JPS6122023A

JPS6122023A - ヒト因子８−ｃとこれを作る製法及び組成物

Info

Publication number: JPS6122023A
Application number: JP60059682A
Authority: JP
Inventors: ウイリアム、ナシユ、ドロウハン; ジヨージ、エイ、リツカ; サリ、エス、ジー、リー
Original assignee: MEROI LAB Inc
Current assignee: MEROI LAB Inc
Priority date: 1984-03-26
Filing date: 1985-03-26
Publication date: 1986-01-30
Also published as: AU575630B2; AU4031585A; ZA852099B; ES8607730A1; EP0157556A3; ES541599A0; EP0157556A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般に構造遺伝子クローニングの分野と所望
のたんぱく質生成物の組換えＤＮＡ指向合成におけるこ
のような遺伝子の使用法とに関する。

ことに本発明は、新規な因子（Ｆａｃｔｏｒ　）■凝血
促進剤活性たんぱく質（因子■−Ｃ）と、その組換えＤ
ＮＡ指向合成と、血友病のような凝血異常の処置におけ
る使用法とに関する。

一般に組換えＤＮＡ法は現在ではよく知られるようにな
っている。たとえばメソツヅ・イン・エンチモロジ−（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　］ｌｃｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）
、〔アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ　）　）第６５巻及び第６８巻（１９７９年）、第
１（１０巻及び第１０１巻（１９８３年）とこれ等に引
用された参照文とがある。これ等はすべてこの説明に引
用しである。一般に使われている組換えＤＮＡ方法論を
実施する広範な技術的討論は、コールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）の−ｒニアテイス
（Ｍａｎｉａｔｉｅ　）等を著者とする論文モレキュラ
ー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　）に認められる。種種のポリペプチドをコードづけ
する遺伝子は、組換えＤＮＡベヒクルたとえばバクテリ
アベクター又はウィルスベクター内のポリペプチドをコ
ードづけするＤＮＡ断片を協働させ、適当な宿主たとえ
ば大腸菌細胞系を形質転換し、組換え体ベクターを含む
クローンを隔離することによりクローン化される。

このようなりローンは生長させ所望のポリペプチドを大
規模に生成するのに使う。

８０６３８　　１９８４年６月２９日　５９２７６５号
２０−０３２５１　１０１　３（１０．（１０ｃＨ８０
６５９１９８４年３月２９日　５９　’２７６５号２０
−０３２５１　１０２　１２０．（１０ｃＨｓ０６４０
　　１９８４年６月２９日　５９２７６５号２０−０３
２５１．１０３　１４０．（１０ＣＨ８０６４１１９８
４年３月２９日　５９２７６５号２０−０３２５１　１
０４　１（１０．（１００Ｈ複数群の作業者が、真正核
類細胞からｍＲＮＡの混合物を隔離し、１連の３種の酵
素反応を使し・、このｍＲＮＡ混合物に相補的な全遺伝
子の二重鎖ＤＮＡ模写を合成した。第１の反応ではｍＲ
ＮＡは、又リバーストランスクリプターゼとも呼ばれる
ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼにより転写され一重鎖の
相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ　）を形成する。リバーストラ
ンスクリプターゼは、ＤＮＡを５’−３’の方向に合成
し、前駆物質としてデオキシリボヌクレオシド５′−ト
リホスヘートを利用し、鋳型及びプライマー鎖を共に必
要とする。これ等のうちのプライマー鎖は遊離６′−ヒ
ドロキシル末端を持たなければならない。リバーストラ
ンスクリプターゼ生成物は、ｍＲＮＡ鋳型の部分模写又
は全模写のどちらであっても、それぞれ３′末端に短い
部分的に二重鎖のヘアピン（「ループ」）を持つことが
多い。第２の反応でｉよ「ヘアピンループ」はＤＮＡポ
リメラーゼに対するプライマーとして利用することがで
きる。

前成りＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの作用で鋳型として
もプライマーとしても必要である。ＤＮＡボ”ＩＪメラ
ーゼは、遊離６′−ヒドロキシル基を持つＤＮＡ　鎖の
存在を必要とする。このＤＮＡ鎖に新らたなヌクレオチ
ド残余、介を加えこの鎖を５’−３’の方向に伸ばす。

このような逐次のリバーストランスクリプターゼ及びＤ
ＮＡポリメラーゼの反応の生成物はなお一端部にループ
を持つ。このようにして生成した二重鎖ＤＮＡのループ
の頂部すなわち「折れ込み点」は実質的に一重鎖セグメ
ントである。第３の反応ではこの一重鎖部分は一重鎖特
異ヌクレアーゼＳ１で分割され、「プラント末端を持つ
」二重鎖ＤＮＡ部分を生成する。この一般的方法は任意
のｍＲＮＡ混合物に応用できジャーナル・オプ・バイオ
ロジカルφケミストリー（；ｒ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、　）２５３：２４８３（１９７８年夕０ピュエル（
Ｂｕｅｌｌ　）等の論文に記載しである。

得られる二重鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓ−ｃＤＮＡ　）は、少
くとも一部は特定の使用ベヒクルに従って多くの公知の
方法の任意の１つによりクローニングベヒクル内に挿入
する。メゾッヅ・イン・エンチモロシー６８：１６−１
８及びこれに引用された参照文には種種の挿入法が極め
て詳細に記載しである。

これ等のクローニングベヒクルは通常、宿主に抗生物質
の抵抗特性を及ぼす。ＤＮＡ区分を挿入すると、クロー
ニングベヒクルは適当な宿主を形質転換するのに使われ
る。このような宿主は一般に原核生物細胞又は真正核類
細胞である。この場合わずかな形質転換宿主又はトラン
スフェクトされた宿主だけが所望のｃ　ＤＮＡを含む。

