JPS633800A - 菌体外分泌による蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 （従来技術） 本発明は、遺伝子工学的手法を利用した菌体外分泌によ
る蛋白質の製造法に関する。

さらに具体的には、本発明は、アルカリ性ホスフ？ター
ゼ由来のブロモ−ターをコードする遺伝子を具備すると
共に、その１４１Ｇ下にシグナル配列をコードする遺伝
子をも具備したベクターに、所望外来性蛋白質をコード
する遺伝子を組込んで組換ＤＮＡとし、これを宿主微生
物（以下微生物を単に「菌」と記すこともある）細胞内
に移入させることにより宿主の形質転換を行って形質転
換体を得て、これを−定条件下で培養することにより所
望蛋白質を宿主菌体外（培地中）に分泌させたのち、培
地中から所望蛋白質を回収することよりなる遺伝子工学
的手法による蛋白質の製造法に関する。

〔先行技術〕

現在、組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学的に有用物
質を生産する方法が確立されつつあり、具体的な方法に
ついては種々の成型や文猷、会同特許公報および特許公
報を参照することができる。

このような手法による物質の生産方法は、通常、ベクタ
ーに所望物質をコードする遺伝子を組込んで造成した組
換えＤＮＡを用いて宿主微生物を形質転換し、得られた
形質転換体を培養したのち、所望物質を回収することよ
りなるものである。

このような方法によって非分泌性の蛋白質の生産を行う
場合は、゛微生物細胞内で産生された蛋白質は宿主菌の
プロテアーゼによって分解（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓＡ、　７９．
１８３０−１８３３（１９８２）　）される恐れがある
ので所望蛋白質を安定かつ人世に得ることができないと
いう問題点があった。また、このような非分泌性の蛋白
質を回収するに際しては宿主微生物を物理的に破壊した
のち、所望蛋白質の分離・精製を行うのであるから、−
般にこのような回収操作は複雑であり、そのため所望蛋
白質の収率が低かったり、活性を有するものは回収操作
中に失活する恐れもあるという問題点があった。そこで
、上記問題点に対処すべく、蛋白質の膜通過に関与する
シグナル配列〔蛋白質・核酸・酵素、２６．３８６〜３
９４　（１９８１））の作用を利用して、宿主微生物細
胞内で産生された蛋白質を細胞外あるいは１１１胞質膜
外に分泌させる方法が種々提案されたく特開昭５５−１
９０９２号、同５５−４５３９５号、同５６−１３７８
９６号、同５６−１４５２２１号、同５６−１５４９９
９号各公報等）。

ところで、上記シグナル配列を利用した遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造において組換えＤＮＡが移入され
得る宿主微生物は、大腸菌が普通である。この大腸菌は
グラム隙性菌であって、このような菌には細胞質膜およ
び外股がある（これらの膜間をペリプラズムという）と
ころ、このような菌に組換えＤＮＡを移入させて形質転
換体としてこの形質転換体を通常の培養に付すと、所望
蛋白質はべりブラズムに蓄積される。このペリプラズム
に蓄積された蛋白質は、オスモティック・ショック法（
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４０．３８６５（１
９６５））によってペリプラズムから菌体外へ放出させ
なければ回収することができない。このオスモティック
・ショック法は、まず遠心により菌体を回収したのち、
これを高１度シジ糖液〔２０％シュークロース、３０ｍ
Ｍトリス塩Ｉ！緩衝液（ｐＨ８，０）、１ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））に懸濁ざＶてから集菌し
、さらにこの菌体を冷水に懸濁させ、そして水浴中で放
置することにより所望蛋白質を含む両分を菌体外に放出
させ、ついで遠心により上清（所望蛋白質を含む）を得
る、という方法である。そして所望蛋白質を回収するに
は、さらにクロマトグラフィー等によってこの上清を処
理することになる。このように、従来から大腸菌のよう
なグラム隙性菌を宿主とし、これに蛋白質の分泌機能を
具備した組換えＤＮＡを移入させて形質転換体を得て、
これを培養することにより所望蛋白質を生産させるとい
う方法は、ダラム陽性菌（枯草菌、酵母菌等）を宿主と
した場合に比べ余分な処理操作（オスモティック・ショ
ック法）が必要となる。

しかしながら、ダラム陽性菌を宿主とする場合は、ダラ
ム陽性菌に認められる上記のような問題点はないとして
も、菌体内に移入された組換λＤＮＡの安定性に問題点
を有する上、大腸菌はど宿主−ベクター系も開発されて
おらず、また菌の取扱いも大腸菌はど容易でない。

一つの解決策 従って、大腸菌のような一般的な菌株を宿主とし、効率
よくしかも大量に所望の蛋白質を製造すべく、本発明者
らは種々検討を重ねた結果、以下のような方法を確立し
ている。すなわち、その方法は、アルカリ性ホスファタ
ーゼ由来のプロモーターをコードする遺伝子（以下プロ
モーター遺伝子という）を具備し、その制御下にシグナ
ル配列をコードする遺伝子（シグナル遺伝子）をも具備
したベクターに、所望の外来性蛋白質をコードする遺伝
子（外来性蛋白質の構造遺伝子）を組込んで組換えＤＮ
Ａを造成し、この組換えＤＮＡを宿主微生物１８ｆｉ内
に移入させて形質転換体となし、この形質転換体を一定
条件下で培養することによって所望蛋白質を菌体外（培
養液中）に分泌させ、これを回収する、という遺伝子工
学的手法による蛋白質の製造法である（特願昭６０−９
５１８１号および同６０−１２１２４９号の用細四参照
。

以下、これらを「先願発明」という。）。

この方法は前記の問題点を解決したものとして有用なも
のであるが、技術というものの通性としてこの先ｍ発明
もまた更なる改良と対象となりうる。

〔発明の概要〕

要　　旨 本発明は、上記先願発明の培養工程においてその培養条
件中、ｐＨをシフトすることにより、所望蛋白質の産生
効率が向上することを見出して完成されたものである。

従って本発明による菌体外分泌による蛋白質の製造法は
、下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程よりなること、を特徴とす
るものである。

（Ａ）　　アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモータ
ーをコードする遺伝子を具備すると共にそのｔＩＩＩｌ
ｌ下にシグナル配列をコードする遺伝子をも具備し、か
つ予定した宿主微生物細胞内で増殖可能なベクター、を
用意すること。

（Ｂ）　　上記ベクターに外来蛋白質をコードする遺伝
子を組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換え
ＤＮＡを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主
の形質転換を行って、形質転換体を得ること。

（Ｃ）　　上記形質転換体を、微生物の増殖過程におけ
る対数増殖期後期から停止期前ＹＩＡにかけて蛋白質合
成能の誘導がおこるに必要な堡の無檄燐を含有する培地
での培養に刊し、その際に蛋白質合成能の誘導が起る前
は弱酸性または中性の条件で、蛋白質合成能誘導後は弱
アルカリ性の条件で培養を行うこと。

