出装置としたものである。

この手段により、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、標的分子を効率良く反応させた検体反応装置を簡単に検出することのできる検出装置となる。

本発明によれば、検体反応中に検体量が変化しても、検体の減少量を簡単にモニタリングできる検体反応装置及び標的分子検出装置が提供できる。

また、検体が載っている位置が標的分子結合素子の固定化されている位置に対してどの位置にあるか簡単にモニタリングできる検体反応装置及び標的分子検出装置が提供できる。

本発明の請求項１記載の発明は、標的分子と結合する一種類以上の標的分子結合素子が固定化された標的分子結合素子固定部と、前記標的分子結合素子固定部上に前記標的分子を含んだ検体を保持する検体保持部と、前記検体保持部の蓋部とを備え、前記検体保持部あるいは前記蓋部に検体蒸発限度表示手段を備えることを特徴とする検体反応装置としたものであり、検体を標的分子結合素子固定部上に反応させる際に、反応時間の経過と共に検体量が蒸発により減少しても、検体蒸発限度表示手段の示す限度量よりも検体量が多いかどうかを比較することによって、検体反応が悪影響を受ける限度量よりも検体が減少しているかどうか容易にモニタリングすることができ、検体反応が精度良く行われているかどうかが容易に判断できるようになるという作用を有する。

本発明の請求項２記載の発明は、前記標的分子結合素子固定部上に前記標的分子が固定化されている領域を表示する標的分子結合素子固定領域表示手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の検体反応装置としたものであり、検体保持部に検体を入れ蓋部を載せることで検体を保持し反応させる際に、標的分子結合素子固定部に表示されている標的分子結合素子固定領域表示手段によって、検体反応させる検体の標的分子結合素子固定部上における位置をモニタリングすることができるため、検体が標的分子結合素子が固定化されている領域からずれることによる検出精度の悪化を防止できるという作用を有する。

本発明の請求項３記載の発明は、前記標的分子結合素子が炭素骨格を有する有機分子であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものであり、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、検体中に含まれる有機分子に結合する標的分子が標的分子結合素子に結合し、検体中に含まれる有機分子に結合する標的分子が選択的に結合することによって精度良く反応させることができるという作用を有する。

本発明の請求項４記載の発明は、前記標的分子結合素子が有機金属錯体であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものであり、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、検体中に含まれる有機金属錯体に結合する標的分子が標的分子結合素子に結合し、検体中に含まれる有機金属錯体に結合する標的分子が選択的に結合することによって精度良く反応させることができるという作用を有する。

本発明の請求項５記載の発明は、前記標的分子結合素子が核酸であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものであり、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、検体中に含まれる核酸に結合する標的分子が標的分子結合素子に結合し、検体中に含まれる核酸に結合する標的分子が選択的に結合することによって精度良く反応させることができるという作用を有する。

本発明の請求項６記載の発明は、前記標的分子結合素子がタンパク質あるいはペプチドであることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものであり、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、検体中に含まれるタンパク質あるいはペプチドに結合する標的分子が標的分子結合素子に結合し、検体中に含まれる有機分子に結合する標的分子が選択的に結合することによって精度良く反応させることができるという作用を有する。

本発明の請求項７記載の発明は、前記標的分子結合素子が糖質であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものであり、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、検体中に含まれる糖質に結合する標的分子が標的分子結合素子に結合し、検体中に含まれる糖質に結合する標的分子が選択的に結合することによって精度良く反応させることができるという作用を有する。

本発明の請求項８記載の発明は、前記標的分子結合素子が脂質であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置としたものであり、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、検体中に含まれる脂質に結合する標的分子が標的分子結合素子に結合し、検体中に含まれる脂質に結合する標的分子が選択的に結合することによって精度良く反応させることができるという作用を有する。

本発明の請求項９記載の発明は、前記標的分子結合素子固定部に金属を蒸着してあること特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の検体反応装置としたものであり、検体中の標的分子を標的分子結合素子に結合させた後、標的分子を光学的に検出する際、標的分子結合素子固定部上に蒸着された金属が光の乱反射を抑えることによって光学的ノイズの少ない検出を行うことのできるという作用を有する。

本発明の請求項１０記載の発明は、前記標的分子結合素子固定部にスポット状に金属が蒸着されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の検体反応装置としたものであり、金属が蒸着されたスポットに標的分子結合素子を固定化することによって、精度良く標的分子結合素子を固定化することができ、検出感度が安定する検体反応装置ができるという作用を有する。また、検体中の標的分子を標的分子結合素子に結合させた後、標的分子を光学的に検出する際、標的分子結合素子が固定化されているスポット状に蒸着された金属が光の乱反射を抑えることによって光学的ノイズの少ない検出を行うことのできるという作用を有する。

本発明の請求項１１記載の発明は、請求項１乃至１０のいずれかに記載の検体反応装置を固定する検体反応装置固定手段と、前記標的分子結合素子固定部に光を照射する光照射手段と、前記標的分子結合素子固定部から反射する反射光を受光する受光手段と、前記標的分子結合素子固定部と前記受光手段の間に配置された集光レンズとを備えたことを特徴とする標的分子検出装置としたものであり、検体反応中に検体量が変化しても検体量が変化することによる検出精度の悪化を防止でき、検体中に含まれる標的分子を精度良く反応させた検体反応装置を簡単にセットし、光学的に検出することができる検出装置ができるという作用を有する。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。

（実施の形態１）
図１（Ａ）は本発明の請求項１に記載の検体反応装置１を示した図である。図１（Ｃ）〜（Ｆ）は検体反応装置１を上面図で示した図である。

図１（Ａ）が示すように検体反応装置１は標的分子結合素子２を固定化した標的分子結合素子固定部３と、円形支持部４と、標的分子５を含有する検体６を保持する検体保持手段７と検体保持手段７内の検体６を濾過するためのピストン部８と、標的分子結合素子固定部３と相似形をした蓋部９から構成されている。標的分子結合素子２と円形支持部４は一体化するように形成され円形支持部４は標的分子結合素子固定部３がずれたり外れたりしないように固定している。標的分子結合素子固定部３としては例えばナイロンメンブレンやフッ化ビニリデン樹脂メンブレンに０．２〜０．８μｍの大きさの穴が開けられたフィルターメンブレンが使用される。フィルターメンブレンにある穴の密度は特に限定されないが通常１５％前後の開孔率のものが使用される。ピストン部８としては、例えばゴムで構成されており、検体保持手段７と同径の平らな面を持っており、検体保持手段７に装着される。検体保持手段７は、例えば金、鉄、銅、アルミなどの金属や塩化ビニル、フェノール樹脂、ジアリルフタレート樹脂、不飽和ポリエステル樹脂などの樹脂で形成された円筒形の容器であり、標的分子結合素子固定部３を底面として円形支持部４に装着される。なお、熱可塑性の無い耐熱性の材料であれば上記以外の材料で形成することもできる。また、検体保持手段７に例えば０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳで１０〜６０分浸漬し親水性処理を施し、検体６が非特異的に結合しにくくすることができる。また、検体保持手段７の容量としては、例えば、直径０．５ｍｍ〜３０ｍｍの真円の標的分子結合素子固定部３に対して高さが１０ｍｍ〜５０ｍｍの円筒形をした検体保持手段７が円形支持部４に装着される。

