JPS62151193A - 菌体外分泌による蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、遺伝子工学的手法を利用した菌体外分泌によ
る蛋白質の製造法に関する。

さらに具体的には、本発明は、培地の含有成分によって
プロモーター活性が調節されるプロモーターをコードす
る遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナル配列を
コードする遺伝子をも具備したベクターに、所望外来性
蛋白質をコードする遺伝子を組込んで組換ＤＮＡとし、
これを宿主微生物（以下微生物を単に「菌」と記すこと
もある）細胞内に移入させることにより宿主の形質転換
を行って形質転換体を得て、これを一定条件下で培養す
ることにより所望蛋白質を宿主菌体外（培養液中）に分
泌させたのち、培養液中から所望蛋白質を回収すること
よりなる遺伝子工学的手法による蛋白質の製造法に関す
る。

Ｌユ呈Ｉ 現在組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学的に有用物質
を生産する方法が確立されつつあり、具体的な方法につ
いては種々の成書や文献、公開特許公報および特許公報
を参照することができる。

このような手法による物質の生産方法は、通常、ベクタ
ーに所望物質をコードする遺伝子を組込んで造成した組
換えＤＮＡを用いて宿主微生物を形質転換し、得られた
形質転換体を培益したのち、所望物質を回収することよ
りなるものである。

ところで、上記方法によって非分泌性の蛋白質の生産を
行う場合、微生物細胞内で産生された蛋白質は宿主菌の
プロテアーゼによって分解〔プロシーディングズ・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ
・量ｆ・ユナイテ・ンド・ステーク・オブ・アメリカ（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ）　、　７９．１８３
０−１８３３　（１９８２））される恐れがあるので所
望蛋白質を安定かつ大量に得ることができないという問
題があった。また、このような非分泌性の蛋白質を回収
するに際しては宿主微生物を物理的に破壊したのち、所
望蛋白質の分離・精製を行うものであるから、一般にこ
のような回収操作は複雑であり、そのため所望蛋白質の
収率が低かったり、活性を有するものは回収操作中に失
活する恐れもあるという問題があった。

そこで、上記聞題点に対処すべく、蛋白質の膜通過に関
与するシグナル配列（蛋白質・核酸・酵素、２６．３８
６〜３９４　（１９８１））（７）作用を利用して、宿
主微生物細胞内で産生された蛋白質を細胞質膜外に分泌
させる方法が種々提案された（特開昭５５−１９０９２
号、同５５−４５３９５号、同５６−１３７８９６号、
同５６−１４５２２１号、同５６−１５４９９９号各公
報等）。

ところで、上記シグナル配列を利用した遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造において組換えＤＮＡが移入され
得る宿主微生物は、大腸菌が普通である。この大腸菌は
ダラム陰性菌であって、このような菌には細胞質膜およ
び外膜がある（これらの膜間をペリプラズムという）と
ころ、このような菌に組換えＤＮＡを移入させて形質転
換体としてこの形質転換体を通常の培養に付すと、所望
蛋白質はペリプラズムに蓄積される。このペリプラズム
に蓄積された蛋白質は、オスモティック・ショック法〔
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、）　、　２４０３６８５　
（１９６５））によってペリプラズムから菌体外へ放出
させなければ回収することができない。このオスモティ
ック・ショック法は、まず遠心により菌体を回収したの
ち、これを高濃度ショ糖液〔２０％シュークロース、３
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＤＨ８，０）１ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））に懸濁させてから集菌し
、さらにこの菌体を冷水に懸濁させ、そして水浴中で放
置することにより所望蛋白質を含む両分を菌体外に放出
させ、ついで遠心により上清く所望蛋白質を含む）を得
る、という方法である。そして、所望蛋白質を回収する
には、さらにクロマトグラフィー等によってこの上清を
処理するのである。このように従来から大腸菌のような
ダラム陰性菌を宿主とし、これに蛋白質の分泌機能を具
備した組換えＤＮＡを移入させて形質転換体を得て、こ
れを培養することにより所望蛋白質を生産さぼるという
方法は、ダラム陽性菌（枯草菌、酵母菌等）を宿主とし
た場合に比べて余分な処理操作（オスモチイックショッ
ク法）が必要となる。

しかしながら、これらダラム陽性菌を宿主とする場合は
、上記の点では右利であっても、これらに移入された組
換えＤＮＡの安定性に問題があるうえ、大腸菌はど宿主
−ベクター系も開発されておらず、また菌の取扱いも大
腸菌はど容易ではない。

したがって、大腸菌のような一般的な菌株を宿主とし、
効率よくしかも大間に所望の蛋白質を製造する方法の開
発が望まれている。

本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、プロ
モーター（プロモーターの通性として培地の含有成分に
よってプロモーター活性が左右される）をコードする遺
伝子（以下プロモーター遺伝子という）を具備し、その
制御下にシグナル配列をコードする遺伝子（シグナル遺
伝子）をも具備したベクターに、所望の外来性蛋白質を
コードする遺伝子（外来性蛋白質の構造遺伝子）を組込
んで組換えＤＮＡを造成し、この組換えＤＮＡを宿主微
生物細胞内に移入させて形質転換体となし、この形質転
換体を上記プロモーターに対するプロモーター活性ｉｌ
！節物質に関して一定条件下で培養することによって所
望蛋白質を菌体外（培養液中）に分泌させ、これを回収
する、という遺伝子工学的手法による蛋白質の製造法を
提供することにより本目的を達成しようというものであ
る。そして、本発明は、グラム隘性菌（大腸菌）を本発
明の方法に従って形質転換してこれを培養すれば所望蛋
白質は菌体が溶菌することなしに菌体外（培養液中）に
分泌されていること、また所望蛋白質が菌体内（細胞質
内）に殆ど留まることがないことを確認してなされたも
のである。

従って、本発明による菌体外分泌による蛋白質の製造法
は、下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程よりなること、を特徴と
するものである。

（Ａ＞　　プロモーターをコードする遺伝子ならびに該
遺伝子の制御下にシグナル配列をコードする遺伝子を具
備しかつ予定した宿主微生物細胞内で増殖可能なベクタ
ーを用意すること。

（Ｂ）　　上記ベクターに外来性蛋白質をコードする遺
伝子を組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換
えＤＮＡを宿主微生物細胞内に移入さぼることにより宿
主の形質転換を行って形質転換体を得ること。

（Ｃ）　　上記形質転換体を微生物の増殖過程における
対数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の
誘導がおこるに必要な船のプロモーター活性調節物質を
含有する培地での培養に付したのち、該培養系外よりプ
ロモーター活性調節物質を含有する培地の連続的ないし
間歇的な添加を伴う培養に付すこと。

（Ｄ）　　上記培養終了後、培養液中より外来性蛋白質
を回収すること。

効　　果 このように本発明は、グラム隘性菌（大腸菌）を用いて
遺伝子工学的手法による蛋白質の造成にあたり、従来の
ように所望蛋白質をペリプラズムに留めることなく菌体
外（培養液中）への分泌を行うべ（、（イ）プロモータ
ー遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナル遺伝子
をも具備し、かつ（０）予定した宿主細胞内で増殖可能
なベクターを用意し、ついでこれに所望の外来性蛋白質
の構造遺伝子を組込んで組換えＤＮＡとし、これを宿主
菌に移入させることによって形質転換体を得て、これを
一定条件下（前記の工程（Ｃ）で）培養することにより
所望蛋白質を菌体外（培養液中）に分泌させ、これを回
収することからなる遺伝子工学的手法による蛋白質の製
造方法に関するものである。

