CN114315998A - Cey17_rs00300基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CEY17_RS00300基因突变体及其在制备L‑缬氨酸中的应用。具体地公开了突变蛋白质CEY17_RS00300V184M及其编码基因。本发明构建了包含点突变(G‑A)的基因工程菌，以及过表达CEY17_RS00300基因或CEY17_RS00300G550A基因的工程菌。实验表明，CEY17_RS00300基因及其变体参与了L‑缬氨酸的生物合成，对CEY17_RS00300基因编码区进行点突变或在生产菌中过表达CEY17_RS00300基因和/或其突变体，有助于L‑缬氨酸产量及转化率的提高，可以培育符合工业化生产的高产高质量菌种，对L‑缬氨酸的工业化生产具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CEY17_RS00300基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用。
背景技术
L-缬氨酸化学名称为2-氨基-3-甲基丁酸，属于支链氨基酸，是人体必需的8种氨基酸和生糖氨基酸，它能促进身体正常生长，修复组织，调节血糖，并提供需要的能量。可用异丁醛作原料合成。为白色结晶或结晶性粉末，在水中溶解，在乙醇中几乎不溶。L-缬氨酸是一种必需氨基酸，这意味着身体本身不能生产，必须通过膳食来源获得补充。L-缬氨酸具有增强机体的免疫防护作用，抗中枢疲劳，抗外周疲劳，加快运动后机体的修复等作用，因此在食品、医药、化妆品行业具有广泛的应用及商业价值。L-缬氨酸含有特殊的生理功能，市场需求量大，使得L-缬氨酸的生产备受关注。
目前，L-缬氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、发酵法。化学合成法的特点是生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物，污染严重，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产具有原料成本低，反应条件温和及可大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法，发酵法生产的缬氨酸皆为L-型，无需旋光拆分。发酵法的菌种为产谷氨酸微球菌，产氨短杆菌，大肠杆菌，产气气杆菌。工业发酵中获得高产的菌种，对于L-缬氨酸的发酵生产来说是至关重要的，是整个L-缬氨酸发酵工业的核心，是决定发酵产品工业价值的重要因素。
随着L-缬氨酸的市场需求不断增加，选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的积累，进一步提高L-缬氨酸的产量一直是L-缬氨酸发酵工业技术开发和发酵工程化研究的热点，并且也将一直伴随L-缬氨酸发酵工业的发展，对于促进L-缬氨酸产业化的进程具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高L-缬氨酸的产量。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称为蛋白质CEY17_RS00300V184M所述蛋白质可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子可为下述任一种：
B1)编码所述蛋白质CEY17_RS00300V184M的核酸分子；
B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
B3)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。
SEQ ID No.3所示的DNA分子即为本发明所述CEY17_RS00300G550A基因。
SEQ ID No.3所示的DNA分子(CEY17_RS00300G550A)编码SEQ ID No.4所示的蛋白质CEY17_RS00300V184M。
所述蛋白质CEY17_RS00300V184M氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第184位甲硫氨酸(M)是由缬氨酸(V)突变而来。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
C1)含有所述核酸分子CEY17_RS00300G550A的表达盒；
C2)含有所述核酸分子CEY17_RS00300G550A的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；
C3)含有所述核酸分子CEY17_RS00300G550A的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物。
本发明还提供了D1)-D8)中任一项的下述任一种应用：
F1)D1)-D8)中任一项在调控微生物的L-缬氨酸的产量中的应用；
F2)D1)-D8)中任一项在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用；
F3)D1)-D8)中任一项在制备L-缬氨酸中的应用；
其中，所述D1)-D8)为：
D1)所述蛋白质CEY17_RS00300V184M；
D2)所述核酸分子CEY17_RS00300G550A；
D3)所述生物材料；
D4)核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；
D5)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.1所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子；
D6)含有D4)或D5)中所述DNA分子的表达盒；
D7)含有D4)或D5)中所述DNA分子的重组载体、或含有D6)所述表达盒的重组载体；
D8)含有D4)或D5)中所述DNA分子的重组微生物、或含有D6)所述表达盒的重组微生物、或含有D7)所述重组载体的重组微生物。
SEQ ID No.1所示的DNA分子即为本发明所述CEY17_RS00300基因。
SEQ ID No.1所示的DNA分子(CEY17_RS00300基因)编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文所述调控微生物的L-缬氨酸的产量可为提高或降低微生物的L-缬氨酸的产量，即提高或降低微生物中L-缬氨酸的积累量(促进或抑制L-缬氨酸的生物合成)。
本发明还提供了一种提高微生物中L-缬氨酸的产量的方法，所述方法包括下述任一种：
E1)提高目的微生物中的所述核酸分子CEY17_RS00300G550A的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
E2)提高目的微生物中的D4)或D5)所述DNA分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
E3)对所述目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物。
上述方法中，所述突变可为点突变(point mutation)，即单个核苷酸的突变。
上述方法中，所述点突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第184位的缬氨酸残基突变为另一种残基。
上述方法中，所述点突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第184位的缬氨酸(V)突变为甲硫氨酸(M)，得到氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质CEY17_RS00300V184M。
所述突变是指通过定点突变改变基因中的某个或某几个碱基，导致对应的蛋白质氨基酸组成发生改变，产生新的蛋白质或使原蛋白质产生新的功能，即基因定点突变。基因的定点突变技术如寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变或盒式突变等是本领域技术人员所熟知的。
本文所述点突变可为单碱基置换、单碱基插入或单碱基缺失，具体地可为单碱基置换。所述单碱基置换可为等位基因置换。
所述点突变可为将CEY17_RS00300基因(SEQ ID No.1)的第550位鸟嘌呤(G)进行核酸改造。
具体地，所述点突变可为将CEY17_RS00300基因(SEQ ID No.1)的第550位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。具体可为pK18mobsacB或pXMJ19。
本文中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、气杆菌属(Aerobacter)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)或芽胞杆菌属(Bacillus)等。
具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)、产氨短杆菌(Brevibacterum ammoniagenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)或产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)但不限于此。
具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21260，或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067。
本文中，所述重组载体具体可为重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A、pK18-CEY17_RS00300OE、pK18-CEY17_RS00300G550AOE、pXMJ19-CEY17_RS00300或pXMJ19-CEY17_RS00300G550A。