（Ｄ）　　上記培養終了後、培地中より産生外来性蛋白
質を回収すること。

効　　果 このように本発明は、ダラム陰性菌（大腸菌）を用いた
遺伝子工学的手法による蛋白質の造成にあたり、従来の
ように所望蛋白質をペリプラズムに留めることなく菌体
外（培地中）への分泌を行わせるべく、（イ）アルカリ
性ホスファターゼ由来のプロモーター遺伝子を具備し、
その制御２１１″Ｆにシグナル遺伝子をも具備するもの
であって、かつ（ロ）予定した宿主細胞内で増殖可能な
ベクターを用意し、ついでこれに所望の外来性蛋白質の
構造遺伝子を組込んで組換えＤＮＡとし、これを宿主菌
に移入させることによって形質転換体を得て、これを−
定条件下（前記の工程（Ｃ）で）培養することにより所
望蛋白質を菌体外（培地中）に分泌させ、これを回収す
ることからなる遺伝子工学的手法による蛋白質の製造方
法に関するものである。

本発明の好ましい態様は、上記（イ）および（０）より
なるベクターが、そのシグナル遺伝子の下流側末端直後
に所望の外来性蛋白質の禍造遺転子を結合し得るように
仕組まれたものを用いる方法である。そして、シグナル
遺伝子の直優に外来性蛋白質の構造遺伝子の導入を容易
にしようとするならば、シグナル遺伝子の塩基対の少な
くとも一つを構成員の少なくとも一部として人工的に創
出されたｍ１１１限酵素認識部位を有するものを用いる
とよい。

この制限酵素認識部位を創出するに当っては、ＤＮＡ塩
基対からなるコドンには縮重があるということを巧みに
利用することができる。すなわら、創出されたυ１限酵
素認識／切断部位を該制限酵素で切断すれば、その切［
１部位がシグナル遺伝子の下流側末端に接して存在する
場合は、該制限酵素切断端と相補性の端部を上流側に形
成させた外来性遺伝子を用意してこれを上記切断端にお
いてシグナル遺伝子と結合させることによってシグナル
遺伝子の下流側に外来性遺伝子を直結さＶることができ
る。また、シグナル遺伝子の切断部位が該遺伝子の下流
側末端より上流側に存在づる場合は、該遺伝子の該切断
部位より下流側の部分を合成して外来性遺伝子の上流側
に結合した断片を用意して上記と同じ結合を行えば、−
旦切断されたシグナル遺伝子がＤＮＡの両鏡につりで復
元されると共にその下流側に外来性遺伝子が直結された
構造が実現される（詳細後記）。

このようなベクターに所望外来性蛋白質の構造遺伝子を
組込んで組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡで宿主菌
を形質転換して形質転換体を得て、これを−定条件下（
本発明の工程（Ｃ）により）で培養すれば、宿主菌が大
腸菌のようなグラム陽性菌であっても、所望蛋白質はべ
りブラズムに蓄積するこ・となく菌体外（培養液中）ま
で分泌される。そして培養中から所望外来性蛋白質を回
収することにより本発明目的が達成される。

従って、本発明は、下記の利点を有するものである。

（１）　　３ｍ！伝子玉子工学的による蛋白質の製造・
回収工程が簡素化される。

本発明の方法に従えば、上記（イ）およＴｊ（０）の要
件を満すベクターに所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を
組込んでなる組換えＤＮＡで宿主微生物を形質転換して
形質転換体を得てこれを培養すれば、所望蛋白質は成熟
蛋白質として（シグナル配列は蛋白質がペリプラズムに
分泌されるときに切断されている）培養液中まで分泌さ
れる。すなわち、形質転換された宿主微生物をオスモテ
ィック・ショック法に付すことなく、培養液中から蛋白
質を回収するだけでよいのである。従って、遺伝子工学
的手法による蛋白質の製造・回収工程が簡素化されるこ
とになる。

なお、本発明方法はグラム陽性菌にも適用されるのであ
るが、枯草菌のようなグラム陽性菌はべりプラズムがな
いので、本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中に
まで分泌されるということはいうまでもない。

（２）　所望蛋白質の′ｒａ製が容易である。

本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中まで分泌さ
れ、その分泌の際にシグナル配列は膜醇素によって切断
されるのでシグナル配列が付着していない蛋白質が得ら
れる。ここで得られる蛋白質は、シグナル配列をコード
する遺伝子と所望蛋白質をコードする遺伝子との門に余
分な遺伝子（リンカ−としてＤＮＡ遺伝子）が存在すれ
ば、余分なアミノ酸を付着したままで分泌される。しか
しながら、本発明の一興体例で示されたようにシグナル
配列をコードする遺伝子の直後に所望蛋白質をコードす
る遺伝子を結合しておけば、所望蛋白質は余分なアミノ
酸が付着することな（完全な成熟蛋白質として培養液中
に分泌される。従って、形質転換体の培養を菌体が溶菌
していない時期に終了しておけば、培養液中には実質的
に所望蛋白質お、よび培養液の構成成分のみが存在り゛
ることになる。使用した培養液はその構成成分が判って
いるのであるから、従って、目的蛋白質の精製は容易で
ある。

（３）　先願発明よりも蛋白質の生産効率がよい。

先願発明の工程（Ｃ）において培養温度を培養中にシフ
トすることにより生産効率の向上（先願発明の少なくと
も１．５倍）が実現した。

（発明の詳細な説明） 本発明は菌体外分泌による蛋白質の製造法に係るもので
あるところ、この方法は工程（Ａ）〜（Ｄ）よりなるも
のである。

工程（Ａ）／ベクターの用意 本発明に用いるベクターは、本発明の工程（Ｃ）におけ
る培養方法が、アルカリ性ホスファターゼが無曙燐の存
在鼾により影響を受ける（　ａｔｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、３８．　４６０（１９６
０））、Ｎａｔｕｒｅ、　　１８３　。

１５２９（１９５９）　）という事実を利用するもので
あるところから、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロ
モーター遺伝子を具備することが要件であり、そして、
さらに、蛋白質の分泌に関与するシグノ”ル遺転子をそ
の制御下に具＠するものであり、また、予定した宿主ｍ
胞内で増殖可能なちの（前記（イ）および（ロ）の要件
を満すベクター）であればよい。

そして、このようなベクターとして特に好ましいものは
、（イ）および（ロ）の必須要件を具備したうえ、シグ
ナル遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質の構
造遺伝子を結合させ得るように仕組れたものＴ：ある。

この好ましいベクター（プラスミド）の具体例としては
、本発明者らの共同研究者によって先に提案されたプラ
スミドｐＴＡ５２９　（特願昭５８−１４０７４８号）
、１）ＴＡ１５２９　（特願昭５９−１５９７０３号）
　、ｐＴＡ２５３９　（特願昭５９−２７９５８５号）
等がある。これらのプラスミドはいずれもアルカリ性ホ
スファターゼ由来のプロモーターおよびシグナル配列（
前二者についてはアルカリ性ホスファターゼ由来、ｐＴ
Ａ２５３９はβ−ラクタマーゼ由来）を具備するもので
あり、かつシグナル配列をコードする遺伝子の直後に外
来性蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なものである。こ
こでｏＴＡ１５２９は、ｐＴＡ５２９（ｐＹＫ２８３（
Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＹＫ２８３）とし
て微工研に寄託（微工研条寄第５５６号））をもとにし
てこれを組換ＤＮＡ技術において慣用されている方法（
特に、特［１昭５８−１４０７４８号の明細書に記載の
方法）に従って造成したもの）とｐＨ５１（このプラス
ミドは、ｐＢＲ３２２（Ｅ、ｃｏ　ｌ　１Ｋ１２Ｃ６０
０（ｐＢＲ３２２）として微工研に寄託（微工研条奇第
２３５号）〕をｖ１限醇素ＥｃｏＲＩおよびＨｉ　ｎｄ
ｌ［ｔ’消化し、コノＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ１１部分
を下記の塩基配列（Ｉ）で示される合成リンカ−と置換
したちのく特開昭５９−７１６９２号公報参照））とか
ら造成したものである。このプラスミドの造成操作の詳
細は特願昭５９−１５９７０３号の明ＩＩＩを参照され
たい。