本発明の好ましい態様は、上記（イ）および（ロ）より
なるベクターが、そのシグナル遺伝子の下流側末端直後
に所望の外来性蛋白質の構造遺　　　□伝子を結合し得
るように仕組れたものを用いる方法である。そしてシグ
ナル遺伝子の直後に外来性蛋白質の構造遺伝子の導入を
容易にするためには、シグナル遺伝子の塩基対の少なく
とも一つを構成員の少なくとも一部として人工的に創出
された制限酵素認識部位を有するものを用いるとよい。

この部位を創出するに当っては、ＤＮＡ塩基対からなる
コドンには給田があるということを巧みに利用すること
ができる。すなわち、創出された制限酵素認識／切断部
位を該制限酵素で切断ずれば、その切断部位がシグナル
遺伝子の下流側末端に接して存在する場合は、該制限酵
素切断端と相補性の端部を上流側に形成させた外来性遺
伝子を用意してこれを上記切断端においてシグナル遺伝
子と結合させることによって、シグナル遺伝子の下流側
に外来性遺伝子を直結させることができる。

また、シグナル遺伝子の切断部位が該遺伝子の下流側末
端より上流側に存在する場合は、該遺伝子の該切断部位
より下流側の部分を合成して外来性遺伝子の上流側に結
合した断片を用意して上記と同じように結合を行えば、
一旦切断されたシグナル遺伝子がＤＮＡの両鎖について
復元されると共にそれの下流側に外来性遺伝子が直結さ
れた構造が実現される（詳細後記）。

このようなベクターに所望外来性蛋白質の構造遺伝子を
組込んで組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡで宿主菌
を形質転換ｌノで形質転換体を得て、これを一定条件下
（本発明の工程（Ｃ）により）で培養すれば、宿主菌が
大腸菌のようなダラム陰性菌であっても、所望蛋白質は
べりブラズムに蓄積することなく菌体外（培養液中）ま
で分泌される。そして、培養液中から所望外来性蛋白質
を回収することにより、本発明の目的が達成される。

従って、本発明は、前記の問題点を回避するととらに下
記の利点を有するものである。

（１）　遺伝子工学的手法による蛋白質の！ｌ！造・回
収工程が簡素化される。

本発明の方法に従えば、上記（イ）および（ロ）の要件
を満すベクターに所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を組
込んでなる組換えＤＮＡで宿主微生物を形質転換して形
質転換体を得てこれを培養すれば、所望蛋白質は成熟蛋
白質として（シグナル配列は蛋白質がペリプラズムに分
泌されるときに切断されている）培養液中まで分泌され
る。すなわち、形質転換された宿主微生物をオスモティ
ック・ショック法に付すことなく、培養液中から蛋白質
を回収するだけでよいのである。従って、遺伝子工学手
法による蛋白質の製造・回収工程が簡素化されることに
なる。

なお、本発明方法はダラム陽性菌にも適用されるのであ
るが、枯草菌のようなダラム陽性菌はべりプラズムがな
いので、本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中に
まで分泌されるということはいうまでもない。

（２）　所望蛋白質の精製が容易である。

本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中まで分泌さ
れ、その分泌の際にシグナル配列は脱酵素によって切断
されるので、シグナル配列が付着していない蛋白質が得
られる。ここで得られる蛋白質は、シグナル配列をコー
ドする遺伝子と所望蛋白質を］−ドする遺伝子との間に
余分な遺伝子（リンカ−としてのＤＮＡＩ伝子）が存在
すれば、余分なアミノ酸を付着したままで分泌される。

しかしながら、本発明の一員体例で示されたようにシグ
ナル配列をコードする遺伝子の直後に所望蛋白質をコー
ドする遺伝子を結合しておけば、所望蛋白質は余分なア
ミノ酸が付着することなく完全な成熟蛋白質として培養
液中に分泌される。従って、形質転換体の培養を菌体が
溶菌してしない時期に終了しておけば、培養液中には実
質的に所望蛋白質および培養液の構成成分が存在するこ
とになる。使用した培養液はその構成成分が判っている
のであるから、従って、目的蛋白質の精製は容易である
。

発明の詳細な説明 本発明は菌体外分泌による蛋白質の製造法に係るもので
あるところ、この方法は工程（Ａ）〜＜Ｄ）よりなるも
のである。

工程（△）／ベクターの用意 本発明の工程（Ｃ）における培養方法は、培地の含有成
分によって形質転換体に組込れたベクターのプロモータ
ー活性が左右されるということを利用したものである。

従って、本発明で用いられるベクターは、使用すべき培
地の関係においでこのようなプロモーターを具備するこ
とが一つの要件である。

ここで「培地の含有成分によってプロモーター活性が左
右される」とは、該成分中の少なくとも一つの成分によ
ってプロモーター活性が誘導されたり抑制されたりする
ことをいう。また、逆に、このような物質（本発明では
、プロモーター活性調節物質という）は、その物質の存
在の有無、量の多少によって、プロモーター活性を阻害
したり、誘導したりする物質のことである。

このようなプロモーター活性調節物質とプロモーターと
の組合せとしては、例えば以下のようなものがある。無
機燐とアルカリホスファターゼのプロモーターとの組合
せ〔ビオキミ力・工・ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈｉａ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）　。

３８、４６０　（１９６０）、ネーチ７−　（Ｈａｔ（
Ｉｒｅ）　、υじ。

１５２９　（１９５９））　、同様に無機燐とｐｈｏＥ
蛋白質のプロモーター〔化学と生物、２ユ、ｐ１８４〜
１８５、蛋白質・核酸・酵素、ｌ旦、２６（１９８３）
〕あるいは酸性ホスファターゼのプロモーター〔底置［
酵母の解剖Ｊｐ１６１〜１６５゜ｗ４談社サイエンティ
フイク刊〕、グルコースとＩａｃプロモーター（但し、
ラクトースあるいはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトシド）等の誘導物質存在下〕、炭素源ある
いは窒素源またはその両者とトｊｕｔプロモーター（但
し、ヒスチジン存在下）、グルコースとａｒａプロモー
ター（但し、アラビノース存在下）、トリプトファンと
ｔｒｐプロモーター（但し、インドールアクリル酸ある
いはインドールプロピオン酸などのトリプトファンアナ
ログの存在下）〔底置「遺伝子の分子生物学」　（下）
第３版　ｐ４３３〜４５７（株）化学同人用〕やグルコ
ースとｊａｍＢプロモーター（但し、マルトース存在下
）〔化学と生物、２３、ｐ１８５〜１８６〕等がある。

このようなプロモーター活性調節物質の一具体例は無機
燐である。無機燐とは、微生物にとって無害であってか
つ水溶液に溶解したときに微生物がリン源として利用可
能な形の無機燐を含有する化合物から供給されるものを
いう。そしこのような無機燐は燐酸塩として培地に添加
するのがふつうであって、具体的にはＫ　２　ＨＰ　Ｏ
４とＫＨ２ＰＯ４とを適宜組合せて用いる。また、無機
燐は、このような燐化合物として培地に添加する代りに
、そのような無機燐を含む酵母エキスなどの天然培地成
分の形で添加することもできる。

