CN111039809B - 固载化的核酸适配体的连接臂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及核酸适配体技术领域，公开了固载化的核酸适配体的连接臂及其制备方法和应用。该连接臂具有式1所示结构；其中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1‑C10的烷基，R为氨基保护基团，n为2‑6的整数。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1)采用本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂在核酸适配体合成最后一步用浓氨水切除CPG时选择性高，只可能得到一种产物；2)所述核酸适配体连接臂上只留下一个仲醇，不易发生副反应；3)制备该固载化的核酸适配体的连接臂的原料为丙酮缩甘油，容易获得。

Description

固载化的核酸适配体的连接臂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及核酸适配体技术领域，具体涉及一种固载化的核酸适配体的连接臂，一种固载化的核酸适配体的连接臂的制备方法以及由该方法制备的固载化的核酸适配体的连接臂，以及所述固载化的核酸适配体的连接臂在制备核酸适配体-药物偶合物中的应用。
背景技术
核酸适配体是一种利用自身折叠的高级结构与特定靶标结合的单链寡核苷酸，可以通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,SELEX)筛选获得。核酸适配体具有与抗体相似的亲和性和特异性，且其毒性较小，临床上应用更安全[Wochner,A.；Menger,M.；Rimmele,M.Characterisation of aptamers for therapeutic studies.Expert Opin.DrugDiscov.2007,2,1205-1224.]。并且，由于可以实现细胞水平的特异性递送，核酸适配体作为靶向分子已经被广泛应用在药物的靶向递送研究中[Jiang,F.；Liu,B.；Lu,J.；Li,F.；Li,D.；Liang,C.；Dang,L.；Liu,J.；He,B.；Badshah S.A.；Lu,C.；He,X.；Guo,B.；Zhang,X.-B.；Tan,W.；Lu,A.；Zhang,G.Progress and Challenges in Developing Aptamer-Functionalized Targeted Drug Delivery Systems.Int.J.Mol.Sci.2015,16,23784-23822.]。
核酸适配体-药物偶合物主要由三部分构成：核酸适配体、药物以及中间的连接臂[Li,F.；Lu,J.；Liu,J.；Liang,C.；Wang,M.；Wang,L.；Li,D.；Yao,H.；Zhang,Q.；Wen,J.；Zhang,Z.-K.；Li,J.；Lv,Q.；He,X.；Guo,B.；Guan,D.；Yu,Y.；Dang,L.；Wu,X.；Li,Y.；Jiang,F.；Sun,S.；Zhang,B.-T.；Lu,A.；Zhang,G.A water-soluble nucleolin aptamer-paclitaxel conjugate for tumor-specific targeting in ovariancancer.Nat.commun.2017,8,1390.]。核酸适配体-药物偶合物能否成功的关键之一在于选择合适的连接臂偶联核酸适配体和药物。王升启等提出一种固载化的核酸适配体连接臂[王升启，杨静，赵海豹，张京玉，丁晓然，鲁丹丹，刘娟，李康。一种脂肪链修饰的寡核苷酸的结构、制备方法及用途，CN201110188688.7]，其化学结构如图1所示，微球代表CPG(可控玻璃微球)。
然而，这个固载化的核酸适配体连接臂存在下列问题：1)在核酸适配体合成最后一步用浓氨水切除CPG时选择性不高，可能会得到如图2a所示的副产物；2)所得核酸适配体连接臂上保留一个伯醇，如图2b所示，这个伯羟基容易和2-位羟基磷酸酯发生酯交换反应；3)制备该连接臂的原料不易获得。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的如上问题，提供一种新的固载化的核酸适配体的连接臂，采用该固载化的核酸适配体的连接臂进行核酸适配体的合成，只会得到一种产物，如图3所示，且不易发生副反应，制备原料容易获得。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种固载化的核酸适配体的连接臂，该连接臂具有式1所示结构；
其中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C10的烷基，R为氨基保护基团，n为2-6的整数。
第二方面，本发明提供一种固载化的核酸适配体的连接臂的制备方法，该方法包括：
(1)在第一催化剂的存在下，使丙烯腈或者ω-易离去基团取代的C3-C7的腈与丙酮缩甘油进行第一接触以发生反应，得到如式2所示的第一中间产物，式2中，n为2-6的整数，其中，ω为C3-C7的腈中与易离去基团连接的C碳原子；
(2)在第二催化剂的存在下，使所述第一中间产物和还原剂发生还原反应，以将所述第一中间产物中的氰基还原为氨基，得到如式3所示的第二中间产物；
(3)在惰性气体的保护下以及第一有机碱的存在下，将所述第二中间产物与能够提供氨基保护基团R的化合物进行第二接触，以使得氨基保护基团R与氨基相连从而对所述第二中间产物中的氨基进行保护，得到如式4所示的第三中间产物，式4中，R为氨基保护基团；
(4)将所述第三中间产物与酸进行第三接触，以脱除丙酮保护基，得到第四中间产物；
(5)在取代反应的条件下，将所述第四中间产物与式5所示的化合物接触，以使所述第四中间产物取代式5所示的化合物的X基团，得到式6所述的第五中间产物；式5中，X为卤素，式5和式6中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C10的烷基；
(6)在第二有机碱的存在下，使所述第五中间产物与丁二酸酐发生酯化反应，得到如式7所示的第六中间产物；
(7)在第三有机碱的存在下，将所述第六中间产物和氨基化的CPG接触并使得所述第六中间产物中的羧基与氨基化的CPG中的氨基进行酰胺化反应，得到式1所示的固载化的核酸适配体的连接臂；
式1中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C10的烷基，R为氨基保护基团，n为2-6的整数。
第三方面，本发明提供了如上所述的方法制备的固载化的核酸适配体的连接臂。
第四方面，本发明提供了如上所述的固载化的核酸适配体的连接臂在制备核酸适配体-药物偶合物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1)采用本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂在核酸适配体合成最后一步用浓氨水切除CPG时选择性高，只可能得到一种产物，例如，如图3所示；2)所述核酸适配体连接臂上只留下一个仲醇，不易发生副反应；3)制备该固载化的核酸适配体的连接臂的原料为丙酮缩甘油，容易获得。