標的分子結合素子固定部３の上には標的分子結合素子２がそれぞれ独立した領域に固定化されている。標的分子結合素子２としては例えば生体中の特定の塩基配列を持った核酸を検出するための相補的塩基配列を有した核酸プローブが用いられ、合成された一本鎖核酸プローブやｃＤＮＡを溶解した核酸溶液をフィルターメンブレンに滴下し乾燥させ物理吸着させる方法や、フィルターメンブレン上にアミノ基やカルボキシル基などの官能基を導入し、一本鎖核酸やｃＤＮＡとカップリング反応させる方法や、光重合反応を利用してフィルターメンブレン上で一本鎖核酸プローブを合成する方法によって固定化される。例えば特定の細菌を検出するために、細菌のゲノム情報を元に細菌ゲノムに対する相補的な塩基配列を一本鎖核酸プローブとすることで試料中の細菌を検出することができる。例えばＶＯＣ分解菌であるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒを検出するためにＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５ＲのゲノムのＩＴＳ領域を含む数十〜数百の塩基配列を一本鎖核酸プローブとして利用し、土壌、河川水などのサンプルあるいは、培養液中から抽出した核酸を一本鎖核酸プローブとフィルターメンブレン上でハイブリダイゼーションさせることによって標的となるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒゲノム由来の核酸を検体反応装置１に補足し、補足された核酸を検出することによってサンプル中のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒの存在を検出することができる。また、同一サンプル中に含まれる複数種類の核酸分子を同時に検出するために、複数種類の核酸分子に対して相補的な塩基配列を有した複数種類の一本鎖核酸プローブをフィルターメンブレン上にそれぞれ独立した領域に固定化することができる。例えば、同時にＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５ＲとＤｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒとＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを検出する場合に、それぞれＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５ＲとＤｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒとＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノムのＩＴＳ領域を含む数十〜数百の塩基配列を一本鎖核酸プローブとして独立した領域に固定化し、土壌、河川水などのサンプルあるいは、培養液中から抽出した核酸を一本鎖核酸プローブとフィルターメンブレン上でハイブリダイゼーションさせることによって標的となるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５ＲとＤｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒとＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノム由来の核酸を検体反応装置１に補足し、補足された核酸を検出することによってサンプル中のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５ＲとＤｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒとＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの存在を検出することができる。独立した領域とは円形や四角形に規定された一つの領域を指し、互いに結合していない二次元平面状に分布した領域であって、例えば円形スポットが数十〜数百個並んだＤＮＡマイクロアレイが利用されている。ＤＮＡマイクロアレイの場合数十μｍ〜数百μｍの直径を有する円形スポットが数十μｍ〜数百μｍの間隙をあけて二次元平面上に配設される。

また、サンプル中のタンパク質や糖鎖などの抗原を検出する場合、タンパク質や糖鎖と特異的に結合する抗体やレクチンなどが利用され、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスの存在を検出するためにはＢ型肝炎ウイルスの抗原であるＨＢＳ抗原に対する抗ＨＢＳ抗体がプローブとして用いられ、また、例えば肝癌マーカーであるα−フェトプロテインアイソフォームを検出するにはＡＦＰレクチンがプローブとして用いられる。なお、プローブとしてこれら以外のものでも、特定の標的生体分子と結合することのできる分子であれば、タンパク質、糖鎖に限らずタンパク質断片、ペプチド、エピトープ、受容体、抗原、アプタマ−アレルゲンなども利用することができる。例えば、０．１μｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌの抗ＨＢＳモノクローナル抗体などをＰＢＳなどの緩衝液に希釈し０．１μｌ〜１０μｌの微小液滴としてスライドグラス上に滴下して固相化することができる。

図１（Ｂ）が示すように、円形支持部４は円形支持部上部１０と円形支持部下部１１から構成されており、円形支持部上部１０と円形支持部下部１１によって標的分子結合素子固定部３を挟み込み標的分子結合素子固定部３を固定している。円形支持部上部１０と円形支持部下部１１には標的分子結合素子固定部３より大きくて同じ形状の内側開口部１２が内側に開口しており、標的分子結合素子固定部３を固定する際、円形指示部４の内側に標的分子結合素子固定部３が隙間無く提示される。円形支持部４としては例えば、金、鉄、銅、アルミなどの金属や塩化ビニル、フェノール樹脂、ジアリルフタレート樹脂、不飽和ポリエステル樹脂などの樹脂で形成されているが熱可塑性の無い耐熱性の材料が望ましい。円形支持部上部１０と円形支持部下部１１には、例えば、直径０．５ｍｍ〜３０ｍｍの同形かつ円形の内側開口部１２が内側に開口しており、二つの内側開口部１２が重なるように標的分子結合素子固定部３を挟み込むことで、内側開口部１２の内側に隙間無く標的分子結合素子固定部３が固定されることとなる。挟み込む方法としては、例えば円形支持部上部１０と円形支持部下部１１を接触させ接着剤などを用いて接着させる方法が用いられる。円形支持部４の形状としては内側開口部１２を形成できる形であれば円形以外に多角形の形状にすることもでき、手で持ちやすいように取手を形成することも可能である。

図１（Ｃ）が示すように、標的分子結合素子固定部３には標的分子結合素子２がほぼ中央に固定化されている。図１（Ｄ）および図４に示すように蓋部９には、蓋部９を標的分子結合素子固定部３に重ねた時に標的分子結合素子が固定化された領域を表示する標的分子結合素子固定領域表示手段３２が設けられている。蓋部９としては、例えばカバーガラスなどの透明で薄い板が用いられる。標的分子結合素子固定領域表示手段３２としては例えば閉じた線で透明な蓋部９上に描かれたものである。また、標的分子結合素子固定領域表示手段３２は標的分子結合素子２が固定化されている領域を表示するために設けられているが、検体６を載せた際に必要最小量の検体量を表示するための検体最小量表示手段として描くこともできる。また、図１（Ｅ）が示すように検体６を標的分子結合素子固定部３に満たして反応させるが、図１（Ｆ）が示すように蒸発により検体６が減少し、標的分子結合素子固定部３が乾いてくる。乾燥によって検体中の夾雑物が標的分子結合素子固定部３に強固に結合してしまい検体反応を阻害する。標的分子結合素子２が固定化されている領域が表示されているので、検体６の蒸発によって標的分子結合素子固定部３が乾燥することを未然に察知することができる。

検体反応装置１を用いて検体６中の標的分子５を検出する工程は以下の５つの工程を含む。（１）検体反応装置１の標的分子結合素子固定部３上に目的の標的分子５と結合する標的分子結合素子２を固定化する標的分子結合素子固定化工程。（２）検体６中の標的分子５に標識分子を結合させる検体標識反応工程。（３）標識分子を結合した標的分子を標的分子結合素子固定部３上の標的分子結合素子２と結合させる検体結合反応工程。（４）標的分子結合素子固定部３上で標的分子結合素子２と結合していない目的外の分子を除去するための洗浄工程。（５）標的分子結合素子２と特異的に結合した生体分子に標識されている標識分子を検出する標識検出工程である。

標的分子結合素子２を固定化する方法としては、例えば前述のように化学修飾基を用いて共有結合させる方法や、標的分子結合素子固定部３上にアビジンを固定化し、ビオチン修飾した核酸や抗体などを結合させ、間接的に固定化する方法が用いられる。