本発明で使用するベクターは、このようなプロモーター
を具備しさらに蛋白質の分泌に関与するシグナル遺伝子
をその制御下に具備するベクターであってかつ予定した
宿主１１１１ａ内で増殖可能なもの（前記（イ）および
（ロ）の要件を満すベクター）であればよい。ここで用
いられるプロモーターをコードする遺伝子（ＲＮＡポリ
メラーぜが結合して転写を開始するＤＮＡ領域）は、天
然の染色体ＤＮＡより取得してもよいし、また既に多数
のプロモーター遺伝子の塩基配列が決定されているので
合成したものの使用も可能である。

このようなベクターとして特に好ましいものは、（イ）
および（ロ）の必須要件を具備したうえ、シグナル遺伝
子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子
を結合させ得るように仕組まれたもの、である。この好
ましいベクター（プラスミド）の具体例としては、本発
明者らの共同研究者によって先に提案されたプラスミド
ｐＴＡ５２９（特願昭５８−１４０７４８号）、ｐＴＡ
１５２９（特願昭５９−１５９７０３号）、ｐＴＡ２５
３９　（特願昭５９−２７９５８５号）等がある。これ
らのプラスミドはいずれもアルカリ性ホスファターゼ由
来のプロモーターおよびシグナル配列（前二者について
はアルカリ性ホスファターゼ由来、ｐＴＡ２５３９はβ
−ラクタマーゼ由来）を具備するものであり、かつシグ
ナル配列をコードする遺伝子の直後に外来性蛋白質の構
造遺伝子の結合が可能なものである。ここでρ王Ａ１５
２９は、ｐＴＡ５２９　（ｐＹＫ２８３　（Ｅ。

ｃｏｌｉに１２　Ｃ６００（ｐＹに２８３）として微工
研に寄託（微工研条寄第　５５６号）〕をもとにしてこ
れを特願昭５８−１４０７４８号の明ｉ書に記載の方法
に従って造成したもの）とｐ）−１３１（このプラスミ
ドは、ｐＢＲ３２２（Ｅ、ｃｏｌｉに１２Ｃ６００（ｐ
ＢＩｌ　３２２）として微工研に寄託（微工研条寄第２
３５号）〕を制限酵素ＥＣ０ＲＩおよびＨ１ｎｄｌＩＩ
で消化し、このＥｃｏＲＩ−Ｈｉ　ｎｄ１１１部分を下
記の塩基配列（Ｉ）で示される合成リンカ−と置換した
ちのく特開昭５９−７１６９２号公報参照））とから造
成したものである。このプラスミドの造成操作の詳細は
特願昭５９−１５９７０３号の明細書を参照されたい。

ＥｃｏＲＩ　　ＨｐａＩ　　ＳｍａＩ　　Ｈｉｎｄｌ［
［（Ｉ） ここで破線は制限酵素切断部位を示し、ＥｃｏＲＩ等は
その切断を行う制限酵素の名称を示す。

また、ｐＴＡ２５３９は、ｐＴＡ１５２９のアンピシリ
ン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に変換し、さら
にシグナル配列をβ−ラクタマーゼ由来のものに変換し
たプラスミドである。このプラスミド造成の詳細は、特
願昭５９−２７９５８５号の明ｉｍｌを参照されたい。

ここでｐＴＡ１５２９は下記の塩基配列（Ｉ［）からな
るＤＮＡ部分を含むので、シグナル遺伝子の直後に外来
性蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なプラスミドである
。

↓　〜（４） 配列（ＩＩ）はシグナル遺伝子部分（１）とその下流側
に結合されたＤＮＡ部分（２）とからなっているが、本
発明の一実施例態様でいう「シグナル配列をコードする
遺伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋白質をコードす
る遺伝子を結合させ得るように仕組まれたもの」とは、
このようなりＮＡ部分を含むものである。なお、本発明
においてＤＮＡに関して「下流側」というときは、５′
→３′鎖（＋鎖）を上に３′←５′鎖（−鎖）を下に表
示したときの右側を意味する。

塩基配列（Ｉｔ）は二本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ遺伝子
の一部を示すものであって、ＡｌＧ、ＣおよびＴはそれ
ぞれアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンを示し
く前記の（Ｉ）も同様）、ｌｙｓ、７！１．Ｉａおよび
Ｔｒｌ）はそれぞれリジン、アラニンおよびトリプトフ
ァンを示す。この二本鎖ＤＮＡの区域（１）はシグナル
遺伝子部分であり、区域（３）は制限酵素Ｈｉ　ｎｄｌ
［［の認識部位であり、破線はＨｉｎｄｌ［Ｉ切断部位
である。区域（２）は、シグナル遺伝子の下流側の直後
に結合されたＤＮＡ部分である。

本発明に用いるベクターは、シグナル遺伝子がアルカリ
性ホスファターゼ由来であるもの、である。この遺伝子
の塩基配列は、下流側末端のアラニンのコドンがＧＣＣ
である。

一方、上記塩基配列（Ｉ）は、アルカリ性ホスファター
ゼ由来の遺伝子の部分（１）のＦ流側末端のアラニンの
コドンＧ　ＣＣをＧＣＴに、さらに続く塩基Ｃを王に改
変したものに相当する。アラニンのコドンには縮重があ
るから、改変後のＧＣＴもアラニンのコドンであり、従
って上記（Ｉ）のＤＮＡ部分（１）は依然としてアルカ
リ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝子に対応するＤ
ＮＡである。

ところで、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺
伝子は、その下流側末端のアラニンのコドンの上流側に
リジンのコドンＡＡＡおよび下流側にアルギニンのコド
ンＣＧＧを有する。

従って、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝
子が本来布していた下流側末端のアラニンのコドンＧＣ
ＣをＧＣＴに改変し、さらにアラニンに続く塩基Ｃを王
に改変したことによって、この末端の塩基対と上流側の
４塩基対および下流側の１塩基対とで制限酵１ｉ：ｌ−
１ｉｎｄ［の認識部位（３）ＡＡＧＣＴＴが現出してい
る。すなわら、シグナル遺伝子には、少なくとも該末端
の塩基対を構成員の少なくとも一部とする制限酵素認識
部位が０１出されている訳である。

ｐＴＡ１５２９の上記（ＩＩ）の具体例では、ｔ−Ｉｉ
　ｎ　ｄ　■の認識部位（３）内のＶ′Ｊ断部断部数線
で示した通りであって、その位置はシグナル遺伝子とそ
の下流側直後に結合されていることあるべきＤＮＡ部分
（上記ｐＴＡ５２９に係る塩基配列（Ｉｆ）では、既に
結合されている区域（２））との間に存在している（切
断部位の位置は、二本鎖ＤＮＡの下流側のそれを意味す
る）。制限酵素切断部位がこのような位置に存在するこ
とは、本発明に用いるベクターにおいて最も好ましいこ
とである。何故ならば、この切断部位はそれを利用して
外来性蛋白質の構造遺伝子をこのシグナル遺伝子に直結
するためのものであり、一方この雑種遺伝子が発坦して
生じる雑種ないし融合蛋白はシグナル配列とそれに続く
蛋白との間でシグナル・ベプチターゼによって切断され
るのであるから、制限酵素切断部位とシグナル・ベプチ
ターゼ切断位置とがこのように一致していれば、上記１
）ＴＡ１５２９の例でいえば外来性蛋白質の構造遺伝子
（この例では、ＴｒｐのコドンＴＧＧで始まっている）
の十鎖の５′−側にＡＧＣＴを補なっておくだけで、Ｈ
ｉ　ｎｄｌｌ［消化後のシグナル遺伝子の粘着末端との
間の結合が可能だからである。なお、外来性遺伝子の一
鎖の３′−側にも塩基を補うことを厭わなければ、制限
酵素切断部位が上流側に存在してもよいことはいうまで
もなく、そのような切断部位の存在するベクターもまた
本発明に用いられるベクターの範囲内である。