附图说明
图1是CN201110188688.7制备的固载化的核酸适配体连接臂的结构图；
图2是CN201110188688.7制备的固载化的核酸适配体连接臂在制备核酸适配体时存在两种副产物结构图；
图3是由本发明提供的一种具体的固载化的核酸适配体的连接臂(实施例1、3和4)制备的核酸适配体AS1411-A1结构图；
图4为由本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂(实施例1、3和4)制备的核仁素适配体AS1411-A1的MS图谱；
图5为由本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂(实施例2)制备的核仁素适配体AS1411-A2的MS图谱；
图6为利用按照CN201110188688.7中公开的方法制备的固载化的核酸适配体连接臂制备的核仁素适配体的AS1411-D的液相图谱；
图7为利用按照本发明提供的固载化的核酸适配体连接臂制备的核仁素适配体的AS1411-A1的液相图谱；
图8为由本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂制备的核仁素适配体AS1411-A1与紫杉醇偶合物的MS图谱；
图9为由本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂制备的核仁素适配体AS1411-A2与紫杉醇偶合物的MS图谱。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供一种固载化的核酸适配体的连接臂，该连接臂具有式1所示结构；
其中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C10的烷基，R为氨基保护基团，n为2-6的整数。
优选的，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C5的烷基，例如，C1的烷基、C2的烷基、直链或支链的C3的烷基，直链或支链的C4的烷基或直链或支链的C5的烷基。
更为优选的，R1和R2各自独立地选自于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、伯丁基和叔丁基所组成的组中。
根据本发明，R1和R2相同或不同。
根据本发明一种最为优选的实施方式，所述R1和R2均为甲基或乙基。
根据本发明，所述氨基保护基团可以为本领域公知的任意能够对氨基进行保护以避免其发生化学反应的基团，根据本发明一种优选的实施方式，所述氨基保护基团为卤素取代的乙酰基。
其中，所述卤素可以为氯或氟，优选为氟。
根据本发明，卤素取代基的个数可以为1个或多个，优选为3个。
根据本发明一种最优选的实施方式，所述氨基保护基团为三氟乙酰基。
根据本发明，n可以为2、3、4、5、6中的任意一个整数，优选的，n为2、3或4。
第二方面，本发明提供了一种固载化的核酸适配体的连接臂的制备方法，该方法包括：
(1)在第一催化剂的存在下，使丙烯腈或者ω-易离去基团取代的C3-C7的腈与丙酮缩甘油进行第一接触以发生反应，得到如式2所示的第一中间产物，式2中，n为2-6的整数，其中，ω为C3-C7的腈中与易离去基团连接的C碳原子；
(2)在第二催化剂的存在下，使所述第一中间产物和还原剂发生还原反应，以将所述第一中间产物中的氰基还原为氨基，得到如式3所示的第二中间产物；
(3)在惰性气体的保护下以及第一有机碱的存在下，将所述第二中间产物与能够提供氨基保护基团R的化合物进行第二接触，以使得氨基保护基团R与氨基相连从而对所述第二中间产物中的氨基进行保护，得到如式4所示的第三中间产物，式4中，R为氨基保护基团；
(4)将所述第三中间产物与酸进行第三接触，以脱除丙酮保护基，得到第四中间产物；
(5)在取代反应的条件下，将所述第四中间产物与式5所示的化合物接触，以使所述第四中间产物取代式5所示的化合物的X基团，得到式6所述的第五中间产物；式5中，X为卤素，式5和式6中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C10的烷基；
(6)在第二有机碱的存在下，使所述第五中间产物与丁二酸酐发生酯化反应，得到如式7所示的第六中间产物；
(7)在第三有机碱的存在下，将所述第六中间产物和氨基化的CPG接触并使得所述第六中间产物中的羧基与氨基化的CPG中的氨基进行酰胺化反应，得到式1所示的固载化的核酸适配体的连接臂；
式1中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C10的烷基，R为氨基保护基团，n为2-6的整数。
根据本发明，R1、R2、氨基保护基团R以及n的选择在以上第一方面已经进行了详细的介绍，为了避免不必要的重复，此处不再重复赘述。
步骤(1)
根据本发明，所述第一催化剂可以为常规的能够使丙烯腈或者ω-易离去基团取代的C3-C7的腈与丙酮缩甘油进行反应，得到如式2所示的第一中间产物的催化剂，例如，可以为碱性催化剂。所述碱性催化剂的种类并没有特别的限定，只要能够催化如上的反应发生即可。优选的，所述碱性催化剂为氢化钠、氢化钾、金属钠、金属钾、叔丁醇钾和二异丙胺锂中的至少一种，更优选为氢化钠或金属钠，进一步优选为金属钠。
其中，所述易离去基团可以为任意的在反应过程中被丙酮缩甘油所取代的基团，例如，可以为但不限于溴、碘、氯、对硝基苯磺酰基和对甲基苯磺酰基。
优选的，所述腈为ω-易离去基团取代的C3-C7的腈，进一步优选为溴、碘或氯取代的C3或C4的腈。
根据本发明，各物质的用量可以在较宽的范围内进行选择，只要能够发生如上的反应并生成式2所示的第一中间产物即可。优选的，相对于1mol的丙酮缩甘油，所述丙烯腈或者ω-易离去基团取代C3-C7的腈的用量为1-3mol(例如，1mol、1.2mol、1.4mol、1.6mol、1.8mol、2mol、2.2mol、2.4mol、2.6mol、2.8mol、3mol)，所述第一催化剂的用量为0.1-0.3mol(例如，0.1mol、0.12mol、0.14mol、0.16mol、0.18mol、0.2mol、0.22mol、0.24mol、0.26mol、0.28mol、0.3mol)。
根据本发明，所述第一接触的条件可以为任意的能够引起如上反应并生成如式2所示的第一中间产物的条件，优选的，所述第一接触的条件包括：温度为20-40℃，时间为1-3h。
根据本发明，所述第一接触在溶剂存在的条件下进行，所述溶剂可以为但不限于四氢呋喃、吡啶、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAC)、乙腈、丙酮或者它们任意的混合物；优选的，所述溶剂为四氢呋喃。其中，相对于1mol的丙酮缩甘油，所述溶剂的用量可以为10-15L。
根据本发明，各组分的混合方式并没有特别的限制，例如，可以直接混合在一起后进行反应，也可以分步混合后进行反应。根据本发明一种优选的实施方式，先将第一催化剂与溶剂混合，并搅拌均匀，然后再加入(优选滴加)丙酮缩甘油，搅拌一段时间，例如，1-3小时，最后加入(优选滴加)丙烯腈或者ω-易离去基团取代C3-C7的腈进行反应。
