JPH0387188A - フィブリン結合ドメインを有するハイブリッドストレプトキナーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （関連出願） 本出願は１９８４年３月２日登録の゛′ストレプトキナ
ーゼをコードする組換えベクター″という表題の米国継
続番号第５８５，　４１７号で現在の米国特許第４，　
７６４，　４６９号の継続出願である１９８８年６月２
７日登録のパストレプトキナーセ゛をコードする組換え
ベクター″という表題の米国継続番号第２１２、　２５
４号の継続出願である。

上記米国継続番号第２１２，　２５４号および米国特許
第４．　７６４．　４６９号は参考として本明細書で引
用している。

（好ましい態様の詳細な説明） 本発明はフィブリン結合ドメインを有するハイブリッド
ストレプトキナーゼおよび該ハイブリッドストレプト］
ーナーセの微生物学的かつ遺伝学的合成方法に関する。

本目標は血栓（血餅）選択性を有する初期のストレプト
キナーゼをバイオテクノロジーにより生産することであ
る。この目標に到達するための技術的方法は原核性生物
を発現べ３ ククー、特に融合たん白質の）′ミノ酸配列をコードす
るＤＮＡを有する発現ベクターｐｋｓＫでトランスホー
ムする遺伝子技術に基づく。該融合たん白質はヒトのプ
ラスミノーゲンのフィブリン結合ドメインを少なくとも
１つ、ならびにス１ーレプトキナーゼ分子の機能性要素
を含む。該３、■換え原核性株の培養後、木遺伝子産物
すなわち木ノ＼イブリソドストレブトトナーゼを該培養
液から単側する。この問題を解決する好ましい方法はト
リハイフ゛リッドストレブｉ〜キナーゼを台底する、二
とであり、そのハイブリッドのＮ−末６：ｉ；は・＼ー
ターガラクｉ・シダーゼのＮ−末端へ−１；ザペプチト
であり、中央部分はヒトのプラスミノーゲンのクリング
ル（Ｋｕｎｇｌｃ）　　ドメインであり、かつＣ−末端
領域はストレブＩ・コツカス　コニクイシミリス（ＳＬ
ｒｅｐｔ。

ｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）　　ＩＩ　４
　６　Ａのストレプｊーキナーゼである。

ダイレクトコーディング台底を用いる本方法により血栓
（血餅）選択性を有するハ・イブリッドストレプトキナ
ーゼが産生され、その結果臨床的に４ を効な１≧１質が得られる。ストレプトキナーゼ（−最
内略号：ＳＫ）は臨床医学で最もよく使用されているフ
ィブリノーゲン溶解剤の１つである。病原生物の遺伝子
産物としてこれは細菌の毒性因子となり得るし、またこ
こで得られる臨床物質は血Ｕｎのプラスミノ−ケン（略
ｐ、　、　ｐ、）と特異的に粘合しｓＫ−ｐｇ）３７合
体を形成して遊離プラスミノ−ケンを酵素的に活性のあ
るプラスミンに変換する。

プラスミンは血餅のフィブリンネットワークを限定たん
白質分解するセリンプロテアーゼとして機能する。ｐ、
−活性化の本反応は血栓塞栓症（つまり心筋梗塞、深部
静脈血栓症、肺塞栓症、動脈性毛細血管血栓症など）に
おけるような閉塞血管の主成分であるフィブリンネット
ワークを分解するフィブリン溶解治療にお６ＪるＳＫ活
性に基づいている。

ストレプＩ・キナーゼは種々の血清学的グループ（グル
ープ八、Ｃ，Ｇなど〉の病原性ストレプトコッカス プトキナーゼは分子流行病学的研究（ハング（ｌｌｕａ
ｎｇ）、　Ｔ．　Ｔ．、　Ｉｌ．　　−ンルケ（Ｍａｌ
ｋｃ）および、１．　Ｊ．　Ｊ．フェレソティ（Ｐｅｒ
ｒｅｔｔｉ）、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ．５７，５０２−５０６　　（１　９８９）
）およびそれら遺伝子のヌクレオチド配列分析（ハング
（Ｈｕａｎｇ）、　Ｔ．　Ｔ．、　Ｈ，マルテ（Ｍａｌ
ｋｃ）およびＪ．　Ｊ．フェレソティ（ＦｅｒｒｅＬｔ
ｉ）　、　ＭＯＩ（！（：、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３
：１９７−２０５　（１９８９）；ウォルター（Ｗａｌ
ｔｅｒ）　、　Ｆ．、　Ｍ．シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）
およびＨ．マルケ（Ｍａｌｋｅ）、　Ｎｕｃｌ，八ｃｉ
ｄｓ　　Ｒｅｓ１７：１２６２　　（１９８９ａ）　　
　；Ｎｕｃｌ，　　八ｃｉｄｓＲｅｓ　　１７：Ｉ２Ｇ
１　　（１９８９ｂ））に関する最近の報告に示されて
いるようにそれらの一次構造が同一ではない。

医薬産業におけるストレプトギナーセ生産で＆Ｊ主にグ
ループＣのストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃ．ｃｕｓ　Ｏｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）
が用いられており、これはＨ　４　６　Ａ株についてク
リステンセン（ＣｈｒｉｓＬｅｎｓｅｎ）が述べている
特性を有している。

カビ（Ｋａｂｉ）　（スウェーデン）および医薬企画合
同ＧＥＩ？ＭＥＤ　（アーズネイＱ７テルワーク）（＾
ｒｚｎｅｉｍｉ６ Ｌｔｅｌ　ｗｃｒｋ）、　　ドレスケン，ＤＡＲ）から
商標名カヒキナーゼおよびアラエリシンで各々製造され
ているストレプトキナーゼばＨ４　６Ａ株により生産さ
れているたん白質と構造的に同じであるようである（マ
ルテ（Ｍａｌｋｅ）　、　Ｉｔ．　、　Ｂ．ロー（Ｒｏ
ｅ）、およびＪ．　Ｊ．　フエレソテイ（Ｆｅｒｒｅｔ
ｔｉ）、　Ｇｅｎｅ　３　４　：３５７−３６２　　（
１．９８５））。Ｈ　４　６　Ａ株のストレプトキナー
ゼ遺伝子（ｓｋｃ）のクローニングおよび配列分析につ
づいて（マルテ＜Ｍａｌｋｅ）、Ｈ．　１およびＪ．　
Ｊ．フエレソティ（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ）、　１　９　８
　４、プロシーディング　ナショナル　アカデミ−　オ
ブ　サイエンス（Ｉ’ｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ
．　Ｓｃｉ．）　ＵＳ＾８１：３５５７−３５６１　；
マルテ（Ｍａｌｋｅ）＋１．、Ｂ．ロー（Ｒｃ＋ｃ）、
およびＪ．　Ｊ．フェレ・７テイ（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ）
、　１　９　８　５　、　ジーン（Ｇｅｎｅ）　　３　
４　：３５７−３６２）、本来Ｓｋｃ　（ｓｋｃ遺伝子
で指定されるストレプトキナーゼたん白質の略号）を生
産しない宿主生物に保有されるｓｋｃ遺伝子構築物を含
む組換えベクターを構築した。該ベクターは米国特許４
，７６４，４６９号、Ｄ　Ｄ２４９　０３７号、７ Ｄ　Ｄ　２５０　５４６号に報告されている。異種宿主
によるｓｋｃ生産に関し、遺伝子または分子手段を用い
、遺伝子投入量効果および産物合成の調節メカニズムに
よりＳｋｃ合或合力能力験的に増加さ−０るのが現在非
常に容易になっている。適当な宿主生物を選択すること
により現在毒性産物を伴なわない非病原性宿主生物をＳ
ｋｃ生産に使用でき、それに、Ｌり以下の過程を簡単に
することができる。このように製造された組換えＳｋｃ
は薬学的に新しい産物ではなく単に現在では生産に適し
た従来と同様の産物なのである。

血栓分解的治療の理想的ゴールは血管内におけるフィブ
リン結合プラスミノーゲンの特異的活性化およびひきつ
づく分解である。このたん白質はさらに循還プラスミノ
ーゲンを活性化し、フィブリノーゲン、凝血因子および
補体系の要素のたん白質分解を誘導するため、表面的に
この理想はストレプトキナーゼまたば組換えストレプト
キナーを用いて遠戚されないように思われる。血小板凝
集およびフィブリン重合に関するフィブリン分８ 解産物の阻害効果と同様血餅因子およびフィブリノーゲ
ン濃度の減少は潜在的に危険な止血障害（出血）へ導く
。

プラス池ノーゲンの全身的活性化を制限するため、ビー
チャム（Ｂｅｅｃｈａｍ）グループ（１９７９以来）は
Ｐｇ酸成分活性セリンをアシル化てブロックしたｌ）　
Ｉ−Ｃ安定化誘導体を開発したく特許Ｎｏ、　Ｅ　Ｐｏ
　００９８７９　Ｂ　ＰＯ０２８４８９，ＥＰＯ０９１
２４０゜Ｅ　Ｐ２Ｓ５７３６　、　Ｕ　３４５９７２８
３）。これらのいわゆるＡ　Ｐ　Ｓ　Ａ　Ｃ物質（商標
名：工旦ナーゼ）はプラスごノーアンクリングルが存在
する特徴を有し、循還ｐＢまたはアルファ２アンチプラ
ス旦ンと反応せず、かつアミル基の解離（脱アシルスＣ
）後に活性化するフィブリン親和性をイＪする。しかし
ＡＰＳ八〇へ質が本来のス１−レプトキナーセよりも秀
れていることを示す信頼すべき臨床データを欠いていた
。さらに該産物はストレプトキナーゼとの複合体形成に
純粋なプラスミノーゲンの使用を必要とする。

過去数年間、基礎研究で開発された特別のヘク■ ターを同じ読み枠に挿々の起源の遺伝子または遺伝子セ
グメントを融合するのに何回も使用されてきたくたとえ
ばシルハベイ　（Ｓ　ｉ　Ｉ　ｈａｖｅｙ）　、　Ｔ、
　、Ｊ、　Ｍ、　Ｌバーマン（口ｅｒｍａｎ）　、およ
びり、Ｌエンキスト（ｌＥｎｑｕｉｓｔ）、　　１９８
４　、遺伝子融合物を用いた実験、コールド　スプリン
グ　ハーバ　ラボラトリ、コールド　スプリング　ハー
バ−、Ｎ、　Ｙ、）。

特定条件下、これらの遺伝子は混合した性質を有するハ
イブリッドたん白質をコードする。またクローン化ｓｋ
ｃ遺伝子は遺伝子融合技術で使用するのに十分な能力お
よび情報を有しており（フレセン（Ｋｌｅｓｓｅｎ）、
　Ｃ，Ｋ、　Ｉｌ、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）、　
Ｊ、　、Ｊ、　フェレッティ（ｆ’ｅｒｒｅｔｔｉ）お
よび１４マルケ（Ｍａｌｋｅ）、　　ｌ　９８８、モレ
キュラジエネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌｅｃ、　Ｇ
ｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、＞２１２：２９５−３００＞また５′末端
をブラント化したｓｋｃ遺伝子とＤＮＡを融合し得る特
定のベクターがある（いわゆるＯ　ＲＦベクタ〉。しか
し、これらのベクターはこれまでフィブリン結合ドメイ
ンをコードするＤＮＡ　（ｆｂｄ）と０ ｓｋｃ、の融合に用いられていない。