生体分子に標識分子を結合させる方法としては、例えば核酸を検出する場合、生物試料からＲＮＡ分子をラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、リン酸ラウリル、カプリレート塩、コレート塩、スルフォンなどのアニオン性界面活性剤処理で抽出させた後、抽出されたＲＮＡをハイドロキシアパタイトカラムを利用して精製し、あるいはアルコール沈殿方法を利用して精製し、精製されたＲＮＡ１００μｇをＭ−ＭｕＬＶリバーストランスクリプターゼとＣｙ３−ｄＣＴＰおよびＣｙ５−ｄＣＴＰを使用して４０μｌの標識反応液中で標識することができる。また、Ｃｙ３以外の蛍光色素や酵素や金属粒子などの標識分子にアミノ基を導入し、標的生体分子のカルボキシル基と標識分子のアミノ基を５０ｍｇ／ｍＬ １−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｍｉｄｙｌ ｈｅｘａｎｏａｔｅ）中で２５℃３０分架橋反応させることで直接的に結合させることもできる。

検体結合反応としては、例えば標識分子で標識されたＤＮＡ分子を９４℃で１分間処理した後、０℃に急冷し一本鎖核酸に変性させた後、変性させた核酸を含む検体６を標的分子結合素子固定部３上に例えばピペットなどを用いて滴下し、４５℃〜６０℃で１時間から２４時間ハイブリダイゼーション反応させる方法が用いられる。標的分子結合素子固定部３上の溶液の蒸発を防止するため標的分子結合素子２上に溶液を滴下した後、カバーガラスなどで蓋をしたり、検体反応装置１を保湿箱内に静置する。また、標的分子結合素子２として抗体を使用する場合は、検体６中の標的分子５と標的分子結合素子２との抗原抗体反応を維持させるために同様に蒸発防止をして４℃〜３７℃で５分〜２４時間反応させる。

洗浄工程としては、例えばハイブリダイゼーション反応後の標的分子結合素子固定部３を洗浄する場合は、２ＸＳＣＣ緩衝液を検体の１０〜１０００倍量を用いて４５℃〜６０℃にて洗浄することによって、標的分子結合素子２に結合していない核酸分子を標的分子結合素子固定部３から洗い流すことができる。また、標的分子結合素子２として抗体を使用している場合は、洗浄液として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳが検体結合反応と同じ温度で使用される。

標識検出工程としては、例えば蛍光分子であるＣｙ３やＣｙ５で標識されたＤＮＡを検出する場合は、蛍光スキャナーを用いて蛍光分子が標的分子結合素子固定部３上にあることを検出することができ、Ｃｙ３を検出する場合は例えば５５０ｎｍの波長の光を出すＬＥＤを励起光源として用いることで、Ｃｙ３は反射光として５７０ｎｍの波長の光を反射する。反射された反射光を例えばバンドパスフィルターを通過させた後にＣＣＤなどを用いて光電変換することによって標的分子結合素子固定部３上のＣｙ３を定量することができる。また、生体分子に標識された酵素としてアルカリフォスファターゼを検出する場合、ＥＣＬなどの発光基質を用いて蛍光させてＣＣＤなどを用いて光電変換することによって検出することができる。

図２は、検体反応装置を用いた検体反応の動作を横からの断面図で示している。円形支持部４によって起伏発生手段１４が標的分子結合素子固定部３に密着して固定されている。起伏発生手段１４としは、例えばピエゾ素子のように交流の入力によって振動を発生するものが用いられる。起伏発生手段１４に挟まれている標的分子結合素子固定部３の表面には標的分子結合素子２が固定化されており、裏面には標的分子５に似た擬似標的分子１５と結合する擬似標的分子結合素子１６が固定化されている。例えば検体６として地下水があり、検体６中の標的分子５としてＶＯＣ分解菌であるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒの１６ＳｒＲＮＡを検出する場合、標的分子結合素子２として１６ＳｒＲＮＡに対する相補的塩基配列を持った一本鎖ＤＮＡプローブを用いる。１６ＳｒＲＮＡは同属微生物の種間で似ているため、１６ＳｒＲＮＡに対する一本鎖プローブを用いると同属の微生物種由来の１６ＳｒＲＮＡも標的分子結合素子２に結合してしまい、検出精度として微生物に対する種特異性は悪くなってしまう。例えば擬似標的分子１５としてＤｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ由来の１６ＳｒＲＮＡを排除したい場合、擬似標的分子結合素子１６として検出から排除したいＤｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓの１６ＳｒＲＮＡに隣接するＩＴＳ配列に対する相補的塩基配列を持った一本鎖ＤＮＡプローブが利用できる。検体６中に含まれる検出から排除したいＤｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓの１６ＳｒＲＮＡは標的分子結合素子固定部３裏面に結合し、標的分子結合素子固定部３の表面からは排除される。例えば、擬似標的分子結合素子１６としてＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒと似ているＤｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ特異的な配列として、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５７ （２００４） ３６９−３７８に公開されている５‘−ｇｔｔａｇｇｇａａｇａａｃｇｇｃａｔｃｔｇｔ−３’あるいは５‘―ｃｃｔｃｔｃｃｔｇｔｃｃｔｃａａｇｃｃａｔａ―３’あるいは５‘−ｃｇａａｇｃａｃｔｃｃｃａｔａｔｃｔ−３’の配列を用いることができる。また、擬似標的分子結合素子１６として一本鎖ＤＮＡプローブだけでなく抗体やレクチンなどの生体分子も利用することができる。図２（Ａ）が示すように標的分子５と擬似標的分子１５と検体反応に影響を及ぼす夾雑物１７を含有した検体６を標的分子結合素子固定部３裏面からピストン部８で濾過する。夾雑物１７としては例えば繊維カスなど検体６に混入してしまったゴミのことを指す。濾過する方法としては、検体反応装置１の上下をひっくり返して検体６を標的分子結合素子固定部３下の検体保持手段７内にピペットなどを用いて導入し、ピストン部８を検体保持手段７に装着した後、検体反応装置１を再び表面が上面になるようひっくり返し、下側からピストン部８を押し上げることによって検体６を濾過する方法がとられる。また、標的分子結合素子固定部３下の検体保持手段７に開閉可能な検体導入口を設け、ピストン部８を検体保持手段７からはずすことなく検体６を導入することもできる。図２（Ｂ）に示すように擬似標的分子１５は擬似標的分子結合素子１６に結合し夾雑物１７は検体６が濾過される際に標的分子結合素子固定部３であるフィルターメンブレンに阻まれ、裏面にトラップされる。表面に濾過された検体６中の標的分子５は表面の標的分子結合素子２に結合する。図２（Ｃ）に示すように反応後の検体６を表面から裏面に濾過することによって表面には標的分子結合素子２に結合した標的分子５が残る。この際、標的分子結合素子固定部３であるフィルターメンブレンの穴から検体６が濾過される際、標的分子５は標的分子結合素子２が固定化されている標的分子結合素子固定部３表面近傍を必ず通過するので標的分子５と標的分子結合素子２との接触確立が高くなる。標的分子５を含んだ検体６を標的分子結合素子固定部３表面から添加した場合、標的分子結合素子固定部３表面付近の検体は流動しにくいので、検体６中の標的分子５が標的分子結合素子２に接触する確率が低く、接触確立を改善するために検体６を攪拌させたり乱流を発生させたりするために振とうする手段が一般的に用いられる。しかしながら固相面との界面付近では流体は流れにくく攪拌がスムーズに起こらず接触確立の改善も十分にされない。したがって、標的分子５と標的分子結合素子２との反応効率も低い。標的分子結合素子固定部３であるメンブレンフィルターで検体６を濾過することによって、検体６中の標的分子５は標的分子結合素子固定部３表面に固定化されている標的分子結合素子２の付近を必ず通過するので、簡単に接触確立を上げることができ反応効率を改善することができる。また、検体６を裏面から表面方向に濾過した後、表面から裏面の方向に濾過し、再度裏面から表面方向に濾過し、このサイクルを繰り返すことによって、接触効率を飛躍的に上昇させ、反応効率を大幅に改善することができる。検体反応後、図２（Ｄ）が示すように、標的分子結合素子固定部３表面に洗浄液１８を添加し、洗浄液１８をピストン部８を用いて裏面に濾過することによって、標的分子結合素子２が固定化された標的分子結合素子固定部３表面を簡単に効率よく洗浄することができる。また、この洗浄操作を数回繰り返すことによって、洗浄効果をさらに上げることもできる。洗浄液１８としては、例えば核酸を検出する際は２ＸＳＳＣ溶液が利用される。