其中，在各物料加入的过程中，优选将体系保持在低温的条件下，例如，在0-10℃的条件下(例如，冰浴)进行。因此，根据本发明一种优选的实施方式，在冰浴条件下，先将第一催化剂与溶剂混合，并搅拌均匀，然后滴加丙酮缩甘油，滴加完毕后，将体系升温至室温(20-40℃)并搅拌1-3小时，之后在冰浴条件下，滴加丙烯腈或者ω-易离去基团取代C3-C7的腈，滴加完毕后，将体系升温至室温(20-40℃)进行反应。
根据本发明，在步骤(1)中，待反应完成后，还优选对反应后的物料进行萃取，得到纯度较高的式2所示的第一中间产物。其中，所述萃取的方法没有特别的限制，只要能够将式2所示的第一中间产物从体系中萃取出来并提高其纯度即可。根据本发明一种优选的实施方式，在反应完成后，向体系中加水并减压蒸馏以去除溶剂，然后采用二氯甲烷萃取，收集油相，之后一次进行浓缩和减压蒸馏得到提纯的式2所示的第一中间产物。
根据本发明，在如上各优选的条件下，有利于提高式2所示的第一中间产物的得率。
步骤(2)
根据本发明，所述第二催化剂可以为常规的能够促进所述还原反应的催化剂，优选为金属催化剂。所述金属催化剂的种类并没有特别的限定，只要能够催化所述还原反应的发生即可。优选的，所述金属催化剂为氯化钴、三氯化铝、和氯化锌中的至少一种。
所述还原剂可以为任意的能够将所述第一中间产物中的氰基还原为氨基的还原剂，优选的，所述还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和四氢铝锂中的至少一种。
根据本发明，各物质的用量可以在较宽的范围内进行选择，只要能够将所述第一中间产物中的氰基还原为氨基即可。优选的，相对于1mol的第一中间产物，所述还原剂的用量为5-15mol(5mol、6mol、7mol、8mol、9mol、10mol、11mol、12mol、13mol、14mol、15mol)，所述第二催化剂的用量为1-3mol(例如，1mol、1.2mol、1.4mol、1.6mol、1.8mol、2mol、2.2mol、2.4mol、2.6mol、2.8mol、3mol)。
根据本发明，所述还原反应的条件可以为任意的能够引起所述还原反应发生并将所述第一中间产物中的氰基还原为氨基的条件，优选的，所述还原反应的条件包括：温度为20-40℃，时间为1-3h。
根据本发明，所述还原反应在溶剂存在的条件下进行，用于所述还原反应的溶剂可以为但不限于四氢呋喃、甲醇、乙醇、吡啶、二氯甲烷、或者它们任意的混合物；优选的，所述溶剂为甲醇。其中，相对于1mol的第一中间产物，所述溶剂的用量可以为2-10L。
根据本发明，用于所述还原反应的各组分的混合方式并没有特别的限制，例如，可以直接混合在一起后进行反应，也可以分步混合后进行反应。根据本发明一种优选的实施方式，先将所述第一中间产物溶于溶剂中，然后加入第二催化剂，再加入(缓慢加入，例如滴加)还原剂进行还原反应。
其中，在各物料加入的过程中，优选将体系保持在低温的条件下，例如，在0-10℃的条件下(例如，冰浴)进行。因此，根据本发明一种优选的实施方式，先将所述第一中间产物溶于溶剂中，然后加入第二催化剂，并冰浴冷却，之后在冰浴下缓慢加入还原剂，加入完毕后，将体系升温至室温(20-40℃)并搅拌1-3小时进行还原反应。
根据本发明，在步骤(2)中，待还原反应完成后，还优选对反应后的物料进行纯化，得到纯度较高的式3所示的第二中间产物。其中，所述纯化的方法可以采用本领域常规的方法，根据本发明一种优选的实施方式，向还原反应后的物料中加入氨水(例如，浓氨水，相对于1mol的丙酮缩甘油，浓氨水的用量可以为1-3L)并过滤，之后用溶剂洗涤滤饼，然后将所有滤液混合并浓缩和减压蒸馏，得到式3所示的第二中间产物。
根据本发明，在如上各优选的条件下，有利于提高式3所示的第二中间产物的得率。
步骤(3)
根据本发明，所述惰性气体可以为常规使用的各种惰性气体，例如，可以为氮气、氩气或氦气。
根据本发明，所述能够提供氨基保护基团R的化合物可以为在接触反应的过程中能够使氨基保护基团R取代所述第二中间产物中氨基上氢原子的任意物质，优选为酸酐，例如，可以为卤素取代的乙酸酐。
其中，所述卤素可以为氯或氟，优选为氟。
根据本发明，卤素取代基的个数可以为1个或多个，优选3个。
根据本发明一种最优选的实施方式，所述能够提供氨基保护基团R的化合物为三氟乙酸酐。
所述第一有机碱种类并没有特别的限制，只要能够为体系提供碱性环境，且有助于氨基保护基团R与氨基相连即可。优选的，所述第一有机碱为吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者它们任意的混合物，更优选为三乙胺。
根据本发明，各物质的用量可以在较宽的范围内进行选择，只要能够将氨基保护基团R与第二中间产物的氨基相连即可。优选的，相对于1mol的第二中间产物，能够提供氨基保护基团R的化合物的用量为0.8-1.5mol(例如，0.8mol、0.9mol、1mol、1.1mol、1.2mol、1.3mol、1.4mol、1.5mol)，所述第一碱性物质的用量为0.8-1.5mol(例如，0.8mol、0.9mol、1mol、1.1mol、1.2mol、1.3mol、1.4mol、1.5mol)。
根据本发明，所述第二接触的条件可以为任意的能够将氨基保护基团R与第二中间产物的氨基相连的条件，优选的，所述第二接触的条件包括：温度为20-40℃，时间为1-3h。
根据本发明，所述第二接触在溶剂存在的条件下进行，用于所述第二接触的溶剂可以为但不限于四氢呋喃、吡啶、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAC)、乙腈、丙酮或者它们任意的混合物；优选的，所述溶剂为四氢呋喃或二氯甲烷，更优选为四氢呋喃。其中，相对于1mol的第二中间产物，所述溶剂的用量可以为1-3L。
根据本发明，用于所述还原反应的各组分的混合方式并没有特别的限制，例如，可以直接混合在一起后进行反应，也可以分步混合后进行反应。根据本发明一种优选的实施方式，在溶剂的存在下，将所述第二中间产物与第一有机碱混合，然后加入(例如，滴加)能够提供氨基保护基团R的化合物，进行第二接触反应，以将氨基保护基团R与第二中间产物的氨基相连。
其中，在各物料加入的过程中，优选将体系保持在低温的条件下，例如，在0-10℃的条件下(例如，冰浴)进行。因此，根据本发明一种优选的实施方式，在溶剂的存在下，将所述第二中间产物与第一有机碱混合，并冰浴冷却，之后在冰浴下缓慢加入能够提供氨基保护基团R的化合物，加入完毕后，将体系升温至室温(20-40℃)进行第二接触反应。
根据本发明，在步骤(3)中，待第二接触反应完成后，还优选对反应后的物料进行纯化，得到纯度较高的式4所示的第三中间产物。其中，所述纯化的方法可以采用本领域常规的方法，根据本发明一种优选的实施方式，向第二接触反应后的物料中加入碳酸钠溶液(优选饱和碳酸钠溶液)，然后加入溶剂萃取，收集油相，然后将油浓缩和减压蒸馏，得到式4所示的第三中间产物。
根据本发明，在如上各优选的条件下，有利于提高式4所示的第三中间产物的得率。
步骤(4)
根据本发明，所述酸为任意的能够将第三中间产物上的酮基(丙酮基)脱除的酸，优选为盐酸、三氯乙酸、三氟乙酸、乙酸、甲酸或者它们的混合物。
根据本发明，所述酸的用量没有特别的限制，只要能够将所述酮基脱除即可。优选的，相对于1mol的第三中间产物，所述酸的用量为1-3L，其中，所述酸为稀酸，例如，1-10重量％的稀盐酸。