本発明はフィブリン結合ドメインをコードするＤＮＡの
機能性セグメントと結合するストレプトキナーゼ遺伝子
（ｓｋｃ　）の機能性セグメン１−を説明する遺伝子融
合物（４・ｉの遺伝子的−微生物学的方法、融合ヌクレ
オチド配列を含む新しいプラスミドベクターの構築およ
び該ＤＮＡコード化ストレプトキナーゼの合成に使用し
得る微生物に基づいている。

本発明に従かい木課題は火水的にまずストレプトキナー
ゼ分子の機能性要素と少なくとも１つのヒトプラスξノ
ーゲンのフィブリン結合ドメインを順番に含む融合たん
白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ　（略号：　ｒ
ｂｄ−’　ｓｋｃ遺伝子融合物）を含む発現プラスミド
を構築するための遺伝子融合技術により達成される。最
初にこのようなｆｂｄ　−’　ｓｋｃ組換え発現プラス
ミドを原核性受容体（すなわち細菌種および細菌起源の
■、型種を含む）にトランスホーメーションにより導入
した後このトランスホームした生物を培養する。最後に
１ 発酵間に形成されたバイブリソトスＩ・レゾ１−トナー
ゼを細胞分解または培養培地から単離する。

本発明の基礎は上述の特徴を有する産生生物のトランス
ホーメーションのために常にグラム陰性および陽性受容
体で複製可能であり、か゛つ文献で知られているｐＫＭ
シリーズのポリリンカー含有プラス旦ドおよびオープン
リーディングクレームベクター（略称：　ＯＲＦ−ベク
ター〉の読聯体′（あるｐＫｓＫｏ　００群のｆｂｄ　
−’　ｓｋｃ組換え発現ベクターが構築されるという事
実により強調される。このようなｐＫＭへククーし、Ｌ
以下の配列要素（５′から３′の方向に）：少なくとも
１つのヒトプラスミノーゲンの天然起源を有する原核性
発現コ〜ニソＩ・または発現分泌ユニット；ポリリンカ
ーまたは制限部位；およびヒトプラスミノーゲンに関す
る“′読み枠からはずれて”プラスミノーゲン（略号：
Ｐｇ）活性化能を有するＮ−末端ブラン１へ化ストレプ
ト１−ナーゼをコードし、かつ天然の転写および翻訳終
止シグナルを有するｓｋｃ構造遺伝子からなる組換え部
分セグメントを含むｆｂｄ　−’　ｓｋｃ　組換え２ 発現プラスミドの構築に用いることが好ましい。

使用されるｐｋＭベクターはストレプトキナーゼネガテ
ィブな発現型のものである。

ｐｋＳＫ群のｆｂｄ　−’　ｓｋｃ組換え発現プラスミ
ドの構築のため従来の化学合成操作またはＰｇ含有組換
えプラスミドからの単離によりｐｇ遺伝子の完全なｃＤ
ＮＡ配列（ホースグレン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ）等、ＦＥ
ＢＳレターズ（Ｌｅｔｔ、）２１３　：　２５４］！１
８７）情報によって合成され、かつ、ヒトプラスミノー
ゲンのフィブリン結合ドメインを少なくとも１つコード
しているＤＮＡフラグメントが使われる。

京礎研究においてｌａｇのいわゆるバクリンクル″。

ドメインがこの血液たん白質にフィブリン結合特異性を
与えていることが知られている。

クリングル１〜５と命名された５個すべての潜在的フィ
ブリン結合ドメイン（略号：Ｆｂｄ）はｐｇ分子」二、
従ってｐｇ遺伝子の５個のＦｂｄコード領域（ｉ’ｂｄ
　）上に存在している。同様にＰｇの個々のＦｂｄはフ
ィブリン結合ドメインの強さに関し等価３ ではないことも知られている。たとえば１８分子のクリ
ングル１ドメインは他の４つのクリングル各々よりも強
いフィブリン親和性を有している。

少なくとも１つのＰｇ結合ｌ′メインをコードする各Ｄ
ＮＡフラグメントは化学合成または、ｇＭｉ換え−１−
ヤリャープラスミｌからのｊｉｌｔ　ｉ５［により４７
Ｈられ、ｓｋｃ読み枠が保存されるように○ＲＦ−ｐＫ
Ｍベクターのポリリンカードメイン中に挿入された。

この様にライゲーションが行なわれると一部のｆｂｄ　
−’　ｓｋｃ組換え発現プラスミドが得られｐＫｓＫＯ
Ｏｏ群の発現プラスミドという名称が与えられた。これ
らのｐ　Ｋ　Ｓ　Ｋ　０００群の発現プラスミドは、先
に述べた受容体ｌＩＹの９、Ｙ定の産生生物のトランス
ホーメーションに使用される。

個々の操作で使用されるｐｋＭ発現発現ツクター存して
、ａ）グラム陰性細菌またはそれらに由来する安定なＩ
７−型種中で単独で複製するプラスミド、ｂ）グラム陽
性細菌またはそれに由来する安定なｌ−７−型種中で単
独で複製するプラスミド、およびＣ）細菌受容体または
それらの両主要グルー４ プのＬ型種内で複製し得るシャトルプラスミドが構築物
のｐＫｓＫｏ　００群の中に含まれる。

さらに個々に含まれるｐＫＳＫ発現ベクターに応じ、構
築物のｐＫＳＫ群の中には必要ならば大腸菌ラクトース
プロモーター−オペレーター（略号：、ｆ！ａｃ　　Ｐ
Ｏ）がコントロールされるｊｌ！ａｃＺＪ伝子の数コド
ン分、各ｆｂｄ　−’　ｓｋｃ遺伝子融合物のその５′
末端から伸長しているプラスミドおよびストレプトコッ
力スピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ）ｓｐｅ　Ａ発現分泌がコントロールされるス
トレプトコッカスＡ型エクソトキシンの数コドン９各ｆ
ｂｄ　−’　ｓｋｃ遺伝子融合物の５′末端が伸長して
いるプラスミドが含まれる。

この研究の結果はｆｌａｃＺ’　−ｆｂｄ　−’　ｓｋ
ｃおよびｓｐｅ　Ａ’　−ｆｂｄ　−’　ｓｋｃ組換え
遺伝子融合体を含むｐＫＳＫｏ　００発現プラスミドの
構築に必要な操作スデップを示している。

ｆｂｄ　−’　ｓｋｃ組換え発現プラスミド群はさらに
提供された種々の方法により大腸菌ｐＫｓＫＯＯ０Ｔ発
現プラスミド群の一部により補なわれている。

５ 各ｐＫｓＫ０００Ｔプラスミドはそれ自体文献でよく知
られているｐＴ７Ｔ３シリーズのポリリンカー含有発現
ベクターの誘導体である。これを行うためｆｂｄ　−’
　ｓｋｃ融合遺伝子、すなわちブラント化ストレプトキ
ナーゼ同様Ｐｇ−クリングルをコドするＤＮＡ要素をｐ
ＫｓＫｏ　００プラスミドから除去し代りにＣｏ１Ｅ１
複製オリジンを有するｐＴ７Ｔ３のポリリンカー中に挿
入する。このサブクローニングは個々のｆｂｄ　−’　
ｓｋｃ　ｇ転子融合物中、それらがｐＫＳＫＯＯ０群の
プラスミド構築中に生成しかつこれらプラスミド中に存
在することから５ｓｔｌまたはＳ　ｐｈ　Ｉ切断部位が
存在しないという知見に基づいている。生成したｐＫｓ
Ｋｏ　００Ｔプラスミドにおいてｆｂｄ　−’　ｓｋｃ
遺伝子融合物は５′末端がＡａｃＺ遺伝子の数コドン分
伸長しており、各場合においてＴ７プロモーターの発現
コントロール下にある。

最初に作られたｆｂｄ−ｓｋｃ遺伝子融合物を含むｐＫ
ｓＫｏ　ＯＯおよびｐＫｓＫｏ　００Ｔ発現プラスミド
に関する本発明はＡａｃＺ’　−ｆｂｄ　−’　ｓｋｃ
６ 組換えｐＫＳＫＯＯＯ発現プラスミドを用いるトランス
ホーメーションにアンピシリン耐性大腸菌受容体株を用
いた点でそのパイオラクノロジーが注目される。そのよ
うなトランスホームした細胞群に由来するアンピシリン
耐性クローンの寒天プレート培養の際ｐｇ活活性能能有
する遺伝子産物の合或はザイモグラフィーで検証した。

細胞増殖後、細胞溶解物からトリハイブリッドＬａｃＺ
’Ｆｂｄ　−’　Ｓｋｃ融合たん白質を単離した。５ｐ
ｅＡ’ｆｂｄ　−’　ｓｋｃ組換えｐＫｓＫｏ　００発
現プラスミドによるトランスホーメーションのためにａ
）クロラムフェニコールおよび、またはエリスロマイシ
ン感受性大腸菌受容株、ｂ）エリスロマイシン感受性ス
トレプトコッ力スザンキス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカスラクチス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ）または枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）受容株ま
たはＣ）プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ１
ｒａｂｉｌｉｓ）、大腸菌、枯草菌またはＳ、ファエシ
ウム（Ｆａｅｃｉｕｍ）のエリスロマイシンおよび、ま
たはクロラムフェニコール７ 感受性の安定Ｉ７型株を使用する。

トランスホームした細胞群由来のクロラムフェニコール
、エリスロマイシン１ｌｉｉ１性りｒｌ−ンの夾天プレ
ーｌ−培養の際再び１１ｇ活性化能をイｆするｊ貫伝子
産物を合威し得るりｌコーンの能力をザイモグラフィー
で検証し、その細胞培養の終りに細胞溶ｊｌＩｉ！物（
ａ）または培養液（ｂおよびＣ）から新しいトリハイブ
リッドＳｐｅへ’−Ｆｂｄ　−’　Ｓｋｃ融合たん白Ｔ
（を単離する。１ハｃ、　Ｚ　’−ｒ屁−’　ｓｋ（、
＆Ｊ１換えｐＫｓＫＯＯＯＴ発現プラス兆ドを用いたト
ランスホーメーションのため、アンピシリン感受性大腸
菌受容株を使用する。つづいてｐ　Ｋ　Ｓ　Ｋ　０００
Ｔプラスミドで１−ランスホームした大腸菌株を再び誘
導可能なＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする第２のプ
ラスミドでトランスホームする。このようにトランスボ
ームした細胞群由来の抗生物質耐性クローンの寒天プレ
ート培養の際必要な場合はザイモグラフィーを使用して
Ｐｇ活活性能能有ずろｊ貫伝子産物の合成を検（Ｗし、
その細胞槁養の最後に、細胞溶解後または培養液からト
リハイブリ２日 ソドＬａｃＺ　’　−Ｆｂｄ　−’　Ｓｋｃ融合たん白
質を単離する。