所述重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1106位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。所述重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A含有SEQ ID No.3所示的突变的基因CEY17_RS00300G550A的第5-1074位所示的DNA分子。
所述重组载体pK18-CEY17_RS00300OE用于将外源基因CEY17_RS00300整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达野生型CEY17_RS00300基因。
所述重组载体pK18-CEY17_RS00300G550AOE用于将外源基因CEY17_RS00300G550A整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达突变型基因CEY17_RS00300G550A。
所述重组载体pXMJ19-CEY17_RS00300用于将外源基因CEY17_RS00300通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达野生型CEY17_RS00300基因。
所述重组载体pXMJ19-CEY17_RS00300G550A用于将外源基因CEY17_RS00300G550A通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达突变型基因CEY17_RS00300G550A。
所述重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A、pK18-CEY17_RS00300OE、pK18-CEY17_RS00300G550AOE、pXMJ19-CEY17_RS00300和pXMJ19-CEY17_RS00300G550A均在本发明的保护范围内。
本文中，所述重组微生物具体可为重组菌YPV-061、YPV-062、YPV-063、YPV-064或YPV-065。
所述重组菌YPV-061是将所述重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260中得到的重组菌，所述重组菌YPV-061含有SEQ ID No.3所示的突变的基因CEY17_RS00300G550A。
所述重组菌YPV-062含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的CEY17_RS00300基因；具体地，重组菌YPV-062是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为CEY17_RS00300基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝CEY17_RS00300基因的重组菌可以显著和稳定地提高CEY17_RS00300基因的表达量。重组菌YPV-062为在基因组上过表达野生型CEY17_RS00300基因的工程菌。
所述重组菌YPV-063含有SEQ ID No.3所示的突变的CEY17_RS00300G550A基因；具体地，重组菌YPV-063是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为CEY17_RS00300G550A基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。重组菌YPV-063为在基因组上过表达突变型CEY17_RS00300G550A基因的工程菌。
所述重组菌YPV-064含有SEQ ID No.1所示的CEY17_RS00300基因；重组菌YPV-064为在质粒上过表达野生型CEY17_RS00300基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-CEY17_RS00300在染色体外进行过表达。
所述重组菌YPV-065含有SEQ ID No.3所示的突变的CEY17_RS00300G550A基因；重组菌YPV-065为在质粒上过表达突变型CEY17_RS00300G550A基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-CEY17_RS00300G550A在染色体外进行过表达。
所述重组菌YPV-061、YPV-062、YPV-063、YPV-064和YPV-065均在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种构建所述重组微生物的方法，所述方法包括至少下述任一种：
F1)将所述核酸分子CEY17_RS00300G550A导入目的微生物，得到所述重组微生物；
F2)将SEQ ID No.1所示的DNA分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；
F3)利用基因编辑手段(如单碱基基因编辑)对SEQ ID No.1所示的DNA分子进行编辑，使目的微生物中含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。
所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。
本发明还提供了一种制备L-缬氨酸的方法，所述方法包括利用本文中任一所述重组微生物生产L-缬氨酸。
上述方法中，所述方法可为发酵法制备L-缬氨酸，所述重组微生物可为棒杆菌属(Corynebacterium)，具体可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)及其变体。
在本发明的一个实施方案中，所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21260、重组菌YPV-061、YPV-062、YPV-063、YPV-064和YPV-065。本发明首先以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21260(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的CEY17_RS00300基因)的CEY17_RS00300基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，构建了包含点突变(G-A)的基因工程菌YPV-061。为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型CEY17_RS00300基因或其突变基因CEY17_RS00300G550A可以增加L-缬氨酸的产量，分别将外源基因整合到宿主染色体中或由质粒在染色体外表达，构建了基因组上和质粒上过表达CEY17_RS00300基因或CEY17_RS00300G550A基因的工程菌YPV-062、YPV-063、YPV-064和YPV-065。实验表明，CEY17_RS00300基因及其变体参与了L-缬氨酸的生物合成，通过对CEY17_RS00300基因进行过表达或敲除、或定点突变(如点突变)可以调控L-缬氨酸在微生物内的积累量。对CEY17_RS00300基因编码区进行点突变或在生产菌中过表达CEY17_RS00300基因或其突变基因CEY17_RS00300G550A，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对CEY17_RS00300基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。可利用CEY17_RS00300基因及其变体(如CEY17_RS00300G550A基因)来构建生产L-缬氨酸的基因工程菌种，以促进L-缬氨酸产量提高，培育符合工业化生产的高产、高质量菌种，对L-缬氨酸的工业化生产具有广泛的应用价值和重要的经济意义。
保藏说明
菌种名称：谷氨酸棒杆菌
拉丁名：Corynebacterium glutamicum
菌株编号：YPFV1
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年11月30日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21260
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1 CGMCCNo.21260是将谷氨酸棒杆菌ATCC15168进行诱变获得，并已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21260。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1，又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260。
实施例1构建包含点突变的CEY17_RS00300基因编码区片段的重组载体
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067基因组序列，设计并合成两对扩增CEY17_RS00300基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的CEY17_RS00300基因)的CEY17_RS00300基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将CEY17_RS00300基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第550位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的CEY17_RS00300基因，名称为CEY17_RS00300G550A)。
其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质(所述蛋白质名称为蛋白质CEY17_RS00300)。
SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(所述突变蛋白质名称为CEY17_RS00300V184M)。所述突变蛋白质CEY17_RS00300V184M氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第184位缬氨酸(V)由甲硫氨酸(M)突变而来。