根据本发明，所述第三接触的条件可以为任意的能够将第三中间产物上的酮基脱除的条件，优选的，所述第三接触的条件包括：温度为20-40℃，时间为2-6h。
根据本发明，所述第三接触在溶剂存在的条件下进行，用于所述第三接触的溶剂可以为但不限于四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAC)、乙腈、丙酮或者它们任意的混合物；优选的，所述溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃。其中，相对于1mol的第三中间产物，所述溶剂的用量可以为1-3L。
根据本发明进一步优选的实施方式，所述第三接触在四氢呋喃的存在下进行。
根据本发明，用于所述第三接触的各组分的混合方式并没有特别的限制，例如，可以直接混合在一起后进行反应，也可以分步混合后进行反应。根据本发明一种优选的实施方式，先将所述第三中间产物溶于溶剂中，然后加入酸进行第三接触反应。
根据本发明，在步骤(4)中，待第三接触反应完成后，还优选对反应后的物料进行纯化，得到纯度较高的第四中间产物。其中，所述纯化的方法可以采用本领域常规的方法，根据本发明一种优选的实施方式，向第三接触反应后的物料中加入无水乙醇浓缩并减压蒸馏，得到第四中间产物。
根据本发明，在如上各优选的条件下，有利于提高第四中间产物的得率。
步骤(5)
根据本发明，各物质的用量可以在较宽的范围内进行选择，只要能够使得所述第四中间产物取代式5所示化合物中的X基团即可。优选的，相对于1mol的第三中间产物，式5所示的化合物的用量为0.1-1mol(0.1mol、0.15mol、0.2mol、0.25mol、0.3mol、0.35mol、0.4mol、0.45mol、0.5mol、0.55mol、0.6mol、0.65mol、0.7mol、0.75mol、0.8mol、0.85mol、0.9mol、0.95mol、1mol)。
根据本发明，所述取代反应的条件可以为任意的能够使得所述第四中间产物取代式5所示化合物中的X基团的条件，优选的，所述取代反应的条件包括：温度为20-40℃，时间为3-8h。
根据本发明，所述取代反应在溶剂存在的条件下进行，用于所述取代反应的溶剂可以为但不限于吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAC)、乙腈、丙酮或者它们任意的混合物。其中，相对于1mol的第三中间产物，所述溶剂的用量可以为1-5L。
根据本发明一种特别优选的实施方式，所述取代反应在二氯甲烷和吡啶的存在下进行，所述二氯甲烷可以作为溶剂，所述吡啶可以作为催化剂。
根据本发明，用于所述取代反应的各组分的混合方式并没有特别的限制，例如，可以直接混合在一起后进行反应，也可以分步混合后进行反应。根据本发明一种优选的实施方式，先将所述第四中间产物溶于溶剂中，搅拌均匀，然后加入式5所示化合物，在搅拌的条件下进行所述取代反应。
根据本发明一种优选的实施方式，式5所示化合物分多次加入，优选为3-5次。
根据本发明，在步骤(5)中，待取代反应完成后，还优选对反应后的物料进行纯化，得到纯度较高的式6所示的第五中间产物。其中，所述纯化的方法可以采用本领域常规的方法，根据本发明一种优选的实施方式，向取代反应后的物料中加入无水乙醇浓缩，并减压蒸馏，收集馏出物，并在所述馏出物中加入溶剂(二氯甲烷)溶解，再使用碳酸氢钠溶液(饱和碳酸氢钠溶液)洗涤，收集油相并干燥浓缩，最后将浓缩产物柱层析纯化(石油醚：乙酸乙脂1-3：1)得到式6所示的第五中间产物。
根据本发明，在如上各优选的条件下，有利于提高式6所示的第五中间产物的得率。
步骤(6)
所述第二有机碱种类并没有特别的限制，只要能够为体系提供碱性环境，且有助于使所述第五中间产物与丁二酸酐发生酯化反应即可。优选的，所述第二有机碱为吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者它们任意的混合物，更优选为4-二甲氨基吡啶。
根据本发明，各物质的用量可以在较宽的范围内进行选择，只要能够使所述第五中间产物与丁二酸酐发生酯化反应即可。优选的，相对于1mol的第五中间产物，丁二酸酐的用量为1-2mol(1mol、1.2mol、1.4mol、1.6mol、1.8mol、2mol)，所述第二有机碱的用量为0.5-1.5mol(例如，0.5mol、0.7mol、0.9mol、1.1mol、1.3mol、1.5mol)。
根据本发明，所述酯化反应的条件可以为任意的能够使所述第五中间产物与丁二酸酐发生酯化反应的条件，优选的，所述酯化反应的条件包括：温度为20-40℃，时间为5-15h。
根据本发明，所述酯化反应在溶剂存在的条件下进行，用于所述酯化反应的溶剂可以为但不限于吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAC)、乙腈、丙酮或者它们任意的混合物。其中，相对于1mol的第五中间产物，所述溶剂的用量可以为5-15L。
根据本发明一种特别优选的实施方式，所述酯化反应在二氯甲烷和吡啶的存在下进行，所述二氯甲烷可以作为溶剂，所述吡啶可以作为催化剂。
根据本发明，用于所述酯化反应的各组分的混合方式并没有特别的限制，例如，可以直接混合在一起后进行反应，也可以分步混合后进行反应。根据本发明一种优选的实施方式，先将第五中间产物溶于溶剂(相对于1mol的第五中间产物，所述溶剂的用量可以为2-5L)中，然后加入丁二酸酐和溶于溶剂中的第二有机碱(相对于1mol的第二有机碱，所述溶剂的用量可以为3-10L)，在搅拌的条件下进行所述酯化反应。
根据本发明，在步骤(6)中，待酯化反应完成后，还优选对反应后的物料进行纯化，得到纯度较高的式7所示的第六中间产物。其中，所述纯化的方法可以采用本领域常规的方法，根据本发明一种优选的实施方式，向酯化反应后的物料中加入无水乙醇，减压蒸馏去溶剂，然后柱层析(石油醚：乙酸乙脂0.5-1.5：1)得到式7所示的第六中间产物。
根据本发明，在如上各优选的条件下，有利于提高式7所示的第六中间产物的得率。
步骤(7)
所述第三有机碱种类并没有特别的限制，只要能够为体系提供碱性环境，且有助于所述第六中间产物中的羧基与氨基化的CPG中的氨基进行酰胺化反应即可。优选的，所述第三有机碱为吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者它们任意的混合物，更优选为4-二甲氨基吡啶和/或吡啶，进一步优选为4-二甲氨基吡啶和吡啶。
根据本发明，各物质的用量可以在较宽的范围内进行选择，只要能够使所述第六中间产物中的羧基与氨基化的CPG中的氨基进行酰胺化反应即可。优选的，相对于1mol氨基化的CPG，所述第六中间产物是过量的，例如，所述的第六中间产物的用量可以为2-5mol(2mol、2.5mol、3mol、3.5mol、4mol、4.5mol、5mol)，所述第二催化剂的用量可以为25-40mol(例如，25mol、27mol、29mol、31mol、33mol、35mol、37mol、40mol)。
根据本发明，所述酰胺化反应的条件可以为任意的能够引起所述酰胺化反应发生的条件，优选的，所述酰胺化反应的条件包括：温度为20-40℃，时间为20-30h。