ＥｃｏＲＩ　　　Ｈｐａ　Ｉ　　　Ｓｍａ　Ｉ　　　Ｈ
ｉｎｄ　ＩＩＩ（Ｉ） ここで破線は制限酵素切断部位を示し、ＥｃｏＲ工等は
その切断を行う＆ｌＪ限酵素の名称を示す。

また、ＤＴＡ２５３９は、ｐＴＡ１５２９のアンピシリ
ン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に変換し、さら
にシグナル配列をβ−ラクタマーゼ由来のものに変換し
たプラスミドである。このプラスミド造成の詳細は、特
願昭５９−２７９５８５号の明細書を参照されたい。

ここでｐＴＡ１５２９は下記の塩基配列（ＩＩ）からな
るＤＮＡ部分を含むので、ジグノール遺伝子の直後に外
来性蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なプラスミドであ
る。

配列（Ｔｉ）はシグナル遺伝子部分（１）とその下流側
に結合されたＤＮＡ部分（２）とからなっているが、本
発明の一実施態様でいう「シグナル配列をコードづ°る
遺伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋白質をコードす
る遺伝子を結合させ得るように仕組れたもの」とは、こ
のようなりＮＡ部分を含むものである。なお、本発明に
おいてＤＮＡに関して「下流側」というときは、５′→
３′鎖（■鎖）を上に３′←５′鎖（Ｏ鎖）を下に表示
したときの右側を意味する。

塩基配列（Ｉ）は、二本！ｌｌｌＤＮＡからなるＤＮＡ
遺伝子の一部を示すものであって、Ａ、Ｇ。

ＣおよびＴはそれぞれアデニン、グアニン、シトシンお
よびチミンを示しく前記の（Ｉ）も同様）、Ｌｙｓ、Ａ
ｌａおよびＴｒｐはそれぞれリジン、アラニンおよびト
リプトファンを示す。この二本鎖ＤＮＡの区域（１）は
ジグノール遺伝子部分であり、区域（３）はｔ１１限酊
素Ｈｉ　ｎｄｌ［［の認識部位であり、破線はＨｉｎｄ
Ｉ［切断部位である。区域（２）は、シグナル遺伝子の
下流側の直後に結合されたＤＮＡ部分である。

本発明に用いるベクターは、シグナル遺伝子がアルカリ
性ホスファターゼ由来であるものである。

この遺伝子の塩基配列は、下流側末端のアラニンのコド
ンがＧＣＣである。

一方、上記塩基配列（ＩＦ）は、アルカリ性ホスファタ
ーゼ由来の遺伝子の部分（１）の下流側末端のアラニン
のコドンＧＣＣをＧＣＴに、さらに続く塩基ＣをＴに改
変したものに相当する。アラニンのコドンには縮重があ
るから、改変後のＧＣＴもアラニンのコドンであり、従
って上記（Ｉｔ）のＤＮＡ部分（１）は依然としてアル
カリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝子に対応する
ＤＮＡである。

ところで、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺
伝子は、その下流側末端のアラニンのコドンの上流側に
リジンのコドンＡＡＡおよび下流側にアルギニンのコド
ンＣＧＧを有する。

従って、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝
子が本来布していた下流末端のアラニンのコドンＧＣＣ
をＧＣＴに改変し、さらにアラニンに続く塩基Ｃ＠Ｔに
改変したことによって、この末端の塩基対と上流側の４
塩基対および下流側の１塩基対とで制限酵素ＨｉｎｄＩ
［Ｉの認識部位（３）ＡＡＧＣＴＴが現出している。す
なわら、シグナル遺伝子には、少なくとも該末端の塩基
対を構成員の少なくとも一部とする制限酵素認識部位が
創出されている訳である。

ｏＴＡ１５２９の上記（ＩＩ）の具体例では、Ｈｉ　ｎ
ｄｌｌＩの認識部位（３）内の切断部位は破線で示した
通りであって、その位置はシグナル遺伝子とその下流側
直後に結合されていることあるべきＤＮＡ部分く上記ｐ
ＴＡ５２９に係る塩基配列（Ｉ）では、既に結合されて
いる区域（２））との間に存在している（切断部位の位
置は、二本鎖ＤＮＡの下流側のそれを意味する）。制限
酵素切断部位がこのような位置に存在することは、本発
明に用いるベクターにおいて最も好ましいことである。

何故ならば、この切断部位はそれを利用して外来性蛋白
質の構造遺伝子をこのシグナル遺伝子が発現して生じる
雑種ないし融合蛋白はシグナル配列とそれに続く蛋白と
の間でシグヅル・ペプチダーゼよって切断されるのであ
るから、制限酵素切断部位とシグナル・ペプチダーゼ切
断位四とがこのように一致していれば、上記ｐＴＡ１５
２９の例でいえば外来性蛋白質の構造遺伝子（この例で
は、ＴｒｐののコドンＴＧＧで始まつている）の■鎖の
５′Ｏ側にＡＧＣＴを補なっておくだけで、Ｈｉ　ｎｄ
ｌ［［消化後のシグナル遺伝子の粘着末端との間の結合
が可能だからである。なお、外来性遺伝子のＯ鎖の３’
０側にも塩基を補なうことを厭わなければ、制限酵素切
断部位が上流側に存在してもよいことはいうまでもなく
、そのような切断部位の存在するベクターもまた本発明
に用いられる範囲内である。

「シグナル配列をコードする遺伝子」は、−般にシグナ
ル配列の種類に応じて各種の塩基配列のものがある。シ
グナル配列の具体例をいくつか挙げれば１．Ｂ−ラクタ
マーゼのもの（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌ、ｓ、Ａ、　７５．３７３
７（１９７８））　、リボ蛋白のちの（同上、７４．１
００４（１９７７））　、アルカリ性フォスファターゼ
のもの（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　９６．
４９（１９７９）　）等がある。ジグノール配列につい
ては、「蛋白質・核酸・酵素ＪＤ１時増刊号（ｒＭ伝丁
子操作）、第２６巻、第４号、第３８６−３９４頁、を
参照することができる。しかしながら、本発明で使用す
る好ましいシグナル配列は、アルカリ性ホスファターゼ
の塩基配列のものおよびβ−ラクタマーゼ由来のもので
ある。このようなシグナル配列を具備する上記プラスミ
ドであれば、本発明の工程（Ｃ）の培養方法を利用する
ことにより前記したような利点が得られるからである。