采用重叠PCR(Overlap PCR)技术进行基因定点突变，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加粗字体的碱基为突变位置：
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG CAAAATTCCG GTGGTGCCCG 3'，
P2:5'GCTGTGCCTT TGACCCGCAC CGGCATGATG GTGG 3'，
P3:5'CC ACCATCATGC CGGTGCGGGT CAAAGGCACA GC 3'，
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GTCAAGAAGA CATCACTGGA 3'。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为588bp和590bp的CEY17_RS00300基因编码区的DNA片段(CEY17_RS00300 Up和CEY17_RS00300 Down)。
PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环)，72℃过度延伸10min。
将上述两条DNA片段(CEY17_RS00300 Up和CEY17_RS00300 Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增，得到大小为1144bp的DNA片段(名称为CEY17_RS00300Up-Down，序列如SEQ ID No.5所示)。SEQ ID No.5所示的DNA片段中，第37-1106位(1070bp)为含有突变位点的CEY17_RS00300G550A基因片段(即SEQ ID No.3的5-1074位)。
Overlap PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；
Overlap PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸10min。
所述DNA片段(CEY17_RS00300 Up-Down，SEQ ID No.5)含有突变位点，用于在菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中野生型CEY17_RS00300基因编码区的第550位引入核酸改造，具体为将第550位的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，最终导致编码蛋白的第184位缬氨酸(V)突变为甲硫氨酸(M)。将所述DNA片段(CEY17_RS00300Up-Down)经琼脂糖凝胶电泳分离后进行纯化，与经过酶切(Xbal I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司，用Xbal I/BamH I酶切)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5a(购自TAKARA公司)后长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A，该重组载体上含有卡那霉素抗性(Kanr)标记。将酶切正确的重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(G-A)的重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A保存备用。
所述重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1106位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。
所述重组载体pK18-CEY17_RS00300G550A含有SEQ ID No.3所示的突变的基因CEY17_RS00300G550A的第5-1074位所示的DNA分子。
实施例2构建包含突变基因CEY17_RS00300G550A的工程菌株
构建方法如下：将实施例1中的等位替换质粒(pK18-CEY17_RS00300G550A)通过电击转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出1151bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P5:5'GTGAACGGGC GGCGGCCAGC 3'，
P6:5'ATGGAGCAGG CCGCGCATGG 3'。
将得到的PCR扩增产物(290bp)通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以质粒pK18-CEY17_RS00300G550A扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌ATCC14067扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增阳性菌株CEY17_RS00300基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变(G-A)的菌株为等位替换成功的阳性菌株，并被命名为YPV-061。
重组菌YPV-061含有SEQ ID No.3所示的突变的基因CEY17_RS00300G550A。
表1培养基的组成和培养条件
表2 SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件
实施例3构建基因组上过表达CEY17_RS00300基因或CEY17_RS00300G550A基因的工程菌株
为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型CEY17_RS00300基因或其突变基因CEY17_RS00300G550A可以增加L-缬氨酸的产量，将外源基因整合到宿主染色体中，构建了基因组上过表达CEY17_RS00300基因或CEY17_RS00300G550A基因的工程菌株。
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成四对扩增上下游同源臂片段及CEY17_RS00300或CEY17_RS00300G550A基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中引入CEY17_RS00300或CEY17_RS00300G550A基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GTAGTGCCGT GCGTACCCCA 3'，
P8:5'ATGTAGGAGG AGCGCAGTGA CCCAACCCCA ATCGCAATGT 3'，
P9:5'ACATTGCGAT TGGGGTTGGG TCACTG CGCTCCTCCT ACAT 3'，
P10:5'GAAAAGGAGG TCGCAAAGTT ATGAGTCAAG AAGACATCAC 3'，
P11:5'GTGATGTCTT CTTGACTCAT AACTTTGCGA CCTCCTTTTC 3'，
P12:5'GTGCGGGTTG GGGTTTTTGA AGGGTGTCTT TTGCGACTTG 3'，
P13:5'CAAG TCGCAAAAGA CACCCT TCAAAAACCC CAACCCGCAC 3'，
P14:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GTTGGTTTAG CGGAGCTGCA3'。
重组菌(工程菌株)构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067或YPV-061为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12，P13/P14进行PCR扩增，获得上游同源臂片段795bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260CEY17_RS02570基因及其CEY17_RS02575的间隔区，序列如SEQ ID No.6所示)，CEY17_RS00300基因片段1456bp(序列如SEQ ID No.7所示)和CEY17_RS00300G550A基因片段1450bp(序列如SEQ ID No.8所示)，CEY17_RS00300和EY17_RS00300G550A基因启动子片段346bp(序列如SEQ ID No.9所示)及下游同源臂片段769bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260CEY17_RS02575基因及其与CEY17_RS02570的间隔区，序列如SEQ ID No.10所示)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的4个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的4个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5a(购自TAKARA公司)后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，分别为pK18-CEY17_RS00300OE、pK18-CEY17_RS00300G550AOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将测序正确的整合质粒(pK18-CEY17_RS00300OE、pK18-CEY17_RS00300G550AOE)分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过P15/P16引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1714bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P17/P18引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1758bp的菌为CEY17_RS00300或CEY17_RS00300G550A基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区上的阳性菌株，分别命名为YPV-062(不含突变点)和YPV-063(含突变点)。