根据本发明，所述酰胺化反应在溶剂存在的条件下进行，用于所述酰胺化反应的溶剂可以为但不限于四氢呋喃、吡啶、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAC)、乙腈、丙酮或者它们任意的混合物；优选的，所述溶剂为乙腈(干燥乙腈)。其中，相对于1mol的第六中间产物，所述溶剂的用量可以为5-15L。
根据本发明，为了促进所述酰胺化反应的发生，优选的，该方法还包括在所述酰胺化反应之前，使用羧基活化剂对所述第六中间产物中的羧基进行活化。
其中，所述羧基活化剂的加入时机并没有特别的限制，例如，可以在所述酰胺化反应发生之前，将所述第六中间产物中的羧基单独进行活化，也可以将所述羧基活化剂、氨基化的CPG以及第三有机碱直接进行混合，边对所述羧基活化边进行酰胺化反应。为了简化操作，本发明优选后者。
根据本发明，所述羧基活化剂可以为任意的能够将第六中间产物中的羧基进行活化同时对其他基团不会产生影响的试剂，优选的，所述羧基活化剂为环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐-N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酚、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯和4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐中的至少一种，更优选为二异丙基碳二亚胺。
根据本发明，为了提高终产物式1所示的固载化的核酸适配体的连接臂的纯度，在步骤(7)所述的酰胺化反应结束后，该方法还优选包括向酰胺化反应后的物料中加入氨基封闭剂以对未反应的氨基化的CPG中的氨基进行封闭，并对封闭后的物料进行过滤。
优选的，所述氨基封闭剂为酸酐，更优选为乙酸酐。
优选的，相对于1mol所述的第六中间产物，所述氨基封闭剂的用量为3-10mol(例如，3mol、4mol、5mol、6mol、7mol、8mol、9mol、10mol)。
根据本发明，为了促进封闭反应的进行，还优选向酰胺化反应后的物料中加入四氢呋喃、吡啶和N-甲基咪唑。优选的，相对于1mol所述的第六中间产物，四氢呋喃的用量为5-15L，吡啶的用量为4-10mol，N-甲基咪唑的用量为4-10mol。
根据本发明，封闭反应的条件优选包括：温度为20-40℃，时间为3-5h。
根据本发明，在步骤(7)中，待封闭反应完成后，还优选对封闭后的物料进行纯化，得到纯度较高的式1所示的固载化的核酸适配体的连接臂。其中，所述纯化的方法可以采用本领域常规的方法，根据本发明一种优选的实施方式，将封闭后的物料进行固液分离，之后用乙腈：吡啶按4-8：1配比洗涤，再使用乙腈洗涤，最后抽干即得式1所示的固载化的核酸适配体的连接臂。
第三方面，本发明提供了如上所述的方法制备的固载化的核酸适配体的连接臂。
第四方面，本发明提供了如上所述的固载化的核酸适配体的连接臂在制备核酸适配体-药物偶合物中的应用。
根据本发明，所述核酸适配体可以为本领域常规使用的任意核酸适配体，根据本发明一种具体的实施方式，所述核酸适配体为核仁素适配体AS1411，其具有如SEQ ID NO:1(5-GGT GGT GGT GGTTGT GGT GGT GGT GG-3)所示的核酸序列。
根据本发明，所述药物可以为本领域常规的用于和核酸适配体偶合的药物，例如，抗癌药物。
根据本发明一种优选的实施方式，所述药物选自紫杉醇、美登素、MMAE、MMAF、雷甲素等。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所用的试剂均为市售产品。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂的合成
(1)第一中间产物的合成
将0.8g氢化钠(60重量％，20mmol)悬浮于250mL无水四氢呋喃中，冰水浴下搅拌，滴加13.2g化合物1丙酮缩甘油(100mmol)，滴加完毕，逐渐升温至室温，搅拌2小时，冰水浴冷却下滴加13.2mL丙烯腈(200mmol)，滴加完毕，室温搅拌2小时，加50mL水，减压蒸去四氢呋喃，用二氯甲烷萃取，收集油相，浓缩，减压蒸馏得到16.8g油状物(产率90.9％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ1.35(s,3H),1.41(s,3H),2.61(t,J＝6.3Hz,2H),3.51-3.58(m,2H),3.69-3.76(m,3H),4.05(dd,J＝8.2Hz,J＝6.4Hz,1H),4.23(m,1H).HRMS calcd forC9H15NO3 185.1052,found 185.2087，证明得到的油状物中含有化合物2。
(2)第二中间产物的合成
取9.25g化合物2(50mmol)溶于300ml甲醇中，加入23.79g六水合氯化钴(100mmol)，冰水浴冷却，缓慢加入18.92g硼氢化钠(500mmol)，加完自然升温至室温，搅拌2小时后加入100mL浓氨水，过滤，用甲醇洗涤滤饼，收集滤液，浓缩，减压蒸馏得到4.75g油状物(产率50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ1.35(s,5H),1.40(s,3H),1.70(m,2H),2.77(t,J＝6.8Hz,2H),3.38-3.57(m,4H),3.70(dd,J＝8.2Hz,J＝6.3Hz,1H),4.05(dd,J＝8.2Hz,J＝6.3Hz,1H),4.24(m,1H).HRMS calcd for C9H19NO3 189.2521,found 189.2032，证明得到的油状物中含有化合物3。
(3)第三中间产物的合成
氮气氛下将10g化合物3(53mmol)和9mL三乙胺(64mmol)加入100mL二氯甲烷中搅拌，冰水浴下滴加9mL三氟乙酸酐(64mmol)，滴加完毕自然升温至室温，加入饱和碳酸氢钠溶液分层，二氯甲烷萃取，收集油相浓缩，减压蒸馏得到13.54g油状物(产率89.6％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ1.32(s,3H),1.40(s,3H),1.84(m,2H),3.40-3.52(m,4H),3.60-3.68(m,3H),4.03(dd,J＝8.2Hz,J＝6.3Hz,1H),4.24(m,1H),7.37-7.43(m,1H).HRMS calcdfor C11H18F3NO4 285.1188,found 285.1104，证明得到的油状物中含有化合物4。
(4)第四、五中间产物的合成
将1.48g化合物4(5mmol)溶于11mL四氢呋喃中，室温搅拌，加入10mL水，滴加1mL浓盐酸，室温搅拌4小时，加入无水乙醇浓缩，减压蒸馏得到0.58g油状物。将得到的油状物溶于15mL无水吡啶中，室温搅拌，分四批加入0.8g 4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(2.4mmol)，室温搅拌5小时，加入5mL无水乙醇，减压蒸馏至无油状物蒸出，往残余物中再加入5mL无水乙醇，减压蒸馏至无油状物蒸出。收集馏出物，加入20mL二氯甲烷溶解，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，收集油相，用无水硫酸钠干燥，浓缩，石油醚：乙酸乙脂2：1过柱，得到0.5g产物(产率18.3％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ1.73(m,2H),3.18(d,J＝5.6Hz,2H),3.30-3.40(m,2H),3.44-3.56(m,4H),3.72(s,6H),3.90-3.96(m,1H),6.80(d,J＝8.4Hz,4H),7.14-7.20(m,1H),7.22-7.29(m,2H),7.31(d,J＝8.4Hz,4H),7.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.66-7.73(m,1H).HRMS calcd for C29H32F3NO6 547.2182,found 547.2173，证明得到的产物中含有化合物5。