上記＜１［）に示した本発明に用いプラスミド（ベクタ
ー）が具備するＤＮＡＷ伝子の転子体例は、アルカリ性
ホスファターゼ由来のＤＮＡを改変してつくったもので
あるから、シグノ゛ル遺伝子ＤＮＡの部分（１）の下流
側末端直後にアルカリ性ホスファターゼ由来のＤＮＡ部
分（２）が結合している。本発明の具体例は、このＤＮ
Ａ部分（２）が外来性蛋白質をコードづる遺伝子に対応
するＤＮＡ部分であるものである。

なお、この具体例の範喘に属する本発明に用いるプラス
ミドが具備するＤＮＡ遺伝子の一例は、シグナル遺伝子
部分が天然物由来の部分と合成された部分とからなるも
のである。すなわち、制限酵素切断部位より上流側が天
然物由来の部分であり、下流側が合成されたものである
。この場合の下流側の合成された部分は上記（■）した
ような切断部位の位置の場合には十鎖の４塩基（Ａ　Ｇ
　ＣＴ　）であるが、切断部位がこれより上流側に存在
すれば一鎖にも合成部分が必要となることはいうまでも
ない。

工程〈Ｂ）／形質転換体の造成 微生物の形質転換は、組換えＤＮＡ技術の分野における
公知の常法に従って行うことができる。

例えば、上記プラスミドに所望外来性蛋白質の構造遺伝
子を組込んで組換えＤＮＡ　（キメラプラスミド）とし
、これを用いて微生物を公知の方法（例えばクシュナー
法（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、皿、１
７（１９７８））　）に従って形質転換したのち、所望
の形質転換体を取得（通常はプラスミドのマーカーを利
用する）する合目的的な任意の方法によって行うことが
できる。

本発明によるこのようなキメラプラスミドによって形質
転換しうる微生物は、その菌体内で上記プラスミドが増
殖しうるものであればよく、具体的には大腸菌、枯草菌
および酵母菌等がある。なかでも大腸菌が比較的よく利
用されており、そして本発明は大腸菌のようなダラム陰
性菌を宿主菌として用いるときに特に前記したような効
果を有するものである。大腸菌としては、例えば、Ｅ、
ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　Ｃ６００（微工研条沓第１１５
号）、Ｅ、Ｃｏ１１　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（微工研
菌寄第７９４１号）、Ｅ、ｃｏｔ　１ＲＲＩ　（ＡＴＣ
Ｃ３１４４７）およびＥ。

ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３６９４）等があ
る。本発明の具体例では、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２　　ＹＫ
５３７を用いている。

本発明において使用したこのような形質転換体の具体例
は、プラスミドｏＴＡ１５２９（前記）に人工的に合成
した１ｌＥＧＦ　（後記）の構造遺伝子を組込んでキメ
ラプラスミドｐＴＡ１５２２を造成し、ついでこのキメ
プラスミド（組換えＤＮＡ）を宿主菌Ｅ、ｃｏｌｉ　　
Ｋ１２　　ＹＫ５３７に移入させることにより造成した
形質転換体Ｅ、Ｃ０Ｉｉ　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（ｐ
ＴＡ１５２２）、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ（ｐＴＡ１５
２２）およびＥ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ（ｏＴＡ１５
２２＞である。

なお、上記プラスミドに組込む所望外来性蛋白質をコー
ドする遺伝子としては、ホルモン、免疫関連物質、神経
ベブヂドおよび酵素等のものが考えられる。これらの構
造遺伝子の調製方法としては、天然の染色体ＤＮＡより
取得する方法や、あるいは人工的に合成する方法等が考
えられ、実際の構造遺伝子の調製方法については種々の
載置や文献を参照することができる。

本発明の一具体例においては、このような外来性蛋白質
の構造遺伝子としてヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ／
ｈＵＧ、以下ｈＥＧＦと記す）をコードする遺伝子であ
って化学的に合成したもの（合成の詳細は特願昭５８−
１２３５２０号の明ｉ書参照のこと）、を用いた。

工程（Ｃ）／微生物の培養 本発明の工程（Ｃ）による培養は、アルカリ性ホスファ
ターゼ由来のブロモ−ターを具備するベクター（プラス
ミド）に所望の外来性蛋白質の構造遺転子を組込んでキ
メラプラスミド（組換えＤＮＡ）とし、これを宿主微生
物に移入させることにより形質転換した微生物の対象と
するものである。

そして、本工程の培養方法の特徴は、形質転換された微
生物が保持しているベクター（プラスミド）の性質、す
なわち無ｍ＊ａに依存して蛋白質合成能に誘導がかかっ
たり、かからなかったり□　する性質（前記Ｂ１０Ｃｈ
ｅ１．　Ｂ１１１）ｈｙｓ、八ｃｔａ、およびＮａｔｕ
ｒｅ）　、を巧みに利用して、単一の培養系において微
生物の増殖とそれに続く微生物による蛋白質誘導とをお
こなわせ、しかち培養途中でＤＨを弱酸性または中性域
から弱アルカリ性域ヘシフトさせることにより、所望蛋
白質の産生効率の向上を図るということである。

このような培養方法の詳細は、下記の通りである。

１）　培養法 本工程による微生物の培養方法は、典型的には、形質転
換された微生物を単ＩＩ胞純粋分離培養し、ついで前培
養に付したのち（以上は微生物を培養する場合の公知の
常法であり、多数の文献や載置を参照することができる
。例えば、成型「微生物学実験法」　（講談社刊）、「
微生物実験法」　（共立出版刊）、「細胞学実習提要」
　（丸善刊）等がある。）、単一の培養系においてその
培養を行うことからなるものである。

この単一の培養系は通気撹拌培養の範晴に属するもので
あって、具体的には、培養系におい′Ｃ菌を接種したの
ち培地に無菌空気（必要に応じて純酸素を混入したもの
）を導入し、これを物理的に撹拌しつつ、ＤＨ，温度、
溶存ｍ素濃度等を、培養する微生物の生育条件に適合さ
せて好適な条件下に維持しながら培養を行うことからな
る。

このような培養は通常はジャーファーメンタ−を用いて
行われ、そして適当なスケールアップが可能であること
はいうまでもない〔載置「生物化学工学」（上）、（下
）巻く東京大学出版会）参照〕。

２）　　培　　地 本工程に用いる培地組成は、ＬＢ培地（トリプトン、酵
母エキス、ＮａＣＩ）を基本培地とし、必要に応じて他
の成分（例えばＭ　ｇＳ　Ｏ４・７　Ｈ２０１抗生物質
等）を添加したものであって、さらに形質転換された微
生物の増殖過程におｔノる対数増殖期後期から停止期前
期にかけて蛋白質合成能の誘導を起すに必要充分量の無
機燐を含有するものより構成される。また、必要に応じ
て添加する抗生物質として、本発明の具体例ではアンピ
シリンを添加している。本発明の具体例において形質転
換体が保持しているプラスミドは、アンピシリン耐性遺
伝子を具備していて、形質転換体はアンピシリン耐性と
なっている。従って、培養中でプラスミドが脱落した菌
（耐性がない）は培地中のアンピシリンによって成育が
抑ｔｉｌｌされるので、プラスミドを保持している宿主
菌のみが成育ず仝ことになる。このように、培地への抗
生物質の添加は、宿主菌の生育上の便宜を図るための一
手段である。