重组菌YPV-062含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的CEY17_RS00300基因；具体地，重组菌YPV-062是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为CEY17_RS00300基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝CEY17_RS00300基因的重组菌可以显著和稳定地提高CEY17_RS00300基因的表达量。重组菌YPV-062为在基因组上过表达野生型CEY17_RS00300基因的工程菌。
重组菌YPV-063含有SEQ ID No.3所示的突变的CEY17_RS00300G550A基因；具体地，重组菌YPV-063是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为CEY17_RS00300G550A基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。重组菌YPV-063为在基因组上过表达突变型CEY17_RS00300G550A基因的工程菌。
PCR鉴定引物如下所示：
P15:5'CGGTTAGATT TTTTGGCCCC 3'(对应上同源臂CEY17_RS02570的外侧)，
P16:5'TGAAGATCAC GGACTTTGGT 3'(对应CEY17_RS00300基因内部)，
P17:5'CATCATCTCA TAGCCGACCA 3'(对应CEY17_RS00300基因内部)，
P18:5'TCTGGACTGG GTGTTGCGCT 3'(对应下同源臂CEY17_RS02575的外侧)。
实施例4构建质粒上过表达CEY17_RS00300基因或CEY17_RS00300G550A基因的工程菌株
为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型CEY17_RS00300基因或其突变基因CEY17_RS00300G550A可以增加L-缬氨酸的产量，将外源基因由质粒在染色体外表达，构建了质粒上过表达CEY17_RS00300基因或CEY17_RS00300G550A基因的工程菌株。
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，分别设计并合成两对扩增CEY17_RS00300或CEY17_RS00300G550A基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P19:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC TCACTG CGCTCCTCCT ACAT 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)，
P20:5'GAAAAGGAGG TCGCAAAGTT ATGAGTCAAG AAGACATCAC 3'，
P21:5'GTGATGTCTT CTTGACTCAT AACTTTGCGA CCTCCTTTTC
P22:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC AGGGTGTCTT TTGCGACTTG3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)。
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067和YPV-061为模板，以引物P19/P20，P21/P22分别进行PCR扩增，获得CEY17_RS00300基因及其启动子片段(序列如SEQ ID No.11所示)和CEY17_RS00300G550A基因及其启动子片段1786bp(序列如SEQ ID No.12所示)，对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-CEY17_RS00300(含有CEY17_RS00300基因)和pXMJ19-CEY17_RS00300G550A(含有CEY17_RS00300G550A基因)，将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。
PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将测序正确的pXMJ19-CEY17_RS00300和pXMJ19-CEY17_RS00300G550A质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R(-48)/P18进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1825bp片段的为阳性菌株，其被命名为YPV-064(不含突变点)和YPV-065(含突变点)。
重组菌YPV-064含有SEQ ID No.1所示的CEY17_RS00300基因；重组菌YPV-064为在质粒上过表达野生型CEY17_RS00300基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-CEY17_RS00300在染色体外进行过表达。
重组菌YPV-065含有SEQ ID No.3所示的突变的CEY17_RS00300G550A基因；重组菌YPV-065为在质粒上过表达突变型CEY17_RS00300G550A基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-CEY17_RS00300G550A在染色体外进行过表达。
实施例5构建基因组上缺失CEY17_RS00300基因的工程菌株
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067的基因组序列，合成两对扩增CEY17_RS00300基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P23:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG CTTGCCACGA GCCTGCTCGG 3'，
P24:5'CAGCCGGAGG ATTTTAAAAT CCTTCGTGAT CGCTGATCGC 3'，
P25:5'GCGATCA GCGATCACGA AGG ATTTTAA AATCCTCCGG CTG 3'，
P26:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GCGCGGATGC TCTGCGCGCG3'。
重组菌(工程菌株)构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别以引物P23/P24和P25/P26进行PCR扩增，获得CEY17_RS00300的上游同源臂片段563bp及CEY17_RS00300的下游同源臂片段563bp。再用引物P23/P26进行Overlap PCR得到整个同源臂片段1200bp(序列如SEQ ID No.13所示)。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔCEY17_RS00300，将该质粒送测序。该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记。
Overlap PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
Overlap PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将测序正确的敲除质粒pK18-ΔCEY17_RS00300电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P27:5'CTTGCCACGA GCCTGCTCGG 3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260pknB基因内部)，
P28:5'GCGCGGATGC TCTGCGCGCG 3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260CEY17_RS00305基因内部)。
上述PCR同时扩增出大小1126bp及2536bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2536bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P27/P28引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1126bp条带的菌株为CEY17_RS00300基因编码区被敲除的阳性菌株CEY17_RS00300。再次通过P27/P28引物PCR扩增阳性菌株CEY17_RS00300片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPV-066(谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260上的基因组上的CEY17_RS00300基因被敲除)。
实施例6L-缬氨酸发酵实验
将上述实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表5所示。
结果如表5所示，在谷氨酸棒杆菌中对CEY17_RS00300基因编码区进行点突变CEY17_RS00300G550A和/或在生产菌中过表达CEY17_RS00300基因或其突变基因CEY17_RS00300G550A，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对CEY17_RS00300基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。
表3发酵培养基配方(其余为水)