本発明の好ましい態様におい−で“ｆｂｄ−’　ｓｋｃ
組換えｐＫｓＫｏ　ＯＯ発現プラスミドの構築”にお旬
るセグメントとして以下のｐｋＭヘクターが使われてい
る； ａ）ＯＲＦヘクターｐｋＭ２　（選択マーカーアンピシ
リン耐性）；大腸菌中で複製し得る本プラスミドは（５
′から３′の方向に）以下の配列要素： ベーターガラクトシダーゼの６個のＮ−末端アミノ酸の
コドン（略号：βａｃＺ’）を含む大腸菌−６ａｃ、Ｐ
○、 クロ）クローニングベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩＸ
ｂａ１部分ポリリンカーおよびｊ！ａｃＺ遺伝子のヒト
プラスミノーゲンの読み枠からずれてシグナルペプチド
に力０え１３個のＮ−末端アミノ酸を欠くブラント化ス
Ｆ−レプＩ・キナーゼをコードし天然の転写および翻３
）ｉ！終止シグナルをもつストレプトコッカスラクチス
ごリス９ （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉ
ｓ）　Ｈ４６Ａ染色体ＤＮＡ出来の１５９６ｂｐ　　Ｈ
ｉｎｃ　ｎフラグメント（略称：　’　ｓｋｃ　ｉｌｔ
伝了）、を含む領域を有する。

ｂ）○ＲＦヘクターｐ　Ｋ　Ｍ　３　　（ｉ公）尺マー
カーアンピシリン耐性）； これも大腸菌中で複製し得る該プラス旦１・′ベクター
は配列要素； 成熟Ａ型ストレプトコソカスエントトキシンの５個のＮ
−末端アミノ酸番こ対するコドンを含むストレブトコソ
力スビロゲネス（Ｓ　Ｌｒ（！ｐ　Ｌｏｃ、。

ｒ、ｃｕｓ　ｐｙｒｏ８ｃｎｅｓ）−ｓｐｃＡ　　ＩＥ
ｓＥ　（略Ｓ；：ｓｐｅ　Ａ　’　）、 クローニングベクターｐＵＣ９の修正されたＳｍａＩ−
３ａＩ１１部分ポリリンカー、および肚ＬＡ遺伝子のヒ
トプラスミノーゲンの読み枠からはずれた上述の’　ｓ
ｋｃ遺伝子を含む１５９６ｂｐ　　Ｈｉｎｃ　ｌ’Ｉフ
ラグメントを含む領域を有する、 ｃ）ＯＲＦヘクターｐＫＭ５　（選択マーカー：り０ ロラムフェニコールおよびエリスロマイシン耐性）；こ
れは大腸菌同様ス１−レブトコンヵスおよびハヂルス内
で複製し得、ｐ　ｋ　Ｍ　３と同し配列要素を有してい
る。

適当な基本的研究から分るように上述の’　ｓｋｃ遺伝
子は機能性Ｓｋｃをコードする完全な配列を含むにもか
かわらず’　ｓｋｃ　、（４ａｃＺ　’　、およびｍ’
遺伝子は互いに読み枠がずれていることから」二速の３
種の発現ヘクターばス］・レプＩ−キナーゼネガティブ
の発現型を示す。

さらに好ましい方法においては文献に報告されておりヌ
クレオチド配列も決定されているヒトプラスミノーゲン
の完全なｃＤＮＡを含むポリリンカー含有大腸菌クロー
ニングヘクターｐＵｃ１８の読導体である組換えｐＦＤ
ｌを使用する（フォースグレン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ）等
、ＦＥＢＳレターズ（Ｌｅｔｔ、）２１３　：　２５４
．　１’９８７）。

ｐＫｓＫＯＯＯ発現プラスξドの操作上爪しい構築のた
めキャリヤープラスミドから対応する制限酵素を用いた
最初の消化により以下のものを得る：■ ａ）クリングルエフイブリン結合ドメインの完全なｃＤ
ＮＡ（略号二に１）を含む５０２ｂｒ］Ｐｖｕｌｌ−３
ｔｕｌフラグメント（Ｐｇ−ｃＤＮＡのヌクレオチド部
位１９６〜６９７）およびｂ）クリングル４および５個
のフィブリン粘合ドメインの完全なｃＤＮＡを含む１０
４１０４ｂｌ）Ｈフラグメント　（Ｐｇ　　ｃＤＮＡの
ヌクレオチド部位９７９〜１９９２）。上述のに１コ一
ドＰｇ−ｃＤＮＡフラグメントはすでに調製されている
ｐｋＭシリーズのＯＲＦベクター内の挿入物直前に存在
する。

いくつかの変異体に対する中間体である」二速のＨｇ１
Ａ　Ｉ　−Ｐｇ−ＣＤＮＡフラグメントを所定の方法を
用いＢａｊ２３１ヌクレアーセおよびクレノー酵素で処
理してｃＤＮＡザブフラクメント混合物を得、既知ｐＫ
Ｍベクターへの挿入用に用いる。

１０１４ｂｐ　　Ｈｇ１Ａ　Ｉフラグメントを所定の方
法を用いヌクレアーゼＢａｄ　３１およびクレノー酵素
で処理する第（変異体の場合Ｋ　４　＋Ｋ　５をコドす
るｃＤＮＡザブフラクメントの混合物が得ら２ れる。

１０１４ｂｐフラグメントを所定の方法を用いヌクレア
ーゼＢａｊｌ！　３１およびクレノー酵素で処理する第
２変異体の場合、Ｋ４およびに５の一部をコードするｃ
ＤＮＡサブフラグメントの混合物が得られる。

第３変異体の場合所定の方法を用いヌクレアセＢａｄ　
３１およびクレノー酵素で処理したプラスミドｐＦＤｌ
の１０１４ｂｐ　　Ｈｇ１Ａ　Ｉフラグメントをさらに
制限酵素ＰｓｔＩで完全に消化してこの修正中間ステッ
プにおけるライゲーション反応の結合を可能にするとと
もに完全なに４をコードする最小長のｃＤＮＡサブフラ
グメントのｃＤＮＡ混合物が得られる。

上述の中間ステップをさらに修正したｐＫｓＫＯＯ０発
現プラスミドの好ましい構築法によりＫＩ＋に２＋に３
＋に４フィブリン結合ドメインをコードするＰｇ−ｃ　
Ｄ　ＮΔサブフラグメントの混合物を得る。このステッ
プのため、まずキャリヤプラスミドｐＦＤ１を制限酵素
Ａｈａ　ＩＩで全体的３ に消化する（ｐＦＤｉＤＮＡばそのｃＤＮＡＪＩＩｉ入
物のに５領域にこの酵素の唯一・の確認配列を存する）
。生成したＡｈａｌＩ消化物にｒ９１シヌクレアーゼＢ
ａ＃３１およびクレノー酵素による所定の処理を行う。

生成するＤＮＡ産物を制限酵素Ｐｖｕｌｌで消化し、そ
れによりヌクレオチド部位１９６にお番ノる’　Ａｈａ
ＩＩ−Ｂａｊ！　３１　ＤＮＡ　”のｇＪＩＩＪ？が起
こる。このようにして得た消化産物を電流泳動にかりそ
のゲル混合物からＫ　１　＋Ｋ　２１−　Ｋ　３　＋Ｋ
　４コードサブフラグメントを単離する。

好ましい方法でば各ｆｂｄ　−ｃＤＮＡセグメントは、 ａ）Ｋｌをコードする５　０２ｂｐＰｖｕＩｌ−３ｔｕ
　Ｉフラグメント、 ｂ）　　１０１４ｂｐ　　Ｈｇ１Ａ　Ｉフラグメント出
来のＢａｆｆ　３１およびクレノー処理したＫ　４−１
−　Ｋ　５を：ｌ−ドする゛す′ブフラグメンｌ−？昆
合物、ｃ）　　１０１４ｂｐ　　ｌ−１ｇ１Ａ　Ｔフラ
グメント由来のＢａｊ’！３１およびクレノー処理した
に５をコードするン昆合物、 ４ ｄ）　　］　ＯＩ　４ｂｐ　　Ｈｇ１Ａ　Ｉフラグメン
ト由来のＢａｄ　３１およびクレノーおよびＰｓｔ　　
Ｉ処理したに５をコードするサブフラグメント混合物、
ｅ）最糸冬的に八ｈａ　　Ｈ−１−Ｂａ　ｊ！　３１１
−クレノー４ＰｖｕＩＩ処理したＫｌ十に２−１−に３
＋に４をコードするサブフラグメント混合物、 以上ａ）〜Ｃ）として使用するように本発明を推進する
。各々平行するステップで生成したライゲーション産物
を用い、アンピシリン剛性でかつＳｋｃポジイティブな
りローンをスクリーニングすることによりｐＫｓＫＯＯ
Ｏ発現プラスミＦの次に示す初期集団： ａ２）　　　ｐＫｓＫＯ５６ ｂ２）　　　ｐＫｓＫＯ３６ ｃ２）　　　ｐＫｓＫＯ２９ ｄ２）　　　ｐＫｓＫ３５１ ｅ２）　　　ｐＫｓＫ０６′Ｆ ｅ２．１）　　ｐＫｓＫＯｆ；９ を得るため、および特性を調べるために十分な量のプラ
スミドＤＮＡを生威し、さらにこれら新規５ なプラスミドを使用するためにアンピシリン感受性大腸
菌ＪＭ１０９受容株をトランスホームする。

この方法は以下の事実に基づいている。

ａｌ）で述べたＫｌをコードする５　０２　ｂｐＰ　Ｖ
ＩＪＩＩＳｔｕｌ−ｃＤＮＡフラクフラグメントｂｌ）
〜ｅｌ）で述べたｆｂｄ−ｃＤＮＡ中の少なくとも１個
のザブフラグメントはオープン−リーディングフレーム
を示している。次にこれらの配列を標準的技術に従かう
ライゲーションステップによりベクターｐｋＭ２のｊ？
ａｃＰｏと’　ｓｋｃの間に’　ｓｋｃ読み枠が保存さ
れるように挿入する。ずなわち各々の場合’　ｓｋｃの
仲人活性化が遠戚される。ａ２）からｅ　２．　ｌ）に
リストした各ｐＫｓＫ０００発現プラスミドは機能性ｊ
２ａｃＺ’　−ｆｂｄ　−’　ｓｋｃ遺伝子融合物を含
んでいる。トリハイブリッドストレプトキナーゼを作る
ための３個の要素を含む融合ストレプトキナーゼを形成
するこのような゛融合パ遺伝子のたん白質発現レベルで
各場合にその生物学的活性はザイモグラ７法で示すこと
ができる。