３）　培養条件 （１）　培養温度 培ｉ温度は、使用する微生物（形質転換体）の増殖また
は生育が可能でかつ産生物が安定である範囲内の温度で
あればよい。通常用いる大腸菌および本発明に使用した
大腸菌の場合は、３７℃が好ましい。なお、微生物培養
の常法に従えば培養温度は培養中−定に保つことになろ
うが、培養温度は必ずしも経時的に一定である必要はな
い。

培養中に温度をシフトさせることによって蛋白質の生産
効率を向上させることができることを本発明者らは見出
している（同時出願特許願（１）参照）。この別件発明
による培？ｉ温度のシフトと本発明によるｐＨのシフト
との組合わけもまた効率のよい蛋白質の生産手段として
期待されるものである。この別件発明によれば、この温
；哀範囲内において、培養温度を低温域から高温域ヘシ
フトさせる。両温度域での培養温度の差は、少なくとも
４℃であるべきである。ここで低１Ｍとは、中温菌の場
合は、２５℃〜３５℃程度の範囲内であリ、高温域とは
３２℃〜４２℃程庭の範囲内をいう。例えば、本発明の
一実施例において用いられた形質転換体が大腸菌のよう
な場合は、低温域として３０℃付近が好ましく、高温域
としては３７℃付近が好ましい。そして、低温域から高
温域への培！温度のシフトは、蛋白質の合成能の誘導の
観点から行う。すなわち、蛋白質の合成能の誘導が起る
前は低温域で培養し、誘導俊は培養温度を高温域へ移行
させる。培養温度を低温域から高温域への移行は、培養
液の熱容量が許す限り＠速に行うことが望ましい。各温
度域での培養温度は、微生物培養の常法に従えば実質的
に一定に保つことがふつうである。

培養温度シフトの時期の判断は、培養液中の無機燐量を
モニターすることによって行うのが便利である。すなわ
ち、培養開始より無ｍａｎを経時的に定量していき、そ
のｉが最小になるまで（本発明の一実施例では約９時間
）は低温域で培養し、それから急に培養温度を高温域に
シフトさせるのがよい。

（２）培養時間 本工程の培養時間は、培養中にｐＨを弱酸性ないし中性
域から弱アルカリ性域ヘシフトさせた後であって培養液
中に分泌されている所望物質の産生量が忠犬となる時間
、が好ましい。そして、さらに好ましい培養時間は、菌
が溶菌ゼずにかつ所望蛋白質が培養液中に多聞に分泌さ
れている時間である。本発明の一興体例では、ｈＥＧＦ
を１４１する場合は約２０．５時間を採用している。そ
れ以上培養を行うと、菌体が溶菌し、菌体中の種々の雑
多な物質が培地中に混入するに到って所望蛋白質の回収
が難しくなるからである。このような培養時間の検討は
、培地中のグルコースおよび無機燐の定量、０Ｄ６６ｏ
の測定、生菌数の測定、ペリプラズム中および培養液中
の産生物質の定量を指標として行うことができる。グル
コースの定量はグルコースオキシダーゼ法にューグルコ
スタット「フジサワ」のキットを利用。）により行うこ
とができる。生菌数は、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｙ　　
Ｋ５３７（ｐＴＡ１５２２）の場合についていえばアン
ピシリンを含むし一培地（前記）およびし−培地の寒天
上に生育するコロニー数を測定すればよい。そして、本
発明の一実施例では、アンピシリン含有し一培地の寒天
上に生育するコロニー数に対するし一培地の寒天上に生
育するコロニー数の割合（％）をプラスミド保持率とし
て算出している。無機燐の定量はモリブデンブルー法（
工場排水試験方法：ＪＩＳ　　Ｋ　　０１０２）に従っ
て行った。また、培養液中の産物ｈＥＧＦの定量はまず
培養液＜１０ｄ）をとり、これを遠心したのち上清をＲ
ＲＡ法（後記）に従って行い、ペリプラズム中のｈＥＧ
Ｆについては菌体をオスモティック・シｇツタ法〔前記
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌ　）によって処理後、この
溶液を遠心して上洛をラジオレセブターアｙｂイ（ＲＲ
Ａ）法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５７．３
０５３　（１９８２））によって分析することにより行
ったｈＥＧＦ定ｍの詳細は後記参考例および特願昭　５
９−１５９７０３号明細書参照）。

なお、ここで菌体内で発現されたｈＥＧＦが菌体内（ｉ
ｌｌ胞質内）に存在しているがどうかをも調べた。

すなわら、上記オスモティック・ショック処理後、得ら
れた沈殿（菌体）を純水に再度懸濁させたのち、超音波
処理を行って菌体を破壊し、ついで遠心を行って上清を
得て、この上清を上記ＲＲＡ法に従って分析することに
より、菌体内（細胞質内）のｈＥＧＦを定量した。

（３）　培地のｐＨ −般に、ｐＨは微生物の生育可能な範囲であればよく、
用いられる微生物によっで適ν好ましいｐＨを設定すれ
ばよい。大腸菌を用いる場合には、大腸菌の生育可能な
ｐＨは通常４．６〜８．８であり、このうちｐＨ７，０
〜８．０の間が特に好ましい。なお、ここで培養中のｐ
Ｈは変動するのがふつうであるが、−定りＨ付近に保つ
のがふつうである。

このような情況において、本発明ではｐＨを弱酸性ない
し中性域から弱アルカリ性域ヘシフトさせる。そして、
この場合のＤＨシフトは、蛋白質の合成能の訓導の観点
から行う。りなわら、蛋白質の誘導が起る前は弱酸性〜
中性域で培養を行い、誘導後は弱アルカリ性域へ移行さ
せる。

ここで、弱酸性域とは、ｐＨ６，０程度以上７．０未満
をいい、中性域とはＥ）Ｈ７，Ｏをいい、弱アルカリ性
域とは、ｐｌ−１７，０程度以上８．０程度以下をいう
。そして宿主菌が大腸菌のような場合は、弱酸性若しく
は中性域としてｐＨ６，８〜７．０付近が好ましく、ま
た、弱アルカリ性域としてはｐＨ７，４〜７．８付近が
好ましい。

ところで、組換えＤＮＡ技術により１ｌｙＪされた形質
転換体を培養する場合は、まず菌を増殖させ、ついでこ
れら増加させた菌に所望蛋白質を合成させるというよう
な条件下で培養を行うのがふつうである。従って、本発
明は、上記条件を実現すべく、先願発明の培養工程を基
本としてさらに先願発明よりも所望蛋白質の生産効率を
上げるため、先願発明の培養条件にＩ）Ｈのシフト条件
を加味したものである。すなわち、ＤＨ条件として菌を
増殖させる段階では弱酸性若しくは中性域での培養を行
い、ついで菌に所望蛋白質を効率よく合成させるべくｐ
Ｈを弱アルカリ側ヘシフトさせるのである。このような
ｐＨのシフト時期は、使用する宿主菌により適宜変更す
る必要があるが、培養液中の菌の生菌数、無機燐量およ
び所望蛋白質の量を指標として決めればよい。本発明の
一実施例では、弱酸性域（ｐＨ６，８〜７．０）での培
養を、培養開始からの時間が最小で、無機燐量が律速段
階に達したのちであり、かつ、生菌数が比較的高くなる
時間（培養開始後１１時間まで）まで行ったのち、ｐＨ
を弱アルカリ側に急にシフトする。