また、例えばピエゾ素子で構成された起伏発生手段１４を用いて、例えばフィルターメンブレンである標的分子結合素子固定部３に振動を加え、標的分子結合素子固定部３表面に連続的に起伏を発生させる。表面に起伏が発生することによって標的分子結合素子固定部３表面付近の検体６に乱流が起こりやすくなり、検体６を濾過する際にさらに標的分子５を標的分子結合素子２との接触確立が上昇し、反応効率を上昇させることができる。また、洗浄の際にも同様に標的分子結合素子固定部３表面に起伏を発生させることによって洗浄効率を上昇させることができる。なお、図２においては、起伏発生手段１４を標的分子結合素子固定部３に接触させるように配置したが、標的分子結合素子固定部３自身を例えばピエゾ素子とし微細孔をあけたフィルターメンブレンとすることもできる。例えばピエゾ素子のような起伏発生手段１４によって振動を発生させる場合、ピエゾ素子に流す電流の交流周波数と出力によって振動の強さを制御することができるが、出力が強すぎると標的分子結合素子固定部３表面上の検体６が飛び跳ねてしまい、検体反応が上手くいかなくなってしまう。また、検体６の組成によって粘性が異なってくるため、検体６が飛び跳ねてしまう条件は検体６の種類によって異なってくる。例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いる場合は、周波数として１８〜８０Ｈｚ、加速度として、１５〜７０ｍ／ｓ・ｓになるように出力を調節することによって、検体６が標的分子結合素子固定部３表面から飛び跳ねずに振動させることができる。

また、図２において検体保持手段７は、例えば金、鉄、銅、アルミなどの金属や塩化ビニル、フェノール樹脂、ジアリルフタレート樹脂、不飽和ポリエステル樹脂などの樹脂で形成されているが熱可塑性の無い耐熱性の材料が望ましい。また、検体保持手段７に例えば０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳで１０〜６０分浸漬し親水性処理を施し、検体６が非特異的に結合しにくくすることができる。なお円形支持部４に厚みを設け、標的分子結合素子固定部３表面の検体６が保持されるようにすることもできる。

また、例えばナイロンメンブレンなどの標的分子結合素子固定部３に例えば金などの金属を蒸着したものを使用することもできる。例えば、真空蒸着法を利用し、１０の３乗から１０の４乗Ｐａの環境で蒸着源を５８０℃に制御し、１分〜５分程度蒸着することによってメンブレン表面が金で被覆され標的分子結合素子固定部３ができる。なお、金は蒸着される金属の一例であって金に限られたものでなく、また蒸着方法も、真空蒸着法に限定されるものではなく、分子線蒸着や直流放電を利用した方法でもかまわない。例えば金蒸着された標的分子結合素子固定部３上に標的分子結合素子２として複数種類の一本鎖ＤＮＡをそれぞれ別々の独立したスポットとして固定化した標的生体分子検出チップ１を用いることによって、金属蒸着されたＤＮＡマイクロアレイとして使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイや検体反応装置１を用いた生体分子検出方法の標識検出工程において、例えば、標識分子である蛍光色素を検出する場合は標識分子に励起光を照射する際に標的分子結合素子固定部３を構成する樹脂が強い自家蛍光を発するため標識分子を検出するのが困難となる。金属蒸着フィルターメンブレン上に標的分子結合素子２を固定化することによって、樹脂の蛍光によるノイズを低減し、蛍光分子を感度良く検出することができるようになる。

上記構成において、検体反応装置１にトラップされた標的分子５を光学的に検知する際、標的分子結合素子固定部３上の光学的ノイズが小さいためノイズの影響が少なくなり、高い検出精度で標的分子５を検出することができるようになる。

また、金属蒸着をスポット状に行い標的分子結合素子固定部３上に形成された金属スポットに標的分子結合素子２を固定化することもできる。例えば、フォトマスクを使用したスパッタリングによって微小なスポット状に金属を蒸着し、蒸着されたスポット状の金属薄膜上に標的分子結合素子２を固定化する。例えば金をスポット状に蒸着したフィルターメンブレンを１ｍＭのｎ―オクタンチオールなどのアルカンチオールに１〜２４時間浸漬させることによって金属蒸着されたスポット上に単分子膜を導入し、単分子膜を介して標的分子結合素子２を固定化することができる。単分子膜は金属蒸着されていないところには形成されず、金属蒸着されたスポット上にのみ形成されるので、標的分子結合素子２は金属蒸着スポットの上にのみ固定化される。フォトマスクを使用したスパッタリングによる金属蒸着スポットの形状ばらつきは非常に小さいため、標的分子結合素子が固定化されるスポットを非常に精度良く作製することができる。例えば、スパッタリングによって直径２０〜２００μｍの金属蒸着スポットが±０．１μｍ以下の精度で作製される。