(5)第六中间产物的合成
将3.75g化合物5(6.8mmol)溶于20mL无水吡啶中，加入1.03g丁二酸酐(10.3mmol)和0.83g 4-二甲氨基吡啶(6.8mmol)的40mL无水吡啶溶液，室温搅拌10小时，加入无水乙醇，减压蒸去溶剂，石油醚：乙酸乙脂1：1过柱，得到2.9g产物(产率65.8％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ1.70-1.80(m,2H),2.60-2.70(m,4H),3.19(d,J＝5.6Hz,2H),3.30-3.40(m,2H),3.42-3.50(m,1H),3.50-3.60(m,2H),3.64-3.72(m,2H),3.76(s,6H),5.17-5.24(m,1H),6.80(d,J＝8.4Hz,4H),7.12-7.30(m,8H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H).HRMS calcd forC33H36F3NO9 647.2342,found 647.2339，证明得到的产物中含有化合物6。
(6)本发明的固载化的核酸适配体的连接臂的制备
将0.13g(0.2mmol)化合物6溶于18mL干燥乙腈中，加入吡啶3mL，80mg 4-二甲氨基吡啶(0.65mmol)，4.2g氨基化的CPG(79μm/g，购自Chem Gene Corporation，货号11040491)(0.65mmol)，0.1mL二异丙基碳二亚胺(0.65mmol)，摇动24小时后，加入17mL四氢呋喃，1mL乙酸酐(10.6mmol)，1mL吡啶(12.4mmol)和1mL N-甲基咪唑(12.5mmol)，摇动4小时后，过滤，用乙腈：吡啶6：1洗涤，再用乙腈洗涤，抽干，得到终产物。取部分产物氨解后检测，得到的产物中含有化合物5，证明成功获得了本发明的固载化的核酸适配体的连接臂。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂的合成
按照实施例1的方法进行固载化的核酸适配体的连接臂的合成，不同的是，步骤(1)中，将丙烯腈替换为4-溴丁腈。取部分产物氨解后检测，证明成功获得了本发明的固载化的核酸适配体的连接臂，各步骤的产率如表1所示。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂的合成
按照实施例1的方法进行固载化的核酸适配体的连接臂的合成，不同的是，步骤(4)中，将4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷替换为等摩尔量的4,4'-二丁氧基三苯基氯甲烷。取部分产物氨解后检测，证明成功获得了本发明的固载化的核酸适配体的连接臂，各步骤的产率如表1所示。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的固载化的核酸适配体的连接臂的合成
按照实施例1的方法进行固载化的核酸适配体的连接臂的合成，不同的是，第一中间产物的合成中用金属钠代替氢化钠，第一中间产物的合成中用3-溴代丙腈代替丙烯腈，第三中间产物的合成中用四氢呋喃代替二氯甲烷，第四、五中间产物的合成用二氯甲烷作为溶剂，加吡啶作为催化剂，第六中间产物的合成用二氯甲烷做溶剂，加吡啶做作为催化剂，取部分产物氨解后检测，证明成功获得了本发明的固载化的核酸适配体的连接臂，各步骤的产率如表1所示。
表1
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由表1可以看出，在本发明优选制备方法下，各中间产物的得率能够进一步提高。
测试例1
利用实施例1-4得到的固载化的核酸适配体连接臂进行核酸适配体的合成。
以实施例1-4得到的固载化的核酸适配体连接臂为起点，采用经典的四步合成法在固相合成仪上完成。粗品用高效液相色谱分离纯化得到带有连接臂的核仁素适配体AS1411(序列如SEQ ID NO:1(5-GGT GGT GGT GGTTGT GGT GGT GGT GG-3)所示)。
高效液相色谱在waters UPLC-UV/Vis上进行，分离条件如下：
色谱柱：XBridge Shield RP18，3.5um，4.6*50mm；
柱温：40℃；
流动相：乙腈/乙酸的氨水溶液，梯度洗脱；
流速：1.5mL/min。
测试例1：利用实施例1得到的固载化的核酸适配体连接臂制备得到的带有连接臂的核仁素适配体AS1411-A1(图3所示)，MS：calculated 8482.2,found 8483.3。
测试例2：利用实施例2得到的固载化的核酸适配体连接臂制备得到的带有连接臂的核仁素适配体AS1411-A2，MS：calculated 8496.6,found 8494.2。
测试例3：利用实施例3得到的固载化的核酸适配体连接臂制备得到的带有连接臂的核仁素适配体AS1411-A1(图3所示)，MS：calculated 8482.2,found 8483.3。
测试例4：利用实施例4得到的固载化的核酸适配体连接臂制备得到的带有连接臂的核仁素适配体AS1411-A1(图3所示)，MS：calculated 8482.2,found 8483.3。
其中，AS1411-A1的MS图谱如图4所示，AS1411-A2的MS图谱如图5所示。
测试例2
按测试例1的方法进行核酸适配体的合成，不同的是，采用的是CN201110188688.7得到的固载化的核酸适配体连接臂(如图1所示)，从液相色谱可以看出，利用按照CN201110188688.7中公开的方法制备的固载化的核酸适配体连接臂来制备带有连接臂的核仁素适配体AS1411-D。
对AS1411-A1和AS1411-D进行液相色谱测试，AS1411-D液相图谱显示出和主峰接近的肩峰(出峰时间9.297)(如图6所示)，可能是异构化得到的产物。而按照本发明得到固载化的核酸适配体连接臂来制备带有连接臂的核仁素适配体AS1411-A1，其液相图谱显示为一个峰(出峰时间9.112)(如图7所示)。
测试例3
核仁素适配体AS1411-紫杉醇偶合物的合成
取20mg紫杉醇衍生物8(14.71μmol)于1.5mL离心管中，加入120μL的DMF，涡旋振荡使充分溶解后，加入10.37mg HATU(27.29μmol)和20μL DIPEA的127μL的DMF溶液，振荡60分钟后，加入150nmol的测试例1和测试例2制备的带有连接臂的核仁素适配体AS1411的30μL去离子水溶液，放在摇床上振荡20小时后用高效液相色谱分离纯化得到纯品9。