このようになｐＨのシフトは、現在自動的に調製できる
装置によって行うのがふつうであり、本発明の実例も、
このような装置を具備するもので行っている。

（４）　消泡剤 培養中発泡の著しいときは、消泡剤（高級アルコール、
植物油等）を添加するのが常套手段である。本発明の場
合において用いる消泡剤は無機燐の存在量によって微生
物の蛋白質合成能を制御するのであるから、無機燐を含
有しないものであることが肝要である。そのような消泡
剤の具体例としては、「アンチホーム−ＡＦ−エマルジ
ョン」（牛丼化学）がある。

（５）　溶存酸素（Ｄｏ） 溶存酸素とは、液相中に溶解している分子状酸素のこと
をいう。

一般に通気撹拌培養に際しては、Ｄｏが過多の場合は微
生物の増殖は阻害され、−万〇〇が１　ｐｐｍ以下にな
っても同様に増殖が阻害されるということが知られてい
る。従。て、ＤＯｍを微生物生育の阻害因子とならない
ようにｔ、ＩＩ　ｌすることが好ましい。本発明の一興
体例の場合はＤＯコントロール装置〔オリエンタル電気
ｆｔｌＦｃ−４型〕によりＤＯｆｆｉを４　ＤＥＣＩに
保持している。

工程（Ｄ）／蛋白質の回収 生成蛋白質の回収は、公知の常法に従って行うことがで
きる。

例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィー、電気泳動法、高速液体クロマトグラ
フィーあるいはこれらを種々組合上た方法等（底置［生
化学実験講座１タンパク質の化学工」日本生化学会編、
東京化学同人刊（１９８２）参照〕があり、ｔａ製する
蛋白質あるいはペプチドの性質にあわせて適当なものを
選択して使用すればよい。

本発明の一実施例では、培養終了後の培養液を遠心し、
ついで得られる上清を逆層カラムに通じてゲルン濾過を
行ってｈＥＧＦが含有されている画分をＤＥＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ■（イオン交換）に通じることによりｈ
ＥＧＦ画分を分離して、所望画分を回収した。なお、本
発明の方法に従って産生された目的蛋白質をより多くし
かも効率よく回収しようとするならば、培養液中に分泌
される目的蛋白質の量が多くかつ菌体が溶菌していない
時期に培養を終了して、培養液中から目的蛋白質を回収
すると共に菌体を集菌後にオスモティック・ショック法
により処理後ペリプラズム中の目的蛋白質を回収すれば
よい。本発明方法によれば宿主菌体内で産生された目的
蛋白質は菌体内（細胞質中）に留ることなくペリプラズ
ム（少量）あるいは培養液中（大部分）のいずれかに分
泌されているので、この回収法によれば菌体内で産生さ
れた殆んどの蛋白質が回収されるであろう。なお、ペリ
プラズム中の蛋白質の回収は、例えば、本発明者らの共
同研究者らによって先に提案された特願昭６０−２２６
３０号の方法によればよい。

友−１−１ （１）　形質転換体の造成 下記の方法に従って形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２　　
ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）を造成した。

ｐＴＡ１５２９（造成の詳ｍは特願［（５９−１５９７
０３号の明Ｉｌｌ書参照）５μりを、５０μｍの緩衝液
（１０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝？ｌｋ（以下Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ）Ｈ）８７．５）、１０ｍＭＭｇ１ｌ　　　ｇｏ
ｍｖ　　ＮａＣり中で４単位のυ１限酵素Ｈｉ　ｎｄｌ
［Ｉ　Ｃタカラ〕　（以下Ｈｉ　ｎｄｌ［）を用いて３
７℃で１時間加水分解した。ついで、エタノール沈殿を
行い、得られた沈殿物を、３０μｍの反応液（６７ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，８）、１６．６ｍＭ硫
酸アンモニウム〔以下（ＮＨ４）２ＳＯ４〕、６．７ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡ）　、０．６
６ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）
中で１１１位のＴ４−　ＤＮＡポリメラーゼを用いて、
３７℃で１５分間処理した。ついで、エタノール沈殿物
を、５０μｍの反応液（６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＩ
Ｈ８，０）、６ｍＭ　　ＭｏＣｌ３．１５０ｍＭ’　Ｎ
ａＣＩ　）中で４単位の制限酵素Ｓａｔ　　Ｉ（タカラ
〕　（以下、３ａｌＩと記す）を用いて３７℃で１時間
加水分解した。反応終了後、アガロースゲル電気泳動に
よって、３９００ｂｐのＤＮＡ断片（第１図中■）を得
た。

プラスミドｐＢＲ３２２−ｈＵＧ（ｐＢＲ３２２（Ｅ、
ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）とし
て寄託済み〔微工研条奇第２３５号〕）を（：Ｃ０ＲＩ
Ｉ３よび、５ａｌＩで消化したものに人工的に合成した
ｈＥＧＦ構遍遺伝子をＥＣ０ＲＩおよび５ａｌＩで消化
した断片を組み込んでもの〕５μ９を、５０μｍの反応
液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ＜ＤＨ７，５）、
５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　　ＭｇＣ１２）中で
４単位の＆ｌＩ限酵素ＥｃｏＲＩ　（タカラ〕を用いＹ
Ｋ５３７　（Ｅ）ＴＡｌ　５２２）を以下のようにして
培養した。車輻１１０１！粋分離したＥ、ｃｏ＋＋で３
７℃で１時間加水分解したのち、上記と同様にＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理を行い、さらにＳａｔ工処理を行っ
たのち、アガロースゲル電気泳動によって１６０ｂｌ）
のＤＮＡｌ１片（第１図中■）を得た。

上記でｍ製した二つのＤＮＡ断片（第１図中■および■
）を、３０μｍの反応液（２０ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣＩ
　（ＤＨ７，５＞　、１０ｍＭＭ０ＣＩ　　　１０ｍＭ
　　ＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰ）中で３０〇単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼ（タカラ〕を用いて１４℃で１６時間反
応させた。

反応終了後、これで大腸菌に１２　　ＹＫ５３７の形質
転換を行って、目的のプラスミド（以下ｐ−ｒＡ１５２
２）（第１図中■）を含有する形質転換株（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（ｐＴＡｌ　５２２））を
得た。

（２）　形質転換体の培養 本発明者らの共同研究者らにより組換えＤＮＡ技術によ
ってプラスミドｐＴＡ１５２２を用いて形質転換された
微生物［”、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７　（ｐＴＡ
１５２２）を以下のようにして培養した。単細胞純粋分
離したＥ、ｃｏｌｉＫ１２　　ＹＫ５３７（ｏＴＡ１５
２２）−白金耳をトリプトン１０９／リツトル、酵母エ
キス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ　　５９／リツトル、ア
ンピシリン２０■／リツトルからなる培地１００ｄに接
種し、５０〇−容の坂ロコルベンで３７℃で一夜振盪培
養を行った。