| 成分 | 配方 |
| 硫酸铵 | 14g/L |
| 磷酸二氢钾 | 1g/L |
| 磷酸氢二钾 | 1g/L |
| 硫酸镁 | 0.5g/L |
| 酵母粉 | 2g/L |
| 硫酸亚铁 | 18mg/L |
| 硫酸锰 | 4.2mg/L |
| 生物素 | 0.02mg/L |
| 维生素B1 | 2mg/L |
| antifoam(CB-442)消泡剂) | 0.5mL/L |
| 70％葡萄糖(底糖) | 40g/L |
表4发酵控制工艺
表5L-缬氨酸发酵实验结果
| 菌株 | OD<sub>610</sub> | L-缬氨酸产量(g/L) |
| 谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260 | 98.0 | 84.0 |
| YPV-061 | 98.7 | 84.4 |
| YPV-062 | 97.6 | 85.1 |
| YPV-063 | 97.5 | 85.0 |
| YPV-064 | 98.7 | 85.3 |
| YPV-065 | 99.2 | 85.5 |
| YPV-066 | 97.1 | 83.0 |
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> CEY17_RS00300基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 1
atgagtcaag aagacatcac tggaaaagat cgactccaag aactcatcgg tgctgattat 60
cgtctgcagt ggatcatcgg acacggtggc atgtccaccg tgtggctcgc agatgatgtg 120
gtcaatgatc gcgaagtagc catcaaggta ctgcgcccgg aattttccga caaccaggag 180
ttcttgagcc gtttccgcaa tgaagcgcaa gcggctgaga atatcgattc tgaacacgtg 240
gtggccacct atgactaccg tgaggttcca gaccctgctg ggcatacttt ctgcttcatc 300
gtcatggaat ttgtccgcgg tgaatcgctt gcggatcttc tagagcgcga aggcagcctg 360
ccggaagatt tggctcttga tgtgatggag caggccgcgc atggtttgtc ggtgattcac 420
cggatgaaca tggtgcaccg cgatatcaag ccgggcaaca tgctgatcac agccaatggc 480
attgtgaaga tcacggactt tggtatcgct aaggctgccg ctgctgtgcc tttgacccgc 540
accggcatgg tggtgggtac tgctcaatat gtttcacctg agcaagccca gggcaaggaa 600
gtcaccgcgg cttctgatat ttattctctc ggtgtggtcg gctatgagat gatggctggc 660
cgccgcccgt tcactggaga ttcttcggtg tctgtggcga tcgcgcacat caaccaagct 720
ccgccgcaga tgcccaccag catttcggca cagactcgcg agttgattgg cattgcgttg 780
cgcaaggatc cgggtcgccg tttccctgat ggaaatgaaa tggcgctagc tgtttctgct 840
gtgcgccttg gcaagcgccc gcctcaaccg cgcacgagcg cgatgatggc gcaggcggag 900
gcgccgtcgc caagcgaatc aacggcgatg ctgggcaggg tggcccggcc tgcaacaatc 960
acccaagaag tggccccgaa acgcggttcc ggcattggca ttggtctgtt catcgcagct 1020
ttgctggccg tgattattgg cgcggtgatc tatgcgggca ccaccggaat tttgttcaac 1080
gacactccgg aagaaaccac cacacctgaa accattacgg aaacctacac cccaaccgtg 1140
gaggaaacca cctctcagtg ggtaccgcca acgcctccaa ctcggtcaac tttcaccgaa 1200
cctgaaacaa cttcacaccg tccgacgaca agtgaagaga gcacctccga ggaaccaacc 1260
acggaagctc caacaagtag ccgaactgtg cctcaaatcc ctacctctac acctaggacg 1320
agtgctagcg ttccagttga gactaatgca ccggctgatg atttaatcga cgccgtaaat 1380
ggcctattgg atgtaggagg agcgcagtga 1410
<210> 2
<211> 469
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 2
Met Ser Gln Glu Asp Ile Thr Gly Lys Asp Arg Leu Gln Glu Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ala Asp Tyr Arg Leu Gln Trp Ile Ile Gly His Gly Gly Met Ser
20 25 30
Thr Val Trp Leu Ala Asp Asp Val Val Asn Asp Arg Glu Val Ala Ile
35 40 45
Lys Val Leu Arg Pro Glu Phe Ser Asp Asn Gln Glu Phe Leu Ser Arg
50 55 60
Phe Arg Asn Glu Ala Gln Ala Ala Glu Asn Ile Asp Ser Glu His Val
65 70 75 80
Val Ala Thr Tyr Asp Tyr Arg Glu Val Pro Asp Pro Ala Gly His Thr
85 90 95
Phe Cys Phe Ile Val Met Glu Phe Val Arg Gly Glu Ser Leu Ala Asp
100 105 110
Leu Leu Glu Arg Glu Gly Ser Leu Pro Glu Asp Leu Ala Leu Asp Val
115 120 125
Met Glu Gln Ala Ala His Gly Leu Ser Val Ile His Arg Met Asn Met
130 135 140
Val His Arg Asp Ile Lys Pro Gly Asn Met Leu Ile Thr Ala Asn Gly
145 150 155 160
Ile Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Ile Ala Lys Ala Ala Ala Ala Val
165 170 175
Pro Leu Thr Arg Thr Gly Met Val Val Gly Thr Ala Gln Tyr Val Ser
180 185 190
Pro Glu Gln Ala Gln Gly Lys Glu Val Thr Ala Ala Ser Asp Ile Tyr
195 200 205
Ser Leu Gly Val Val Gly Tyr Glu Met Met Ala Gly Arg Arg Pro Phe
210 215 220
Thr Gly Asp Ser Ser Val Ser Val Ala Ile Ala His Ile Asn Gln Ala
225 230 235 240
Pro Pro Gln Met Pro Thr Ser Ile Ser Ala Gln Thr Arg Glu Leu Ile
245 250 255
Gly Ile Ala Leu Arg Lys Asp Pro Gly Arg Arg Phe Pro Asp Gly Asn
260 265 270
Glu Met Ala Leu Ala Val Ser Ala Val Arg Leu Gly Lys Arg Pro Pro
275 280 285
Gln Pro Arg Thr Ser Ala Met Met Ala Gln Ala Glu Ala Pro Ser Pro
290 295 300
Ser Glu Ser Thr Ala Met Leu Gly Arg Val Ala Arg Pro Ala Thr Ile
305 310 315 320
Thr Gln Glu Val Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Ile Gly Ile Gly Leu
325 330 335
Phe Ile Ala Ala Leu Leu Ala Val Ile Ile Gly Ala Val Ile Tyr Ala
340 345 350
Gly Thr Thr Gly Ile Leu Phe Asn Asp Thr Pro Glu Glu Thr Thr Thr
355 360 365
Pro Glu Thr Ile Thr Glu Thr Tyr Thr Pro Thr Val Glu Glu Thr Thr
370 375 380
Ser Gln Trp Val Pro Pro Thr Pro Pro Thr Arg Ser Thr Phe Thr Glu
385 390 395 400
Pro Glu Thr Thr Ser His Arg Pro Thr Thr Ser Glu Glu Ser Thr Ser
405 410 415
Glu Glu Pro Thr Thr Glu Ala Pro Thr Ser Ser Arg Thr Val Pro Gln
420 425 430
Ile Pro Thr Ser Thr Pro Arg Thr Ser Ala Ser Val Pro Val Glu Thr
435 440 445