全部の形質転換宿主又はトランスフェクトされた宿主の
和が遺伝子「ライブラリー（１ｉｂｒａｒｙ　）　Ｊを
構成する。

この方法により生成された全ｄａ−ｃＤＮＡライブラリ
ーは、出発材料として使われたｍＲＮＡ混合物中に存在
するコードづけ情報の代表的試料になる。

適笛なオリゴヌクレオチド配列が利用できれば、この配
列を使し・次のようにして問題のクローンを識別するこ
とができる。各別の形質転換細胞又はトランスフェクト
された細胞はニトロセルロースろ紙で集落として生長す
る。これ等の集落を解離し、このようにして解離したＤ
ＮＡを加熱により共有的にろ紙に付着させ、標識オリゴ
ヌクレオチドプローブと共に定温保持する。このプロー
ブ配列は問題の構造遺伝子に相補的である。このプロー
ブは、これが相補的なｄｓ−ｃＤＮＡと雑種形成し、こ
れは自動ラジオグラフィーにより識別する。これ等のク
ローンは、所望のたんぱく質に対する全部の構造情報を
含むクローンを識別する特性がある。

問題のたんぱく質をコードづけする核酸配列は隔離して
表現ベクターにふたたび挿入する。この表現ベクターは
クローン化遺伝子を、特異の原核生物制御要素又は真正
核類制御要素の調整制御のもとに持来す。このようにし
てクローン化全長ｄｓ−ｃＤＮＡの有効な表現（転写及
び翻訳）ができる。

すなわちこの一般的方法は、それぞれアミノ酸又はＤＮ
Ａ配列の少くとも一部分が知られオリゴヌクレオチドプ
ローブが利用で膚るたんぱく質にだけしか応用できない
（前記のマニアテイス等の論文参照）。

なお近年では、問題のコードづけたんぱく質に特定の抗
体でバクテリア集落を試験することにより特定のクロー
ンを識別する方法が開発されている。この方法は、生成
たんぱく質の精製が必要であるから、「表現ベクター」
クローニングベヒクルにしか使うことができない二構造
遺伝子は、たんぱく質の表現を誘起する調整遺伝子配列
に隣接してベクター内に挿入する。細胞は、ベクターに
より又は化学的方法により解離し、特定の抗体及び標識
系たとえば免疫分析によりたんぱく質を検出する。この
例には、米国のプロシーデイングズ・オプ・ず・す７ヨ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンジズ（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　）　Ｆ３　Ｑ
　：１１９４〜１１９８（１９８３年刊）のヤング（Ｙ
ｏｕｎｇ）及びディビス（Ｄａｖｉｓ　）の論文とサイ
エンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２２　：　７７８　（１
９８３年刊）のヤング及びディビスの論文とに記載しで
あるλｇｔ　１１系がある。

正常なヒトの血漿は、因子■複合体と呼ばれる２種のた
んぱく質の複合体を含む。因子■複合体の一方の成分は
抗血右肩因子凝血促進剤活性を持ち因子■〜Ｃと称する
。因子■−Ｃの不足は、Ｘ染色体遺伝により伝わる病気
である血友病の特長である。

因子■−Ｃの生化学については文献にほとんど情報がな
い。因子■−Ｃ１Ｃつ℃・ては、完全な因子■複合体を
使し・多くの研究が行われている。最近上として免疫吸
着又はイオン交換クロマトグラフィーにより因子■複合
体及びその他多くの血漿たんぱく質から因子■−Ｃが分
離されている。このことは一般にヘイヤー（Ｈａｙｅｒ
　）を著者とするブラッド（Ｂｌｏｏｄ）５８：１　：
１３（１９８１年刊）とシンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍ
ａｎ　）等を発明者とする米国特許第４，３６１，５０
９号明細書とこれ等に引用された参照文とに記載しであ
る。

因子■〜Ｃは、その血友病患者の凝血不全を補正する能
力があるので治癒値を持つ。しかし前記したように因子
■−Ｃを確実に得るのに利用できる方法はヒトの血漿の
分別娯限られる。血漿分別による因子■−Ｃの生産では
限られた量しか得られない。これでは、調製によって変
り、高価で、血友病の患者が肝炎のような病気にかかる
おそれがあり、又免疫不全症候群になる。

前記した問題を認識し解決するのに本発明により、血漿
分別調製の病気伝染のおそれのなし・多量の因子■〜Ｃ
抗血友病因子が容易に入手できるようになった。このこ
とは、因子■−Ｃたんぱく質分子の各区分に特異のコー
ドづけをするオリゴヌクレオチドと、因子■−Ｃたんぱ
く質に対しコードづｈするクローニングベヒクルを調製
する組換えＤＮＡ法の応用と、ヒト起原の他のたんぱく
質を実質的に含まないヒト因子■−Ｃを収得する選別／
隔離法とにより達成できた。

従って本発明は、ヒト超厚の他のたんぱく質を実質的に
含まなし・ヒト因子■−Ｃを提供するものである。とく
に因子■−Ｃは、宿主細胞又はその他の自己複製゛系内
の組換えＤＮＡ法により作られ、実質的に純粋な形で得
られる。又前記した因子■−Ｃと共に治療組成物を調製
する方法及び組成物と、ヒト及び動物の凝固異常の処置
の際の因子■−Ｃたんぱく質の使用法とが得られる。

さらに本発明により、ヒト因子■−Ｃをコードづけする
ＤＮＡ配列とこれにより形質転換し又はトランスフェク
トする細胞の又は細胞を含まなし・自己複製宿主系とを
協働させた複製できる表現ベクターが得られる。宿主系
は通常原核生物細胞たとえば大腸菌又は枯草菌或は真正
核類細胞である。