このような活性トリハイブリッドストレゾ１−キナ６ −ゼを台底するクローンはヒトのプラスミノーゲンおよ
びカゼインまたはフィブリンなどの活性化したプラスミ
ノーゲンに対する基質を含む検定培地の重層後コロニー
のまわりのカゼイン分解またはフィブリン分解ゾーンに
よりトランスホーメーション寒天プレートを用いて容易
に確認される。

この関係において上述の技術は、培養培地中への各異質
遺伝子産物の至適排出が行なわれないとまでさえ、Ｌａ
ｃ’　−Ｆｂｄ−’　Ｓｋｃ融合たん白質の合成および
構築されたｅａｃＺ’　−ｆｂｄ　−’　ｓｋｃ組換え
発現プラスミドの機能が大腸菌トランスホーメーション
システムで使用しうろことを示すのに用いうることは注
目される。

ａ２）〜ｅ２，１）で述べた好ましい技術により命名さ
れた発現プラスミドを用いて各ｆｂｄ　−ｃＤＮ八フへ
グメントをＯＲＦ・ベクターｐｋＭ５のポリリンカーに
挿入する。このようにして生成したライゲーション産物
を用い、各平行ステップにおいてエリスロマイシン感受
性ストレプトコッカスサンギス　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ）ジャリス（Ｃｈａｌ１７ ｉｓ）　−６受容株を１〜ランスボームし、かつ先に述
べたスクリーニング操作を使用し、以下の第２隼団 ａ２）　　　　ｐＫｓＫ１５６ ｂ２）　　　　ｐＫｓＫ１３６ ｃ２）　　　　ｐＫｓＫ１２９ （１２）　　　　ｐＫＳＫ４５］ ｅ２）　　　　ｐＫｓＫ１６７ ｅ２．１）　　ｐＫｓＫ１６９ を現在のり且、Ａ　’−Ｑ４５１−−−−　］−妙−（
、−３、■換えｐ　Ｋ　Ｓ　Ｋ０００発現プラスごドか
ら得ると同時にすでに述べた生物学的活性およびこれら
構築物の機能を確認し得る。

実行した最後の好ましい方法において、ｐＫｓＫＯＯｏ
発現プラス兆ドの２個の使用可能な集団の１つ、主に ａｌ）　　ｐＫｓＫＯ５６およびｐＫｓＫ１５６ｂｌ）
　　ｐ　Ｋ　Ｓ　Ｋ　Ｏ３６およびｐＫｓＫ１３６ｃｌ
）　　ｐＫｓＫＯ２９およびｐＫｓＫ１２９ｄｌ）　　
ｐＫｓＫ３５１およびｐＫＳＫ４５１８ ｅｌ）　　ｐＫｓＫＯ６７およびｐＫｓＫ１６７ｅ１．
１）　ｐＫｓＫｏ　６９およびｐＫｓＫ１６９からカセ
ットの形のＳｓｔ　Ｔ　−３ｐｈ　Ｉフラグメントとし
てｆｂｄ−ｓｋｃ遺伝子融合物を取り出し、大腸菌発現
ベクターｐＴ７Ｔ３１８Ｕのポリリンカに挿入する。生
じたライゲーション産物を用い、アンピシリン感受性大
腸菌ＪＭ１０９株をトランスホームする。誘導可能なＴ
’１−ＲＮＡポリメラーセをコードする大腸菌プラスミ
ドｐｃｐ　１−２による二次トランスホーメーションの
後、機能するｆｂｄ　−ｃＤＮＡ遺伝子融合物を含むｐ
ＫｓＫＯＯＯＴ発現プラスミドの第３集団、 ａ２　　　ｐＫｓＫＯ５６Ｔ ｂ２　　　ｐＫｓＫＯ３６Ｔ ｃ２　　　ｐＫｓＫＯ２９Ｔ ｄ２　　　ｐＫｓＫ３５１Ｔ ｅ２　　　ｐＫｓＫＯ６７ ｅ２．ｌ）　ｐＫｓＫｏ　６９Ｔ を先に述べたスクリーニング操作により得る。

上述の説明から確証されるようにｅｌ）のｆｂｄ９ ｃＤＮＡフラグメント混合物中に各々オープンリーディ
ングフレームを示す種々の長さのＫ　１　＋Ｋ　２　十
Ｋ　３−＋−Ｋ　４コードフラグメントを少なくとも２
個存在する。

各々ｐＫｓＫＯＯＯおよびｐ　Ｋ　Ｓ　Ｋ　ＯＯＯＴ発
現プラスミド生産に関連して、機能的に活性のある融合
ス１−レプトキナーゼを合成する組換えりｌ二１−ンを
各１〜リハイブリツドストレプＩ・こ１−ナーゼコドＤ
ＮＡの存在を試験する。この目的のため文献に報告され
ている配列ムクター中に適当な方法で作られる選択され
た発現プラスミド出来の組換えＤＮＡを通常の方法で再
り【コーニングし、再度配列決定を行う。このヌクレオ
チド配列に基づき、融合ＤＮＡの種々の要素の結合部位
を確認し、同時に正しい読み枠結合を検証する。この実
験操作によりたとえば次のことを示し胃る：発現プラス
ミドル　Ｋ　Ｓ　Ｋ　Ｏ５６は５８５個のアミノ酸残基
からなる１〜リハイブリソドスＩ−レゾ１〜キナーゼを
指定する一次構造： ０ ０　　１　　　６　　（１）　　　（４）　　４１　　
２０？（５）八ＴＧ　　八［：Ｃ，、、ＴＣＧ　　ａｇ
ｃ、、、ｃｃｃ　　ＣＴＧ、、ｉへＧ　　Ｇｇｇ、、。

（１０）　　１４　　４１４ ｇｔｃ　　へＡＣ，，，へへへ　ＴＡＡ〔０−６、ｊ２
　ａｃＺ　コドン；　、（１）−（４）、ポリリンカー
コドン；４１−２０７、プラスミノーアンｃＤＮＡコド
ン；（５）−〇〇、ポリリンカーコドン：１／４−４１
４、　ｓｋｃコドン〕のクリングル（Ｋ１）ストレプト
キナーゼをコードする遺伝子融合物を有する（略称Ｋｌ
−ストレプトキナーゼｐＫｓＫＯ５６）；発現プラスミ
ドｐＫｓＫＯ３６は７００個のアミノ酸残基からなるト
リフ１イブリツドストレプトキナーゼを指定する一次構
造；０　１　　６　　（１）　　（４）３３２　６１３
（５）八ＴＧ　　八ＣＣ０，，ＴＣＧ’　　ａｇｃ、、
、ｃｃｃ　　ＧＣＣｏ、、ＴＣＣＣｇｇ、、。

（１０）　１４　４１４ ｇｔｃ　　へへＣ，，，へＡＡ　　ＴＡＡ〔Ｏ−６、ｆ
ｌａｃＺコドン；　（１）　−（４）、ポリリンカーコ
ドン；　３３２−６１３、プラスミノーゲンＣＤＮＡＤ
トン；（５）−（ＩＬ　ポリリンカーコドン；１ １４−４１４、’　ｓｋｃコドン〕のクリングル（Ｋ４
＋に５）ストレア１−キナーゼをコードする遺伝子融合
物を有する（略称：　Ｋ　４−＋　Ｋ　５−ストレプト
キナーゼｐＫｓＫＯ３６）；発現プラスミドｐＫｓＫＯ
２９は６１１個のアミノ酸残基からなるトリハイブリソ
ドストレプｌ−キリー−ゼを指定する一次構造； ０　１　　６　　（１）　　（４）／１２０　６１２（
５）八ＴＧ　　ＡＣＣ，、、ＴＣＧ　　ａｇｃ、、、ｃ
ｃｃ　　ＧＧＣ，、、ＴＧＧ　　ＣＢ。

（１０）　１４　４１．４ ｇｔｃ　　ＡＡＣ，、、へへへ　ＴＡＡ（０−６、ｎ、
ｌｃＺコドン；（１）−（４）、ポリリンカーコドン１
４２０−６１２、プラスくノーアンｃ　ｌ）　Ｎ　Ａコ
ドン；（５）−００）、ポリリンカー二！トン：１４−
４１４、’　ｓｋｃコドン〕のクリングル（Ｋ５〉スト
レプトキナーゼをコードする遺伝子融合物を有する（略
称：に５−ストレプトキナーゼ３５１は６１０個のアミ
ノ酸残基からなるトリバイブリソトス１〜レプトキナー
ゼを指定する−・次措２ 造； ０　１　　６　（１）　　（４）３１６　５０７（５）
八ＴＧ　　八Ｃ［：、、、ＴＣＧ　　ａｇｃ、、、ｃｃ
ｃ　　ＧＧＣ，、、ＴＧＧ　　Ｃｇｇ、、。

（１０）　１４　４１４ ｇｔｃ　　八人Ｃ，，八人Ａ　　ＴＡＡ〔０−６、ｆｌ
ａｃＺ’　コドン：　（１）　−（４，）、ポリリンカ
ーコドン；３１６−５０７、プラスミノーゲンｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａ　：１ド：／；（５）−ＯＬポリリンブＪ−二−
＋トン１４−４１４、’　ｓｋｃコドン〕のクリングル
（Ｋｌ）ストレプトキナーゼをコードする遺伝子融合物
を有する（略称二に４−ストレプトキナーゼｐＫｓＫ３
５１）；発現プラスミドｐＫＳＫ０６７は８６３個のア
ミノ酸残基からなるトリハイブリッドストレプトキナー
ゼを指定する一次構造； ０　１　　　Ｂ　（１）　　（４）　　４１　４９ｔｌ
（５）八ＴＧ　　八ＣＣ，，，ＴＣＧ　　ａｇｃ、、、
ｃｃｃ　　ＧＴＧ、、、ＣＧ八　Ｇｇｇ、、。

（１０）　１４　４１４ ｇｔｃ　　ＡＡＣ，、へ人へ　ＴＡＡ 〔０−６、ｊｉ！ａｃＺ−１トン；　（１）−（４）、
ポリリンカ３ コドン；４１−４９０、プラスミノーゲンｃ　ＤＮＡコ
ドン；　（５）−（＋ｏ）、ポリリンカーコドン；１４
−／ＩＩ／Ｉ、’ｓｋｃコ１−ン〕のクリングル（Ｋ　
１−１−　Ｋ　２　＋Ｋ　３　＋　Ｋ　４　）ストレプ
トキナーゼをコードする遺伝子融合物を有する（略称：
に１十Ｋ　２　十Ｋ　３　−１−　Ｋ　４　−ストしブ
１ー１ーナーゼｐＫｓＫ０６７）；発現プラスよドｐＫ
ｓＫＯＧ９１は８７４個のアミノ酸残基からなるｌ・リ
ハ・イブリットストレプト− ０　　１　　　６　　（１）　　（４）　　４１　　４
９６（５）＾ＴＧ　　ＡＣＣ．、、ＴＣＧ　　ａＢｃ．
、、ｃｃｃ．　　ＣＴＧ．、、ＡＣＴ　　ＧＢ．、。