Asn Ala Pro Ala Asp Asp Leu Ile Asp Ala Val Asn Gly Leu Leu Asp
450 455 460
Val Gly Gly Ala Gln
465
<210> 3
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
atgagtcaag aagacatcac tggaaaagat cgactccaag aactcatcgg tgctgattat 60
cgtctgcagt ggatcatcgg acacggtggc atgtccaccg tgtggctcgc agatgatgtg 120
gtcaatgatc gcgaagtagc catcaaggta ctgcgcccgg aattttccga caaccaggag 180
ttcttgagcc gtttccgcaa tgaagcgcaa gcggctgaga atatcgattc tgaacacgtg 240
gtggccacct atgactaccg tgaggttcca gaccctgctg ggcatacttt ctgcttcatc 300
gtcatggaat ttgtccgcgg tgaatcgctt gcggatcttc tagagcgcga aggcagcctg 360
ccggaagatt tggctcttga tgtgatggag caggccgcgc atggtttgtc ggtgattcac 420
cggatgaaca tggtgcaccg cgatatcaag ccgggcaaca tgctgatcac agccaatggc 480
attgtgaaga tcacggactt tggtatcgct aaggctgccg ctgctgtgcc tttgacccgc 540
accggcatga tggtgggtac tgctcaatat gtttcacctg agcaagccca gggcaaggaa 600
gtcaccgcgg cttctgatat ttattctctc ggtgtggtcg gctatgagat gatggctggc 660
cgccgcccgt tcactggaga ttcttcggtg tctgtggcga tcgcgcacat caaccaagct 720
ccgccgcaga tgcccaccag catttcggca cagactcgcg agttgattgg cattgcgttg 780
cgcaaggatc cgggtcgccg tttccctgat ggaaatgaaa tggcgctagc tgtttctgct 840
gtgcgccttg gcaagcgccc gcctcaaccg cgcacgagcg cgatgatggc gcaggcggag 900
gcgccgtcgc caagcgaatc aacggcgatg ctgggcaggg tggcccggcc tgcaacaatc 960
acccaagaag tggccccgaa acgcggttcc ggcattggca ttggtctgtt catcgcagct 1020
ttgctggccg tgattattgg cgcggtgatc tatgcgggca ccaccggaat tttgttcaac 1080
gacactccgg aagaaaccac cacacctgaa accattacgg aaacctacac cccaaccgtg 1140
gaggaaacca cctctcagtg ggtaccgcca acgcctccaa ctcggtcaac tttcaccgaa 1200
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acggaagctc caacaagtag ccgaactgtg cctcaaatcc ctacctctac acctaggacg 1320
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ggcctattgg atgtaggagg agcgcagtga 1410
<210> 4
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Met Ser Gln Glu Asp Ile Thr Gly Lys Asp Arg Leu Gln Glu Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ala Asp Tyr Arg Leu Gln Trp Ile Ile Gly His Gly Gly Met Ser
20 25 30
Thr Val Trp Leu Ala Asp Asp Val Val Asn Asp Arg Glu Val Ala Ile
35 40 45
Lys Val Leu Arg Pro Glu Phe Ser Asp Asn Gln Glu Phe Leu Ser Arg
50 55 60
Phe Arg Asn Glu Ala Gln Ala Ala Glu Asn Ile Asp Ser Glu His Val
65 70 75 80
Val Ala Thr Tyr Asp Tyr Arg Glu Val Pro Asp Pro Ala Gly His Thr
85 90 95
Phe Cys Phe Ile Val Met Glu Phe Val Arg Gly Glu Ser Leu Ala Asp
100 105 110
Leu Leu Glu Arg Glu Gly Ser Leu Pro Glu Asp Leu Ala Leu Asp Val
115 120 125
Met Glu Gln Ala Ala His Gly Leu Ser Val Ile His Arg Met Asn Met
130 135 140
Val His Arg Asp Ile Lys Pro Gly Asn Met Leu Ile Thr Ala Asn Gly
145 150 155 160
Ile Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Ile Ala Lys Ala Ala Ala Ala Val
165 170 175
Pro Leu Thr Arg Thr Gly Met Met Val Gly Thr Ala Gln Tyr Val Ser
180 185 190
Pro Glu Gln Ala Gln Gly Lys Glu Val Thr Ala Ala Ser Asp Ile Tyr
195 200 205
Ser Leu Gly Val Val Gly Tyr Glu Met Met Ala Gly Arg Arg Pro Phe
210 215 220
Thr Gly Asp Ser Ser Val Ser Val Ala Ile Ala His Ile Asn Gln Ala
225 230 235 240
Pro Pro Gln Met Pro Thr Ser Ile Ser Ala Gln Thr Arg Glu Leu Ile
245 250 255
Gly Ile Ala Leu Arg Lys Asp Pro Gly Arg Arg Phe Pro Asp Gly Asn
260 265 270
Glu Met Ala Leu Ala Val Ser Ala Val Arg Leu Gly Lys Arg Pro Pro
275 280 285
Gln Pro Arg Thr Ser Ala Met Met Ala Gln Ala Glu Ala Pro Ser Pro
290 295 300
Ser Glu Ser Thr Ala Met Leu Gly Arg Val Ala Arg Pro Ala Thr Ile
305 310 315 320
Thr Gln Glu Val Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Ile Gly Ile Gly Leu
325 330 335
Phe Ile Ala Ala Leu Leu Ala Val Ile Ile Gly Ala Val Ile Tyr Ala
340 345 350
Gly Thr Thr Gly Ile Leu Phe Asn Asp Thr Pro Glu Glu Thr Thr Thr
355 360 365
Pro Glu Thr Ile Thr Glu Thr Tyr Thr Pro Thr Val Glu Glu Thr Thr
370 375 380
Ser Gln Trp Val Pro Pro Thr Pro Pro Thr Arg Ser Thr Phe Thr Glu
385 390 395 400
Pro Glu Thr Thr Ser His Arg Pro Thr Thr Ser Glu Glu Ser Thr Ser
405 410 415
Glu Glu Pro Thr Thr Glu Ala Pro Thr Ser Ser Arg Thr Val Pro Gln
420 425 430
Ile Pro Thr Ser Thr Pro Arg Thr Ser Ala Ser Val Pro Val Glu Thr
435 440 445
Asn Ala Pro Ala Asp Asp Leu Ile Asp Ala Val Asn Gly Leu Leu Asp
450 455 460
Val Gly Gly Ala Gln
465
<210> 5
<211> 1144
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagcaaa attccggtgg tgcccgcata 60
gatcaccgcg ccaataatca cggccagcaa agctgcgatg aacagaccaa tgccaatgcc 120
ggaaccgcgt ttcggggcca cttcttgggt gattgttgca ggccgggcca ccctgcccag 180
catcgccgtt gattcgcttg gcgacggcgc ctccgcctgc gccatcatcg cgctcgtgcg 240
cggttgaggc gggcgcttgc caaggcgcac agcagaaaca gctagcgcca tttcatttcc 300
atcagggaaa cggcgacccg gatccttgcg caacgcaatg ccaatcaact cgcgagtctg 360