「シグナル配列をコードする遺伝子」は、一般にシグナ
ル配列の種類に応じて各種の塩基配列のものがある。シ
グナル配列の具体例をいくつが挙げれば、β−ラクタマ
ーゼのもの〔ブ０シーディングズ・オフ・ナショナル・
アカデミ−・オフ・サイエンシズ・オフ・ユナイテッド
・ステーツ・オフ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、＾、）、塁、３７３７　（１９７８）　）　
、リポ蛋白のもの〔同上、ハ、１００４　（１９７７）
　）　、アルカリ性ホスファターゼのもの〔ユーロピア
ン・ジャーナル・オフ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、
　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、）、並、４９　（１９７９）
　）等がある。シグナル配列については、「蛋白質・核
酸・酵素」臨時増刊号（「遺伝子操作」）、第２６巻、
第４号、第３８６−３９４頁、を参照することができる
。しかしながら、本発明で使用する好ましいシグナル配
列は、アルカリ性ホスファターゼの塩基配列のものおよ
びβ−ラクタマーゼ由来のものである。このようなシグ
ナル配列を具備する上記プラスミドであれば、本発明の
工程（Ｃ）の培養方法を利用することにより前記したよ
うな利点が得られるからである。

上記（Ｉｆ）に示した本発明に用いるプラスミド（ベク
ター）が具備するＤＮＡ遺伝子の一具体例は、アルカリ
性ホスファターゼ由来のＤＮＡを改変してつくったもの
であるから、シグナル遺伝子ＤＮＡの部分（１）の下流
側末端直後にアルカリ性ホスファターぜ由来のＤＮＡ部
分（２）が結合している。本発明の具体例は、このＤＮ
Ａ部分（２）が外来蛋白をコードする遺伝子に対応する
ＤＮＡ部分であるものである。

なお、この具体例の簡略に属する本発明に用いられるプ
ラスミドが具備するＤＮＡ３ＩＩ伝子の一例は、シグナ
ル遺伝子部分が天然物由来の部分と合成された部分とか
らなるものである。すなわち、制限酵素切断部位より上
流側が天然物由来の部分であり、下流側が合成されたも
のである。この場合の下流側の合成された部分は上記（
■）したような切断部位の位置の場合には十鎖の４塩基
（ＡＧＣＴ）であるが、切断部位がこれより上流側に存
在すれば一鎖にも合成部分が必要となることはいうまで
もない。

工程　８）／形質転換体の造成 微生物の形質転換は、組換えＤＮＡ技術の分野における
公知の常法に、従って行うことができる。

例えば、上記プラスミドに所望外来性蛋白質の構造遺伝
子を組込んで組換えＤＮＡ　（キメラプラスミド）とし
、これを用いて微生物を公知の方法（例えばクシュナー
法；ジェネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　）　、１９７８．１７（
１９７８）　）に従って形質転換したのち、所望の形質
転換体を取４！７（通常はプラスミドのマーカーを利用
する）する合口的的な任意の方法によって行うことがで
きる。

本発明によるこのようなキメラプラスミドによって形質
転換しうる微生物は、その菌体内で上記プラスミドが増
殖し得るものであればよく、具体的には大引り枯草菌お
よび酵母菌等がある。なかでも大腸菌が比較的よく利用
されており、そして本発明は大腸菌のようなダラム陰性
菌を宿主菌として用いるときに特に前記したような効果
を有するものである。大腸菌としては、例えば、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　　Ｋ１２　　Ｃ６００（微工研条寄第１１５号
）、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（微工研菌
奇第７９４１号）、［Ｅ、ｃｏｌ　１ＲＲ１（ＡＴＣＣ
３１４４７）および Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｌ−１８１０１（ＡＴＣＣ３３６９４
）等がある。本発明の具体例ではＥ、ｃｏｌｉＫ１２　
　ＹＫ５３７を用いている。

本発明において使用したこのような形質転換体の具体例
は、プラスミドｐＴＡ１５２９（前記）に人工的に合成
したｈ−ＥＧＦ（後記）のｔａ構造遺伝子組込んでキメ
ラプラスミドｐＴ１５２２を造成し、ついでこのキメラ
プラスミド（組換えＤＮＡ）を宿主菌１：、ｃｏｌｉ　
　Ｋ１２ＹＫ５３７に移入させることにより造成した形
質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（ｐＴ
Ａ１５２２）である。

なお、上記プラスミドに組込む所望外来性蛋白質をコー
ドする遺伝子としては、ホルモン、免疫関連物質、神経
ペプチドおよび酵素等のものが考えられる。これらの構
造遺伝子の；Ｊ！ＩＩ！Ｊ方法としては、天然の染色体
ＤＮＡより取得する方法や、あるいは人工的に合成する
方法等が考えられ、実際の構造遺伝子の調製方法につい
ては種々の載置や文献を参照することができる。

本発明の一実施例においては、このような外来性蛋白質
の構造遺伝子としてヒト上皮細胞成長因子（ｈ　−ＥＧ
Ｆ／１ｌ−ＵＧ、以下ｈ−ＥＧＦと記す）をコードする
遺伝子であって化学的に合成したもの（合成の詳細は特
願昭５８−１２３５０号の明細書参照のこと）、を用い
た。

工程（Ｃ）／微生物の培・ 本発明の工程（Ｃ）による培養は、培地の含有成分によ
ってプロモーター活性が調節されるプロモーター（本発
明の一員体例ではアルカリ性ホスファターゼ由来のプロ
モーター）を具備するベクター（プラスミド）に所望の
外来性蛋白質の構造遺伝子を組込んでキメラプラスミド
（組換えＤＮＡ）とし、これを宿主微生物に移入させる
ことにより形質転換した微生物を対象とするものである
。

そして、本工程の培養方法の特徴は、形質転換された微
生物が保持しているベクター（プラスミド）の性質、す
なわち培地の含有成分（本発明の一員体例では無機燐量
）に依存して蛋白質合成能に誘導がかかったり、かから
なかったりする性質（前記ビオキミカ・工・ビオフィジ
力・アクタおよびネーチア参照）、を巧みに利用して、
単一の培養系において微生物の増殖とそれに続く微生物
による蛋白質合成能の誘導を行わせたのち、さらに微生
物の生育と蛋白質合成とを維持するための成分（本発明
の具体例では無機燐）を含有する培地を該培養系外より
連続的に添加するということよりなる点である。

このような培養方法の詳細は下記の通りである。

１）　培養方法 工程（Ｃ）による微生物の培養方法は、まず形質転換さ
れた微生物を単細胞純粋分離培養し、ついで前培養に付
したのち〔以上は微生物を培養する場合の公知の常法で
あり、多数の文献や底置を参照することができる。例え
ば、載置「微生物学実験法」（講談社用）、「微生物実
験法」　（共立出版刊）、「ｉｌｌｌｌ実学実習提要（
丸首ｆ１Ｊ）等がある。〕、単一の培養系において微生
物の増殖に続き蛋白質の合成能の誘導を行わせ〈以下「
第一工程」）だのち、微生物の生育と蛋白質合成能とを
維持するための成分（例えば本発明の一興体例では（無
機燐）を含有する培地（流加培地）を該培地系外より連
続的に添加する（以下「第二工程」）というものである
。