（１０）　１４　　４１４ ｇｔｃ　　へ人Ｃ．４，八八八　ＴＡＡ〔Ｏ−６、ｎａ
ｃＺ］トン、　（１１　−　（／１．１、ポリリンカー
コドン、４１−４９６、プラスミノーゲンｃ　Ｉ）　Ｎ
　Ａ　：：Ｉ　ｌ’　７　；　（！’ｉ）−（ｌ（１）
、ボ’Ｊ　’Ｊ　７／ＩＪ−：ＴＩ　ドア　；］　４−
４．　１　４、’　ｓｋｃコドン〕のクリングル（Ｋｌ
→−Ｋ　２　＋Ｋ　３　千Ｋ　４　）ストしブトキナー
セをコードする遺伝子融合物を有する（略称Ｋ　１　＋
　Ｋ　２　−＋−　Ｋ　３　−１−　Ｋ　４−ストレプ
トキナーゼｐＫｓＫｏ　６　９）　。

＋Ｆ　Ｋｌ・法に従って構築されるトリハイブリッドス
トレプトキナーゼの生産株としては以下のものが使われ
るのが好ましい； ａ）　　ｊ２ａｃＺ’　−ｆｂｄ　−　　ｓｋｃ組換え
ｐＫｓＫＯＯ。

発現プラスミドの場合のアンピシリン感受性細菌大腸菌
ＪＭＩ０９株 ｂ）　　ｓｐｅ　Ａ’　−ｆＭ　−’　　ｓｋｃ組換え
ｐＫｓＫＯＯＯ発現プラスミドの場合のエリスロマイシ
ン感受性細菌ストレプトコッカスサンギス（Ｓｔｒｅｐ
ｔ。

ｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ）ジャリス（Ｃｈａｌｌ
ｉｓ）　−　６株およびクロラムフェニコール感受性の
プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉ
ｌｉｓ）　Ｌ　Ｖ　Ｉ安定り型株； ｃ）　　１ａｃＺ’　−ｆＭ−’　ｓｋｃ組換えｐ　Ｋ
　Ｓ　ＫＯＯＯＴ発現プラスミドの場合のアンピシリン
感受性細菌大腸菌ＪＭ１　０　９株。この様にして得た
組換え微生物、すなわち、 大腸菌ＪＭ１０９　　（ｐＫｓＫＯＯＯ）株；ＪＭＩ　
Ｏ　９　　（ｐＫｓＫｏ　５　６）、５ ＪＭＩ　０　９　　（ｐＫｓＫｏ　３　６）　　、、Ｊ
　Ｍ　Ｉ　　（１　９　　（　ｐＫ　Ｓ　Ｋ　０　２　
！］　）　　、３Ｍ１０９　　（ｐＫｓＫ３５１）　　
、、ＪＭ＋ｏ９　　（ｐＫｓＫＯ６７）　　、、３Ｍ１
０９　　（ｐＫｓＫＯ６９）　　、ストレゾ１゛コツカ
ス゛リーンギス（　ＳＬｒ（！ｐＬｏｃｏｃ．ｃｕｓｓ
ａｎｇｕｉｓ）株； ジャリス（Ｃｈａｌｌｉｓ）６　　（ｐＫＳＫ　１　５
　Ｇ）、ジャリス　　　　　　（ｉ（ｐＫｓＫＩ３６）
、ジャリス　　　　　６　　（ｐ　ＫＳＫ　１　２　９
）、ジャリス　　　　　６　　（ｐＫＳＫ４　５　１）
、ジャリス　　　　　６（ｐＫｓＫＩ６７）、ジャリス
　　　　　６　　（ｐＫｓＫＩ６９）、および、大腸菌
株； ３Ｍ１０９　（ｐＫｓＫＯ５６’ｒ；ｐＧＰｌ−２）、
３Ｍ１０９　（ｐＫｓＫ０３６′Ｆ；ｐＧＰｌ−２）、
３Ｍ１０９　（ｐＫｓＫＯ２９Ｔ；ｐｃＰｌ−２）、Ｊ
ＭＩＱ９　（ｐＫｓＫ３５１Ｔ；ｐＧＰｌ−２）、３Ｍ
１０９　（ｐＫｓＫＯ６７Ｔ；ｐＧＰｌ−２）、３Ｍ１
０９　（ｐＫｓＫＯ６９Ｔ；ｐＧＰｌ−２）、６ の寒天プレート培養を従来の標準条件で行う。

ｐＫｓＫＯＯＯ発現プラスミド群を使用する場合、（生
成する組換え微生物株に従って先に命名されているよう
に）以下の処理がイリ加する。つまり大腸菌ＪＭ１０９
　（ｐＫＳＫＯＯＯＴ）中間株の１ランスホーメーシヨ
ンに読導可能なｌ゛７　ＲＮ　Ａポリメラーゼをコード
するベクターｐＧＰ１−２を用い、通常培養培地にリフ
ァンピシンが添加される（宿主ＲＮＡポリメラーゼの選
択的阻害のため）。

次の両ステップを組合−ヒ、大腸菌、Ｊ　Ｍ　１０９（
ｐＫｓＫｏ　００Ｔ　；　ｐＧＰ　］−２）株の培養は
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのそれ自身のプロモーターにお
ける特異性を利用してクリングルストレプトキナーゼ 本発明で得た組換え生産株群、すなわち上述の；大腸菌
．ＪＭ１０９　（ｐＫｓＫＯＯｏ）株、ｓ．　　リ゛ン
ギス（ｓａｎｇｕｉｓ）ジャリス６　（ｐＫｓＫｏｏｏ
）株、Ｐ．ミラビリス（ｍｉｒａｂｉｌｓ）　　Ｌ　Ｖ
　Ｉ　（ｐＫｓＫＯＯｏ）株、大腸菌．ＪＭｌ　０　９
　（ｐＫｓＫＯＯＯＴ；　ｐＧＰｌ−２）株の好ましい
態様における好気性寒天プレート発酵に従来の生物学的
培養培地を使用する。発現プラスミドおよび各組換え原
核性生産生物で使用され、かつそれにより使用される発
現プラスミドの設計に依存する受容株の特別な組合せに
依存して、合成遺伝子産物は細胞質内、細胞周辺腔また
は細胞外に位置し、そこから生したトリハイブリッドス
トレプトキナーゼを単離する。このことばある場合には
細胞溶解物（大腸菌ＪＭ１０９株全てについて）またあ
る場合には培養液（組換えＳ．サンギス（ｓａＢｕｉｓ
）ジャリス６株およびＰ．ミラビリス（ｍｉｒａｂｉｌ
ｉｓ）株について）からの精製ステップによって行なわ
れる。

つづくＴ占製ステップの６才しめには分子ふるいオンよ
びイオン交換クロマトグラフィー法が使用される。最終
的精製はクリングルドメインに対するりシンセファロー
スまたは抗プラスミノーゲン結合セファロース、および
、またはストレプトキナーセに対するオクチル−セファ
ロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで行
なわれる。最終産物の純度はＦデシル硫酸ナトリウｊ、
−ボリアクリルア実ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）で検山ｒする。

標重的合成および操作に従がって得たバイブリソトスｉ
・レゾ１−キナーゼをゲル電気泳動、ザイモグラフィー
法および免疫学的方法を用いて同定しかつ１、Ｙ性を調
べた。最初に８１１■胞外またに目■胞周辺腔産物のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを行う。この場合サンプルの通常の調製
法とは異なり熱変性は行なわない。つづい“（ずでに特
徴つげられたス１〜レプトキナーゼ検定溶媒中先に述べ
たようにゲルのザイモグラフをとる。クリングルストレ
プトキナーゼのフィブリン結合ドメインは、ハイブリッ
ドストレプトキナーゼのフィブリン結合要素を指向する
特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用い
たゲルのウェスタンイムノブロッティングを用いて示さ
れる。この方法では免疫親和性によって精製したヒトプ
ラスごノーアンに対するポリクローナルウサギ抗血？Ｈ
を使用するのが好ましい。

本発明の特徴は本発明の方法を用いることにより臨床的
に意義のある性質を有するハイブリット９ ストレプトキナーゼを始めて生産したことにある。

該バイブリソトス１−レプトキナーセの生合成のため、
Ｌ型の原核性生産生物を該ハイブリッドストレプトキナ
ーゼの遺伝子を含む発現プラス迅ドでトランスホームす
る。該発現プラス完ドは遺伝子融合（支術により１・、
１徴づ＆Ｊられ、本来の機能をも一゛）グループＣスト
レプト牛ナーゼをコードする遺伝子領域およびヒトプラ
スミノーゲンのフィブリン結合ドメインをコードする配
列から選択した領域を用いて構築された。標準的方法に
より合成されたハイブリッドストレプトキナーゼはその
血栓（血餅）選択性で区別される。ここで目的とされる
イ」知的性質を有するス１ーレプトキナーゼ分子を得る
ために本方法または技術においてストレプトキナーゼ ん白質化学的方法に訴える必要はない。むしろここで得
られた結果は目的とするハイブリッドストレプトキナー
ゼ 合成である。

すでによく知られている一連のＤＮＡ単離法に０ 基づき、ＤＮＡ合威合成びＤＮＡ融合は多錘の分子型の
クリングル−ストレプトキナーゼ設計の目標を達成する
ためのいくつかの方法で応用される本方法論理的解答の
遺伝子学的技術ステップにより可能となる。