tgccgaaatg ctggtgggca tctgcggcgg agcttggttg atgtgcgcga tcgccacaga 420
caccgaagaa tctccagtga acgggcggcg gccagccatc atctcatagc cgaccacacc 480
gagagaataa atatcagaag ccgcggtgac ttccttgccc tgggcttgct caggtgaaac 540
atattgagca gtacccacca tcatgccggt gcgggtcaaa ggcacagcag cggcagcctt 600
agcgatacca aagtccgtga tcttcacaat gccattggct gtgatcagca tgttgcccgg 660
cttgatatcg cggtgcacca tgttcatccg gtgaatcacc gacaaaccat gcgcggcctg 720
ctccatcaca tcaagagcca aatcttccgg caggctgcct tcgcgctcta gaagatccgc 780
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tggaacctca cggtagtcat aggtggccac cacgtgttca gaatcgatat tctcagccgc 900
ttgcgcttca ttgcggaaac ggctcaagaa ctcctggttg tcggaaaatt ccgggcgcag 960
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gctg 1144
<210> 6
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
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ggccattccg ccacccaagc cagatccagg tcatgagggc taccaggcca cacagaagca 540
gcgctaccta gaacgccaga tcagggcgtc gaaacggatg gaagctgcag ccatcgaccc 600
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
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gttgaccgag ttggaggcgt tggcggtacc cactgagagg tggtttcctc cacggttggg 300
gtgtaggttt ccgtaatggt ttcaggtgtg gtggtttctt ccggagtgtc gttgaacaaa 360
attccggtgg tgcccgcata gatcaccgcg ccaataatca cggccagcaa agctgcgatg 420
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ggccgggcca ccctgcccag catcgccgtt gattcgcttg gcgacggcgc ctccgcctgc 540
gccatcatcg cgctcgtgcg cggttgaggc gggcgcttgc caaggcgcac agcagaaaca 600
gctagcgcca tttcatttcc atcagggaaa cggcgacccg gatccttgcg caacgcaatg 660
ccaatcaact cgcgagtctg tgccgaaatg ctggtgggca tctgcggcgg agcttggttg 720
atgtgcgcga tcgccacaga caccgaagaa tctccagtga acgggcggcg gccagccatc 780
atctcatagc cgaccacacc gagagaataa atatcagaag ccgcggtgac ttccttgccc 840
tgggcttgct caggtgaaac atattgagca gtacccacca ccatgccggt gcgggtcaaa 900
ggcacagcag cggcagcctt agcgatacca aagtccgtga tcttcacaat gccattggct 960
gtgatcagca tgttgcccgg cttgatatcg cggtgcacca tgttcatccg gtgaatcacc 1020
gacaaaccat gcgcggcctg ctccatcaca tcaagagcca aatcttccgg caggctgcct 1080
tcgcgctcta gaagatccgc aagcgattca ccgcggacaa attccatgac gatgaagcag 1140
aaagtatgcc cagcagggtc tggaacctca cggtagtcat aggtggccac cacgtgttca 1200
gaatcgatat tctcagccgc ttgcgcttca ttgcggaaac ggctcaagaa ctcctggttg 1260
tcggaaaatt ccgggcgcag taccttgatg gctacttcgc gatcattgac cacatcatct 1320
gcgagccaca cggtggacat gccaccgtgt ccgatgatcc actgcagacg ataatcagca 1380
ccgatgagtt cttggagtcg atcttttcca gtgatgtctt cttgactcat aactttgcga 1440
cctccttttc 1450
<210> 8
<211> 1450
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
acattgcgat tggggttggg tcactgcgct cctcctacat ccaataggcc atttacggcg 60
tcgattaaat catcagccgg tgcattagtc tcaactggaa cgctagcact cgtcctaggt 120
gtagaggtag ggatttgagg cacagttcgg ctacttgttg gagcttccgt ggttggttcc 180
tcggaggtgc tctcttcact tgtcgtcgga cggtgtgaag ttgtttcagg ttcggtgaaa 240
gttgaccgag ttggaggcgt tggcggtacc cactgagagg tggtttcctc cacggttggg 300
gtgtaggttt ccgtaatggt ttcaggtgtg gtggtttctt ccggagtgtc gttgaacaaa 360
attccggtgg tgcccgcata gatcaccgcg ccaataatca cggccagcaa agctgcgatg 420
aacagaccaa tgccaatgcc ggaaccgcgt ttcggggcca cttcttgggt gattgttgca 480
ggccgggcca ccctgcccag catcgccgtt gattcgcttg gcgacggcgc ctccgcctgc 540
gccatcatcg cgctcgtgcg cggttgaggc gggcgcttgc caaggcgcac agcagaaaca 600
gctagcgcca tttcatttcc atcagggaaa cggcgacccg gatccttgcg caacgcaatg 660
ccaatcaact cgcgagtctg tgccgaaatg ctggtgggca tctgcggcgg agcttggttg 720
atgtgcgcga tcgccacaga caccgaagaa tctccagtga acgggcggcg gccagccatc 780
atctcatagc cgaccacacc gagagaataa atatcagaag ccgcggtgac ttccttgccc 840
tgggcttgct caggtgaaac atattgagca gtacccacca tcatgccggt gcgggtcaaa 900
ggcacagcag cggcagcctt agcgatacca aagtccgtga tcttcacaat gccattggct 960
gtgatcagca tgttgcccgg cttgatatcg cggtgcacca tgttcatccg gtgaatcacc 1020
gacaaaccat gcgcggcctg ctccatcaca tcaagagcca aatcttccgg caggctgcct 1080
tcgcgctcta gaagatccgc aagcgattca ccgcggacaa attccatgac gatgaagcag 1140
aaagtatgcc cagcagggtc tggaacctca cggtagtcat aggtggccac cacgtgttca 1200
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tcggaaaatt ccgggcgcag taccttgatg gctacttcgc gatcattgac cacatcatct 1320
gcgagccaca cggtggacat gccaccgtgt ccgatgatcc actgcagacg ataatcagca 1380
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<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
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ggtgaacggc gccagagtta taggccaaac caccgggatg cataaattta caactttgtt 240
gccattcagg aaaccgctat ttagctgccg atttggtatt ccatgccagg tgcgtgctat 300
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<210> 10
<211> 769