实施例1：3-5：MS：calculated 9822.8，found 9826.0，如图8所示。
实施例2：MS：calculated 9836.6，found 9832.9，如图9所示。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 赣南医学院
<120> 固载化的核酸适配体的连接臂及其制备方法和应用
<130> GZI00597GNYXY
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 核仁素适配体AS1411
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26

Claims (32)

1.一种固载化的核酸适配体的连接臂，其特征在于，该连接臂具有式1所示结构；
式1
其中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C10的烷基，R为氨基保护基团，n为2-6的整数；
所述氨基保护基团为氯或氟取代的乙酰基。
2.根据权利要求1所述的连接臂，其中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C5的烷基。
3.一种权利要求1所述的固载化的核酸适配体的连接臂的制备方法，其特征在于，该方法包括：
（1）在第一催化剂的存在下，使丙烯腈或者ω-易离去基团取代的C3-C7的腈与丙酮缩甘油进行第一接触以发生反应，得到如式2所示的第一中间产物；
式2
（2）在第二催化剂的存在下，使所述第一中间产物和还原剂发生还原反应，以将所述第一中间产物中的氰基还原为氨基，得到如式3所示的第二中间产物；
式3
（3）在惰性气体的保护下以及第一有机碱的存在下，将所述第二中间产物与能够提供氨基保护基团R的化合物进行第二接触，以使得氨基保护基团R与氨基相连从而对所述第二中间产物中的氨基进行保护，得到如式4所示的第三中间产物；
式4
（4）将所述第三中间产物与酸进行第三接触，以脱除丙酮保护基，得到第四中间产物；
（5）在取代反应的条件下，将所述第四中间产物与式5所示的化合物接触，以使所述第四中间产物取代式5所示的化合物的X基团，得到式6所述的第五中间产物；
式5 式6
（6）在第二有机碱的存在下，使所述第五中间产物与丁二酸酐发生酯化反应，得到如式7所示的第六中间产物；
式7
（7）在第三有机碱的存在下，将所述第六中间产物和氨基化的CPG接触并使得所述第六中间产物中的羧基与氨基化的CPG中的氨基进行酰胺化反应，得到式1所示的固载化的核酸适配体的连接臂；
式1，
上述式中，R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C10的烷基，R为氯或氟取代的乙酰基，n为2-6的整数，ω为C3-C7的腈中与易离去基团连接的C碳原子，X为卤素。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，
步骤（1）中：
所述第一催化剂为碱性催化剂；
步骤（2）中：
所述第二催化剂为金属催化剂；
步骤（4）中：
所述酸为盐酸、三氯乙酸、三氟乙酸、乙酸和甲酸中的至少一种；
步骤（5）中：
R1和R2各自独立地选自直链或支链的C1-C5的烷基；
步骤（6）中：
所述第二有机碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的至少一种；
步骤（7）中：
所述第三有机碱为吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者它们任意的混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（1）中所述第一催化剂为氢化钠、氢化钾、金属钠、金属钾、叔丁醇钾和二异丙胺锂中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（1）中所述易离去基团选自溴、碘、氯、对硝基苯磺酰基和对甲基苯磺酰基中的一种。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（1）中相对于1mol的丙酮缩甘油，丙烯腈或者ω-易离去基团取代C3-C7的腈的用量为1-3mol，所述第一催化剂的用量为0.1-0.3mol。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（1）中所述第一接触的条件包括：温度为20-40℃，时间为1-3h。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述金属催化剂为氯化钴、三氯化铝和氯化锌中的至少一种。
10.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（2）中所述还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和四氢铝锂中的至少一种。
11.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（2）中相对于1mol的第一中间产物，所述还原剂的用量为5-15mol，所述第二催化剂的用为1-3mol。
12.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（2）中所述还原反应的条件包括：温度为20-40℃，时间为1-3h。
13.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（3）中所述能够提供氨基保护基团R的化合物为酸酐。
14.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（3）中所述第一有机碱为吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者它们任意的混合物。
15.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（3）中相对于1mol的第二中间产物，能够提供氨基保护基团R的化合物的用量为0.8-1.5mol，所述第一碱性物质的用量为0.8-1.5mol。
16.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（3）中所述第二接触的条件包括：温度为20-40℃，时间为1-3h。
17.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（4）中所述第三接触的条件包括：温度为20-40℃，时间为2-6h。
18.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（5）中相对于1mol的第三中间产物，式5所示的化合物的用量为0.1-1mol。
19.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（5）中所述取代反应的条件包括：温度为20-40℃，时间为3-8h。