図３は検体反応装置１を用いた検体反応によって標的分子５を検出する装置の一例を示している。図３が示すように、標的分子検出装置１９は、少なくとも一つの光源２０と受光手段２１と光学判断手段２２と検体反応装置固定化手段２３とスポット位置表示手段２４と制御部２５と集光レンズ２６を備えている。光源２０としては例えば、連続発振レーザーやＬＥＤなどが用いられ、通常光学フィルターを用いて一定波長の光が照射されるように調節されている。使用される光学フィルターとしては短波長カットフィルターや長波長カットフィルターやバンドパスフィルターが利用される。調節される波長領域としては５３０ｎｍ程度のグリーン光や、６３０ｎｍ程度のレッド光が単独または複数で使用されるが、これ以外の波長域であっても蛍光分子に対して干渉可能な波長域であれば何れの波長域であっても使用できる。検体反応装置１を検体反応装置固定化手段２３に固定し、固定された検体反応装置１の標的分子結合素子固定部３上に光源２０から予め定められた波長域で励起光２７が照射され、励起光２７によって発せられる反射光２８を集光レンズ２６が集光し受光手段２１が受光する。受光手段２１としては光電子倍増管や電荷結合素子（ＣＣＤ）が使用される。例えば検体反応装置１としてＤＮＡマイクロアレイが用いられる場合、Ｃｙ３やＣｙ５などの蛍光分子で標識されたＤＮＡ分子が標的分子結合素子２上にそれぞれ独立し一定間隔で結合しており、これら蛍光分子あるいは発光分子はそれぞれ固有の吸収スペクトルと蛍光波長を持っており、蛍光分子に干渉する励起光源は蛍光分子の吸収スペクトルに対応した光源２０が使用され、受光手段２１には反射光の中から目的の波長を制限するための光学フィルターが併用される。例えばＣｙ３やＣｙ５から反射される蛍光はそれぞれ、５７０ｎｍ、６７０ｎｍであるので、５７０ｎｍまたは６７０ｎｍの波長特性をもつ光を通過させる光学フィルターが併用される。また、光源２０によって照射され発光した反射光２８を受光する一定の時間を、例えば１秒〜１０秒の間で調節して設定することによって、標的分子結合素子固定部３の蛍光量が強すぎる場合から弱い時まで対応して受光することができる。なお、設定した一定の受光時間は標的分子結合素子固定部３の蛍光量に合わせて調節することができ、蛍光が弱い時は１０秒以上に設定することができ、また、蛍光が強すぎる時は１秒以下に設定することができる。制御部２５は光源２０に流れる電流量を制御することによって励起光２７のオンオフあるいは強弱を制御する。制御部２５としては光源２０と受光手段２１と光学判断手段２２とスポット位置表示手段２４を制御するためのものであって、例えばＣＰＵなどが使用され、以下のステップで制御される。光源２０から励起光２７を一定の出力で照射するステップ、反射光２８を受光手段２１が受光するステップ、受光された反射光２８が有効なシグナルであるか光学判断手段２２で判断するステップ、光学判断手段２２で有効なシグナルと判断された結果をスポット位置表示手段２４に表示するステップ、光学判断手段２２で有効なシグナルと判断されない場合に光源２０の出力を変化させ再度励起光２７を照射するステップ、再度反射光２８を受光手段２１が受光するステップ、再度受光された反射光２８が有効なシグナルであるか再度光学判断手段２２で判断するステップ、改めて光学判断手段２２で有効なシグナルと判断された結果をスポット位置表示手段２４に表示するステップを少なくとも含む。光学判断手段２２とは、例えば予め一定のデータが記録格納されたメモリであり、例えば受光手段２１であるＣＣＤで取得された画像のピクセルの輝度値と光学判断手段２２であるメモリに記録されたデータと比較することで有効なシグナルであるかどうか判断される。８ビット画像データであるピクセルあたりの輝度値１０〜２５４が有効なシグナルであることを予め光学判断手段２２であるメモリに記録しておき、受光手段２１であるＣＣＤで取得された８ビット画像データが１０〜２５４である場合は有効なシグナルであると判断される。受光手段２１であるＣＣＤで取得された８ビット画像データが０〜９あるいは２５５である場合は有効なシグナルとは判断されず、有効なシグナルではないと判断された情報を制御部２５であるＣＰＵが受け取る。取得された８ビット画像データが０〜９である場合は、ＣＰＵが光源２０の出力を上げて再度励起光２７を照射するように制御する。また、８ビット画像データが２５５である場合は、ＣＰＵが光源２０の出力を下げて再度励起光２７を照射するように制御する。スポット位置表示手段２４としては例えば液晶モニターが利用され、有効なシグナルであると判断された８ビット画像データが表示される。光学画像２９としては例えばＣＣＤで取得された８ビット画像であり、受光手段２１によって取得された画像をそのまま表示し、また、光学判断手段２２で判断された結果のみを表示する。また、制御部２５は撮像された光学画像２９を記憶し測定者が記憶された光学画像２９を呼び出しスポット位置表示手段２４に表示することもできる。検体反応装置固定化手段２３としては、例えばスライドグラス上に作成されたＤＮＡマイクロアレイを固定するためのスライドグラスを挟んで固定する治具で構成されており、また、マイクロウェルなどを固定する窪みを有した治具などが使用される。

また、ピストン部８を除去した検体反応装置１を固定するために平滑基準台３０を用いることができる。平滑基準台３０は例えば、標的分子結合素子固定部３と同心円の平らな面をもち、日本工業規格ＪＩＳＢ０６１０の規定を満たした表面粗さで、例えば金属やガラスや樹脂で成形されている。例えばフィルターメンブレンである標的分子結合素子固定部３を固定している円形支持部４を平滑基準台３０に設置することによってフィルターメンブレンの表面粗さを日本工業規格ＪＩＳＢ０６１０の規定の表面粗さに調節することができる。このように平滑基準台３０を用いることによってフィルターメンブレンなどの表面に起伏が生じる標的分子結合素子固定部３表面の起伏を無くし、標的分子検出装置１９で検出する際に表面粗さによるノイズを除去することができるようになる。

また、標的分子結合素子２として炭素骨格を有した有機分子を用いることによって有機分子に結合する分子を標的分子として反応させ検出することができる。例えば有機分子としてＤＮＡやＲＮＡなどの一本鎖核酸プローブあるいはｃＤＮＡを用いることができるし、また、臨床マーカーである抗原に対する抗体を使用することができる。

また、標的分子結合素子２として利用する有機金属錯体として、例えばシスプラチンのような白金に塩素とアンモニアが配位した化合物を用いた場合、シスプラチンはＤＮＡの二重螺旋に結合することができるため、シスプラチンを標的分子結合素子として用いることによって検体中の二重螺旋構造のＤＮＡを結合し検出することができるようになる。また、有機金属錯体として亜鉛を配位したジンクフィンガーを有する転写因子：Ｒｅｘ−１などを利用することができ、Ｒｅｘ−１はＤＮＡの特定の塩基配列を認識して結合するため、転写因子：Ｒｅｘ−１の結合する転写調節配列を有したＤＮＡを結合し検出することができ、また、転写因子：Ｒｅｘ−１に直接結合して転写活性を調節する転写調節因子も結合して検出することができる。また、ジンクフィンガーを有する複数種類の転写因子をアレイ状に標的分子結合素子固定部３上に配置して、それぞれの転写因子に結合する転写調節配列を有した複数種類のＤＮＡを同に結合し検出することもできる。また、有機金属錯体としてカルボキシペプチダーゼＡなどのメタロプロテアーゼを利用することができ、カルボキシペプチダーゼＡに対する活性阻害剤などを結合できるため、活性阻害剤のスクリーニングなどに用いることができる。

また、標的分子結合素子２として利用する糖質として、例えばシアル酸であるＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−を用いることによって、このシアル酸に結合するインフルエンザウイルスのヘマグルチニンを特異的に結合し検出することができる。

また、標的分子結合素子２として利用する脂質として、例えばスフィンゴミエリンを用いることによって、このスフィンゴミエリンに結合するウルシュ菌α毒素のスフィンゴミエリナーゼを検出することができるようになる。

上記構成において、検体６中に夾雑物１７が混入していても、夾雑物１７が標的分子結合素子固定部３の裏側にトラップされることによって、標的分子結合素子２が固定化されている標的分子結合素子固定部３表面に混入する夾雑物１７を除去できる検体反応装置１になる。