この培養方法は、通気撹拌培養の範噴に属するものであ
って、具体的には、培養系において菌を接種したのち培
地に無菌空気（必要に応じて純酸素を混入したもの）を
導入し、これを物理的に撹拌しつつ、ｐＨ１温度、溶存
酸素濃度等を、培養する微生物の成育条件に適合させて
好適な条件下に維持しながら培養を行うことからなる。

このような培養は通常はジャーファーメンタ−を用いて
行われ、そして適当なスケールアップが苛能であること
はいうまでもない（成田「生物化学工学Ｊｌ）、（下）
巻く東京大学出版会）参照）。

２）培地 本発明の第一工程で用いる培地および第二工程で用いる
添加培地は、下記で示されるものである。

（１）第一工程 本工程は、微生物の増殖とそれに続く微生物による蛋白
質合成を行う工程である。

従って、培地としては、ＬＢ培地（トリプトン、酵母エ
キス、塩化ナトリウム）あるいはこのうち塩化ナトリウ
ムを除去したものを基本培地とし、必要に応じて他の成
分（例えばＭ　Ｑ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ０１ＫＨ２ＰＯ４、
Ｋ２ＨＰＯ４、抗生物質等）を添加したものであって、
さらに形質転換された微生物の増殖過程における対数増
殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘導を
起こすに必要充分量のプロモーター活性調節物質を含有
するように調整したものを用いる。このような物質は、
例えば本発明の一具体例ではプロモーターがアルカリ性
ホスファターゼ由来のものなので、これは無機燐であり
、燐量として１００〜３００η／ン１含有する培地を用
いるのが好ましい。

なお、プロモーターがｐｈｏ［：や酸性ホスファターゼ
由来のものであってもこの条件で培養は可能であろう。

１ａＣプロモーター、Ｈｕｔプロモーター、ａｒａプロ
モーターおよびＬａｍＢプロモーターでは、このような
プロモーター活性調節物質がグルコース、ｔｒｐブＯモ
ーターはトリプトファンなのでこれらの物質を適宜用い
ればよい。

また、本発明の一員体例においては、抗生物質をも培地
に添加している。すなわち、形質転換体がＥ、ｃｏｌｉ
　　ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）の培地にはアンピシ
リンを、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲｌ　（１）ＴＡ２５３２
）の培地にはカナマイシンを添加している。これは、各
々の宿主菌に移入されたプラスミドはアンピシリン耐性
若しくはカナマイシン耐性の遺伝子を具備するものなの
で宿主もアンピシリン耐性若しくはカナマイシン耐性で
あり、従って、培養中にプラスミドの脱落した菌（アン
ピシリン感受性若しくはカナマイシン感受性である）は
培地中のアンピシリン若しくはカナマイシンによって成
育が抑制されるので、形質転換されたものであって該プ
ラスミドが保持されている菌体のみが成育することを目
的としているからである。このような培地への抗生物質
の添加は、宿主菌の成育上の便宜を図るための一手段で
ある。

（２）　第二工程 本工程は微生物の生育を保持し、第一工程での蛋白質合
成能の誘導による蛋白質合成をできるだけ長期にわたり
維持することを目的とする培養工程である。

このような蛋白質合成能はプロモーター作用の誘導によ
り引き起されて、本発明の一具体例のようにプロモータ
ーがアルカリ性ホスファターゼ由来のものである場合、
培養液中の無機燐の欠乏条件下で誘導が起こる。

従って、本工程の目的を満足し得る具体的手段は、上記
第一工程の培養液中に一定量の無機燐含有培地（流加培
地）を連続的ないし間歇的に添加することである（間歇
的添加の場合の添加間隔は同一であっても同一でなくて
もよい）。ここで注意すべきことは、培地中の無機燐量
が過剰にならない程度に流加培地を添加するということ
である。

培地中の無機燐量が過剰状態になると、プロモーター作
用に抑制がかかり、その結果、蛋白質合成能が低下する
からである。

本工程で用いられる流加培地は、微生物の培養に一般に
使用されている種々の培地のうち一定間の無ｔＲｆＩＡ
を含むものであればよく、流加培地の添加により培養液
量が増加することを考慮すればてきるだけ高濃度の培地
を用いるのが好ましい。

このような流加培地の具体例は、トリプトン、酵母エキ
ス、Ｍｇ５０　・７Ｈ２０およびグルコ−スからなるも
のであり、さらに第一工程と同様の目的でアンピシリン
またはカナマイシンを添加したものである。そして、本
工程の目的に適合させるべくこの培地の流加速度を適宜
調節すればよい。流加速度は一定にしても、あるいは微
生物活性状態に合せて随時増大させるようにしてもよい
。

本発明の具体例では、８３ｄ／時間および７５−７時間
で速度を一定にして行っている。

本培地の流加開始時期は、プロモーター活性誘導開始か
ら微生物の死滅が始まるまでの間であればよい。本発明
の具体例では第一工程でプロモーター活性の誘導開始後
５．５時間、すなわち培養開始後約１２．５時間後より
流加培地の添加を開始している。

なお、プロモーターがアルカリ性ホスファターゼ由来以
外のものであっても、上記に準じてそのプロモーター活
性に影響を及ぼす物質（前記）を含む培地を適宜添加す
ればよいと考えられる。

３）　培養条件 （１）　培養温度 第一工程の培養温度は、用いる微生物の増殖に適した温
度であればよい。通常用いる大腸菌および本培養工程に
使用した大腸菌の場合は、３７℃が好適である。

第二工程の培養温度は、微生物の活性が維持でき（例え
ば２５℃〜４０℃）、かつ形質転換された微生物によっ
て産生された産物が安定である温度であればよい。その
ような温度としては、本発明のようなｈ　−ＥＧＦを産
生させる場合は３７℃が好ましい。

（２）　培養時間 本発明の工程（Ｃ）における培養時間は、培養液中に分
泌されている所望蛋白質の量が最大となる時間である。

そして好ましくは、宿主菌が溶菌せずにかつ所望蛋白質
が培養液中に多量に分泌された時間である。菌体が溶菌
すると、菌体中の種々の雑多な物質が培地中に混入する
に到って所望蛋白質の回収が難しくなるからである。

このような培養時間の検討は、培地中のグルコースおよ
びプロモーター活性に影響を与える物質（例えば無機燐
）の定価、ＯＤ　　の測定、生菌数の測定、ペリプラズ
ム中および培養液中の産生物質の定量を指標として行う
ことができる。グルコースの定量はグルコースオキシダ
ーゼ法にューグルコスタット「フジサワ」のキットを利
用。）により、生菌数は［、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ　
　５３７（ｐＴＡ１５２２）の場合についていえばアン
ピシリンを含むし一培地（前記）の寒天上に成育するコ
ロニー数を測定することにより、無機燐の定量はモリブ
デンブルー法（工場排水試験方法：ＪＩＳ　　Ｋ　　０
１０２）に従って行い、また培養液中の産物ｈ　−ＥＧ
Ｆの定量はまず培養液（１０ＩＩｄｌ）をとり、これを
遠心したのち上清をＲＲＡ法（後記）に従って行い、ペ
リプラズム中のｈ　−ＥＧＦについては菌体をオスモテ
ィック・ショック法〔前記ジ１Ｆ−ナル・オフ・バイオ
ロジカル・ケミストリー参照〕によって処理後、この溶
液を遠心してト清をラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ
）法〔ジャーナル・オフ・バイオロジカルケミストリー
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、　２５７．３０
５３（１９８２））によって分析することにより行った
（ｈ−ＥＧＦ定猷の詳細は慢記参照例および特願昭５９
−１５９７０３号明細店参照）。