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
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tgtacatagg gttcggaaca aagcttaaac catccccaat tgaaatgtcg ttacacaccc 120
acatgtttga agtggagcaa accgaaaacc agttttcccc aacggcagcc gccccccacg 180
ttgaaccttc gaaatagtag gcaacaccat caagcggatc ttcatcaagc gaaatagtga 240
ttgactcttc accgttccgc ttacaaactg cgttagtgtc gctattttcc acccacttgt 300
cacactcgta cccgttttca tttagccatt tttcggcatg tcctattttc tcgaaccggg 360
caggagcgtc agggcttccg cagcccgcta gtagtagtcc ggctgcaatg atgcttaatg 420
tttttttcat gaattaaaca tagtactttg ctggtaaaaa tattggagaa ccccactggc 480
ctacatggtc agtgggggca tttttgcgtt tcacccctca aaaatcatca ccacacttgc 540
gggatttccc cctgatttcc cccactccca caccattccc agtggacagt gtggacgtat 600
tggacacatt aaacacattg cgaccaggta aaacgtcatg accaggtatc gtcaatgttc 660
ttgatgaatt tccgcaccgc aggattatca ttcgaggtgg aataaatagc ctgcagctcc 720
gctaaaccaa cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctg 769
<210> 11
<211> 1786
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccctcac tgcgctcctc ctacatccaa 60
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cggcggagct tggttgatgt gcgcgatcgc cacagacacc gaagaatctc cagtgaacgg 780
gcggcggcca gccatcatct catagccgac cacaccgaga gaataaatat cagaagccgc 840
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taggccattt acggcgtcga ttaaatcatc agccggtgca ttagtctcaa ctggaacgct 120
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<210> 13
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
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cgcacgccac cgtttgatac ggttcctgcc atgacagcgg cctgtagcac gttcatttgc 1020
acgtcgcgct ggccaatgct ggattgtcca agggctgcat cgtcggggat ctcacccaag 1080
ccaccgggaa cgttgtccag tcccaagctg taggtttgtc ccactccgaa gtcctcggca 1140
gacgcgcgca gagcatccgc gcgggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg gtcatagctg 1200
Claims (10)
1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
B3)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
C1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；
C2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；
C3)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物。
4.D1)-D8)中任一项的下述任一种应用：
F1)D1)-D8)中任一项在调控微生物的L-缬氨酸的产量中的应用；
F2)D1)-D8)中任一项在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用；
F3)D1)-D8)中任一项在制备L-缬氨酸中的应用；
其中，所述D1)-D8)为：
D1)权利要求1所述的蛋白质；
D2)权利要求2所述的核酸分子；
D3)权利要求3所述的生物材料；
D4)核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；
D5)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.1所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子；
D6)含有D4)或D5)中所述DNA分子的表达盒；
D7)含有D4)或D5)中所述DNA分子的重组载体、或含有D6)所述表达盒的重组载体；
D8)含有D4)或D5)中所述DNA分子的重组微生物、或含有D6)所述表达盒的重组微生物、或含有D7)所述重组载体的重组微生物。
5.一种提高微生物中L-缬氨酸的产量的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：
E1)提高目的微生物中的权利要求2所述核酸分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
E2)提高目的微生物中的权利要求4中D4)或D5)所述DNA分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
E3)对所述目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述突变为点突变。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述点突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第184位的缬氨酸残基突变为另一种残基。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述点突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第184位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，得到氨基酸序列为SEQ IDNo.4的突变蛋白质。
9.一种构建权利要求3或4中所述重组微生物的方法，其特征在于，所述方法包括至少下述任一种：
F1)将权利要求2所述的核酸分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；
F2)将SEQ ID No.1所示的DNA分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；
F3)利用基因编辑手段对SEQ ID No.1所示的DNA分子进行编辑，使目的微生物中含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。
10.一种制备L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求3或4中所述的重组微生物生产L-缬氨酸。
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|---|---|---|---|---|
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2021
- 2021-12-20 CN CN202111561978.1A patent/CN114315998B/zh active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060228712A1 (en) * | 1999-12-16 | 2006-10-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel polynucleotides |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| EMBL: "A0A0F6Z3R9.A0A0F6Z3R9_9CORY, non-specific serine/threonine protein kinase，OS=[Brevibacterium] flavum OX=92706，GN=YH66_00305", UNIPROTKB * |
| FIUZA等: "From the characterization of the four serine/threonine protein kinases (PknA/B/G/L) of Corynebacterium glutamicum toward the role of PknA and PknB in cell division.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 283, no. 26, pages 18106 * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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