以下の実施例は本発明の実行を示している。

実施例　１ １．１） ｆｂｄ　　ＤＮＡ挿入のための遺伝子融合ベクタｐｋＭ
２の調製 大腸菌ＪＭ１０９　（ｐｋＭ２）Ｃデポジトリ−・フォ
ー・マイクロオーガニズム・オブ・ザ°デイ−デイ−ア
ール（Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ　　ｆｏｒＭｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤＤＲ）に保管、ゼン
トラルインスチチュート・ファ・ミクロビオロジー・ラ
ンド・エクスペリメンテレ・セラピ・デル・アカデミ−
・デル・ライセンシャツテン（Ｚｅｎｔｒａｌｉｎｓｔ
ｉｔｕｔ　ｆｕｒ　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅｕｎｄ
　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅ　Ｔｈｅｒａｐｉｅ　
ｄｅｒ　Ａｋａｄａｍｉｅｄｅｒ　Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈ
ａｆｔｅｎ）　、ビューテンベルダストラセ（口ｅｕ１
．ｅｎｂｅｒｇｓｔ、ｒａｓｓｅ）　　ＩＬジェナ（、
Ｊｅｎａ）、ＤＤＲ−６９００、登録番号ＩＭＥＴ１１
３６１　：］の−晩培養物（約３Ｘ１０”細胞）１雁を
５００−培養フラスコを用い０．１ｇ／ｍｆｆアンピシ
リンを含むＬＢ培地中（１リットル当りパフ１１９１１
フ１０ｇ、バクトイーストイクストラクト５ｇ、ＮａＣ
Ｒ１０ｇ、　ｐＨ７、５）培養物が後期対数期に達する
まで３７℃で振とうしながらインキュベートする。この
細胞を遠心してから洗浄し、アルカリ法（０，２Ｎ　　
ＮａＯＨ１１％５ＤＳ）に従って溶解する。５倍容の酢
酸カリウム溶液（５Ｍ、　ｐＨ４，８）添加後、この染
色体ＤＮＡを遠心により他の細胞成分から分離する（２
０００Ｏｒｐｍ、２０分、４℃）。プラスミドＤＮＡを
含むフラクションを０．６倍容のイソプロパツールと混
合し、室温１２０００　ｘ　ｇで３分間遠心しｐｋＭ２
ＤＮＡを得る。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄
し、８ｒｄＴＥバツフア（１０ｍＭ）リス−ＨＣｊｌ！
、　ｐＨ１８，０；　１ｍＭＥＤＴＡ）　　に溶解した
後、精製ｐｋＭ２ＤＮＡを得るため工２ チジウムブロマイド（Ｅｔｂｒ、）　−ＣｓＣｊ！密度
勾配遠心（４５０００ｒｐｍ、３６時間）にかける。そ
こから抽出したＥ　ｔｂｒを含むプラスミドＤＮＡを透
析し、０．５　ｍｇ／’ｍ１−１．０　ｍｇ／　−Ｔ　
Ｅの濃度で４℃保存する。このｐｋＭ２ＤＮＡ溶液８９
μｌに１０μ７！ＳｍａＩバッファ、１μＤＴＴ溶液（
１００ｍＭ）およびＳｍａＩ酵素１００ユニットを加え
る。この混合物を３３℃で２時間インキュベートし、切
断したＤＮＡをフェノール抽出、エタノール沈殿にかけ
た後、５０μｌのＴＥバッファに溶かす。このＤＮＡ挿
入用に線状化した４２８２塩基対（ｂｐ）のｐｋＭ２ベ
クターＤＮＡフラグメントは一２０℃で保存する。

１．２）　　ｆｂｄ　　ＤＮＡの調製 ヒトプラスミノーゲンのｃＤＮＡプラスミド挿入物の調
製 ヌクレオチド配列および塩基番号に関して文献に定義さ
れている（フォースグレン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ）等、Ｆ
ＥＢＳリターズ（Ｌｅｔｔ、）２１３　：　２５４．１
９８７）ヒトプラスミノーゲンめ完全な３ ｃＤＮＡをまず１．１）で述べた条件下で組換え大腸菌
プラスミドｐＦＤ１の形で単離する。

−プラスミノーゲンクリングル１（Ｋｌ）をコードする
ｆｈｄ　　ＤＮＡの単離 ｐＦＤＩＤＮＡ　（およそ１μｇ／μｌのもの２４μｊ
りを各２０ＵのＰｖｕＩＩおよびＳ　ｔｕ　Ｉで続けて
切断する。このＤＮＡ消化混合物のＬＭＰアガロース（
１％）による電気泳動後、Ｋｌをコードする５　０２ｂ
ｐＰｖｕｌｌ−３ｔｕ１７ラグメント　（プラスミノー
ゲンのｃＤＮＡのヌクレオチド部位１９６−６９７）を
ゲルから単離し、フェノール抽出とエタノール沈殿によ
り精製してから１５μｌのＴＥバッファに溶解する。こ
のフラグメントをこれ以上消化することなしにＳｍａＩ
切断したｐｋＭ２ＤＮＡへの挿入に用いることにより’
　ｓｋｃ読み枠は完全に保存される。

プラスミノーゲンクリングル４　　（Ｋ４）をコドする
ｆｂｄＤＮΔの調製 ｐＦＤＩＤＮＡ　（約１μｇ／μｌのもの５０μＩｌ）
を２０ＵのＨｇｉΔＩで完全に消化する。

４ この消化物をＬＭＰアガロース（０，８％）で電気泳動
した後、Ｋ４およびに５をコードする１０１４ｂｐ　　
Ｈｇ１ＡＩフラグメント　（ヌクレオチド部位９７Ｌ−
１９９２）をゲルから単離し、フェノール抽出およびエ
タノール沈殿により精製してから５０μｌのＴＥバッフ
ァに溶かす。

このＨｇ１ＡＩフラグメント溶液２４μｌを室温でそれ
ぞれ１０秒、１分、２分、３分、４分および５分間５Ｕ
のＢａｄ　３１でエクソヌクレオリティカルに消化する
。Ｂａｄ　３１消化はフェノールで停止し、つづいてこ
の消化混合物をフェノール抽出およびエタノール沈殿で
精製する。

精製したＢａ、ｌ！　３１消化混合物は、１０μｌの部
分標本について４種デオキシヌクレオチド三リン酸およ
びクレノー酵素（ＩＵ）存在下室温３０分間のＤＮＡ末
端修復処理を行ない、７ＯｔｌＯ分間の加熱処理を施し
た後使用するまで２０℃で保存する。

５ プラスミノーゲンクリングル４′Ｊ６よび５（Ｋ４＋に
５）をコードするｆｂｄＤＮＡの３周製Ｋ　４　＋Ｋ　
５をコードするｆｂｄ　　ＤＮＡサブフラグメント混合
物を上述の操作を若干修正した方法で調製する。これは
同条件下１０，２０．３０．４０．５０および６０秒間
、５ＵのＢａ、Ｃ３１を用いた消化で行なう。

ヒトプラスミノーゲンの最小長クリンクル４（Ｋ４）を
コードするｆｂｄ　　ＤＮＡの３周製１０１４ｂｐ　　
Ｈｇ１Ａ　Ｉフラグメント　（」二連）はに４をコード
する配列中に存在する内部Ｐｓｔ。

■部位を含んでいる。本Ｈｇ１ＡＩフラグメントを標準
条件下でＢａｄ　３１に消化し、つづいてＰｓｔＩ消化
し、さらにこれをライゲーションすることで最小長（約
３００　ｂｐ）のに４コープインクフラグメントが得ら
れるように組換えを行う。

６ クリングルｌから４　　（Ｋ１＋に２＋に３＋に４）を
コードするヒトプラスミノ−・アンのｆｂｄＤＮＡコー
ディングフラグメントの調製ｃＤＮＡ挿入物のに５領域
中の唯一のＡｈａ１１部位（ヌクレオチド部位１５７３
）を含むｐＦＤＩＤＮＡ（約■μｇ／μｌのもの３２μ
Ｉｌ）を１２ＵのＡｈａＩＩを用いて完全に消化する。

さらにこの全ＡｈａＵ消化物を室温で１分間０．７Ｕの
Ｂａｊ２３１で消化し、つづいてフェノール抽出および
エタノール沈殿で精製する。この精製Ｂａｊ！３１消化
物にクレノー酵素を用いた上述の末端充填反応処理を行
ってからフェノール抽出およびエタノール沈殿により精
製して３２μｌのＴＥバッファに溶解する。該ＤＮＡ調
製物を２０ＵのＰｖｕＨで消化しヌクレオチド部位１９
６で”ＡｈａｌＩ−Ｂａｊ２３１　”　ＤＮＡを切断す
る。この全ｐｖｕｎ消化産物をアガロースゲル電気泳動
にかけ、１３００〜１３８０ｂｐの領域に泳動するＤＮ
Ａ混合物をゲルから単離し、フェノール抽出およびエタ
ノール沈殿物１５μ１７ のＴＥバッファに溶かして必要となるまで２０℃で保存
する。

１．３）ｆｂｄ　　ＤＮＡのクローニングおよび選択さ
れたｐＫｓＫＯＯＯ発現プラスミドの生産１．２）で調
製したｆｂｄ　　ＤＮＡをり、ｌ）で述べたように調製
した遺伝子融合ベクターｐｋＭ２に挿入する。典型的実
験では１μｌのＳｍａＩ切断ｐｋＭ２ＤＮＡを１５μｌ
のターゲットＤＮＡと混合し、２ＵのＴＩＩＤＮΔリガ
ーゼとともに４℃で１６時間インキュベートする。１〜
５μｌのライゲーション混合物をハナハン（ｌｌａｎａ
ｈａｎ）の方法（Ｄ、　Ｍ、　グローハ（Ｇｌｏｖｅｒ
）編、ＤＮＡクローニング１巻、１０９〜１３５）に従
がい大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞ザス細胞ジスペ
ンジョンＢのトランスホーメーションに用いる。ＳＯＣ
溶波（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）、同」二）中、１時
間のインキュベーション後、培養物の部分標本を１００
μｇ／−のアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に捲
き、３７℃で１６〜２０時間インキュベートする。生じ
たア８ ンピシリン耐性コｌ：Ｊニーの」二にストレプトキナー
ゼ ５０ｍＭｌ”リス−Ｈ　Ｃ　Ａ　、　ｐｌ＋８．　１、
１５０ｍＭＮａＣｊ！、１０ｐｇ／ｍｌヒトプラスミノ
ーゲン）を重層し、さらにコロニーのまわりにカゼイン
分解ゾーンが出現するまでこのプレートを３７℃でイン
キュへ−１−する（２〜８時間）。ストレプトキナーゼ
反応を起こすクローンをシングルコロニーアイソレーシ
ョンにより精製し、それらのプラス旦ド種（ｐＫＳＫ発
現プラスミドと呼ぶ）を−次構造分析により特徴づける
。このようにして以下に示すプラスごド；ｐＫＳＫ０５
６、ｐＫｓＫＯ３６、ｐ　Ｔ＜　Ｓ　Ｋ　０　２　９、
ｐＫｓＫ　　３５１、ｐＫＳＫＯ６７およびｐＫｓＫＯ
６９を単離した。

１、４）　　融合遺伝子のヌクレオチド配列分析１〜リ
ハイブリツドストレプトキナーゼの一次構造を誘導する
ためのＤＮＡフラグメントをｐＫｓＫＯＯｏプラスくド
から単離し、シーケンスヘクターＭ１３ｍｐ１８および
Ｍ１３ｍｐ１９９ にクローン化する。一連の典型的付加的実験においては
一例としてｐＫｓＫｏ　０　０プラスミドのＥｃｏＲ　
Ｔ　−　１３ａｍＩ−１　１７ラグメンＩ・を単離し、
ｍｐ１８およびｍｐ１９に挿入後、標準操作に従うダイ
デオキシチェーンター〔不ーシジン法により両方向のシ
ーケンシングを行った。このヌクレオチド配列分析によ
り本発明の特徴で述べられたクリングルスＩ・レプトキ
ナーゼをコードする選択された遺伝子融合物の一次構造
が提供される。