なお、ここで、菌体内で発現されたｈ　−ＥＧＦが菌体
内（ｉｔ！ＩＩ質内）に存在しているかどうかをも調べ
た。すなわち、上記オスモティック・ショック処理後、
得られた沈殿（ｒＡ体）を純水に再度懸濁させたのち、
超音波処理を行って菌体破壊を行い、ついで遠心を行っ
て上清を得、この上清を上記ＲＲＡ法に従って分析する
ことにより、菌体内（１［胞質内）のｈ　−ＥＧＦを定
価した。

さらに、菌が溶菌しているかどうかの判断をするためベ
ータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を定量した。β−
ｇａｌは細胞内に存在する酵素であるところ、もしも菌
が溶菌しているならば培養液中にもβ−ｇａｌが存在す
ることになるからである。このようなβ〜ｇａｌの定量
は、ミラーの方法（載置［エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティツクスＪ　　（ＥＸｐＱｒｉｍ
ｅｎｔＳ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
）　、　Ｐ２Ｓ５．（１９７２）　コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−刊〕に従って行って、ＯＤ
　　　　で活性を表示した。なお、このβ−ｇａｌの定
量を菌が溶菌しているかどうかの判断の指標としている
文献として、ユーロビアン・ジャーナル・オフ・アプラ
イド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロ
ジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉＯ
ｔｅＣｈｎｏｌｏ（ＪＶ）　、　１６．１４６　（１９
８２）、同、す、５（１９８４）がある。

〈３）　培地のｐＨ ｐＨは微生物の成育可能な範囲であればよく、用いられ
る微生物によって適宜好ましいｐＨ＠ｍ定すればよい。

大ｌ！菌を用いる場合には、大腸菌の成育可能なｐＨは
通常４．６〜８．８であり、このうちＥ）Ｈ７，０〜８
．０の間が特に好ましい。

（４）　消泡剤 培養中発泡の著しいときは、消泡剤（高級アルコール、
植物油等）を添加するのが常套手段である。本発明の場
合において用いる消泡剤は、本発明では無機燐の存在量
によって微生物の蛋白質合成能を制御するのであるから
、無機燐を含有しないものであることが肝要である。そ
のような消泡剤の具体例としては、「アンチホーム−Ａ
Ｆ−エマルジョン」　（牛丼化学）がある。

（５）　溶存酸素（ＤＯ） 溶存Ｍ素とは、液相中に溶解している分子状酸素のこと
をいう。

一般に通気撹拌培養に際しては、Ｄｏが過多の場合は微
生物の増殖は阻害され、一方Ｄｏが１ｐｐｎ＋以下にな
っても同様に増殖が阻害されるということが知られてい
る。従って、ＤＯｆｌｌｉを微生物成育の阻害因子とな
らないように制御することが好ましい。本発明の一員体
例の場合は、Ｄｏｌｌントロール装置〔オリエンタル電
気＠ＪＦｃ−４型〕によりＤＯ黴を４　ＤＩ）Ｉｌｌに
保持している。

工程（Ｄ）／　　−の回収 生成蛋白質の回収は、公知の常法に従って行うことがで
きる。

例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフイニテイク
ロマトグラフイー、電気泳動法、高速液体クロマトグラ
フィーあるいはこれらを種々組合せた方法等〔成の［生
化学実験講座１タンパク質の化学１」日本生化学会編、
東京化学同人刊（１９８２）参照）があり、精製する蛋
白質あるいはペプチドの性質にあわせて適当なものを選
択して使用すればよい。

なお、本発明の方法に従って産生された目的蛋白質をよ
り多くしかも効率よく回収しようとするならば、培養液
中に分泌される目的蛋白質の量が多くかつ菌体が溶菌し
ていない時期に培養を終了して、培養液中から目的蛋白
質を回収すると共に菌体を集菌後にオスモティック・シ
ョック法に付してペリプラズム中の目的蛋白質を回収す
ればよい。本発明の方法によれば宿主菌体内で産生され
た目的蛋白質は菌体内（細胞質内）に留ることなくペリ
プラズムあるいは培養液中のいずれかに分泌されている
ので、この回収法によれば菌体内で産生された殆んどの
蛋白質が回収されるであろう。

なお、ペリプラズム中の蛋白質の回収は、例えば、本発
明者らの共同研究者らによって先に提案された特願昭６
０−２２６３０号の方法に従って行えばよい。

下記の方法に従って、形質転換体１：、ｃｏ！１Ｋ１２
　　ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）を造成した。

ｐＴＡ１５２９（造成の詳細は特願昭５９−１５９７０
３号の明細書参照）５μ３を、５０μｍの緩衝液〔１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（以下Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ）　　
　（ｐ　Ｈ７，５）　　、　１０ｍＭＭｇＣｌ　　　５
０Ｍ　　ＮａＣ１）中で４単位の制限ＭｉＨｉｎｄｌｌ
！（タカラ）　（以下）１　ｉ　ｎｄＩ［［）を用いて
３７℃で１時間加水分解した。ついで、エタノール沈殿
を行い、得られた沈殿物を、３０μｍの反応液（６７ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ト］ｃＩ（ｐＨ８，８）　、１６．６
ｍＭ硫酸アンモニウム〔以下（ＮＨ４）２Ｓ０４〕、６
．７ｍＭエチレンジアミン四酢Ｍ（以下ＥＤＴＡ）　、
０．６６ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｔ
ＴＰ）中で１単位のＴ４−ＤＮＡポリメラーゼを用いて
３７℃で１５分間処理した。ついで、エタノール沈殿物
を、５０μｍの反応液（６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−トＩＣＩ
　　　（ｐ　Ｈ８，０）　　　、　　６ｍＭ　　　　　
Ｍ　　ｇ　ＣＩ　　　２．１５０ｍＭ　　ＮａＣ１）中
で４単位の制限酵素３ａｌｌ（タカラ）　（以下、５ａ
１１と記す）を用いて３７℃で１時間加水分解した。反
応終了後、アガロースゲル電気泳動によって、３９００
ｂｐのＤＮＡ断片（図中■）を得た。

プラスミドｐＢＲ３２２−ｈＬＩＧ （ｐＢＲ３２２（Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐ
ＢＲ３２２）として寄託済み〔微工研条寄第２３５号〕
）をＥＣＯＲＩおよび５ａｌＩで消化したものに人工的
に合成したｈ　−ＥＧＦ構造遺伝子をＥＣ０ＲＩおよび
５ａｌｔで消化した断片を組み込んだもの〕　（特開昭
６０−２８９９４号公報記載の方法で造成）５μ３を、
５０μｍの反応液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ７，５）、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、５０ｍＭＭｑＣ
Ｉ２）中゛で４単位の制限酵１Ｆｃｏｌ？Ｔ〔タカラ〕
を用いて３７℃で１時間加水分解したのち、上記と同様
にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行い、さらに５ａｌｌ
処理を行ったのち、アガロースゲル電気泳動によって１
６０ｂｐのＤＮＡ断片（図中■）を得た。