ヒト因子■−Ｃは、（ａｌ細胞の又は細胞を含まない適
当な複製宿主系内のヒト因子■−ＣをコードづけするＤ
ＮＡ配列を表現することのできる複製できる表現ベクタ
ーを調製し、（ｂ＋前記宿主系を形質転換して組換え体
宿主系が得られるようにし、（Ｃ）この組換え体宿主系
を前記の因子■−ＣコードづけＤＮＡ配列を表現できる
条件のもとに保持してヒト因子■−Ｃたんぱく質を生成
し、（ｄ）このヒト因子■−Ｃたんぱく質を収得するこ
とから成る方法により生成する。複製できる表現ベクタ
ーをコードづけする因子■−Ｃは、因子■−Ｃ用の伝令
ＲＮＡを含む伝令ＲＮＡプールを表わす二重鎖相補ＤＮ
Ａ　（ａｓ−ｃＤＮＡ　）調合剤を調製し、ｄｓ−ｃＤ
ＮＡプールから複製できる表現ベクターにＤＮＡを協働
させることによって作るのがよい。ヒト因子■−Ｃを収
得する好適とする方式は、組換え宿主系により表現した
たんぱく質を、因子■−Ｃに特定の少くとも１種類の結
合たんぱく質を含む試薬組成物と反応させ、この反応か
ら任意の検出できる応答を観察し、識別した因子■−Ｃ
を宿主系から隔離することから成っている。

Ａ、好適とする実施例の説明の概論この説明で使う場合に「ヒト因子■−Ｃ」とは、ヒトの
血漿に固有の因子■−Ｃと同様に、正常な血液凝固を開
始する能力を持つ生物学的活性形に細胞の又は細胞を含
まない培養系により作られるヒト因子■−Ｃのことであ
る。

因子■−Ｃの互に異る対立遺伝子は天然に存在する。こ
れ等の種類は、同じ生物学的機能を持つたんぱく質に対
しコードづけする構造遺伝子の全ヌクレオチド配列の違
し・を特長とする。さらにグリコシル化と共に他の後翻
訳変更の場所及び程度は、変化し、たんぱく質を生成す
る宿主及び環境の性質に成る程度依存する。単一の又は
多重のアミノ酸の置換、欠失、添加又は交代を持つヒト
因子■−Ｃ相似体を生成することができる。天然のヒト
因子■−Ｃの生物学的に活性の凝固性を保持するヒト因
子■−Ｃ誘導体の生ずるこのような対立遺伝子変種、変
更体及び相似体はすべて本発明の範囲内に含まれる。

表現ベクターは、その中に含まれるＤＮＡ配列がそれぞ
れの表現を行ことかでき他の調整配列に連鎖する場合に
このようなりＮＡ配列を転写し翻訳することのできるベ
クターのことである。これ等の表現ベクターは、エピソ
ームとして又はバクテリオファージとして或は染色体Ｄ
ＮＡの一体部分として宿主の組織又は系内で複製できな
ければならない。本発明に使うのにとくに適当な表現ベ
クターの１つの形は、バクテリオファージすなわち通常
バクテリア内で存在し複製するウィルスである。

このためにとくに望ましいファージは、前記のヤング等
の論文に記載しであるλｇｔ１０及びλｇｔ１１ファー
ジである。λｇｔ１１は、挿入ＤＮＡにより特定化した
ポリペプチドを作ることのできる組換えＤＮＡ表現ベク
ターである。この組換えベクターは、その安定性を高め
るように単一模写ゲツム挿入体として宿主細胞内で増殖
する。このベクターは、模写数の迅速な増加と異種ＤＮ
Ａの高レベルの転写とによる誘導に応答する。変性が最
少になるように異種真正核たんぱく質ポリペプチドを、
構造ＤＮＡ配列からの真正核成分と遺伝子からの原核生
物たんぱく質のβ−ガラクトシダーゼの少部分を除いた
すべてとの融合として合成する。たんぱく質変性径路に
おける不完全な宿主細胞の使用により又、誘導λｇｔ１
１クローンから誘導される新らたなたんぱく質の寿命が
増す。λｇｔ１１クローン内の異種ＤＮＡの適正な表現
は、β−ガラクトシダーゼプロモーターに対する挿入Ｄ
ＮＡの方位及び解読フレームに依存する。組換えＤＮＡ
法に有用な別の形の表現ベクターは「プラスミド」すな
わち円形の弁組込みの（染色体外の）二重鎖ＤＮＡルー
プである。本発明は、同等の機能に役立ち当業界に知ら
れ又は逐次に知られるようになる任意の他の形の表現ベ
クターを含む。

前記した組換えベクター及び方法論は、広い範囲の原核
生物組織及び真正核組織にわたり宿主細胞に使うのに適
当である。一般に前核類がクローニングＤＮＡ配列に対
し又本発明に有用なベクターの構成に好適であるのはも
ちろんである。たとえば大腸菌に’ｌ　２系統ＭＭ２９
４（ＡＴＣＣ第５１４４６号）はとくに有用である。他
の微生物系統を使ってもよいのはもちろんである。宿主
の細胞又は系に適合できる種から誘導される複製及び制
御配列を含むベクターは、これ等の宿主と関連して使う
。ベクターは通常超厚又は複製と共に形質転換細胞内で
表現型選択を生ずることのできる特性を持つ。

大腸菌は、ｐＢＲ３２２すなわち大腸菌種から誘導され
たプラスミド〔ジーン（Ｇｅｎｅ　）　２　：　９５（
１９７７年刊）のポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ　）等の論
文による〕を使い形質転換することができる。このｐＢ
Ｒ３２２は、アムピシリン及びテトラサイクリンの抵抗
に対する遺伝子を含み、従って形質転換細胞を識別する
手段となる。表現ベクターは又、これ自体のたんぱく質
の表現のためにこのベクターに使うことのできるプロモ
ーターを含まなければならな℃・。一般的な原核生物プ
ロモーターには、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）と
ラクトースとトリシトファン（ｔｒｐ　）とバクテリオ
ファージλのｐＲ及びｐＩ＋プロモーターとがある。こ
れ等のプロモーターの組合わせも又使われる（たとえば
ｔｒｐプロモーターとラクトースオペレーターとの融合
体であるＴＡＣ）。その他のプロモーターも又認められ
利用されている。これ等のプロモーターのヌクレオチド
配列についての詳細は刊行され、熟練した作業者がこれ
等の配列を適当なベクターにより機能的に結合すること
ができる。