（実施の形態２）
図４は本発明の実施の形態２の検体反応装置を示している。図４において実施の形態１と異なるところは、蓋部９に標的分子結合素子固定領域表示手段３２が追加されている点である、図４において、実施の形態１と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。

図４（Ａ）に示すように蓋部９を標的分子結合素子固定部３に被せた時、標的分子結合素子２が固定化されている領域を視覚的に表示する標的分子結合素子固定領域表示手段３２が標的分子結合素子固定部３上に設けられている。図４（Ｂ）に示すように、検体６の量は検体反応に必要な最少量存在しているが、検体６が標的分子結合素子２が固定化されている領域からずれているかどうかが簡単にモニタリングすることができる。図４（Ｃ）に示すように、検体反応に必要な最少量を表示する検体蒸発限度表示手段１３を満たし、かつ標的分子結合素子固定領域表示手段３２を検体６が満たしている場合に正常に検体反応が進んでいると判断される。

また、検体６が検体反応に必要な最少量存在しているが標的分子結合素子固定領域表示手段３２からずれてしまっている際、蓋部９を動かすことによって、蓋部９と標的分子結合素子固定部３に挟まれて保持されている検体６を動かすことができ、標的分子結合素子２が固定されている場所に検体６を移動させることができるようになる。

上記構成において、検体反応させる検体６の標的分子結合素子固定部３上における位置をモニタリングすることができるため、検体６が標的分子結合素子２の固定化されている領域からずれることによる検出精度の悪化を防止できる検体反応装置１になる。

（実施の形態３）
図５は本発明の実施の形態３の検体反応装置１を示している。

図５に示すように標的分子結合素子固定部３上面には標的分子５と特異的に結合する有機分子３３が固定化されている。有機分子３３としてＤＮＡやＲＮＡなどの一本鎖核酸プローブあるいはｃＤＮＡを用いることができ、また、臨床マーカーである抗原に対する抗体を使用することができる。例えばＶＯＣ分解菌であるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒを検出するためにＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５ＲのゲノムのＩＴＳ領域を含む数十〜数百の塩基配列を一本鎖核酸プローブとして利用し、土壌、河川水などのサンプルあるいは、培養液中から抽出した核酸を一本鎖核酸プローブとフィルターメンブレン上でハイブリダイゼーションさせることによって標的となるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒゲノム由来の核酸を検体反応装置１に補足し、補足された核酸を検出することによってサンプル中のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒの存在を選択的に検出することができる。

上記構成において、検体６中に含まれる有機分子３３に結合する標的分子５が効率良く標的分子結合素子２に反応することができ、蒸発による検体６の減少や検体６の位置のずれによる検体反応の阻害を防止できる検体反応装置１となる。

（実施の形態４）
図６は本発明の実施の形態４の検体反応装置１を示している。

図６に示すように標的分子結合素子固定部３上面には標的分子５と特異的に結合する有機金属錯体３４が固定化されている。有機金属錯体３４として、例えばシスプラチンのような白金に塩素とアンモニアが配位した化合物を用いることができる。シスプラチンはＤＮＡの二重螺旋に結合することができるため、シスプラチンを標的分子結合素子として用いることによって検体中の二重螺旋構造のＤＮＡを選択的に検出することができるようになる。また、有機金属錯体として亜鉛を配位したジンクフィンガーを有する転写因子：Ｒｅｘ−１などを利用することができ、Ｒｅｘ−１はＤＮＡの特定の塩基配列を認識して結合するため、転写因子：Ｒｅｘ−１の結合する転写調節配列を有したＤＮＡを結合し検出することができ、また、転写因子：Ｒｅｘ−１に直接結合して転写活性を調節する転写調節因子も結合して検出することができる。また、ジンクフィンガーを有する複数種類の転写因子をアレイ状に標的分子結合素子固定部３上に配置して、それぞれの転写因子に結合する転写調節配列を有した複数種類のＤＮＡを同に結合し検出することもできる。また、有機金属錯体としてカルボキシペプチダーゼＡなどのメタロプロテアーゼを利用することができ、カルボキシペプチダーゼＡに対する活性阻害剤などを結合できるため、活性阻害剤のスクリーニングなどに用いることができる。

上記構成において、検体６中に含まれる有機金属錯体３４に結合する標的分子５が効率良く標的分子結合素子２に反応することができ、蒸発による検体６の減少や検体６の位置のずれによる検体反応の阻害を防止できる検体反応装置１となる。

（実施の形態５）
図７は本発明の実施の形態５の検体反応装置１を示している。

図７に示すように標的分子結合素子固定部３上面には標的分子５と特異的に結合する核酸３５が固定化されている。核酸３５としてＤＮＡやＲＮＡなどの一本鎖核酸プローブあるいはｃＤＮＡを用いることができる。例えばＶＯＣ分解菌であるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒを検出するためにＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５ＲのゲノムのＩＴＳ領域を含む数十〜数百の塩基配列を一本鎖核酸プローブとして利用し、土壌、河川水などのサンプルあるいは、培養液中から抽出した核酸を一本鎖核酸プローブとフィルターメンブレン上でハイブリダイゼーションさせることによって標的となるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒゲノム由来の核酸を検体反応装置１に補足し、補足された核酸を検出することによってサンプル中のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ １９５Ｒの存在を選択的に検出することができる。

上記構成において、検体６中に含まれる核酸３５に結合する標的分子５が効率良く標的分子結合素子２に反応することができ、蒸発による検体６の減少や検体６の位置のずれによる検体反応の阻害を防止できる検体反応装置１となる。

（実施の形態６）
図８は本発明の実施の形態６の検体反応装置１を示している。

図８に示すように標的分子結合素子固定部３上面には標的分子５と特異的に結合するタンパク質３６あるいはペプチド３７が固定化されている。

例えばタンパク質３６として抗ＨＢＳモノクローナル抗体を用いることによって、検体６中に含まれるＨＢＳ抗原と特異的に結合反応させることができ、検体６中のＨＢＳ抗原の有無を検出することができる。また、例えばペプチド３７としてＨＢＳ抗原のペプチド配列を用いることによって検体６中の抗ＨＢＳ抗体と特異的に結合反応することによって検体６中の抗ＨＢＳ抗体の有無を選択的に検出することができるようになる。

上記構成において、検体６中に含まれるタンパク質３６あるいはペプチド３７に結合する標的分子５が効率良く標的分子結合素子２に反応することができ、蒸発による検体６の減少や検体６の位置のずれによる検体反応の阻害を防止できる検体反応装置１となる。

（実施の形態７）
図９は本発明の実施の形態７の検体反応装置１を示している。

図９に示すように標的分子結合素子固定部３上面には標的分子５と特異的に結合する糖質３８が固定化されている。例えば糖質３８として、シアル酸であるＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−を用いることによって、検体６中に含まれるインフルエンザウイルスのヘマグルチニンがＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−と特異的に結合する。

上記構成において、検体６中に含まれる糖質３８に結合する標的分子５が効率良く標的分子結合素子２に反応することができ、蒸発による検体６の減少や検体６の位置のずれによる検体反応の阻害を防止できる検体反応装置１となる。