１、５）組換え大腸菌ＪＭ１０９　（ｐＫＳＫＯＯＯ）
株の培養および細胞溶解 組換え大腸菌ＪＭ１０９　（ｐＫｓＫＯＯｏ）株を１０
０μｇアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｅイソプロピル
ーベーク−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含むＬＢ培地
（上述）またば２ＹＴ培地（１リットル当りバクトドリ
プトン１６ｇ、ハクトイーストイクストラクトＩＯｇ，
Ｎａ（１５ｇ，ｐＨ７、５）中高好気的条件下で３７゛
Ｃで増殖の後期対数期となるまで培養する。遠心で細０ 胞を沈降させた後４℃の４０μｇ／ーフェニルメタンス
ルホニルフルオライドおよび５０μｇ／　ｍｅの４−ト
シルアミド−ルー７−アミノ−２へブタノン−１−Ｉ　
Ｃ　＃を含むトリスバッファ（０．ＩＭ）リス、ｐＨ７
．４、１ｍＭＥＤＴＡ）またはＰＢＳ　（上述）で洗浄
する。つづいて細胞を適当なバッファ溶液中で１０倍の
濃縮した後、超音波またはフレンチ圧力細胞処理で分解
する。

この細胞分解物を遠心（２００００ｒｐｍ、１０分間）
により清澄化し、その上清溶液を０．１ｍＭチオレドキ
シンおよびＯ．ＬｍＭＤＴＴと混合して４°Ｃで一晩放
置する。この調製物はハイブリットストレプトキナーゼ
の分析および精製用の出発物質として用いる。

１６）Ｐｇ−ハイブリットストレプトキナーゼ（クリン
グル−ストレプトキナーゼ）の単離１、６．１）ヒトプ
ラスミノーゲンに対する一特異的ウサギ抗血清の調製 精製ヒトプラスミノーゲン５ｍｇを０．５ｍ１．のＮａ
ＨＣ○３溶液（０．　１　Ｍ，　ｐＨ８．　５　）に溶
かし、同溶肢に対して透析する。その後この透析プラス
ミノーゲンを４℃で４時間アフィゲル１０（Ａ　ｆＦｉ
−ｇｅｊ！　１　０　）に結合させ、ついでエタノール
アミン（ＩＭ）でブロックする。リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）およびグリシン（０．　１　Ｍ　；　ｐＩ＋２、７）
でこのカラムを洗浄後再びＰＢＳで平衡化してから、４
−の抗プラスミノーゲン血清をチャージする。１時間の
反応後カラムをＰＢＳおよび蒸留水で十分洗浄してから
最後にグリシン（０．　１　Ｍ，　ｐＨ１２．　７　）
で溶出する。２８０ｎｍにおける分光測定で吸光度１２
５以上と測定される一特異的ウサギ抗体フラクションを
トリス○Ｈ　（２．　５　Ｍ，　ｐｉｌｌ　Ｏ．　５　
）による中和複合せて２００μｌづつのフラクションに
子分けして２ ７０℃で保存する。

］、６．２）クリングルストレプトキナーゼの精製ヒト
プラスミノーゲンに対する一特異的つザギ抗体（１，６
，］で調製したもの）をＮａ　ＩＩ　ＣＯＪ溶液（０，
１Ｍ、　ｐｌ＋８．０　）に対して透析し、オーバーナ
イトでアフィーゲル（Ａｆｆｉ−ｇｅｎ）に結合させる
。ゲル床のブロッキングおよび洗浄後（１，６，１参照
）、カラムにＰＢＳで調製した大腸菌ＪＭ１０９　（ｐ
ＫｓＫＯＯｏ）分解物をチャージする。少なくとも１時
間の反応時間後このカラムを洗浄し、最後にグリシン溶
液（０，１Ｍ、　ｐＨ２，７）で溶出する。クリングル
ス１−レプトキナーゼを含むフラクションの純度は５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびゲルのザイモグラフィーを用いてア
フィニティークロマトグラフィー前の同物質と比較する
ことにより測定する。この方法で示されるように、この
アフィニティークロマトグラフィーによりクリングル構
造をもたない分解生成物が除かれストレプトキナーゼ活
性を示すたん白質が得られる。

３ １．７）クリングルストレプ１−キナーゼのリジン結合 イムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製し
たクリングルストレプト１−ナーゼをＮｉｌ、ＩＩＣ○
３溶液（０，１Ｍ、　ｐＨ８，２）に対して透析し、つ
いでリジンセファ１コースと定常的に攪拌しなから４°
Ｃで一晩反応さ一已る。ストレプトキナーゼ活性に対す
るパンチ−ホールプレニトチスト められなくなるまでそのカラムをＮ　Ｈ　、　Ｈ　Ｃ　
Ｏ　＋。

（０．　１　Ｍ　：　ｐｔ＋８．　２　）で洗浄する。

つづいて、このカラムをＮ　Ｈ　ａ　Ｈ　Ｃ　Ｏ　ａ　
？客演（０．　１　Ｍ，　ｐＨ７、９）に？容かしたニ
ブシロン−アミノカブン酸（ＥＡＣＡ　；　ＩＭ）で溶
出する。リジン−セファロースクロマトグラフィーまで
の洗浄および？容出？客演および物質についてストレプ
トキナーゼ活性に対するパンチ−ホールプレートテスト
施例１における種々のステップで台底されたクリングル
ストレプトキナーゼは結果的に（Ｋ５４ ストレプトキナーゼは例外）リジンセファロースに結合
し、かつＥＡＣＡで溶出し得た。

実施例　２ ２、１　　選択したｐＫｓＫｏ　０　０Ｔ発現プラスミ
ドの生成 実施例１のステップ１．３）に従って得られたｆｂｄ−
’ｓｋｃ組換えｐＫｓＫｏ　０　０発現プラスミ　ト’
ｐＫｓＫ０　　５　　６　、　ｐＫＳＫＯ　　３　　６
　、ｐＫｓＫｏ　２　９、ｐＫＳＫ３　５　１、ｐＫＳ
Ｋ０６７、およびｐＫＳＫＯ　６　９を一方ではＳｓｔ
Ｉ−ＳｐｈＩフラグメントとしてのカセット形および対
応するｆｂｄ−’ｓｋｃ遺伝子融合物の形で使用される
。他方大腸菌発現ベクターｐＴ７Ｔ３　Ｌ　８Ｕ　（２
．９ｋｂ；選択マーカーアンピシリン耐性）由来のＤＮ
Ａの部分標本は個々のｆｂｄ’　ｓｋｃ遺伝子カセット
の挿入のため制限酵素Ｓ　ｓｔ　Ｉ　＋　Ｓ　ｐｈ　Ｉ
による消化により調製する。典型的実験においてｐＫｓ
Ｋｏ　０　０発現プラスミドのＤＮＡ１００ｎｇは２、
１　ｋｂ（ｐＫｓＫｏ　５　６）、２、５ｋｂ　（ｐＫ
ｓＫｏ　３　６）　、２．１ｋｂ　（ｐＫＳＫ５ ０　２　９）　、２．２ｋｂ　（ｐＫＳＫ３　５　１）
　、および３、Ｏｋｂ　（ｐＫｓＫｏ　６　７およびｐ
ＫｓＫｏ　６　９）ＤＮＡフラグメントとして単離され
る。その後これらをフェノール抽出およびエタノール沈
殿で精製する。各々の指定されたｆｂｄ−ｓｋｃ遺伝子
融合物と切断したベクターとのライゲーション後、この
ライゲーションしたＤＮＡをステップ１．３）で述べた
ようにアンピシリン耐性で選択される大腸菌ＪＭ１０９
にトランスホームし、制限酵素Ｓ　ｓｔ　ＩおよびＰｓ
ｔＩを用いた制限分析によりｆ　ｂｄ　−　　ｓｋｃ遺
伝子融合物の構造統合性を検証した結果、ｆｂｄ−’ｓ
ｋｃ組換え発現プラスミドｐＫｓＫｏ　５　６Ｔ，ｐＫ
ＳＫ（］　３　６Ｔ，ｐＫｓＫｏ　２　９ＴＸｐＫｓＫ
０　３　５　ＩＴ。

ｐＫｓＫｏ　６　７Ｔ，ｐＫｓＫｏ　６　９Ｔが得られ
る。大腸菌ＪＭＩ　０　９　（ｐＫｓＫｏ　０　０Ｔ）
株の各々を再びハナハン（ｌｌａｎａｈａｎ）　（上述
）の方法に従がい１００ｎｇのプラスミドｐＧ１−２で
トランスホームし、ついで各々５μｇ／−のカナマイシ
ンおよびアンピシリンに対する耐性に６ 関し該トランスホーマントを二重選択した後組換え大腸
菌ＪＭ１０９　　（ｐＫｓＫＯＯＯＴ；ｐｃｐ　１−２
）株を得る。

２．２）合成ハイブリッドストレプトキナーゼ生産を目
的とした組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＳＫｏ　００Ｔ
　；　ｐＧＰ　１−２）株の培養。ステップ２．１）に
従って得られた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫｓＫｏ　００Ｔ
　；　ｐＧＰ　１−２）株を細胞濃度が５Ｘ１０８とな
るまでアンピシリンおよびカナマイシン（各々５０μｇ
／ｍＥ）を含む２％バタトトリプトン、１％バクトイー
ストイクストラクト、５％ＮａＣＲおよび０．２％グル
コース（ｐＨ７、２）からなる培地中好気条件下３０℃
でインキュベートする。その細胞密度に到達した後、Ｔ
７ポリメラーゼ／プロモーターシステムの誘導のためこ
の培養液を４２℃で２５分間インキュベートする。つづ
いてこれらを１００〜２００μｇ／７のりファンピシン
と混合し、さらに３７℃で少なくとも２時間インキユベ
ションする。このような発酵過程が終った後、７ 細胞収穫および細胞分解をステップ１．５）で述べたよ
うに行う。

本明細書中に示されている本発明の態様、または該態様
の一部分または要素、または本方法におけるステップま
たは該ステップの配列に関し、特許請求の範囲で定義さ
れているように本発明の精神および範囲を逸脱すること
なしに修正することができる。