前核類のほかに培養酵母のような真正核微生物を使って
もよい。パン酵母又は一般的なパン屋の酵母は真正核微
生物の間で最も一般的に使われるが、若干の他の系統が
一般的に利用できる。酵母ベクター内の適当なプロモー
ター配列は、６−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその
他の解糖酵素系に対するプロモーターを含む。適当な表
現ベクターを構成する際比は、これ等の遺伝子を協働さ
せた末端配列は又、表現するのに望ましい配列の表現ベ
クター３′内に結合されｍＲＮＡ及び末端のポリアデニ
ル化を生ずる。酵母に適合できるプロモーターと複製の
起原と適当な末端配列とを含む任意のベクターが因子■
−Ｃの表現に適当である。

微生物のほかに多細胞生体から誘導される培養細胞も又
宿主として使われる。一般に任意のこのような培養細胞
は、を椎動物培養体又は無を椎動物培養体のどちらかの
ものであっても、使用できる。しかしを椎動物細胞が最
も重要である。そして培養体（組織培養体）内のを椎動
物細胞の増殖は近年では慣例の手順になっている。この
ような有用な宿主細胞系の例には、ＶＩＣＲＯ細胞及び
ＨθＬａ細胞と中国産ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系
とＷ１３８、ＢＨＫ　、　ＣＯＥ！　−７及びＭＤＣに
細胞系とがある。このような細胞に対する表現ベクター
には通常、（必要に、応じて）複製の起原と、任意所要
のリポソーム結合部位、ＲＮＡ接合部位及びポリアデニ
ル化部位と共に表現しようとする遺伝子の前部に位置す
るプロモーターと、転写末端配列とがある。

哺乳類細胞に使うには、表現ベクターに対する制御機能
はウィルスにより生ずることが多し・。たとえば一般に
使われるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス
２そして最もひんばんにはシミアンウィルス４０（ＳＶ
４０）から誘導される。

さらに又、所望の遺伝子配列を自然に協働させたプロモ
ーター又は制御配列を、このような制御配列が宿主系に
適合する場合には、利用することができ又望ましいこと
が多い。転写の割合を増すには、構造に真正核エンハン
サー配列を加えてもよい。これ等の配列は、種種の動物
細胞又はマウス肉腫ウィルスのような腫瘍誘発ウィルス
から得られる。

複製の超厚は、５Ｖ４Ｑにより得られるような外因超厚
を含む又はその他のウィルス源を含むベクターの構造に
より得られ、或は宿主細胞染色体複製機構により得られ
る。ベクターを宿主細胞染色体に組込めば、この染色体
は十分であることが多い。

宿主細胞により、種種の化学的組成物から成るヒト因子
■−Ｃたんぱく質を調製することができる。第１のアミ
ノ酸（構逗遺伝子の前部に挿入し。

たＡＴＧ出発信号ごトンにより存在する）としてメチオ
ニンを持つたんぱく質が作られる。正規に第１のアミノ
酸を持つメチオニンは又細胞内又は細胞外で分割される
。このたんぱく質は、その信号ポリペプチド又は普通の
ポリペプチド以外の接合したたんぱく質と一緒に作られ
る。接合の信号ポリペプチドは細胞内又は細胞外の環境
で十分に分割することができる。最後に因子■−Ｃは、
外部のポリペプチドの分割を必要としないで成熟した形
に直接表現により作られる。

組換え体宿主細胞とは、組換えＤＮＡ法を使って構成し
たベクターにより形質転換した細胞のことである。前記
したように因子■−Ｃはこの形質転換によって作られる
。このような細胞により作った因子■−Ｃは「組換え因
子■−Ｃ」と称する。

Ｂ１組換え及び選別の方法ただし以下の手順は、本発明方法に有用な特定の試薬を
作る広範囲の公知の手順のうちの若干のものである。伝
令ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）混合物を得る一般的手順では
、組織試料から抽出物を作り又は所望のたんぱく質を生
成する細胞を培養し、バイオケミストリー（Ｉｊ、ｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　１８　：　５２９４（１９７
９９７９年刊アギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　）等の論文に
記載しであるような方法によりｍＲＮＡを抽出する。ｍ
ＲＮＡは、オリゴ（（ＬＴ　）セルロース又はポリ（Ｕ
）セファロースに対するクロマトグラフィーにより、次
でボＩＪ　（Ａ　）含有ｍＲＮＡ濃厚化分別分の誘出に
よりポリ（Ａ　）　ｍＲＮＡ含有物質に対し濃厚化する
。

前記のポＩＪ　（Ａ　）含有ｍＲＮＡ濃厚化分別分は誘
出バーストランスクリプターゼを使（・−重鎖相補ＤＮ
Ａ　（５ｓ−ｃＤＮＡ　）を合成するのに使う。ＤＮＡ
合成によって、ＤＮＡの６′端にヘアピンループを形成
し、第２鎖ＤＮＡ合成を開始する。適当な条件のもとで
、このヘアピンループは、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌク
レオチドトリホスフェートの存在のもとに第２鎖の合成
を行うのに使う。

得られる二重鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓ−ｃＤＮＡ　）は、多
くの公知の方法の任意の１つにより表現ベクターに挿入
する。一般的な方法は前記のマニアテイスの論文とメン
ツブ１イン・エンチモロジー第６５巻及び第６８巻（１
９，８０年刊）とに記載しである。

一般にベクターは、少くとも１つの制限エンドヌクレア
ーゼにより直線化し、少くとも２つのプラント末端又は
結合性末端を生ずる。ＤＮＡはベクター挿入部位で結合
し又はこの部位に接合する。