（実施の形態８）
図１０は本発明の実施の形態８の検体反応装置１を示している。

図１０に示すように標的分子結合素子固定部３上面には標的分子５と特異的に結合する脂質３９が固定化されている。例えば脂質３９としてスフィンゴミエリンを用いることによって、検体６中に含まれるウルシュ菌α毒素のスフィンゴミエリナーゼとスフィンゴミエリンが特異的に結合する。

上記構成において、検体６中に含まれる脂質３９に結合する標的分子５が効率良く標的分子結合素子２に反応することができ、蒸発による検体６の減少や検体６の位置のずれによる検体反応の阻害を防止できる検体反応装置１となる。

（実施の形態９）
図１１は本発明の実施の形態９の検体反応装置１を示している。

図１１（Ａ）は金属を蒸着した金属蒸着メンブレン４０を示しており、図１１（Ｂ）は金属蒸着メンブレン４０を用いた検体反応装置１の一部を示している。

図１１（Ａ）に示すように、例えばナイロンなどのメンブレンに０．２μｍ径の穴が開孔したメンブレンフィルターに真空蒸着法を利用し、１０の３乗から１０の４乗Ｐａの環境で蒸着源を５８０℃に制御し、１分〜５分程度金を蒸着することによってメンブレン表面が金で被覆され金属蒸着メンブレン４０ができる。なお、金は蒸着される金属の一例であって金に限られたものでなく、また蒸着方法も、真空蒸着法に限定されるものではなく、分子線蒸着や直流放電を利用した方法でもかまわない。

図１１（Ｂ）に示すように、例えば金蒸着された金属蒸着メンブレン４０上に標的分子結合素子２として複数種類の一本鎖ＤＮＡをそれぞれ別々の独立したスポットとして固定化した検体反応装置１を用いることによって、金属蒸着されたＤＮＡマイクロアレイとして使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイを用いた標的分子５の検出する場合、例えば、蛍光色素で標識した標的分子５に対してレーザー光を照射することによって光学的に検出するが、標的分子結合素子固定部３を構成する樹脂が強い自家蛍光を発する場合は、蛍光色素由来の信号より自家蛍光が強いために標識分子を検出するのが困難となる。金属蒸着メンブレン４０上に標的分子結合素子２を固定化することによって、樹脂の蛍光によるノイズを低減し、蛍光分子を感度良く検出することができるようになる。

上記構成において、検体反応装置１を光学的に検知する際、金属蒸着メンブレン４０の光学的ノイズが小さいため樹脂の自家蛍光などのバックやノイズの影響が少なくなり、高い検出精度で標的分子５を検出することができるようになる。

（実施の形態１０）
図１２は本発明の実施の形態１０の標的分子結合素子固定部３上に金属蒸着スポット４１が形成されている検体反応装置１を示している。

図１２において実施の形態１１と異なるところは、標的分子結合素子固定部３上に金属蒸着スポット４１が形成されており、金属蒸着スポット４１上に標的分子結合素子２が固定化されている点である、図１２において、実施の形態１１と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。

例えば、フォトマスクを使用したスパッタリングによって微小なスポット状に金属を蒸着し、同形のスポットを精度良く形成する。蒸着されたスポット状の金属薄膜上に標的分子結合素子２を固定化する。例えば金をスポット状に蒸着したフィルターメンブレンを１ｍＭのｎ―オクタンチオールなどのアルカンチオールに１〜２４時間浸漬させることによって金属蒸着スポット４１上に単分子膜を導入し、単分子膜を介して標的分子結合素子２を固定化することができる。単分子膜は金属蒸着スポット４１上にのみ形成されるので、標的分子結合素子２は金属蒸着メンブレン４０上にのみ固定化される。フォトマスクを使用したスパッタリングによる金属蒸着スポット４１の形状ばらつきは非常に小さいため、標的分子結合素子２が固定化されるスポットを非常に精度良く作製することができる。

上記構成において、標的分子結合素子２が固定化されている領域を目で簡単に確認でき、かつ、標的分子結合素子２に結合した生体分子を光学的に検出する際光学的ノイズが小さく精度良く検出できるようになる。また、標的分子結合素子２を固定化する際、金属蒸着スポット４１上に正確に固定化できるようになるため、標的分子結合素子２が固定化されるスポット径を精度良くコントロールすることができるようになる。

（実施の形態１１）
図３は本発明の実施の形態１１の標的分子検出装置１９を示している。

図３が示すように、標的分子検出装置１９は、少なくとも一つの光源２０と受光手段２１と光学判断手段２２と検体反応装置固定化手段２３とスポット位置表示手段２４と制御部２５と集光レンズ２６を備えている。光源２０としては例えば、連続発振レーザーやＬＥＤなどが用いられ、通常光学フィルターを用いて一定波長の光が照射されるように調節されている。使用される光学フィルターとしては短波長カットフィルターや長波長カットフィルターやバンドパスフィルターが利用される。調節される波長領域としては５３０ｎｍ程度のグリーン光や、６３０ｎｍ程度のレッド光が単独または複数で使用されるが、これ以外の波長域であっても蛍光分子に対して干渉可能な波長域であれば何れの波長域であっても使用できる。検体反応装置１を検体反応装置固定化手段２３に固定し、固定された検体反応装置１の標的分子結合素子固定部３上に光源２０から予め定められた波長域で励起光２７が照射され、励起光２７によって発せられる反射光２８を集光レンズ２６が集光し受光手段２１が受光する。受光手段２１としては光電子倍増管や電荷結合素子（ＣＣＤ）が使用される。例えば検体反応装置１としてＤＮＡマイクロアレイが用いられる場合、Ｃｙ３やＣｙ５などの蛍光分子で標識されたＤＮＡ分子が標的分子結合素子２上にそれぞれ独立し一定間隔で結合しており、これら蛍光分子あるいは発光分子はそれぞれ固有の吸収スペクトルと蛍光波長を持っており、蛍光分子に干渉する励起光源は蛍光分子の吸収スペクトルに対応した光源２０が使用され、受光手段２１には反射光の中から目的の波長を制限するための光学フィルターが併用される。例えばＣｙ３やＣｙ５から反射される蛍光はそれぞれ、５７０ｎｍ、６７０ｎｍであるので、５７０ｎｍまたは６７０ｎｍの波長特性をもつ光を通過させる光学フィルターが併用される。また、光源２０によって照射され発光した反射光２８を受光する一定の時間を、例えば１秒〜１０秒の間で調節して設定することによって、標的分子結合素子固定部３の蛍光量が強すぎる場合から弱い時まで対応して受光することができる。なお、設定した一定の受光時間は標的分子結合素子固定部３の蛍光量に合わせて調節することができ、蛍光が弱い時は１０秒以上に設定することができ、また、蛍光が強すぎる時は１秒以下に設定することができる。制御部２５は光源２０に流れる電流量を制御することによって励起光２７のオンオフあるいは強弱を制御する。制御部２５としては光源２０と受光手段２１と光学判断手段２２とスポット位置表示手段２４を制御するためのものであって、例えばＣＰＵなどが使用され、以下のステップで制御される。光源２０から励起光２７を一定の出力で照射するステップ、反射光２８を受光手段２１が受光するステップ、受光された反射光２８が有効なシグナルであるか光学判断手段２２で判断するステップ、光学判断手段２２で有効なシグナルと判断された結果をスポット位置表示手段２４に表示するステップ、光学判断手段２２で有効なシグナルと判断されない場合に光源２０の出力を変化させ再度励起光２７を照射するステップ、再度反射光２８を受光手段２１が受光するステップ、再度受光された反射光２８が有効なシグナルであるか再度光学判断手段２２で判断するステップ、改めて光学判断手段２２で有効なシグナルと判断された結果をスポット位置表示手段２４に表示するステップを少なくとも含む。光学判断手段２２とは、例えば予め一定のデータが記録格納されたメモリであり、例えば受光手段２１であるＣＣＤで取得された画像のピクセルの輝度値と光学判断手段２２であるメモリに記録されたデータと比較することで有効なシグナルであるかどうか判断される。８ビット画像データであるピクセルあたりの輝度値１０〜２５４が有効なシグナルであることを予め光学判断手段２２であるメモリに記録しておき、受光手段２１であるＣＣＤで取得された８ビット画像データが１０〜２５４である場合は有効なシグナルであると判断される。受光手段２１であるＣＣＤで取得された８ビット画像データが０〜９あるいは２５５である場合は有効なシグナルとは判断されず、有効なシグナルではないと判断された情報を制御部２５であるＣＰＵが受け取る。取得された８ビット画像データが０〜９である場合は、ＣＰＵが光源２０の出力を上げて再度励起光２７を照射するように制御する。また、８ビット画像データが２５５である場合は、ＣＰＵが光源２０の出力を下げて再度励起光２７を照射するように制御する。スポット位置表示手段２４としては例えば液晶モニターが利用され、有効なシグナルであると判断された８ビット画像データが表示される。光学画像２９としては例えばＣＣＤで取得された８ビット画像であり、受光手段２１によって取得された画像をそのまま表示し、また、光学判断手段２２で判断された結果のみを表示する。また、制御部２５は撮像された光学画像２９を記憶し測定者が記憶された光学画像２９を呼び出しスポット位置表示手段２４に表示することもできる。検体反応装置固定化手段２３としては、例えばスライドグラス上に作成されたＤＮＡマイクロアレイを固定するためのスライドグラスを挟んで固定する治具で構成されており、また、マイクロウェルなどを固定する窪みを有した治具などが使用される。