上記で調製した二つのＤＮＡ断片（図中■および■）を
、３０μｍの反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ
Ｈ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭ　　ＤＴＴ
、０．５ｍＭＡＴＰ）中で３００単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ〔タカラ〕を用いて１４℃で１６時間反応させた。

反応終了後、これで大腸菌に１２ＹＫ５３７の形質転換
を行って、目的のプラスミド〔以下、ｐＴＡ１５２２）
（図中■）を含有する形質転換株（［、ｃｏｌｉ　　Ｋ
１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ　　１５２２））を得た。

工　　Ｃ／ブ　転換体の培゛ 形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ
１５２２）を、以下の方法に従って培養した。Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７（ｐＴＡｌ　５２２）を複合
培地（トリプトン　１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ
／リットル、アンピシリン２０１＋１！？／リツトル）
１００Ｉｄを含む５００ｄ容の坂ロコルベンで３７℃で
一夜振盪培養した（前培養）。

ついで、この培養液５１１！ｌ！をとり、複合培地（１
リットル当りグルコース３０ｇ、トリプトン２０び、Ｗ
ｊ母エキス１０ｇ、Ｍ　Ｑ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２°０１３
、アンピシリン２０＋ｙ／リツトル）１リツトルに接種
したのち３リツトル容の小型通気撹拌培養装置（ミニジ
ャーファーメンタ−）中で培養した。

培養温度は３７℃、通気量はＱ、５ｖｖｍ　　（ｌ　Ｖ
Ｖｍはｌ　ｖｏｌｕｍｅ−Ｖｏｌｕｌｌｅ−１ｉｎｌＪ
ｔｅのことで、１分間あたり培養液１リツトルに対して
１リツトルの空気が導入されることを意味する）、ｐＨ
は７．０（４ＮＮａＯｌ−１，４ＮＨＣＩで調整する）
、溶存Ｍ索（Ｄｏ）ＩＱはＤｏコントロール装置により
撹拌速度を変化させて４　ｐｐｍ付近に保持した。

無機燐が増殖制限因子となってプロモーター活性の誘導
がおこってから５．５時間（培養時間１２．５時間）培
養を行ったのち、流加培地の添加を開始したく第二工程
）。流加培地は、グルコース８０ｇ／リットル、トリプ
トン４０ｇ／リットル、酵母エキス２０ｇ／リットル、
アンピシリン８０１ｎ９７リツトルからなる複合培地を
用い、流加速度は８３Ｉｎｌ／時間で一定に保ったく定
速流加培養）。

培養は、ＯＤ　　を目安として菌体量が最大に達した後
、菌体量が低下し始めるのを確認し、培養液中のｈ−Ｅ
ＧＦの量が最大となるまで行った。

また、培養状態を把握するため、グルコースおよび無機
燐の定量、生菌数の測定、菌体内（ａ胞質内）およびペ
リプラズム中のｈ−ＥＧＦの定量を経時的に行った。

グルコースの定量は、グルコースオキシダーゼ法にュー
グルコースタット「フジササワ」のキットを用いた）に
従って行った。生菌数の測定は、アンピシリン２０■／
リツトルを含むし一培地（トリプトン１０ｇ／リットル
、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ　　５ｇ／リッ
トル）の寒天プレート上に出現するコロニーの数を測定
することにより行った。

無機燐の定石は、モリブデンブルー法（前記）によって
行った。また、菌体内（細胞質中）、培養液中およびペ
リプラズム中のｈ　−ＥＧＦの定♀は下記の方法で行っ
た。すなわち、培養液−１０−をとり、遠心分離したの
ち上清をＲＲＡ法（下記）で分析することにより培養液
中のｈ　−ＥＧＦを定量し、ついでこのとき沈殿物とし
て得られた菌体を２０％シュークロース、０．０３ＭＴ
ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、ＥＤＴＡＯ，
ＯＯＩＭからなる溶液２０Ｉｄに懸濁させ、室温で１０
分放置した。ついで、再度遠心して集菌し、この菌体を
２０ｔｄの冷却水（０℃〜４℃）に懸濁させ、水中で１
０分間放置した（オスモティック・ショック法による処
理）。そしてこの懸濁液を遠心して上清を得、この上清
をラジオリセブターアッセイ（ＲＲＡ）法によって分析
することによりペリプラズム中のｈ　−ＥＧＦを定ｍし
、また、上記オスモティック・ショック処理後に得られ
た沈殿物（菌体）を純水１ｏ威に再懸濁したのちこれを
超音波処理（［クボタインソネーターモデル２００ＭＪ
　）（１０分間）を行って菌体を破壊し、遠心（２７０
００ｇ、３０分間）して得らしｔｃ　上清ヲＲＲＡ法（
下記）に従って分析することにより、菌体中（細胞質中
）のｈ　−ＥＧＦの定量を行った。ＲＲＡ法は、下記の
ようにして行った。まず、ヒト鼻咽腔癌細胞由来のＫＢ
細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ１７）を、８００ｍ（７）
フラスコ中でダルベツコ変法イーグル（ＤＭＥ＞培地〔
日本〕中で単層培養した。ついで培地を除き、０．０５
％のＥＤＴＡを含むリン酸平衡化塩溶液（ＰＢＳ）を用
いて細胞をはがして、細胞懸濁液を作成した。その後、
２０ｍＭヒープス（Ｈｅｐｅｓ）　（Ｄ　Ｈ７、４）を
含むハンクス（ｆｌａｎｋｓ）平衡塩類溶液（１−Ｉ　
Ｂ　Ｓ　Ｓ　）で２回細胞を洗浄した。細胞をパインデ
ィング・ツルージョン（８ｉｎｄｉｎｇ　ｓ。

１ｕｔｉｏｎ）　（Ｄ　Ｍ　Ｅ培地２０ｍＭヒーブス（
Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７，４）　・０．３５ｇ／リットル
ＮａＨＣＯ３−１０Ｃ１’ｉ／ｄ、ストレプトマイシン
〕に懸濁後、細胞数を計算して３０万〜４０万１０．２
ｍパインディング・ソルーショーンとなる様調整し、チ
ューブに０．２ｍｌ！ずつ分注した。

ついで上記３種の上清を各々および１２５　ｒ　−ｍ　
ＥＧＦ（マウス上皮細胞成長因子（以下ｍＥＧＦ））を
含む試料液０．２−をチューブに加えて、３７℃で１時
間インキュベートした。細胞を氷冷したＨＢＳＳで３回
洗浄後、１０％のトリクロロ酢酸〔以下、ＴＣＡ）に懸
濁させ、グラスフィルターを用いて細胞を固定し、アセ
トンでＴＣＡを除いた後、液体シンチレーションカウン
ターを用いて計数した。そして、ｈ　−ＥＧＦのけをｍ
ＥＧＦに換算した。本工程における各培養時間における
、ＯＤ　　　、生菌数、無機燐、グルコースおよびｈ６
Ｏ −ＥＧＦｆｆｉ、さらに培養中での菌の溶菌の度合を調
べるため培養液中のβ−ｇａｌおよび菌体内（細胞質中
）、オスモティックショック処理後に得られる上清中の
β−ｇａｌ（すなわちペリプラズム中のβ−ｇａｌ）の
定量結果を第１表に示した。なお、表中の％は、培養液
中、ペリプラズム中（オスモティック処理上清中）およ
び細胞質中の総和に対する各割合を示し、■、■、■は
各々培養液中、ペリプラズム中、細胞質中を示したもの
である。また、ここでβ−ｇａｌの定量を行っているの
は、菌が溶菌しているかどうかを調べるためである。β
−ｇａｌは細胞内に存在する酵素であるので、本発明の
場合に培養液中に存在するｈＥＧＦが菌の溶菌によるも
のであれば、本物質も培養液中に存在することになるか
らである。