原核生物細胞又は実質的な細胞壁構造を含む細胞を使え
ば、表現ベクターによる最も一般的な形質転換法は、米
国のプロシーデイングズｅオプ・ず・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ６９：２１１０（１９７２
９７２年刊−エン（Ｃｏｈｅｎ　）、Ｐ、Ｎ、等の論文
に記載しであるような塩化カルシウム前処理である。宿
主細胞として細胞壁障壁のない細胞を使えば、形質転換
は、ビーロロジ−（ＶｉｒＯＩＯｇ７　）　６２　：　
５４６（１９７８年刊）のダラハム（Ｇｒａｈａｍ　）
及びフェル噂デア・Ｅｂ　（Ｖｅｒｄｅｒ　Ｒｂ）の論
文に記載しであるりん酸カルシウム沈澱法により実施す
る。ＤＮＡを細胞内に導入する他の方法たとえば被注入
又は原形質体融合も又有効に使われている。この°場合
組織を選択媒体上で培養し組換えｃＤＮＡライブラリー
によりコードづけするたんぱく質を生成する。

因子■−Ｃの一部の配列又は全配列を含むクローンは、
このようにして形成した（１８−ｃＤＮＡ混合物を化学
的に合成したオリゴヌクレオチドプローブで雑種形成す
ることにより識別する。オリゴヌクレオチドプローブは
因子■−Ｃたんぱく質の一部アミノ酸配列から決定する
。与えられたアミノ酸配列をコードづけするオリゴヌク
レオチドの配列は、遺伝コードの縮重性に基づＬ・て推
定することができる。

形質転換体は、米国プロシーディングズ・オシ・デ・ナ
ショナル・アカデミ−・オシ・サイエンシズ７２：３９
６１　（１９７５９７５年刊ランスティン（Ｇｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ　）及びホグネス（Ｈｏｇｎｅｅｓ　）の論文
により雑種形成のためにニトロセルロースフィルタで生
長させて作る。形質転換体含有フィルタは、因子■−Ｃ
のアミノ酸配列に基づいて合成した３２ｐ標識オリゴヌ
クレオチドと反応させ、次で洗浄し乾燥してオートラジ
オグラフ生成を行う。強い雑種形成信号を示した集落を
さらに分析のために選定する。ＤＮＡはジャーナル・オ
シ・バクチリオール（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　）　
１３８　：　２７０（１９７９年刊）のノアガード（Ｎ
ｏｒｇａｒｄ　）等の論文に記載しである方法により隔
離し、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌにより分割する
。これ等の分割断片は前記のマニアティスの論文（１９
７５年）に記載しであるように水平１．５係アガロース
デル中で電気泳動により分離する。次でメソッジ・イン
・エンチモロシ−６５：　４９９　（１９８０年刊）の
マクずム（ＭａＸａｍ　）及びギルバート（Ｇ１１ｂｅ
ｒｔ　）の論文に記載しであるように最長のｃＤＮＡ挿
入体を含むベクターを配列する。全部のクローンを分析
し、因子■〜Ｃをコードづけする全ヌクレオチド配列に
対応するクローンを識別する。

因子■−Ｃの一部又は全部の遺伝子を含むクローンは又
因子■−Ｃたんぱく質の一部又は全部の方に向いた特定
の抗体で識別する。この識別法には、挿入部位に隣接し
て適当な調整核酸配列を含むベクター内にｄｓ−ｃＤＮ
Ａを挿入する必要がある。

これ等の調整配列は、ベクターに挿入したこれ等のｄｓ
−ｃＤＮＡ分子の転写及び翻訳を開始する。調整配列に
対して正確に位置した因子■−Ｃ配列を含むこれ等のク
ローンは、因子■〜Ｃたんぱく質の一部又は全部を増殖
する。この因子■−Ｃアミノ酸配列配列適当な特定の抗
体により検出する。このようなりローニング系は前記の
ヤング及びデービスの論文に第１に記載しであるλｇｔ
　１１系である。

特定結合分析選別法は、形質転換宿主により作り出され
た因子■−Ｃたんぱく質を識別するのに使うのがよい。

特定の結合分析は、配位子すなわち決定のもとでの結合
できる分析物とこれに対する結合相手との間の特定の相
互作用に基づく。因子■−Ｃの場合のように配位子及び
その結合相手の一方が抗原であり他方が対応する抗体で
ある場合には、この分析は免疫分析として知られる。

当業界では複数の互に異る結合分析方式が知られている
が、これ等の分析方式は使用標識の性質に従って一般に
類別する。標識の影響を受ける特性は任意の測定できる
性質である。多くの場合にこの分析方式では、試料内の
配位子又はその試料の結合能力を相互作用する同種の特
異の結合分析試薬に免疫化学的に協働させる。たとえば
１つの方式では標識は酵素であり、基質に作用する酵素
の能力は、結合相手に接合する標識の結合により積極的
に又は消極的に影響を受ける。基質に及ぼす酵素の作用
により、若干の方式で通常螢光又は光吸収（色）により
区別できる生成物を生ずる。

Ａ、全ＲＮＡの調製全ＲＮＡ　（伝令、リボゾーム及び転移）を前記のチア
ギンの論文（１９７９年）に記載しであるように新鮮な
冷凍肝臓から抽出した。これ等の肝臓は、４Ｍのグアニ
ジンチオシアネートとｐＨ７，０の２５　ｍＭのくえん
酸ナトリウムと０．５％Ｎ−ラウリルサルコシンと０．
１Ｍの２−メルカプトエタノールと０．２％アンチオー
ム（Ａｎｔｊ、ｆｏａｍ　）　Ａ　Ｃ米国ミズーリ州セ
ントルイス市シグマ・ケミカル・カムパ＝　（Ｓｉｇｍ
ａ　Ｃｈｅｍｉｃａ’ｌ　Ｃｏ、　）　）とを含む１５
容積の溶液内で均質化した。この均質液はソーボール（
ＳＯｒｖａｌｌ）ＧＳＡ回転子内で６（１００　ｒｐｍ
で１５　ｍｉｎにわたり１０℃で遠心分離した。上澄流
体は酢酸の添加によりｐｉ−１５，０に調節し、−２０
℃の０．７５容積のエタノールにより２　ｈｒにわたり
ＲＮＡを沈澱させた。このＲＮＡを遠心分離により集め
て、２５ｍＭのくえん酸ナトリウム及び５　ｍＭのジチ
オトレイトールを含む７．５Ｍの塩酸グアニシン中に溶
解した。０．５容積のエタノールを使う２つの付加的沈
澱に次で、残留塩酸グアニジンを無水アコールにより沈
澱から抽出した。ＲＮＡを殺菌水中に溶解し、不溶性物
質を遠心分離九より除去し、ペレットを水で再抽出した
。ＲＮＡは０．２Ｍ酢酸カリウムに調節し、２．５容積
のエタノールを加えることにより一２０℃で夜通し沈澱
させた。