次に、この培養液１０Ｉｄ、をとり、グルコース１０ｇ
／リットル、トリプトン１０９／リツトル、酵母エキス
５ｇ／リットル、Ｍ　ｇＳ　Ｏ４・７８２０　０．５ｇ
／リットル、およびアンピシリン２０＃＋９／リツトル
よりなる培地２リツトルに接種し、３リツトル容のミニ
ジャーファーメンタ−で培養した。培養温度は、無機燐
ｍ／ｆｉ最小になるまで（培養開始後約９時間）は３０
℃付近とし、それ以降は＠激に３７℃に変換した。通気
量は０．５ｖｖｍ　　（１ｖｖａ　は１Ｖ０１ｔｌｌｅ
−Ｖｏｌｕｍｅ−１ｉｎｕｔＣのことで、１分間あたり
培養液１リツトルに対して１リツトルの空気が導入され
ることを意味するものである。）、ｐＨは培！開始から
１１．５時間後まではｐＨ６，８で、それ以降は７．４
〜７．５にしく４Ｎ　　ＮａＯＨまたは４Ｎ　　ＨＣＩ
で講整する）、溶存酵素（Ｄｏ）１度はＤｏコントロー
ル装置により撹拌速度を変化させて４１）ｌ）１付近に
保持した。培養は、グルコースおよび無機燐の定量、生
菌数の測定、および培養液中のｈＥＧＦの定量を経時的
に行うことにより、ｈＥＧＦの生産速度が低下するまで
（培養開始から約２３時間）行った。グルコースの定量
はグルコースオキシダーゼ法にューグルコスタット「フ
ジサワ」のキットを用いた）に従って行った。

生菌数はアンピシリン２０η／リツトルを含むし一培地
（トリフ８２１０ｇ／リットル、１ｌｆｆｉエキス５９
リツトル、　Ｎａ（１５９／リツトル）の寒天プレート
上に出現するコロニーの数を測定することにより行った
。０Ｄ６６゜は菌体量の指標として測定したものであり
、無機燐の定番はモリブデンブルー法（ｔｔｉ記）によ
って行った。培養液中のｈＥＧＦの定量は、培養液１０
ａｅをとり、遠心分離したのち上清をＲＲＡ法（下記）
で分析することにより行った。

ＲＲＡ法は、下記のようにして行った。まず、ヒト鼻咽
腔癌ｍ孟由来のＫＢ細胞（ＡＴＣＣ１ｋｌＣＣＬ１７）
を８００ｍのフラスコ中ぐダルベツコ変法イ゛−グル（
ＤＭＥ）培地〔日水〕中で単層培養を行った。ついで培
地を除ぎ、０．０５％のＥＤＴＡを含むリン酸平衡化塩
溶液（ＰＢＳ）を用いて細胞をはがして、ｍ胞ＩＩ濁液
を作成した。その後、２０ｍＭヒープス（Ｈｅｐｅｓ　
）　　（ｐＨ７，４）を含むハンクス（Ｈａｎｋｓ）平
衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回細胞を洗浄した。細胞を
パインディング・ツルージョン（Ｂｉｎｄｉｎａ　ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）（ＤＭＥ培地培地２０上 ７、４）　　・０．３５９／リツトルＮａＨＣＯ３”１
００μ９／ｄストレプトマイシン〕に懸濁後、細胞数を
計算して３０万〜４０万１０．２ｄバインデイング・ツ
ルージョンとなる様調整し、チューブに０．２ｄ！ずつ
分注した。ついで上記の３種の上清を各々および　　Ｉ
　−ｍＥＧＦ　（マウス上皮ｍ胞成長因子（以下ｍＥＧ
Ｆ））を含む試料液０、２ｍをチューブに加えて、３７
℃で１時間インキュベートした。ｔａｎを氷冷したＨＢ
ＳＳで３回洗浄後、１０％のトリクロロ酢酸〔以下、Ｔ
ＣＡ）に懸濁させ、グラスフィルターを用いてｖＩＡ胞
を固定した。アセトンでＴＣＡ＠除いた後、液体シンチ
レーション力・クンターを用いて計数した。そしてｈ　
Ｅ　Ｇ　Ｆの量をｍＥＧＦに換算した。

そのときの培養時開、ＯＤ　　　、生菌数、無機燐の量
、グルコース量およびｈＥＧＦ　（培養液中）の農の経
時変化を第１表に示す。このデータ中、ＯＤ　　　、生
菌数、無機燐の量および培養液中のｈＥＧＦｆｆｉの経
時変化を第２図に示す。同図中間、ム、０，、０および
０でプロットされた曲線は各々下記を意味するものであ
る。

■ニゲルコース濃度 ム：０Ｄｓ６０ ０：生菌数 ・：無機ｆ！４ｍ （Ｅ）Ｓ　ｈＥＧＦ量 また、１１．５時間の位置の直線はｐＨをシフトさせた
位置を示す。

（３）　蛋白質の回収 上記培養液１リツトルを遠心分離 ＜１２．０００′Ｊ、１０分）して上清を得て、これを
逆層りＯマドグラフィー（カラムサイズ：直径４．１ａ
＋Ｘ長さ８０１１樹脂：Ｐｒｅｐ　　ＰＡＫ５００／ｃ
１８逆層樹脂（ウォーターズ社））に付して所望蛋白質
画分を分離した。ついで上記クロマトグラフィーによっ
て得られた所望画分をＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＲ
（カラムサイズ：直径１．５ａＲＸ長さ２５α）カラム
に付したのら、所望蛋白質画分を分離した。なお、ここ
で得られた所望蛋白質の画分の一部をとってポリアクリ
ルアミド電気泳動を行ったところ、ｈＥＧＦ標品と同一
位置にバンドが見られたので、所望蛋白質ｈＥＧＦが回
収されていることが示唆された。

参　　考　　例 本発明を完成するにあたり、培養のｐＨを種々変更して
、培養を行った。すなわち、ｐＨを６．８．７．０．７
．２．７．４．７．６．７．８および８．０の各々−定
に保って培養を行った実験およびｌ）Ｈを７．６から６
．５にシフトさせる培養を行うという実験を試みた。な
お、その際にｈＥＧＦの定量は、培養液中のみならず、
ペリプラズム中および菌体中（細胞内）についても行っ
た。すなわち、培養液１０Ｉ１１をとり、遠心分離した
のち上清をＲＲＡ法で分析り゛ることにより培養液中の
ｈＥＦＧを定量し、ついでこのとき沈殿物として得られ
た菌体を２０％シュークロース、０．０２ＭＴｒｉｓ　
−ＨＣｌ　（ＤＨ８，０）、ＥＤＴＡｏ、００１Ｍから
なる溶液２０ｍに懸濁させ、室温で１０分放置した。つ
いで、再度遠心して集菌し、この国体を２０１ｄの冷却
水（０℃〜４℃）に懸濁させ、水中で１０分間放置した
（オスモティック・ショック法による処理）。そしてこ
の懸濁液を遠心し゛ＣＣ上管得、この１泪をラジオリセ
ブターアツセイ（ＲＲＡ）法によっ（°分析することに
よりペリプラズム中のｈＥＧＦを定量し、また、上記オ
スモティック・ショック処理後に得られた沈殿物（菌体
）を純水１０ｍに再懸濁したのちこれを超音波処理（［
クボタインソネ−々７モデルー２００ＭＪ　）（１０分
間）を行つで国体を破壊し、遠心（２７０００９，３０
分間）して得られた上清をＲＲＡ法（ド配）に従って分
析することにより、菌体中（ＩＩ胞質中）のｈＥＧＦの
定ａを行った。あとは実施例と同様に行った。