また、ピストン部８を除去した検体反応装置１を固定するために平滑基準台３０を用いることができる。平滑基準台３０は例えば、標的分子結合素子固定部３と同心円の平らな面をもち、日本工業規格ＪＩＳＢ０６１０の規定を満たした表面粗さで、例えば金属やガラスや樹脂で成形されている。例えばフィルターメンブレンである標的分子結合素子固定部３を固定している円形支持部４を平滑基準台３０に設置することによってフィルターメンブレンの表面粗さを日本工業規格ＪＩＳＢ０６１０の規定の表面粗さに調節することができる。このように平滑基準台３０を用いることによってフィルターメンブレンなどの表面に起伏が生じる標的分子結合素子固定部３表面の起伏を無くし、標的分子検出装置１９で検出する際に表面粗さによるノイズを除去することができるようになる。また、光源２０及び検体反応装置１及び受光手段２１を収め外部の光を遮断する筐体３１を設けることによって、外光の影響を受けずに精度良く光学画像２９を取得できる標的分子検出装置１９となる。例えば筐体３１としては光を透過しない金属などで形成された箱型のものが利用される。

上記構成において、検体反応装置の標的分子結合素子固定部３表面を簡単に平滑にすることによって、標的分子結合素子固定部表面の凹凸によるノイズを削減し感度良く標的分子を光学的に検出することができる標的分子検出装置１９となる。

本発明の検体反応装置及び検出装置を用いることによって、夾雑物や擬似標的分子が含まれている検体中の標的分子を精度良く検出することができるようになり、ＤＮＡマイクロアレイなどの生体分子検知デバイスを用いて効率良く分子マーカーである標的分子を検出することができるようになる。また、安全かつ簡便に検出反応を行うことができるため、誰でも簡単に利用することができるようになる。

本発明の実施の形態１の検体反応装置を示す図 同実施の形態１の検体反応装置を示す図 同実施の形態１、１１の標的分子検出装置示す図 同実施の形態１、２の検出反応装置示す図 同実施の形態３の検出反応装置示す図 同実施の形態４の検出反応装置示す図 同実施の形態５の検出反応装置示す図 同実施の形態６の検出反応装置示す図 同実施の形態７の検出反応装置示す図 同実施の形態８の検出反応装置示す図 同実施の形態９の検出反応装置示す図 同実施の形態１０の検出反応装置示す図 従来のハイブリダイゼーション反応検出方法及びその装置を示す図

符号の説明

１ 検体反応装置
２ 標的分子結合素子
３ 標的分子結合素子固定部
４ 円形支持部
５ 標的分子
６ 検体
７ 検体保持手段
８ ピストン部
９ 蓋部
１０ 円形支持部上部
１１ 円形支持部下部
１２ 内側開口部
１３ 検体蒸発限度表示手段
１４ 起伏発生手段
１５ 擬似標的分子
１６ 擬似標的分子結合素子
１７ 夾雑物
１８ 洗浄液
１９ 標的分子検出装置
２０ 光源
２１ 受光手段
２２ 光学判断手段
２３ 検体反応装置固定化手段
２４ スポット位置表示手段
２５ 制御部
２６ 集光レンズ
２７ 励起光
２８ 反射光
２９ 光学画像
３０ 平滑基準台
３１ 筐体
３２ 標的分子結合素子固定領域表示手段
３３ 有機分子
３４ 有機金属錯体
３５ 核酸
３６ タンパク質
３７ ペプチド
３８ 糖質
３９ 脂質
４０ 金属蒸着メンブレン
４１ 金属蒸着スポット

Claims (11)

1. 標的分子と結合する一種類以上の標的分子結合素子が固定化された標的分子結合素子固定部と、前記標的分子結合素子固定部上に前記標的分子を含んだ検体を保持する検体保持部と、前記検体保持部の蓋部とを備え、前記検体保持部あるいは前記蓋部に検体蒸発限度表示手段を備えることを特徴とする検体反応装置。
2. 標的分子結合素子固定部上に前記標的分子が固定化されている領域を表示する標的分子結合素子固定領域表示手段を備えることを特徴とする請求項１記載の検体反応装置。
3. 標的分子結合素子が炭素骨格を有する有機分子であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置。
4. 標的分子結合素子が有機金属錯体であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置。
5. 標的分子結合素子が核酸であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置。
6. 標的分子結合素子がタンパク質あるいはペプチドであることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置。
7. 標的分子結合素子が糖質であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置。
8. 標的分子結合素子が脂質であることを特徴とする請求項１または２記載の検体反応装置。
9. 標的分子結合素子固定部に金属を蒸着してあること特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の検体反応装置。
10. 標的分子結合素子固定部にスポット状に金属が蒸着されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の検体反応装置。
11. 請求項１乃至１０のいずれかに記載の検体反応装置を固定する検体反応装置固定手段と、前記標的分子結合素子固定部に光を照射する光照射手段と、前記標的分子結合素子固定部から反射する反射光を受光する受光手段と、前記標的分子結合素子固定部と前記受光手段の間に配置された集光レンズとを備えたことを特徴とする標的分子検出装置。

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