Ｂ、　　ＲＮＡ含有ポリ（Ａ）の調製前記したようにして用意した全ＲＮＡ沈澱を、１［１ｍ
ＭのＥＤＴＡ及び１係のＳＤＳを含むＰＨ７，２の２　
Ｑ　ｍＭのヒープス（Ｈｅｐｅｓ　）緩衝液中に溶解し
、１０　ｍｉｎ間６５℃に加熱し、次で２５℃に急速に
冷却した。このＲＮＡ溶液は次で等しい容積の水で希釈
し、ＮａＣＡを加えて３　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１に最
終濃度にした。２４０　ＯＡ２６０単位までのＲＮＡを
含む試料を標準の手順を使いボＩＪ、　（Ｕ）−セファ
ロースでクロマトグラフィー処理をした。ＲＮＡを含む
ポリ（、Ａ）を、１ｍＭのヒープス緩衝液（ｐＨ７，２
）及び２　ｍＭのＥＤＴＡを含む７０％ホルムアミドで
溶離した。この溶離液を０．２４　Ｍ　ＮａＣＡ’に調
節し、２．５容積のエタノールにより一２０℃でＲＮＡ
を沈澱させた。

Ｃ２λｇｔｌｌ中のｃＤＮＡクローンの構成全部の酵素
反応に対し行った手順を第１図に示しである。ｍＲＮＡ
　（２１）　ｕｇ　）を前記のビュエル等の論文とゾヤ
ーナルーオプ・バイオロジカル・クミストリー２５３：
２４８３（１９７８年刊）のヮイクンズ（Ｗｉｋθｎｓ
　）等の論文とに記載しであるようにリバーストランス
クリプターゼ及びＤＮＡポリメラーゼＩによりａｓ−ｃ
ＤＮＡに正確に模写した。

ｄｓ−ｃＤＮＡをセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　
）　Ｇ　−５０で脱塩し、ボイド容積部分を製造者の指
示に従いエリューチツゾ（Ｅ’１ｕｔｉｐ−Ｄ　）カラ
ム〔米国ニューハンプシャー州キーン市シュレイカー〇
エンド・シュエル（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈ
ｕｅｌｌ　）製〕でさらに精製した。ｄｓ−ｃＤＮＡは
前記のノーが−ド等によるＳ１ヌクレアーゼによる定温
保持によってプラント末端を生成した。０．２Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４，５）と肌４塩化ナトリウムと２．５
ｍＭ酢酸亜鉛とｄｓ−ｃＤＮＡのｎｇ当たり０．１単位
の８１ヌクレアーゼとから成る反応混合物を１Ｄ　Ｄ　
ｕ／の最終反応容積にした。ｄｓ−ｃＤＮＡを６７℃で
１ｈｒだけ定温保持し、フェノール：クロロホルムで抽
出し、次で前記（−だようにセファデックスσ−５Ｄカ
ラムで脱塩した。

次で二重鎖ｃＤＮＡを前記のモレキュラー・クローニン
グのマニアナイスの論文に記載しである反応条件を使し
・ＫｃｏＲ１メチラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼＩ〔フ
レノウ（ＫｌｅｎＯＷ　）　）で処理した。

ｃＤＮＡを前記したようにセファデックスＧ−５０でふ
たたび脱塩し、次でＴ、　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ（前記マ
ニアナイス）で０．５　ｕｇのりん酸化ＫｃＯＲ１リン
カ−（Ｌｉｎｋｅｒ　）に結合した。この混合物は次で
ＥｃｏＲｌで分割しトリス−ボーレート緩衝液（前記マ
ニアナイス）中の８チアクリルアミドゲルで分別した。

１キロベースより大きい大きさを持つＤＮＡをグルから
溶離しエリューチップーＤカラムに結合することにより
回収し、ｉ　Ｍ　ＮａＣＡ！で溶離し、次でエタノール
沈澱により収集した。

この例の残りで行った手順を第２図に示しである。次で
ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼと共ＶｃＥｃｏＲ１の
切断しホスファターゼ処理したλｇｔ１１内に挿入し約
８（１０万の組換え体ファージから成るライブラリーを
生成した。このライブラリーは、大腸菌Ｙ　Ｉ　Ｄ　８
８　Ｃ５ｕｐＥ　５ｕｐＦ　ｍｅｔＢ　ｔｒｐＲｈｓｄ
Ｒ−ｈｓｄＭ”　　ｔｏｎＡ２１　５ｔｚ−Ａ　　１ａ
ｃＵ　　１　６　９　　ｐｒｏＣｉｉ　　Ｔｎ５（ｐＭ
Ｃ９）　Ｅに４２℃でプレートストックを生成すること
により増幅した。これ等の増幅手順は前記のマニアナイ
スの論文に記載しである。ヤング及びディビスの論文に
記載しであるこの系統の重要な特長には、５ｕｐＦ　（
Ｓ遺伝子のファージアンバー突然変位の抑圧に必要であ
る）と、ｈｓｄＲ−ｈｓｄＭ”　（宿主変更に先だって
他種ＤＮＡの制限を防ぐの忙必要）と、１ａＣＵ１６９
〔ラックオペロンの欠失は、宿主ファージ組換えを減ら
し、λｇｔ１１組換え体（一般にＢガラクトシダーゼ活
性がほとんど又は全くない）を弁組換え体（Ｂガラクト
シダーゼ活性）から区別するのに必要である〕と、Ｉ）
ＭＣ９（宿主細胞及びファージの生長に有害な他種遺伝
子の表現を抑制するｌａｃ工を運搬するｐＢＲ６２２シ
ラスミド）とがある。