そのときの結果を第２表〜９表に示す。なお、＊１〜＊
３の意味はいずれも各々、下記の意味を示すものである
。

＊１：アンピシリン耐性のＩＲＩｎ数 ＊２：検出できなかった。

培養液中ノｈＥＧｔＪ＋へ’Ｊ７ラスム中ノｈＥＧＦｆ
ｆｉ＋１ｌｌｌｉ内ノｈＥＧＦｆｆｉこれら第２表〜第
８表の結果より、生菌数の最大値は（弱酸性域での培養
）〉（弱アルカリ性域での培￥！＆）の傾向にあり、培
養液中のｈＥＧＦはの最大値は（弱酸性域での培り　＜
　（弱アルカリ性域での培養）の傾向にあった。従って
、本発朗のように大腸菌を宿主として用いた場合は、ま
ず弱酸性として１）８６．８〜７．０付近で培養を行い
、ついでｐＨ７，４〜７．８付近で培養すればよいとい
うことが示唆される。なお、弱アルカリ性域から中性若
しくは弱酸性へのシフトは顕苔な生産量増加は認められ
なかった。

なお、本発明の実施例および参考例をまとめれば第１０
表の通りである。

第１０表 本発明において開示された微生物の菌学的性質および受
託番号は下記の通りである。

受託年月日 （１）　　昭和５６年　６月　９日 （２）　　昭和５８年　４月３０日 （３）　　昭和５６年　６月　９日 （４）　　昭和５６年１１月１４日 本　通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託
番号 本＊　　　Ａ　１−　ＣＧ　　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　
Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｔ　１ｅｃｔｉｏｎ）
の受託番号 菌学的性質 （１）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００この菌は、
ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の大腸
菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含まず、サプレッ
サー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに関与するヌ
クレアーゼをコードするｒｅｃＢＧ遺伝子に欠陥を有す
るものである。栄養要求性としては、トレオニンとロイ
シンをその最小培地上での増殖に必要とす゛る。また、
分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである。

なお、本国に関する文献は以下の通りである。

（イ）　　ＧｅｎｅｔｉＣ３，３９，４４０（１９５４
）（ｏ　）　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２１７．１１１０（
１９６８）（２）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００
（ｐＹＫこの菌は、グラム確性桿菌で、胞子を作らず、
通性嫌気性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子
を含まず、サブレツナ−遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子
組替えに関与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢＧ
遺伝子に欠陥を有するものである。栄養要求性としては
、トレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必
要とする。

ｐｈｏＡ遺伝子のプロモーター−オペレーター領域ｐＡ
ｃＹｃ１７７由来の複製開始領域およびｐＢＲ３２２の
ｂｌａ遺伝子から構成されたプラスミドｐＹＫ２８３を
含み、アンピシリンに対して耐性を示す。また、分類学
上、腸内細菌科、大ｒｌｉ、菌夙に属するものである。

なお、プラスミドｐＹＫ２８３由来の形質を除けば、こ
の菌株の菌学的性質はその親株Ｅ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００のそれと同じである。

（３）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐ１３Ｒ
この菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気
性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含まず
、サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに
関与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢＧ遺伝子に
欠陥を有するものである。栄養要求性としては、トレオ
ニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする
。また、薬剤耐性プラスミドｐＢＲ３２２を含む。なお
、プラスミドｐＢＲ３２２に関してはＧｅｎｅ、　２．
９５（１９７７）、大腸菌に１２Ｃ６００に関しては上
記ＮＬＩｔＬＩｒｅを参照することができる。ｐＢＲ３
２２由来の形質を除けば、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６
００（ｐＢＲ３２２）の菌学的性質は親株のそれと同じ
である。

（４）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７大腸菌に
１２ＹＫ５３７は、公知株であるところの大腸菌に１２
株（Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｉ　Ｒｅｖｉｅｗｓ
　。

４４．１〜５６（１９８０））の誘導体大腸菌に１２Ｒ
Ｒ１（Ｇｅｎｅ、　２．９５（１９７７）、Ｂｉｏｃｈ
ｃｉ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

ＡＣｔａ、　、６５５．２４３（１９８１）　）をさら
に改変したものであり、下記の性質を示し、他の性質に
ついてはに１２ＲＲ１のそれと異なるところのない菌株
である。（ｒＣ’ＣＡ１、ｐｈｏＡ８、ｐｒｏ＋）（５
）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ大腸菌に１２株（上
記）と大腸菌Ｂとをハイブリッドさせて造成した菌であ
り、下記の遺伝子型を有する。なおこの株に関する文献
としてはＪ、　Ｎｏｔ、　Ｂ１１１．４１．４５９（１
９６９）およびＨＯｔｈＯｄＳＥｎｚｙｉｏｌ、、６８
．２４８（１９７９）がある。

Ｆ−、ｈｓｄｓ２０　（ｒ　　−、ｍＢ−）、ｒｅｃＡ
１３、ａｒａ−１４、Ｄ　ｒ’　ＯＡ　２、ＩａｃＹｌ
、ＱａｌＫ２、ｒｌ）ＳＬ２０（Ｓｍ’　）、ｘｙｌ−
５、ｍｔｌ−１，５ｕＤＥ４４、λ− （６）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ 大腸菌ＨＢＩＯＩをｒｅｃＡ＋に改変したＥ。

ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩの誘導体である。従って、遺伝
子型はＣＦ−１ｒｅＣＡ＋以外はＨ８１０１と同一〕で
ある。なお、この株に関する文献としてはＧｅｎｅ　２
．９５（１９７７）およびＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ
　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　、　　６５５．２
４３（１９８１）がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｌ：、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｙ５３７を形質転
換するために使用したプラスミドｐＴＡ１５２２造成の
ため、のフローチャートである。 第２図は、第１表の結果をプロットした図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（Ａ）〜（Ｄ）よりなることを特徴とす
   る、菌体外分泌による蛋白質の製造法。 （Ａ）アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターを
   コードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナ
   ル配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿
   主微生物細胞内で増殖可能なベクター、を用意すること
   。 （Ｂ）上記ベクターに外来蛋白質をコードする遺伝子を
   組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換えＤＮ
   Ａを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主の形
   質転換を行つて、形質転換体を得ること。 （Ｃ）上記形質転換体を、微生物の増殖過程における対
   数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘
   導がおこるに必要な量の無機燐を含有する培地での培養
   に付し、その際に蛋白質合成能の誘導が起る前は弱酸性
   または中性の条件で、蛋白質合成能誘導後は弱アルカリ
   性の条件で培養を行うこと。 （Ｄ）上記培養終了後、培地中より産生外来性蛋白質を
   回収すること。 ２、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターをコ
   ードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナル
   配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿主
   微生物細胞内で増殖可能なベクターが、そのシグナル配
   列をコードする遺伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋
   白質をコードする遺伝子を結合させ得るように仕組まれ
   たものである、特許請求の範囲第１項記載の菌体外分泌
   による蛋白質の製造法。 ３、工程（Ｂ）においてベクターに組込む外来性蛋白質
   をコードする遺伝子が、ヒト上皮細胞成長因子である、
   特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の
   菌体外分泌による蛋白質の製造法。