第１表の結果より、以下のことがいえる。すなわち、ま
ず第一にβ−ｇａｌの定は結果より、β　。

−ｇａｌは少なくとも９０％程度が細胞質中に存在する
ことが示唆され、このことより培養液中に存在づ゛るｈ
　−ＥＧＦは菌の溶菌によって生ずるものではなくて、
本発明中の（Ｃ）の培養工程において培養液中まで分泌
されているということが示唆される。第二に、培養後３
１時間程度で培養液中に分泌されるｈ　−ＥＧＦｆｆｉ
が最大となっているので、本培養条件での培養時間は３
１時間程度がよいといえる。

また、この培養工程中、ｐＨを７．２に、流加培地の添
加速度を７５ｄ／時間にしたこと以外は全く同一条件で
培養を行った。そのときの培養液中の無機燐、グルコー
スおよびＥＧＦの定量結果を第２表に示す。

第　　２　　表 この結果より、本培養条件下でも培養時間は約３１時間
程度がよいことになる。

工程（Ｄ　／　　−の回 上記培養液１リツトルを遠心分１ｉ１１（１２，０００
ｇ、１０分）して上清を得て、これを逆層クロマトグラ
フィー（カラムサイズ：直径４．１ｃｍＸ長さ８α、樹
脂：Ｐｒｅｐ　　ＰＡＫ５００／ｃ１８逆層樹脂（ウォ
ーターズ社）に付して所望蛋白質画分を分離した。つい
で、上記クロマトグラフィーによって得られた所望画分
を　ＤＥＡＥ　−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＲ（カラムサイズ
：直径１．５ｃｍ　ｘ長さ２５ｃｒＲ）カラムに付した
のち、所望蛋白質画分を分離した。なお、ここで得られ
た所望蛋白質の両分の一部をとってポリアクリルアミド
電気泳動を行ったところ、ｈ−ＥＧＦ標品と同−位首に
バンドが見られたので、所望蛋白質ｌ−１−ＥＧＦが回
収されていることが示唆された。

関連微生　の　−的　−および風・　ｐ本発明において
開示された微生物の菌学的性質受託年月日 （１）　昭和５６年　６月　９日 （２）　昭和５８年　４月３０日 （３）　昭和５６年　６月　９日 （４）　昭和５９年１１月１４日 ＊通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託番
号 直笠煎１１ （１）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００この菌は、
ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の大腸
菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含まず、サプレッ
サー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組換えに関与するヌ
クレアーゼをコードするｒｅｃＢｃｍ伝子に欠陥を有す
るものである。栄？＆要求性としては、トレオニンとロ
イシンをその最小培地上での増殖に必要とする。また、
分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである。

なお、本閑に関する文献は以下の通りである。

（イ）　ジェネティックス（ＧｅｎｅｔｉＣ５）、■、
４４０ （ロ）　ネーチ７−（Ｎａｔｕｒｅ）、２１７゜（２）
　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＹＫこの菌は
、グラム飽性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の大
腸菌属の一般属性を右する他、Ｆ因子を含まず、サブレ
ツナ−遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組換えに関与する
ヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢＧ遺伝子に欠陥をａ
するものである。栄養要求性としては、トレオニンとロ
イシンをその最小培地上での増殖に必要とする。

ｐｈｏＡ３！Ｉ伝子のプロモーター−オペレーター領域
ｐＡＣＹＣ１７７由来の複製開始領域およびｐＢＲ３２
２のｂ　Ｉ　ａｍ伝子から構成されたプラスミドｐＹＫ
２８３を含み、アンピシリンに対して耐性を示す。また
１、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものであ
る。

なお、プラスミドｐＹＫ２８３由来の形質を除けば、こ
の菌株の菌学的性質はその親株Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２
Ｃ６００のそれと同じである。

（３）　　Ｅ、ｃｏｌｔ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＢＲ３
２２）、 この菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気
性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含まず
、サブレツナ−遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組換えに
関与するヌクレアーゼをコードするｒｃｃＢｃ逍伝子に
欠陥を右するものである。栄養要求性としては、トレオ
ニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする
。また、薬剤耐性プラスミドｐＢＲ３２２を含む。なお
、プラスミドｐＢＲ３２２に関しｒはＧｅｎｅ、２９５
（１９７７）、大腸菌に１２Ｃ６００に関しては上記Ｎ
ａｔＬＪｒｅを参照することができる。

ｐＢＲ３２２由来の形質を除けば、Ｅ、ｃｏｌｉＫｌ　
２Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）の菌学的性質は親株のそれ
と同じである。

（４）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７大腸菌に
１２ＹＫ５３７は、公知株であるところの大腸菌に１２
株〔（マイクロバイオロジカル・レビューズ（旧ｃｒｏ
ｂｔｏ＋ｏｇｔｃａ＋　Ｒｅｖｉｅｗｓ　）、±４，１
〜５６（１９８０））の誘導体大腸菌に１２ＲＲ１（（
ジーン（Ｇｅｎｅ）　、２．９５（１９７７）、ビオキ
ミカ・工・ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｎ＋、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ、　　）　、６５５．２４
３（１９８１））をさらに改変したものであって、下記
の性質を示し、他の性質についてはに１２ＲＲ１のそれ
と異なるところのない菌株である。

（ｒｅｃＡｌ、ｐｈｏＡ８、ｐｒｏ＋）

【図面の簡単な説明】

図面は、プラスミドｐＴＡ１５２２調製のフローチャー
トである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（Ａ）〜（Ｄ）よりなることを特徴とす
   る菌体外分泌による蛋白質の製造法。 （Ａ）プロモーターをコードする遺伝子ならびに該遺伝
   子の制御下にシグナル配列をコードする遺伝子を具備し
   かつ予定した宿主微生物細胞内で増殖可能なベクターを
   用意すること。 （Ｂ）上記ベクターに外来性蛋白質をコードする遺伝子
   を組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換えＤ
   ＮＡを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主の
   形質転換を行つて形質転換体を得ること。 （Ｃ）上記形質転換体を該微生物の増殖過程における対
   数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘
   導がおこるに必要な量の上記プロモーターに対するプロ
   モーター活性調節物質を含有する培地での培養に付した
   のち、該培養系外よりプロモーター活性調節物質を含有
   する培地の連続的ないし間歇的な添加を伴う培養に付す
   こと。 （Ｄ）上記培養終了後、培養液中より外来性蛋白質を回
   収すること。 ２、工程Ａのベクターがそのシグナル配列をコードする
   遺伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋白質をコードす
   る遺伝子を結合させ得るように仕組まれたものである、
   特許請求の範囲第１項記載の菌体外分泌による蛋白質の
   製造法。 ３、工程Ａにおけるプロモーターをコードする遺伝子が
   アルカリ性ホスファターゼ由来のものである、特許請求
   の範囲第１項あるいは第２項のいずれか１項に記載の菌
   体外分泌による蛋白質の製造法。