Ｄ、因子■−Ｃ配列を含むクローンの識別クローンを生
成する因子■−Ｃ抗原性遺伝基質のライブラリーを選別
するには、λｇ’ｔ　１１組換え体ファージを大腸菌培
養地（１ａｃＵ　１６９　ｐｒｏＡ”１ｏｎ　ａｒａ　
Ｄ　ｉ　３９５ｔｒＡ　５ｕｐＦ　（ｔｒｐＣ２２ｉｉ
　Ｔｎｌ　０　）　（ｐＭｃ　９　）　）で平板培養し
４２°ＣＩｃ　’２．５ｈｒだけ定温保持する。この宿
主は１ｏｎプロテアーゼ中では有効でないから、表現さ
れた他種たんぱく質の変性を減らす。ｉＱｍＭのイソプ
ロピルチオ−Ｂ−４−がラクトピラノシド（工ＰＴＧ　
）で前もって飽和して乾燥したニトロセルロースフィル
ターを平板上に乗せる。次でこれ等の平板は６７°Ｃで
ｉ、５ｈｒにわたり除く。工ＰＴＧは１　ａ　ＱＺ転写
の誘発要因である。λｇｔ１１内の他種ＤＮＡ挿入体の
表現は、１ａｃＺ転写の共通の制御のもとにあり、この
転写が又誘発される。フィルターの位置は針で印を付け
、このフィルターを取出しＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７，５の
２Ｑ　ｍＭのトリス及び５（１０　ｍＭのＮａＣＪ　）
中で洗浄して、３％のゼラチンを加えたＴＢＳ中で６Ｑ
　ｍｉｎ間室温に保つ。

このフィルターは、ＴＢｓ中の１チゼラチンから成る緩
衝液中の因子■−Ｃに指向したｅｍｕポリクローン抗体
の１対１（１０の希釈液中で夜通し室温に保つ。この抗
体はプロシーディングズ・オシ・ヂ・ナショナル・アカ
デミ−・オシ・サイエンシズ７９　：　１６４８　（１
９８２年刊）のファルチャ−（Ｆｕｌｔｕｒｅ　）及び
シンマーマンの論文に記載しであるように作る。フィル
ターは次でそれぞれＴＢＳ緩衝液中で１０ｍ１ｎ間ずつ
２回洗浄する。

次に１％ゼラチン及びＰＢＳ中の親和カー精製ウサギ抗
−ｅｍｕ免疫グロブリンの１対２（１０の希釈液５ｄを
加え、このフィルターなｉ　ｈｒ室温に保持した。この
フィルターは次でそれぞれＴＢＳ緩衝液中でｉＱｍｉｎ
間ずつ１回洗浄し、これに次で西洋ワサビペロキシダー
ゼ（ｎＲｐ　）結合のヤギ抗つサギエｇＧ　Ｃ米国リッ
チモンド市のパイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕の
１対２（１００の希釈液２０＋Ｊを加え、次で室温にｉ
　ｈｒだけ保持し、それぞれＴＢＳ中でｉ　Ｑ　ｍｉｎ
ずつ２回洗浄した。各フィルターは次で前記バイオ−ラ
ド社の文献に記載しであるようにＨＲＰ発色溶液中で室
温に保持する。

各発色信号の位置で直径４闘の寒天栓を平板から取出し
、ｐＨ７，５の１０ｍＭ）リスＨ（Ｊ及びｉＱｍＭＭｇ
ＳＯ４の中で少くともｉ　ｈｒだけ定温保持した。

この溶液中のファージは、約１０３溶菌斑形成単位（Ｐ
ＦＵ　）の濃度で９０ｍｍの平板上でふたたび培養し前
記したようにふたたび選別する。この再培養及び選別の
処理は、平板上の全部の溶菌後が信号を生ずるまで反復
する。これ等の溶菌後により、ヒト因子■−Ｃを生ずる
組換え体クローンを識別する。

すなわちこの例は、他のヒトたんぱく質又はポリペプチ
ドの広いライブラリーに対するＲＮＡとの異種混合物中
の因子■−ＣをコードづけするＲＮＡを含むヒト組織抽
出物からヒト超厚の他のたんぱく質を実質的に含まない
ヒト因子■−Ｃを生ずる実験的手順を述べたものである
。