20.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（6）中相对于1mol的第五中间产物，丁二酸酐的用量为1-2mol，所述第二有机碱的用量为0.5-1.5mol。
21.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（6）中所述酯化反应的条件包括：温度为20-40℃，时间为5-15h。
22.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（7）中相对于1mol氨基化的CPG，所述的第六中间产物的用量大于1mol，所述第三有机碱的用量为25-40mol。
23.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（7）中相对于1mol氨基化的CPG，所述的第六中间产物的用量为2-5mol。
24.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（7）中所述酰胺化反应的条件包括：温度为20-40℃，时间为20-30h。
25.根据权利要求4所述的方法，其中，该方法还包括：向步骤（7）所得反应产物中加入氨基封闭剂以对未反应的氨基化的CPG中的氨基进行封闭，并对封闭后的物料进行过滤，得到式1所示的固载化的核酸适配体的连接臂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述氨基封闭剂为酸酐。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，相对于1mol所述的第六中间产物，所述氨基封闭剂的用量为3-10mol。
28.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（7）中，在所述酰胺化反应之前，还包括使用羧基活化剂对所述第六中间产物中的羧基进行活化。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述羧基活化剂为环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐-N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酚、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯和4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐中的至少一种。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，相对于1mol所述的第六中间产物，所述羧基活化剂的用量为2-5mol。
31.权利要求1、2所述的固载化的核酸适配体的连接臂在制备核酸适配体-药物偶合物中的应用。
32.根据权利要31所述的应用，其中，所述核酸适配体的核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114441749B (zh) * 2022-01-28 2022-09-30 安源基因科技(上海)有限公司 一种新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光afp中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567811A (en) * 1990-05-03 1996-10-22 Amersham International Plc Phosphoramidite derivatives, their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
WO2006081035A2 (en) * 2004-12-30 2006-08-03 Berry & Associates, Inc. Fluorous oligonucleotide reagents and affinity purification of oligonucleotides
CN102295673A (zh) * 2011-07-07 2011-12-28 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种脂肪链修饰的寡核苷酸的结构、制备方法及用途
WO2013036748A1 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Berry, Lana, L. Bicyclo[6.1.0]non-4-yne reagents for chemical modification of oligonucleotides

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7579459B2 (en) * 2005-12-12 2009-08-25 Ngo Nam Q Activator bound solid supports for nucleic acid synthesis via the phosphoramidite approach

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567811A (en) * 1990-05-03 1996-10-22 Amersham International Plc Phosphoramidite derivatives, their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
WO2006081035A2 (en) * 2004-12-30 2006-08-03 Berry & Associates, Inc. Fluorous oligonucleotide reagents and affinity purification of oligonucleotides
CN102295673A (zh) * 2011-07-07 2011-12-28 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种脂肪链修饰的寡核苷酸的结构、制备方法及用途
WO2013036748A1 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Berry, Lana, L. Bicyclo[6.1.0]non-4-yne reagents for chemical modification of oligonucleotides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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A water-soluble nucleolin aptamer-paclitaxel;Fangfei Li 等;《Nature Communications》;20171231(第8期);1390，1-14 *

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