Ｇ只

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、融合たん白質をコードしかつ適当なベクターへの挿
   入に適したポリデオキシリボヌクレオチドセグメントで
   、 （イ）ヒトのプラスミノーゲンのフィブリン結合ドメイ
   ンの少なくとも１つをコードするＤＮＡフラグメント、
   および （ロ）ストレプトキナーゼ分子の機能要素をコードする
   遺伝子を含むＤＮＡ配列を含むポリデオキシリボヌクレ
   オチドセグメント。 ２、前記ポリデオキシリボヌクレオチドセグメントのフ
   ィブリン結合ドメインＤＮＡフラグメントがクリングル
   １、クリングル２、クリングル３、クリングル４、また
   はクリングル５、前記クリングルのいずれかの機能領域
   、または前記領域を組合せたものをコードするＤＮＡフ
   ラグメントからなる群から選ばれる請求項１記載のポリ
   デオキシリボヌクレオチドセグメント。 ３、請求項１記載のポリデオキシリボヌクレオチドセグ
   メントで、さらにストレプトキナーゼ分子の機能要素を
   コードする遺伝子および発現コントロール配列が、５′
   から３′の方向に、（イ）翻訳開始コードを有する発現
   コントロール配列、 （ロ）ポリリンカー部位、および （ハ）翻訳開始コドンの読み枠をはずれてプラスミノー
   ゲンを活性化する能力を有するＮ−末端ブラント化スト
   レプトキナーゼをコードし、天然の転写および終止シグ
   ナルを有するストレプトキナーゼの機能要素をコードす
   る遺伝子で、フィブリン結合ドメインをコードするＤＮ
   Ａフラグメントがストレプトキナーゼの機能要素をコー
   ドする遺伝子をその読み枠に保存するポリリンカー部位
   に挿入されている遺伝子、 を含むｐｋＭベクター群の１つから得られるＤＮＡ配列
   に機能的に結合する発現コントロール配列を含み、かつ
   さらにｐｋＭベクター群の１つから得られるポリリンカ
   ー部位を含むポリデオキシリボヌクレオチドセグメント
   。 ４、前記ｐｋＭベクターが、 （ａ）（イ）翻訳開始コドンを含み、かつベーターガラ
   クトシダーゼのＮ−末端６残基のアミノ酸のコドンを含
   む大腸菌−ｌａｃ−プロモーター−オペレーター、 （ロ）クローニングベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲ I
   −Ｘｂａ I −部分ポリリンカーおよび （ハ）翻訳開始コドンの読み枠をはずれて、シグナルペ
   プチドの１３個のＮ−末端アミノ酸を欠くブラント化ス
   トレプトキナーゼをコードするＳ．エクィシミリスＨ４
   ６Ａの染色体由来の１５９６塩基対ＨｉｎｃIIフラグメ
   ント、を含むｐｋＭ２ベクター、 （ｂ）（イ）翻訳開始コドンを含み、かつストレプトコ
   ッカスＡ型エクソトキシンのＮ−末端の５残基のアミノ
   酸のコドンを含むストレプトコッカス−￥ｓｐｅ￥Ａ発
   現−分泌ユニット、（ロ）クローニングベクターｐＵＣ
   ９のポリリンカーの修正されたＳｍａ I −Ｓａｌ I 部
   分、および （ハ）翻訳開始コドンの読み枠をはずれてブラント化ス
   トレプトキナーゼをコードする、Ｓ．エクイシミリスＨ
   ４６Ａ染色体ＤＮＡ由来の１５９６ｂｐＨｉｎｃIIフラ
   グメント、を含むｐｋＭ３ベクター、および （ｃ）（イ）翻訳開始コドンを含み、かつストレプトコ
   ッカスＡ型エクソトキシンのＮ−末端の５残基アミノ酸
   に対するコドンを含むストレプトコッカスピオジネス−
   ｓｐｅＡ発現−分泌ユニット、 （ロ）クローニングベクターｐＵＣ９のポリリンカーの
   修正されたＳｍａ I −Ｓａｌ I 部分、および （ハ）翻訳開始コドンの読み枠をはずれてブラント化ス
   トレプトキナーゼをコードするＳ．エクイシミリスＨ４
   ６Ａ染色体ＤＮＡ由来の １５９６ｂｐＨｉｎｃIIフラグメント、 を含むｐｋＭ５ベクター、 以上（ａ）〜（ｃ）のベクターからなる群から選ばれる
   請求項３記載のポリデオキシリボヌクレオチドセグメン
   ト。 ５、融合たん白質をコードし、 （イ）ヒトのプラスミノーゲンのフィブリン結合ドメイ
   ンをコードするＤＮＡフラグメント、および （ロ）ストレプトキナーゼ分子の機能要素をコードする
   遺伝子を含むＤＮＡ配列を含むポリデオキシリボヌクレ
   オチドセグメントが挿入されたベクターを含む組換えベ
   クター。 ６、前記ポリデオキシリボヌクレオチドセグメントのフ
   ィブリン結合ドメインＤＮＡフラグメントがクリンゲル
   １、クリンゲル２、クリンゲル３、クリンゲル４、また
   はクリンゲル５、前記クリンゲルのいずれかの機能性部
   分、または前記領域を組合せたものからなる群から選ば
   れる請求項５記載の組換えベクター。 ７、請求項５記載の組換えベクターで、さらに５′から
   ３′方向で （イ）翻訳開始遺伝子を有する発現コントロール配列、 （ロ）ポリリンカー部位、および （ハ）翻訳開始コドンの読み枠からはずれてプラスミノ
   ーゲンを活性化する能力を有するＮ−末端ブラント化ス
   トレプトキナーゼをコードし、天然の転写および終止シ
   グナルを有するストレプトキナーゼ分子の機能性要素を
   コードする遺伝子、 を含むｐｋＭベクター群の１つから得られるストレプト
   キナーゼ分子の機能性要素をコードする遺伝子および発
   現コントロール配列を含むＤＮＡ配列と機能的に結合す
   る発現コントロール配列およびポリリンカー部位を含み
   、そのポリリンカー部位にストレプトキナーゼの機能性
   要素をコードする遺伝子と同じ読み枠でフィブリン結合
   ドメインをコードするＤＮＡフラグメント挿入されてい
   る組換えベクター。 ８、請求項７記載の組換えベクターで、ｐｋＭベクター
   が （ａ）（イ）翻訳開始コドンを含みベーターガラクトシ
   ダーゼの６個のＮ−末端アミノ酸のコドンを含む大腸菌
   −￥ｌａｃ￥−プロモーター−オペレーター、 （ロ）クローニングベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲ I
   −Ｘｂａ I −部分ポリリンカーおよび （ハ）翻訳開始コドンと同じ読み枠で、シグナルペプチ
   ドの１３個のＮ−末端アミノ酸を欠くブラント化ストレ
   プトキナーゼをコードする５、エクイシミリスＨ４６Ａ
   の染色体由来の１５９６塩基対ＨｉｎｃIIフラグメント
   、 以上（イ）〜（ハ）を含むｐｋＭ２ベクター、（ｂ）（
   イ）翻訳開始コドンを含み、Ａ型ストレプトコッカスエ
   クソトキシンの５個のＮ−末端アミノ酸のコドンを含む
   ストレプトコッカス−￥ｓｐｅＡ￥発現−分泌ユニット
   、 （ロ）クローニングベクターｐＵＣ９のポリリンカーの
   修正されたＳｍａ I −Ｓａｌ I 部分、および （ハ）翻訳開始コドンと同じ読み枠のブラント化ストレ
   プトキナーゼをコードするＳ．エクイシミリスＨ４６Ａ
   染色体ＤＮＡ由来の１５９６ｂｐＨｉｎｃIIフラグメン
   ト、 以上（イ）〜（ハ）を含むｐｋＭ３ベクター、および （ｃ）（イ）翻訳開始コドンを含みＡ型ストレプトコッ
   カスエクソトキシンの５個のＮ−末端アミノ酸のコドン
   を含むストレプトコッカスピオゲネス−￥ｓｐｅＡ￥発
   現−分泌ユニット、（ロ）クローニングベクターｐＵＣ
   ９のポリリンカーの修正されたＳｍａ I −Ｓａｌ I 部
   分、および （ハ）翻訳開始コドンと同じ読み枠でブラント化ストレ
   プトキナーゼをコードするＳ．エクイシミリスＨ４６Ａ
   染色体ＤＮＡ出来の１５９６ｂｐＨｉｎｃIIフラグメン
   ト、 以上（イ）−（ハ）を含むｐｋＭ５ベクター、以上（ａ
   ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる組換えベクター。 ９、ヒトプラスミノーゲンのフィブリン結合ドメインを
   コードするＤＮＡフラグメントおよびストレフトキナー
   ゼ分子の機能性要素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配
   列を含む融合たん白質をコードするポリデオキシリボヌ
   クレオチドセグメントが挿入されたベクターを含む組換
   えベクターを含有するトランスホーマント微生物。 １０、前記ポリデオキシリボヌクレオチドセグメントが
   さらに前記ＤＮＡ配列に機能的に結合するストレプトコ
   ッカスピオゲネス−￥ｓｐｅ￥Ａ発現−分泌ユニットを
   含む発現コントロール配列を含む請求項９記載のトラン
   スホーマント微生物で大腸菌、ストレプトコッカスサン
   ギス、ストレプトコッカスラクチス、枯草菌、プロテウ
   スミラビリスおよびストレプトコッカスファエシウムＬ
   −型株からなる群から選ばれる一員を含む微生物。 １１、前記ＤＮＡフラグメントをコードするフィブリン
   結合ドメインがクリングル１、クリングル２、クリング
   ル、クリングル４、またはクリングル５、前記クリング
   ルの機能性領域または前記領域を組合せたものからなる
   群から選ばれるものである請求項９記載のトランスホー
   マント微生物。 １２、ヒトプラスミノーゲンのフィブリン結合ドメイン
   およびストレプトキナーゼの機能性要素を含むハイブリ
   ッドストレプトキナーゼ。 １３、前記結合ドメインがクリングル１、クリングル２
   、クリングル３、クリングル４、またはクリングル５、
   前記クリングルの機能性領域または前記領域を組合せた
   ものからなる群から選ばれる請求項１２記載のハイブリ
   ッドストレプトキナーゼ。 １４、（イ）ヒトプラスミノーゲンのフィブリン結合ド
   メインをコードするＤＮＡフラグメントおよび （ロ）ストレプトキナーゼ分子の機能性要素をコードす
   る遺伝子を含むＤＮＡ配列を含む融合たん白質をコード
   するポリデオキシリボヌクレオチドセグメントを挿入し
   たベクターを含む組換えベクターを含むトランスホーマ
   ント微生物により産生される請求項１２記載のハイブリ
   ッドストレプトキナーゼ。 １５、ヒトプラスミノーゲンのフィブリン結合ドメイン
   およびストレプトキナーゼ分子の機能性要素を有するハ
   イブリッドストレプトキナーゼの合成法で、 （イ）少なくともヒトプラスミノーゲンの１つのフィブ
   リン結合ドメインの機能性部分およびストレプトキナー
   ゼ分子の機能性要素を含むハイブリッドストレプトキナ
   ーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで適当な
   微生物をトランスホームする、 （ロ）該微生物を培養することにより該ハイブリッドス
   トレプトキナーゼを産生させる、および （ハ）該ハイブリッドストレプトキナーゼを単離する、 以上（イ）〜（ハ）のステップを含む方法。 １６、前記ハイブリッドストレプトキナーゼをコードす
   るＤＮＡがさらにストレプトキナーゼビオゲネス￥ｓｐ
   ｅ￥Ａ発現−分泌ユニットを含む発現コントロール配列
   を含み、かつ前記微生物がエシェリシア、ストレプトコ
   ッカス、バチルスまたはプロテウス属からなる群から選
   ばれたものである請求項１５記載の方法。