以上本発明をその実施例について詳細に説明したが本発
明はなおその精神を逸脱しないで種種の変化変型を行う
ことができるのはもちろんである。

【図面の簡単な説明】

第１図は全部の酵素反応に対し本発明により実施する手
順の説明図、第２図は第１図の残りの手順の説明図であ
る。手　続　補　正　書　（方式）昭和６０年７月２５日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト起源の他のたんぱく質を実質的に含まないヒ
ト因子VIII−Ｃ。
（２）関連する自然のグリコシル化を伴わないヒト因子
VIII−Ｃ。
（３）組換え体宿主系により生成したヒト因子VIII−Ｃ
。
（４）実質的に純粋な形のヒト因子VIII−Ｃ。
（５）内生のヒト因子VIII−Ｃの通常第１のアミノ酸の
Ｎ−末端から延びるポリペプチド配列を含む前項（１）
〜（４）のいずれかに記載のヒト因子VIII−Ｃ。
（６）細胞の又は細胞なしの自己転写組換え体系で前項
（１）〜（４）のいずれかに記載のヒト因子VIII−Ｃを
表現することのできる複製できる表現ベクター。
（７）前項（６）に記載のベクターにより形質転換した
、細胞の又生細胞なしの自己複製組換え体系。
（８）大腸菌又は枯草菌を形質転換することにより得ら
れた前項（７）に記載の組換え体系。
（９）自然の内生因子VIII−Ｃを生成する細胞に、前項
（６）に記載の表現ベクターを協働させることにより得
られた組換え体系。
（１０）自己複製組換え体宿主系内のヒト因子VIII−Ｃ
をコードづけするＤＮＡを表現することから成る方法。
（１１）（ａ）適当な自己複製組換え体宿主系内のヒト
因子VIII−ＣをコードづけするＤＮＡ配列を表現するこ
とのできる複製できる表現ベクターを調製し、（ｂ）前
記宿主系を形質転換して組換え体宿主系が得られるよう
にし、（ｃ）この組換え体宿主系を前記の因子VIII−Ｃ
コードづけＤＮＡ配列を表現できる条件のもとに保持し
てヒト因子VIII−Ｃを生成し、（ｄ）このヒト因子VII
I−Ｃを収得することから成る、ヒト因子VIII−Ｃの製
法。
（１２）複製できる表現ベクターを調製するに当たり、
因子VIII−Ｃをコードづけする伝令ＲＮＡを含む伝令Ｒ
ＮＡ集団からｄｓ−ｃＤＮＡを調製し、このｄｓ−ｃＤ
ＮＡから複製できる表現ベクター内にＤＮＡを含ませる
前項（１１）に記載の製法。
（１３）表現ベクターとしてバクテリオフアージを使う
前項（１１）に記載の製法。
（１４）バクテリオフアージとしてλｇｔ１０又はλｇ
ｔ１１を使う前項（１３）に記載の製法。
（１５）表現ベクターとしてプラスミドを使う前項（１
１）に記載の製法。
（１６）プラスミドとしてｐＢＲ３２２を使う前項（１
５）に記載の製法。
（１７）ヒト因子VIII−Ｃを収得するに当たり、組換え
体宿主系により表現したたんぱく質に因子VIII−Ｃに特
定の少くとも１種類の結合たんぱく質を含む試薬を反応
させ、この反応からの任意の検出できる応答を観察し、
検出した因子VIII−Ｃを宿主系から隔離する前項（１１
）に記載の製法。
（１８）特定の結合たんぱく質として一次抗体を使う前
項（１７）に記載の製法。
（１９）抗体としてポリクローン抗体を使う前項（１８
）に記載の製法。
（２０）抗体としてモノクローン抗体を使う前項（１８
）に記載の製法。
（２１）抗体に検出できる応答を生ずるのに有効な物質
を含ませる前項（１８）に記載の製法。
（２２）試薬組成物を、ヒト因子VIII−Ｃに特定の一次
抗体とこの一次抗体に特定の二次抗体とにより構成する
前項（１７）に記載の製法。
（２３）一次及び二次の抗体として共にポリクローンを
使う前項（２２）に記載の製法。
（２４）二次抗体に、検出できる応答を生ずるのに有効
な物質を含ませる前項（２２）に記載の製法。
（２５）検出できる応答を生ずるのに有効な物質に、同
位体標識又は非同位体標識を含ませる前項（２１）また
は（２４）に記載の製法。
（２６）物質を、酵素と、その基質と、前記の酵素及び
その基質の相互作用に特異に応答し検出できる応答を生
ずる試薬とにより構成する前項（２１）または（２４）
に記載の製法。
（２７）酵素としてペロキシダーゼを使い、基質として
ペロキシドを使い、試薬として酸化還元色素源を使う前
項（２６）に記載の製法。
（２８）ヒト因子VIII−Ｃをこのたんぱく質に対するｍ
ＲＮＡを含む異種のｍＲＮＡ混合物から調製する組成物
において、（ａ）異種ｍＲＮＡに相補の異種のｄｓ−ｃ
ＤＮＡを調製する手段と、（ｂ）前記ｄｓ−ｃＤＮＡを
バクテリオフアージ直接表現ベクターに含ませる手段と
、（ｃ）前記ｄｓ−ｃＤＮＡ集団を含ませることのでき
るバクテリオフアージ直接表現ベクターと、（ｄ）前記
ｄｓ−ｃＤＮＡ含有バクテリオフアージからヒト因子V
III−Ｃを表現する手段と、（ｅ）ヒト因子VIII−Ｃを
隔離し収得する手段とを包含する組成物。
（２９）隔離し収得する手段を、ヒト因子VIII−Ｃに特
定の少くとも１種類の結合たんぱく質を含む試薬組成物
により構成した前項（２８）に記載の組成物。
（３０）ｄｓ−ｃＤＮＡ含有バクテリオフアージを宿主
系に導入しｄｓ−ｃＤＮＡ異種集団を表わすｄｓ−ｃＤ
ＮＡライブラリーを生ずるようにした物質を含んだ前項
（２８）に記載の組成物。
（３１）ヒト因子VIII−Ｃを収得するに当たり、ｄｓ−
ｃＤＮＡプールを含む組換え体宿主系を、因子VIII−Ｃ
たんぱく質の少くとも一部分を配列する標識オリゴヌク
レオチドプローブと共に定温に保持し、このプローブに
より因子VIII−Ｃをコードづけするｄｓ−ｃＤＮＡと雑
種形成し、このようにして識別した因子VIII−Ｃｄｓ−
ｃＤＮＡ含有の複製できる表現ベクターを隔離して培養
する前項（１１）に記載の製法。
（３２）薬学的に許容できる担体との混和物内に前項（
１）〜（４）のいずれかに記載のヒト因子VIII−Ｃを治
療上有効な量だけ含む組成物。
（３３）非経口的施薬に適当な前項（３２）に記載の組
成物。
（３４）凝血異常を処置し又はこのような処置に有用な
薬剤を調製する、前項（１）〜（４）のいずれかに記載
の因子VIII−Ｃの使用法。